專利名稱：口粘膜細(xì)胞因子組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過口粘膜施藥Th1或Th2特異細(xì)胞因子刺激哺乳動(dòng)物保護(hù)機(jī)制的方法，以及口粘膜投送Th1或Th2特異細(xì)胞因子的組合物。具體地說，本發(fā)明可應(yīng)用于自身免疫、過敏性的、炎癥的、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的、腫瘤的、神經(jīng)病的、寄生蟲的、和病毒的疾病的治療方法。
白細(xì)胞介素(IL)是一類多組分的分泌型多肽和蛋白質(zhì)。它們的主要功能是調(diào)解細(xì)胞局部相互作用。有關(guān)IL的絕大部分信息是來自白細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞的工作。
一般地講，人們認(rèn)為CD4 T細(xì)胞能夠分成兩個(gè)功能不同的亞型，T輔助1(Th1)和T輔助2(Th2)細(xì)胞，它們以所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的模式為特征。如鼠Th1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因子β(TNFβ)、和白細(xì)胞介素2(IL-2)，而鼠Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10和IL-13。盡管，IL-2，IL-6，IL-10和IL-13的合成不象在鼠中緊緊限定在一個(gè)亞型，但是人的Th1和Th2細(xì)胞有類似的細(xì)胞因子分泌形式。由Th1和Th2分泌幾種其它的細(xì)胞因子，包括IL-3、TNFα，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，甲基-腦啡肽，一些趨化因子(CK)。另外一些新的細(xì)胞因子，例如IL-18(Yoshimoto等1997．Proc．Natl．Acad．Sci．USA．94，3948-3953)，原先被稱作干擾素γ誘導(dǎo)因子(IGIF)，它具有加強(qiáng)Th1應(yīng)答的作用，將繼續(xù)予以描述。而且將來非?？赡軙?huì)發(fā)現(xiàn)另外的一些新的細(xì)胞因子，它們影響Th1或Th2的應(yīng)答。
Th1和Th2細(xì)胞因子分泌的模式與免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的活性效應(yīng)子表型一致。它們并不存在于幼稚細(xì)胞中。當(dāng)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的抗原首次剌激時(shí)，開始幼稚CD4+T細(xì)胞僅僅產(chǎn)生IL-2，然后分化成分泌其它細(xì)胞因子的表型。已經(jīng)鑒定出第三類CD4+T細(xì)胞，被稱為Th0細(xì)胞，它們由部分分化的效應(yīng)子細(xì)胞組成，該效應(yīng)子細(xì)胞表達(dá)Th1和Th2兩類細(xì)胞所表達(dá)的細(xì)胞因子表達(dá)模式，并代表分化成Th1和Th2細(xì)胞的分化途徑中的一個(gè)瞬時(shí)階段。也鑒定出了第四類CD4+T細(xì)胞，被稱為Th3細(xì)胞，它產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)。
Th1和Th2細(xì)胞不僅產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞因子，產(chǎn)生不同功能性能，而且還優(yōu)選表達(dá)一些活性的標(biāo)記。這樣，人Th1細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)淋巴細(xì)胞活性基因3(LAG-3)，一個(gè)免疫球蛋白超家族的成員，而人Th2細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)CD 30，一個(gè)TNF受體家族的成員。LAG-3的表達(dá)受IFNγ的作用而增強(qiáng)，受IL-4的作用而抑制，而CD 30的表達(dá)依賴于IL-4的存在。Th1細(xì)胞也表達(dá)E-選擇蛋白，P-選擇蛋白配基和IL-12受體的β-鏈，這些是Th2細(xì)胞所不能表達(dá)的。
CD8+T細(xì)胞毒性(Tc)細(xì)胞亞組基于它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子也能予以區(qū)分。Tc1細(xì)胞分泌IL-12和IFNγ，具有Tc2外形的細(xì)胞分泌IL-4和IL-5而且發(fā)現(xiàn)它們存在于一些病理狀態(tài)下，例如，具有很高的IgE水平的瘤型麻風(fēng)和HIV感染個(gè)體。
Th1和Th2細(xì)胞以它們各自不同的細(xì)胞因子相互關(guān)聯(lián)。Th1細(xì)胞參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(巨噬細(xì)胞的激活、抗體依賴性細(xì)胞毒性，遲發(fā)型超敏反應(yīng))和阻止病素的感染，并且?guī)追NTh1細(xì)胞因子激活細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)。Th2細(xì)胞因子加強(qiáng)抗體的產(chǎn)生，特別是IgE應(yīng)答，并通過肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的因子的產(chǎn)生也增強(qiáng)粘膜的免疫性。因此，Th2細(xì)胞是與抗體產(chǎn)生，過敏反應(yīng)和對(duì)病毒感染的敏感性有關(guān)。
Th1和Th2細(xì)胞因子對(duì)彼此表型的分化和效應(yīng)子功能是互相抑制的。因而，IL-12和IFNγ選擇性地抑制Th2細(xì)胞的增生，IL-14和IL-10抑制Th1的發(fā)育。在許多情況下，用細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子能夠顛倒宿主的抗性或?qū)Ω腥镜拿舾行?。參見，the Th1-Th2 paradigm，SergioRomagani，Immunology Today，June 1997，18∶6(263-266)。
白細(xì)胞介素-2(IL-2)是一種生物學(xué)的應(yīng)答修飾子，它能激活溶細(xì)胞T一細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞(參見Kuziel，W．A．和Gree，W．C．(1991)，白細(xì)胞介素-2，細(xì)胞因子手冊(cè)(Interleukin-2，in The Cytokine Handbook，A．Thompson(Ed．)，San Diego，California，Academic Press，pages 83-102))。因此，已對(duì)IL-2對(duì)惡性腫瘤，免疫缺陷以及慢性感染具有的潛在的治療作用進(jìn)行了檢測(cè)。
IL-2通過結(jié)合到有很高親合力的α、β、γ三個(gè)肽鏈組成的細(xì)胞表面受體上調(diào)節(jié)T-淋巴細(xì)胞和另外的淋巴樣細(xì)胞的增生和分化(Waldmann，T．A．，1993，Immunol．Today,14264)。由Vasily Gelfanov等(Proceedings of the Keystone Symposium on Mucosal Immunity，1997，S11212)提供的資料顯示，腸內(nèi)皮淋巴細(xì)胞(已知它在很多個(gè)重要的方面不同于中央免疫系統(tǒng)的T-細(xì)胞)優(yōu)先響應(yīng)最近鑒定的T-細(xì)胞生長(zhǎng)因子，白細(xì)胞介素15(IL-15)，而不是傳統(tǒng)的T-細(xì)胞生長(zhǎng)因子，IL-2。IL-15與一種異源三聚體細(xì)胞表面受體相互作用，它由IL-2受體的β和γ亞單位以及一種被稱為IL-15Rα的特異性高親和IL-15結(jié)合亞基組成。因?yàn)镮L-2受體的β和γ亞單位需要由IL-2或IL-15呈遞信號(hào)，已報(bào)導(dǎo)的這二個(gè)細(xì)胞因子共享許多共同的生物的活性就顯得不足為奇(Kennedy,M．K．和Dark L．S．，1996，臨床免疫學(xué)雜志(J．Clin，Immunol．)，16134-143)。
與干擾素α一樣，IL-12是天然殺傷細(xì)胞(NK)活性的主要調(diào)節(jié)者之一，在宿主對(duì)瘤細(xì)胞的防御中它起著重要作用(Kobayashi，M．，1989，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J．Exptl．Med．)，170827)。主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12通過激活T-細(xì)胞和NK細(xì)胞也能誘導(dǎo)釋放γ-干擾素，而且與IL-2協(xié)同產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)(Aragane等，1994，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)，1535366-5372)。IL-12與IL-2和γ-干擾素一起在Th1效應(yīng)子細(xì)胞的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用。Th1應(yīng)答常常與抵御感染聯(lián)系在一起，而且已表明感染人乳頭瘤病毒的病人用干擾素α2抗病毒作用時(shí)它起了決定性的作用(Arany，I．和Tyring，K．，1996，干擾素和細(xì)胞因子研究(J．Interferon and Cytokine Res．)，16453-460)。
全身性施用的IL-2的抗腫瘤活性被認(rèn)為主要是由LAK細(xì)胞介導(dǎo)(Natuk等，1989，病毒學(xué)雜(J．Virol．)，634969-4971)。全身性施用的IL-2的抗病毒活性被認(rèn)為主要是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)的，它涉及在輔助T-細(xì)胞中γ-干擾素的誘導(dǎo)(Kohe 等，(J．Inf．Dis．)，159239-247)，并通過LAK細(xì)胞(Natuk等，1989，病毒學(xué)雜志(J．Virol．)，634969-4971)。
白細(xì)胞介素一般是腸胃外施藥。然而，IL-2腸胃外施藥伴隨許多嚴(yán)重的副作用，諸如血中毒和腎功能異常(參見Haworth，C．和Felamann，M．，1991，細(xì)胞因子在人免疫治療上的應(yīng)用，細(xì)胞因子手冊(cè)，A．Thompson(Ed．)，San Diego，CaliforniaAcademic Press，Pages 301-324)。也觀察到另外一些白細(xì)胞介素具有類似的毒性。
全身性施用的重組人IL-2也被用于治療許多腫瘤疾病，包括腎細(xì)胞癌(Rozenberg等，1989．Ann．Surg．，210474)和惡性黑色素瘤(Rozenberg等，1987，New Engl．J．Med．，816889)。但較少用于某些病毒病治療，包括慢性乙型肝炎(Kakumu，等，1988，Hepatology,8487-492)。在所有的這些研究中遇到了一些值得考慮的毒性，包括發(fā)熱、發(fā)冷、厭食和疲勞(Kakumu等，1988，Hepatology，8487-492)。
一系列的專利和專利公開以概括性的術(shù)語(yǔ)特別提到各種白細(xì)胞介素口服藥的可能性。例如，WO 91／16917公開了IL-1用于腸潰瘍和肥胖的治療；WO 92／11030公開了IL-4用于增強(qiáng)對(duì)疫苗免疫原的免疫應(yīng)答；美國(guó)專利No．5，601，814公開了IL-6用于治療中毒休克；美國(guó)專利No．5，188,828公開了IL-6用于增強(qiáng)內(nèi)源的促紅細(xì)胞生成素的水平；和WO 96／25171公開了IL-12用于抑制血管形成。然而，這些一般地公開實(shí)際上不包含活性組分口的吸收，也沒有任何一個(gè)例子包含口的吸收或口的投送后蛋白質(zhì)活性的報(bào)導(dǎo)。例如，雖然美國(guó)專利No．5，449，515概括性地公開了口服投送IL-4，也公開了如果制備成口服形式，IL-4可被一種防止它失活的材料包被，或者與這種材料一起施用，并討論了各種用于防止這種失活的材料。提出的措施包括酶抑制劑和將白細(xì)胞介素包裹在脂質(zhì)體中(參見Column 3，第7-22行)。很明顯，這些參考文獻(xiàn)預(yù)想到了通過口腔向小腸投送的施用形式。
Koren S．和Fleischmann W．R．Jr．，“干擾素研究雜志”，14(6)343-7，Dec．1994，描述了在無病原的小鼠中通過口服rhIL-2對(duì)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓功能的調(diào)節(jié)，并且斷定白細(xì)胞計(jì)數(shù)的抑制水平類似于通過皮下施藥得到的水平。他們斷定口服IL-2能產(chǎn)生全身性效應(yīng)，推測(cè)口服IL-2具有潛在的治療作用。Marinaro，M．，Boyaka，P．N．，F(xiàn)inkelman，F(xiàn)．D．，Kiyono，H．，Jackson，R．J．，Jirillo，E．，和McGhee，J．R．，J．Exp．Med．，F(xiàn)eb 3 1997，185(3)，第415-27頁(yè)，斷定重組鼠IL-12(rmIL-12)經(jīng)胃內(nèi)而不是胃腸外給藥造成對(duì)口服疫苗進(jìn)行Th2型應(yīng)答，而不致敏腸粘膜IgA的應(yīng)答。作者斷定IL-12能夠通過口通道給藥，以調(diào)節(jié)對(duì)口服疫苗的全身性響應(yīng)，并且建議為了向小腸的派伊爾氏淋巴集結(jié)投送而配制的IL-12也可在粘膜水平施加免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。
Marinaro，M．，Boyaka，P．N．，Jackson．R．J．，F(xiàn)inkelman，F(xiàn)．D．，Kiyono，H．，McGhee，J．R．，過敏臨床免疫雜志(J．Allergy Clin．Immunol)99，No．1Pt．2，S34，1997對(duì)與脂質(zhì)體復(fù)合的IL-12由鼻內(nèi)投送相對(duì)于口投送進(jìn)行了研究。他們發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)投送IL-2增強(qiáng)Th2-型的應(yīng)答，而口服IL-2使Th2型應(yīng)答改變?yōu)門h1型應(yīng)答。這表明兩種不同粘膜途徑投送IL-12對(duì)口服疫苗產(chǎn)生粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答的相反類型。
但是，所有的這些專利和文獻(xiàn)“口服投送”顯然是指通過口服藥投送到小腸，而IL實(shí)際上在小腸被吸收。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在將小鼠用通常情況下快速致死的病毒和腫瘤至敏后，通過口腔粘膜施用Th1細(xì)胞因子可有效延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。
本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的方法，它是通過口腔粘膜施用Th1或Th2特異性細(xì)胞因子進(jìn)行的，其劑量最好是誘導(dǎo)宿主防御機(jī)制刺激效應(yīng)的劑量，也就是Th1或Th2細(xì)胞因子在制備用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的口腔粘膜藥物中的應(yīng)用，用于口腔粘膜投送細(xì)胞因子的組合物和用細(xì)胞因子治療疾病的方法。
本發(fā)明也提供了一種哺乳動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包含通過口粘膜接觸施用免疫刺激量的Th1或Th2特異細(xì)胞因子的步驟，也就是Th1或Th2細(xì)胞因子在制備用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的口腔粘膜藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明以及下文中，作為優(yōu)選的實(shí)施方案提出的刺激宿主防御機(jī)制或者免疫應(yīng)答的方法也是Th1或Th2細(xì)胞因子在制備口腔粘膜藥物中的應(yīng)用的優(yōu)選的實(shí)施方案。
優(yōu)選Th1細(xì)胞因子選自下組干擾素-α，-β，-ω，-γ，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，GM-CSF和腫瘤壞死因子β(lymphotoxin)。優(yōu)選Th2細(xì)胞因子選自下組IL-4，IL-5，IL-10，和IL-13。優(yōu)選的細(xì)胞因子是由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。
本發(fā)明的組合物和方法可用于治療人和非人哺乳動(dòng)物疾病，包括伴隨人的動(dòng)物，例如狗和貓，以及家畜，例如馬、牛和羊。
本發(fā)明方法也允許特異性細(xì)胞因子Th1和Th2在一種特別的劑量下施用，這種特別的劑量在通過胃腸外途徑施用相同的細(xì)胞因子時(shí)為可誘導(dǎo)病理效應(yīng)的過量?；蛘撸景l(fā)明提供了一種通過細(xì)胞因子的口腔粘膜施用提高Th1或Th2細(xì)胞因子的治療指數(shù)的方法。
下文將參照下列定義和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本文中提及的所有的專利和文獻(xiàn)引入本文作為參考。
“口粘膜”是指排布在口腔和／或鼻咽腔的粘膜。對(duì)于本發(fā)明說明書中描述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有關(guān)細(xì)胞因子施用途徑的術(shù)語(yǔ)“口粘膜的”，“口咽的”，“鼻內(nèi)的／口腔的”，“鼻內(nèi)的加口腔的”和“在／或”為同義詞，表示細(xì)胞因子制劑被施用至鼻腔或口腔的深處，以便細(xì)胞因子迅速地分布到受體哺乳動(dòng)物的口和喉，從而與腔體的粘膜襯里相接觸。雖然吸收位點(diǎn)，而不是施用方法起著關(guān)鍵的作用，細(xì)胞因子不需要與鼻、口、和咽喉的腔體的整個(gè)粘膜襯里相接觸。
當(dāng)用于本文而沒有進(jìn)一步的限定時(shí)，“細(xì)胞因子”是指Th1或Th2特異性細(xì)胞因子，即刺激Th1或Th2細(xì)胞活性的細(xì)胞因子。
“白細(xì)胞介素”是指由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子蛋白質(zhì)，包括但不限于通常被稱為IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18的細(xì)胞因子和其混合物。白細(xì)胞介素可以由天然來源得到，但優(yōu)選重組產(chǎn)生的。本發(fā)明中“細(xì)胞因子”也包括具有細(xì)胞因子活性的多肽及其片斷，以及其中導(dǎo)入了序列變化的嵌合或突變形式的細(xì)胞因子，以提高例如其穩(wěn)定性，而不影響其生物學(xué)活性。其它的變化，例如pegylated形式，與免疫球蛋白或其它的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。
口腔粘膜施用可包含通過單一劑量施用有效劑量的細(xì)胞因子，或者該有效劑量可在足以引發(fā)與單一劑量相當(dāng)?shù)拿庖叽碳さ臅r(shí)間內(nèi)分多次小劑量施用。同樣，細(xì)胞因子的劑量可在足以誘導(dǎo)與單一劑量相當(dāng)?shù)男Ч臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用。
本發(fā)明提供一種治療選自下組的疾病的方法胞內(nèi)細(xì)菌感染，神經(jīng)疾病、過敏、炎癥、腫瘤疾病、寄生蟲感染和病毒感染，包括向哺乳動(dòng)物通過口粘膜接觸施用有效量的Th1特異性細(xì)胞因子的步驟。
而且，本發(fā)明提供了一種通過口粘膜施用Th2細(xì)胞因子治療自身免疫疾病的方法，這些疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，I型糖尿病，紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化癥，以及牛皮癬。
炎癥，例如結(jié)腸炎潰瘍和Crohn氏病；胞內(nèi)細(xì)菌感染，包括Listeria；真菌細(xì)菌感染，例如麻瘋病和肺結(jié)核；神經(jīng)疾病，包括多樣性硬皮癥和amyotrophic lateral sclerosis；寄生蟲疾病，例如瘧疾，血吸蟲病和利什漫原蟲??；和CMV感染和過敏，包括哮喘和遺傳過敏性皮炎，可以通過口粘膜施用細(xì)胞因子予以治療。
本發(fā)明還提供了一種治療腫瘤疾病的方法，這些腫瘤疾病包括，例如，多種骨髓瘤，毛細(xì)胞白血病，慢性骨髓的白血病，低等淋巴腺瘤，皮膚的T-細(xì)胞淋巴腺瘤，類癌腫瘤，子宮頸癌；肉瘤，包括Kaposi氏肉瘤；癌，包括腎細(xì)胞癌，肝細(xì)胞癌，鼻咽癌，血液惡性腫瘤，結(jié)腸癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，喉乳頭狀瘤，肺癌，結(jié)腸癌，惡性黑色素瘤；和腦腫瘤，包括惡性腦瘤。
雖然本發(fā)明的方法可以在沒有同時(shí)使用其它藥物進(jìn)行治療的情況下使用，但預(yù)想到本發(fā)明的這一實(shí)施方案特別適用于以下情況a)通過標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行手術(shù)，化療，或放射療法(X-射線，紫外線UV)后作為輔助治療；b)用于治療細(xì)胞因子敏感性瘤，本發(fā)明的方法可以單獨(dú)使用或者與常規(guī)的化療或放療結(jié)合使用。
c)用于治療耐細(xì)胞因子性瘤，本發(fā)明的方法可以單獨(dú)使用或最優(yōu)選與常規(guī)的化療或放療協(xié)同使用。
在第三個(gè)實(shí)施方案中被治療的疾病是病毒感染。這種病毒感染可以是急性或暴發(fā)性的感染，例如鼻病毒，流感，帶狀皰疹，登革熱或病毒腦炎，包括但不限于麻疹病毒腦炎，河谷腦炎、日本B腦炎、森林腦炎和皰疹腦炎；出血熱，諸如；Ebola病毒，馬爾堡病毒、拉沙熱；漢坦病毒感染和被認(rèn)為是由動(dòng)物傳染到人的其它病毒的感染，例如馬傳麻疹病毒。對(duì)于其中的許多病癥目前還無法治療或沒有可使用的疫苗，而且輔助治療也無濟(jì)于事。或者病毒性疾病可導(dǎo)致慢性感染，例如乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，或其它形式的病毒性感染，或巨細(xì)胞病毒(CMV)，人免疫缺陷型病毒(HIV)，人乳頭狀瘤(HPV)，和單純皰疹病毒Ⅰ和Ⅱ(HSVⅠ＆Ⅱ)。
本發(fā)明的方法和藥劑形式可以與其它治療結(jié)合使用。例如，對(duì)于皰疹病毒感染可以使用無環(huán)鳥苷或9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基鳥嘌呤]治療。對(duì)于HIV感染可以使用疊氮胸苷(zidovudine)或一種或多種其它的HIV反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，和／或HIV蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，被治療的疾病是瘧疾，如上文所述施用細(xì)胞因子。瘧疾的病原體可以是三日瘧原蟲，問日瘧原蟲，惡性瘧原蟲，或卵型瘧原蟲。本發(fā)明的方法特別預(yù)想到防止瘧疾發(fā)展到大腦?？扇芜x使用一種抗瘧疾的藥物，例如氯奎。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種藥物組合物在哺乳動(dòng)物口腔粘膜刺激宿主防御機(jī)制中的應(yīng)用，該組合物包含Th1或Th2剌激細(xì)胞因子和至少一種用于口腔粘膜投送的藥學(xué)可接受的賦形劑。
如前文所述，在本發(fā)明中，作為優(yōu)選的用于刺激宿主防御機(jī)制的方法而提出的實(shí)施方案也是Th1或Th2細(xì)胞因子在制備用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的口腔粘膜藥物中的應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種口腔粘膜施用的藥物組合物，包含至少一種治療有效量的Th1或Th2特異細(xì)胞因子，和適于口腔粘膜施用的藥學(xué)上可接受的載體。該組合物可以是一種溶液，片劑，錠劑，膠體，糖漿，鼻噴霧劑，鼻滴液，可吸入的配劑，膏，或可控制釋放的口腔粘膜投送系統(tǒng)。可任選擇的，該組合物可含有緩沖液、穩(wěn)定劑、增稠劑、吸附劑和增粘劑等。
本方法可以作為單獨(dú)地作為治療方案進(jìn)行實(shí)施，或作為放療，化療的輔助治療，或者與一種或多種其它試劑或與干擾素誘導(dǎo)劑或白細(xì)胞介素誘導(dǎo)劑一起治療。在一些情況下，可同時(shí)或隨后施用多種細(xì)胞因子，以利用多種作用機(jī)制。
截至目前，我們的結(jié)果表明，口腔粘膜施用細(xì)胞因子沒有顯著的毒性，在最差的情況下，僅有輕微的副作用。因而，本發(fā)明的方法允許施用Th1或Th2特異性細(xì)胞因子的量當(dāng)胃腸外途徑使用相同的細(xì)胞因子時(shí)為可誘導(dǎo)病理應(yīng)答的過量劑量?；蛘?，本發(fā)明提供了一種通過口腔粘膜施用細(xì)胞因子提高特異細(xì)胞因子Th1或Th2的治療指數(shù)的方法。
口腔粘膜細(xì)胞因子的施用劑量可以低于，等于或高于宿主防御機(jī)制產(chǎn)生時(shí)胃腸外的劑量水平。具體地說，本發(fā)明的優(yōu)選形式為，總劑量大約是從0．01μg／kg到約150μg／kg。
該細(xì)胞因子可任選地與誘導(dǎo)劑，或細(xì)胞因子的產(chǎn)生、激活、或釋放的增效劑一起施用。誘導(dǎo)劑可以與口粘膜細(xì)胞因子一起施用，或分開施用。IL誘導(dǎo)劑是已知的；例如，細(xì)菌脂多糖刺激多種IL和其它的細(xì)胞因子的釋放。
對(duì)于特定的疾病，本發(fā)明的多種方法，用途和組合物可任選地與一種或多種其它的治療相組合，在這種情況下，參與治療的醫(yī)生和獸醫(yī)會(huì)容易地選擇這種其它的治療。
有關(guān)腫瘤疾病的治療方法的目的在于誘導(dǎo)和／或保持疾病的消退狀態(tài)。“與其它的治療相組合”是指在外科手術(shù)、放療或化療之前，在進(jìn)行的過程中和／或之后施用細(xì)胞因子。最適合的方案依賴于下述的各種因素。
具體地說，優(yōu)選本發(fā)明的方法與選自下組的至少一種其它的治療相組合使用細(xì)胞靜止藥物、一種或多種具有抗癌活性但與口腔粘膜細(xì)胞因子的作用機(jī)制不同的作用機(jī)制的其它的細(xì)胞因子、抗生血管生成劑、和增強(qiáng)特異的細(xì)胞因子的活性的制劑的化療。優(yōu)選的第二細(xì)胞因子是干擾素α，β，γ，ω或共有的干擾素；優(yōu)選的血管形成抑制劑是AGM-1470[(氯乙酰)-氯甲基酸(3R-(3α，4α，(2R*，3R*)，5β，6β))-5-甲氧-4-(2-甲基-3-(3-甲氧-2-丁烯基)環(huán)氧乙烷基)-1-噁螺環(huán)(2，5)辛-6-基酯]。
癌的化療試劑的實(shí)例是一些抗代謝物，例如6-巰基嘌呤，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，和這些試劑的代謝物和衍生物。其它的癌的化療試劑是抗葉酸鹽類(antifolates)，例如氨甲喋呤，或從天然產(chǎn)物中得到的試劑，如長(zhǎng)春花生物堿，諸如長(zhǎng)春花堿、vincristine和秋水仙堿得到的；亞德里亞霉素，道諾紅霉素，doxorubicin，teniposide或etoposide。這種癌癥的化療試劑也包括鉑抗癌藥物，例如cisplatin和carboplatin。此外本發(fā)明的試劑可與環(huán)磷酸胺，丁基砜，前卡巴肼，十卡巴肼，亞硝基脲氮芥，lomustine，甲基氯乙胺(mechlorethamine)，苯丁酸氮芥，羥基脲，亞硝基脲及其衍生物，苯丙氨酸氮芥，mitotone，紫杉醇，α-二氟甲基鳥氨酸，和螺鍺一起施用。通常使用長(zhǎng)春花生物堿，蒽環(huán)化的道諾紅霉素，doxorubicin和亞德里亞霉素；和鬼臼亞乙苷(etoposide)和表鬼臼毒噻吩糖苷(teniposide)觀察到多藥物抗性，用抗代謝物和其它的化療試劑較少觀察到多藥物抗性。
優(yōu)選的與細(xì)胞因子結(jié)合施用的細(xì)胞靜止藥物包括但不限于環(huán)磷酸胺，cisplatin，carboplatin，亞硝基脲氮芥(BCNU；N，N-雙(2-氯乙基)-N-亞硝基脲)，氨甲蝶呤，亞德里亞霉素，α-二氟甲基鳥氨酸，和5-氟尿嘧啶。
在本發(fā)明的藥物組合物的制備中，可使用多種細(xì)胞因子的載體和賦形劑，這對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是公知的。代表性的配制技術(shù)描述于Remington“藥學(xué)的科學(xué)和實(shí)踐”，19thed．，Mack出版公司，Easton，PA，1995，及其以前的版本。細(xì)胞因子配方可包含穩(wěn)定增強(qiáng)劑，如，甘氨酸或丙氨酸，如美國(guó)專利No．4，496，537所述，和／或一種或多種載體，如載體蛋白質(zhì)。例如，用于人的治療，通常使用藥品級(jí)人血清白蛋白，可選擇磷酸鹽緩沖液作為稀釋劑一起使用。當(dāng)細(xì)胞因子的賦形劑是人血清白蛋白時(shí)，人血清白蛋白可以是從人血清中得到的，或通過重組得到的。
細(xì)胞因子可以通過使細(xì)胞因子以足以得到所需的刺激的時(shí)間與受體的口腔粘膜接觸的方式施用。其它的粘膜可能有相似的應(yīng)答。這樣，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于任何特定類型的配方。本發(fā)明說明書中描述了將細(xì)胞因子施用到口腔粘膜的深處；這可通過液體，固體，或霧，以及鼻用滴液、噴霧實(shí)現(xiàn)。為此本發(fā)明包括，但并不限于，液體、噴霧、糖漿、錠劑、口腔藥片和噴霧配方。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到噴霧或噴霧器配方中的顆粒大小是重要的，并且將會(huì)知道用適當(dāng)?shù)姆椒ǜ淖冾w粒的大小。優(yōu)選使用微?；呐浞?。
一方面，將細(xì)胞因子以單一的劑量施用?；蛘?，該細(xì)胞因子可以在一段時(shí)間內(nèi)以低劑量多次施用，并使其總體效果等同于高劑量單次施用。這種投送方式的一個(gè)方案是通過提供植入口腔的持續(xù)或控制釋放器械，以在一段時(shí)間內(nèi)釋放細(xì)胞因子，其使用量等同于高劑量單次施用。
用于口腔粘膜施用的細(xì)胞因子的一個(gè)配方示于下文(所有的％是指W／W)片劑葡萄糖(英國(guó)藥典 BP)45％；明膠(BP)30％；小麥淀粉(BP)11％；carmellose sodium(BP)5％；蛋白蛋白(BPC)4％；亮氨酸(USP)3％；丙二醇(BP)2％；細(xì)胞因子1％。該片劑在口中能慢慢地溶解或在水里被溶解以及按需要含在口中并與口粘膜接觸。
按美國(guó)專利No．4，675，184，由甘油45％，羧甲基纖維素鈉(CMCNa)2％，檸檬酸緩沖液(pH4．5)25％，加蒸溜水至100％，和1％的細(xì)胞因子配制細(xì)胞因子膏劑。細(xì)胞因子膏劑可粘附在口粘膜上。
同樣的，在可從商業(yè)途徑獲得的漱口液或止咳糖漿中加入所需量的細(xì)胞因子，以制備成含漱劑或糖漿。
在上述特定的劑量范圍內(nèi)，個(gè)案的治療依賴于疾病的性質(zhì)，疾病的發(fā)展階段，原先的治療，其它的后續(xù)治療，哺乳動(dòng)物的總體健康狀態(tài)，患者對(duì)細(xì)胞因子的敏感性等，因此，應(yīng)當(dāng)由醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)這些情況進(jìn)行判斷。治療時(shí)間當(dāng)然要根據(jù)所治療的疾病而變化，例如，治療象前列腺癌那樣的生長(zhǎng)緩慢的癌與治療生長(zhǎng)迅速的癌，如肝細(xì)胞癌相比要涉及不同的治療療程。同樣的，治療急性感染，例如由Ebola病毒引起的急性感染與慢性感染，如肝炎相比要涉及不同的療程。
本文中公開的有效劑量為黨胃腸外施用時(shí)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生病理應(yīng)答但當(dāng)通過口腔粘膜施用時(shí)為有效的并且是無毒性的或者毒性較小的劑量。病理應(yīng)答可以是急性的，慢性的，或累積性的，并且可以表現(xiàn)為血液化學(xué)的改變，例如白細(xì)胞減少，骨髓抑制，或其它組織學(xué)參數(shù)變化。在本文中，病理學(xué)應(yīng)答包括逆副效應(yīng)，例如發(fā)燒、發(fā)冷、厭食、疲勞、不適或類流感的癥狀，血管的反應(yīng)，例如靜脈炎，以及注射部位局部炎癥。考慮到對(duì)細(xì)胞因子敏感性的個(gè)體差異，這種應(yīng)答在患者人群中會(huì)有較大的變化。
對(duì)于許多患者來說，口腔粘膜劑量將超過現(xiàn)存的已獲批準(zhǔn)的胃腸外施用方案中的可耐受的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，總劑量可在一段時(shí)間內(nèi)被分成多個(gè)低劑量施用，或者甚至可以從一個(gè)粘附在或被植入口腔粘膜的控釋器械上連續(xù)施用或以間斷的方式使用。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明涉及
一種用于在哺乳動(dòng)物中剌激宿主防御機(jī)制的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th1或Th2刺激細(xì)胞因子。
一種在哺乳動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包括通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th1或Th2剌激細(xì)胞因子。
一種所說的方法，其中所說的量按每公斤體重是從0．01μg至約150μg細(xì)胞因子。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
一種用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th1剌激細(xì)胞因子。
一種在哺乳動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包括通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th1剌激細(xì)胞因子。
一種所說的方法，其中所說的量按每公斤體重是從0．01μg至約150μg細(xì)胞因子。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
一種用于在哺乳動(dòng)物中治療腫瘤疾病的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th1剌激細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子包括干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，或者粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一種用于治療病毒感染的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th1剌激細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子包括干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一種用于在哺乳動(dòng)物中治療過敏性疾病的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th1細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子選自干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一種用于治療哮喘的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th1細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子選自干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一種用于治療特應(yīng)性皮炎的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th1細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子選自干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
一種用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th2剌激細(xì)胞因子。
一種在哺乳動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包括通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用刺激量的Th2刺激細(xì)胞因子。
一種所說的方法，其中所說的量按每公斤體重是從0．01μg至約150μg細(xì)胞因子。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
一種用于在哺乳動(dòng)物中治療自體免疫疾病的方法，該方法包含通過口腔粘膜接觸向哺乳動(dòng)物施用有效量的Th2刺激細(xì)胞因子，以及一種所說的方法，其中細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-4，白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10，白細(xì)胞介素-13。
所述的方法，其中細(xì)胞因子包括重組細(xì)胞因子。
Th1或Th2細(xì)胞因子在制備用于在哺乳動(dòng)物中刺激宿主防御機(jī)制的口腔粘膜藥物中的應(yīng)用。
一種用于在哺乳動(dòng)物中口腔粘膜刺激宿主的防御機(jī)制的藥物組合物，該組合物含有TH1或TH2剌激細(xì)胞因子和至少一種用于口腔粘膜投送的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
一種適于口腔粘膜施用的單位劑量形式的藥物組合物，包含約0．01μg至約10000μg的TH1或TH2剌激細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體，并且所說的組合物含有約10μg至約10000μg的細(xì)胞因子。
所說的組合物包含TH1細(xì)胞因子。
所說的組合物包含TT12細(xì)胞因子。
細(xì)胞因子配方天然鼠干擾素-α／β天然鼠干擾素-α／β是由用Newcastle Disease Virus(NCV)病毒誘導(dǎo)的C243-3細(xì)胞培養(yǎng)物制各的，并按以前的描述(Tovey等，Proc．Exp．Biol．Med．，1974，146406-415)進(jìn)行純化。本研究中使用的制備物(批號(hào)T638)的效價(jià)是1×106IU／ml，比活是5×107IU／mg蛋白，這是用Vesicular Stomatitis Virus(VSV)病毒至敏鼠L929細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定的(Tovey等，Proc．Exp．Biol．Med．，1974，146406-415)，而且與美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生院(NIH)的鼠干擾素α／β國(guó)際參考制劑的標(biāo)準(zhǔn)(G-002-9004-5411)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。重組鼠白細(xì)胞介素-2重組鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)購(gòu)自R&D Systems，Inc．(Minneapolis，MN)。本研究中使用的制劑(批號(hào)MX056111)的純度用SDS-PAGE測(cè)定大于97％，用IL-2依賴性鼠細(xì)胞毒T-細(xì)胞系CTLL-2的細(xì)胞增殖檢測(cè)測(cè)得的ED50是0．1-0．4ng／ml。重組鼠白細(xì)胞介素-4重組鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)購(gòu)自蛋白質(zhì)研究公司(Protein InstituteInc．Paris，F(xiàn)rance)。本研究中使用的制劑(批號(hào)No．P200M-04)，用SDS-PAGE和N-末端序列分析測(cè)得的純度大于98％。該制劑的ED50是2．0ng／ml。重組鼠白細(xì)胞介素-5重組鼠白細(xì)胞介素-5購(gòu)自R&D Systems Inc．。本研究使用的制劑(批號(hào)No．405-ML-025)用SDS-PAGE測(cè)定純度大于97％，ED50是0．04至0．15ng／ml。重組鼠白細(xì)胞介素-10重組鼠白細(xì)胞介素-10(IL-10)購(gòu)自蛋白質(zhì)研究公司(ProteinInstitute Inc．)。本研究使用的制劑(批號(hào)No．P200M-10)用SDS-PAGE和N-末端序列分析測(cè)得的純度大于98％。該制劑的ED50是2．0ng／ml。重組鼠白細(xì)胞介素-12重組鼠白細(xì)胞介素-12(IL-12)購(gòu)自R&D Systems Inc．。本研究使用的制劑(批號(hào)No．PB01711)用SDS-PAGE測(cè)定純度大于97％，ED50是0．05至0．2ng／ml，測(cè)定方法同上。重組鼠白細(xì)胞介素-13重組鼠白細(xì)胞介素-13(IL-13)購(gòu)自R&D Systems Inc．。本研究使用的制劑(批號(hào)No．413-ML-025)用SDS-PAGE測(cè)定純度大于97％，ED50是3至6 ng／ml。重組鼠白細(xì)胞介素-15重組鼠白細(xì)胞介素-15(IL-15)購(gòu)自蛋白質(zhì)研究公司(ProteinInstitute Inc．)。本研究使用的制劑(批號(hào)No．P200-15)用SDS-PAGE和N-末端序列分析測(cè)得的純度大于98％。該制劑的ED50小于0．5ng／ml，相應(yīng)于比活2×106單位／mg。重組鼠白細(xì)胞介素-18重組鼠白細(xì)胞介素-18(IL-18)購(gòu)自蛋白質(zhì)研究公司(ProteinInstitute Inc．)。本研究使用的制劑(批號(hào)P200-18)用SDS-PAGE和HPLC分析測(cè)得的純度大于98％。本研究使用的制劑的ED50是5ng／ml。重組鼠的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子重組鼠的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)購(gòu)自蛋白質(zhì)研究公司(Protein Institute Inc．)。本研究使用的制劑(批號(hào)No．P300M-03)用SDS-PAGE和N-末端序列分析測(cè)得純度大于98％。該制劑的ED50為0．1ng／ml。
鼠的干擾素α／β，重組鼠IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-13，IL-1 5，IL-18，和CM-CSF在施用前用FerimmuneTM賦形劑處理。賦形劑用含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)或如下所述的專用賦形劑稀釋細(xì)胞因子制劑。牛血清白蛋白V部分(RIA級(jí)；無免疫球蛋白；產(chǎn)品號(hào)No．A7888；Sigma，USA)用pH7．4的PBS緩沖液稀釋，最終濃度為100μg／ml，而且通過過濾除菌(0．2μm，Millex-GV．Millipore，USA)。
本文描述的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞因子制劑是用專用賦形劑進(jìn)行稀釋。所使用的賦形劑如下所示，以片劑的形式(FerimmuneTM，PharmaPacific)提供
**以無水計(jì)算***得自44．64％的葡萄糖(無水葡萄糖)BP和0．03％的葡萄糖(葡萄糖40注射級(jí)BP)將一個(gè)FeximmuneTM片劑賦形劑(批號(hào)B09002，失效日1997年9月)溶解在一個(gè)2 ml Eppendorf離心管中的1．5ml PBS中，并在室溫下在一個(gè)旋轉(zhuǎn)(底對(duì)底)混合器上振蕩3小時(shí)。然后將懸浮液在16000g離心15分鐘，回收上清液。在使用之前每日制備FerimmuneTM賦形劑。
Ⅱ投送系統(tǒng)初步的試驗(yàn)表明用P20安培道夫微量吸管向普通成年鼠的每一鼻孔施用5μl結(jié)晶紫，結(jié)果立即產(chǎn)生遍布整個(gè)口咽腔的表面的著色分布。施用染料30分后口咽腔的著色仍然是明顯的。在所有其后的實(shí)驗(yàn)中都是采用這種施藥的方法。
Ⅲ實(shí)驗(yàn)材料(1)腦心肌炎病毒EMCV批號(hào)No．095001
有效期1997年12月制備EMCV株系JH是在鼠L929細(xì)胞上按照Gresser I，Bourali C，Thomas MT，F(xiàn)alcoff E，感染腦心肌炎病毒鼠反復(fù)接種干擾素制劑的效果，Proc Soc Exp Biol Med 1968 Feb；127491-6中所述的方法進(jìn)行繁殖的。
特征本研究中使用的病毒貯存液在鼠L929細(xì)胞測(cè)得的滴度是5×108．62TCID50。
(2)弗蘭德紅白血病細(xì)胞弗蘭德紅白血球細(xì)胞(FLC)的抗干擾素-α／β-抗性克隆，3C18，是從Dr．E．Affabris，Rome得到的，并描述于Affabris等，1982年(病毒學(xué)，120441-452)。其后將這些細(xì)胞維持在體內(nèi)傳代。簡(jiǎn)而言之，用大約100倍半至死劑量的3C18通過腹膜注射接種鼠DBA／2，一周后從鼠腹膜收獲瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用100 LD50的3C18細(xì)胞接種另外的鼠。這一程序重復(fù)60至100次傳代。已經(jīng)表明用第60次至100次傳代的3C18細(xì)胞對(duì)肝和脾有高的轉(zhuǎn)移性(Gresser等，Int．J．Cancer，1987 39789-792)。常規(guī)地用體內(nèi)傳代的細(xì)胞在體外在干擾素-α／β存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，證實(shí)了IFN抗性的表型(Belardelli等，Int．J．Cancer，1982 30813-820)。
Ⅳ．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本發(fā)明使用的鼠得自特別無病原的品系(IFFA CREDO，法國(guó))。按照EEC標(biāo)準(zhǔn)，將它們飼養(yǎng)在法國(guó)國(guó)家研究院(CNRS)Federatif研究所無病原菌的動(dòng)物房中。
實(shí)施例1IL-2和IL-12對(duì)致死劑量的腦心肌炎病毒的(EMCV)接種的小樹的作用用100倍半致死劑量的腦心肌炎病毒(EMCV)感染十組六周齡的瑞士雄鼠。病毒感染一小時(shí)后，對(duì)這些鼠或者不予治療，或者通過鼻／口的途徑用10μl的Ferimmune賦形劑中的重組鼠IL-2或重組鼠IL-12，或單獨(dú)用10μl賦形劑(對(duì)照)，或用200μl的賦形劑腹內(nèi)膜注射，或單獨(dú)用200μl賦形劑進(jìn)行治療，每日一次，共四天。
通過鼻／口的途徑每天用2μg重組鼠IL-2治療成年鼠共4天結(jié)果增加了用EMCV致死劑量注射的動(dòng)物存活的百分?jǐn)?shù)。高達(dá)40％被治療的動(dòng)物在用致死劑量的EMCV感染100天后仍然存活，在所有未經(jīng)治療的或者用賦形劑治療的狀況下，病毒感染的動(dòng)物在第6天死亡。
通過鼻／口途徑用重組鼠IL-2治療的成年小鼠從感染致死劑量的EMCV存活的百分比顯著提高。從致死劑量的EMCB存活的動(dòng)物的百分比的提高依賴于通過鼻／口途徑施用的IL-2的劑量。因而，通過鼻／口途徑用1微升的重組鼠IL-2治療成年小鼠，每天一次，共4天，得到的動(dòng)物的存活率為60％。IL-2治療的動(dòng)物在用致死劑量的EMCV感染100天后仍然存活和健康，而沒有治療的，或賦形劑治療的病毒感染的動(dòng)物在第6天死亡。相比之下，通過鼻／口途徑每天用0．1微克的重組鼠IL-2治療成年鼠，共4天，并沒有明顯地提高致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物的存活率。
通過鼻／口途徑每天用0．1或1μg的重組鼠IL-2進(jìn)行治療的動(dòng)物沒有表現(xiàn)可檢測(cè)到的任何毒性的征兆。然而，通過鼻／口途徑用3μg重組IL-2高劑量治療動(dòng)物，觀察到急毒性征兆，表現(xiàn)為戰(zhàn)栗、嗜睡、豎毛。
通過鼻／口途徑用重組鼠的IL-12治療成年瑞士鼠也發(fā)現(xiàn)能夠提高用致死劑量的EMCV感染動(dòng)物的存活百分率，盡管與相同劑量的重組IL-2相比程度較低。這樣，通過鼻／口途徑每天用2μg重組鼠IL-2治療成年瑞士鼠，共4天，結(jié)果用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物在100天時(shí)的存活率為大約20％。
臨床觀察表明，所有的在100天時(shí)存活的用IL-2和IL-12治療的動(dòng)物將仍然存活。
類似地，通過腹內(nèi)膜途徑用重組鼠IL-2治療成年鼠，結(jié)果用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物存活的百分?jǐn)?shù)的提高取決施藥劑量。這樣通過腹內(nèi)膜途徑每天用0．1μg重組鼠IL-2共4天治療動(dòng)物并沒有明顯提高病毒感染的動(dòng)物的存活率，而通過腹內(nèi)膜途徑每天用1μg或3μg的重組鼠IL-2共4天治療鼠，導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物分別有40％和70％存活。
本文中給出的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口粘膜途徑提供了一種以高劑量的IL-2并具有可接受的毒性的施藥方法。這樣，通過鼻／口途徑每日用0．1或1μg的重組鼠的IL-2對(duì)動(dòng)物治療4天沒有表現(xiàn)出任何可檢測(cè)的毒性征兆。根據(jù)體重(成年鼠0．025公斤，成人體重60公斤)，這分別相當(dāng)于大約0．24mg和2．4mg對(duì)于人的劑量，或者相當(dāng)于通過胃腸外途徑施用IL-2的最高耐受量的24和240倍(Huland等，1994，J．Cancer Res．，Clin．Oncol．，120，22l-228)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口粘膜途徑提供了一種沒有明顯毒性的施用IL-2和IL-12的有效方法。這些結(jié)果對(duì)臨床使用IL-2和IL-12作為抗毒劑有重要的指導(dǎo)作用。
實(shí)施例2IL-2和IL-12對(duì)用高轉(zhuǎn)移性的弗蘭德白血病細(xì)胞接種的小鼠的作用將十組6周齡的DBA／2小鼠在第0天用大約等于20000倍半致死劑量的105弗蘭德白血病細(xì)胞(抗干擾素克隆3C18)通過靜脈內(nèi)接種。將接種瘤的鼠或者不予以治療，或者通過鼻／口途徑用10μl Ferimmune賦形劑中的重組鼠IL-2或重組鼠IL-12或僅用10μl的賦形劑(對(duì)照)每天治療二次，共20天。
通過鼻／口途徑用2μg的重組鼠IL-2，每天二次治療成年鼠共治療二十天，結(jié)果導(dǎo)致用大約20000倍半致死劑量的弗蘭德白血病細(xì)胞接種的動(dòng)物存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。盡管不用IL-2治療，接種腫瘤的動(dòng)物可存活32天以上，但通過鼻／口途徑用2μg的重組鼠IL-2，每天二次治療成年鼠DBA／2共治療二十天，其存活時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)于沒任何治療或賦形劑治療的接種腫瘤的動(dòng)物(平均天數(shù)，13．8±0．13天)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性(治療過的死亡平均天數(shù)，22．6±2．08天)。
通過鼻／口途徑用重組鼠IL-12治療成年DBA／2鼠也發(fā)現(xiàn)用致死劑量的弗蘭德白血病細(xì)胞接種動(dòng)物的存活時(shí)間延長(zhǎng)，盡管比用相同量的IL-2存活程度較低。盡管不用IL-12治療，腫瘤接種動(dòng)物的存活時(shí)間可超過20天，通過鼻／口途徑用2μg的重組鼠IL-12，每天施藥二次共施藥20天治療成年鼠DBA／2，與未經(jīng)治療的或用賦形劑治療的接種腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物(平均死亡天數(shù)，13．8±0．13天)相比，存活時(shí)間的延長(zhǎng)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性(平均死亡大數(shù)，15．9±0．56天)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組鼠的IL-2對(duì)用高度轉(zhuǎn)移性的弗蘭德白血病細(xì)胞接種的鼠在通過鼻／口途徑施藥后有明顯抗腫瘤活性。這些結(jié)果值得引人注目的是，按照以前的報(bào)道，全身性施用的重組IL-2對(duì)提高通過靜脈內(nèi)接種弗蘭德白血病細(xì)胞的小鼠的存活時(shí)間沒有任何效果(Belardelli等、1989，Int．J．Cancer，441108-116)。這些結(jié)果也表明口粘膜途徑提供了有效的無明顯毒性的施藥IL-2的方法。
實(shí)施例3IL-2和IFN的組合對(duì)用致死劑量的EMCV接種的小鼠的效果將十組，六周齡雄性瑞士鼠用100倍EMCV的半致死劑量接種。病毒感染一小時(shí)后，將這些小鼠或者不進(jìn)行治療，或者通過鼻／口或腹膜內(nèi)途徑施用賦形劑FerimmuneTM中的1．0μg的重組鼠IL-2，103IU的鼠干擾素α／β，或相同劑量的重組鼠IL-2和鼠干擾素α／β，或用單獨(dú)的等體積的賦形劑(對(duì)照)治療4天，每天一次。或者，用相同劑量的重組鼠IL-2，鼠干擾素α／β，或重組鼠IL-2和鼠干擾素α／β通過腹膜內(nèi)注射治療小鼠。
為了測(cè)定重組鼠的IL-2與鼠的干擾素α／β在一起施用是否產(chǎn)生附加的或甚至是協(xié)同的抗病毒效果，先通過鼻內(nèi)／口途徑用重組鼠IL-2進(jìn)行治療，30分鐘后用干擾素α／β進(jìn)行治療。通過鼻／口途徑用重組鼠IL-2與鼠干擾素α／β通過鼻／口途徑一起施用提高了致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物的存活百分?jǐn)?shù)。因而，通過鼻／口途徑用1μg的重組鼠IL-2接著用103IU的鼠干擾素α／β對(duì)成年鼠進(jìn)行一天一次，共計(jì)4天的治療導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物有80％的存活率。
通過腹內(nèi)膜途徑使用1．0μg的重組鼠IL-2，30分鐘后用103IU的干擾素α／β治療成年鼠導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物有80％的存活。
通過鼻內(nèi)／口的途徑或腹內(nèi)膜的途徑用1μg的重組鼠IL-2，1000IU的干擾素α／β，或者重組鼠IL-2和干擾素α／β兩者結(jié)合，治療四天，每天一次，動(dòng)物沒有表現(xiàn)出任何可檢出的中毒的征兆。
實(shí)施例4Th1和Th2細(xì)胞因子對(duì)用致死劑量的EMCV接種的小鼠的效果將10組，6周齡的瑞士雄鼠用100倍致死劑量的EMCV進(jìn)行感染。病毒感染后，將鼠或者不予治療，或者通過鼻內(nèi)的／口途徑用在體積為10μl的Freimmune賦形劑中的鼠IFNα／β，重組鼠IL-2，IL-4，IL-10，IL-12，或IL-15或單獨(dú)用10μl的賦形劑作對(duì)照每天治療一次，共計(jì)4天。
成年鼠通過鼻／口的途徑用鼠干擾素α／β進(jìn)行治療導(dǎo)致用EMCV致死劑量感染的動(dòng)物存活的百分?jǐn)?shù)明顯提高。用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物用1000IU的鼠干擾素α／β治療后，其中的百分之五十在86天時(shí)仍然存活，在所有沒有接受治療或者用賦形劑治療的情況下，感染病毒的動(dòng)物七天死亡。通過鼻／口途徑每天用1μl的重組鼠的IL-2對(duì)成年鼠治療4天導(dǎo)致致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物的存活率明顯提高。病毒感染后86天，用重組鼠IL-2通過鼻／口途徑治療的結(jié)果是30％的動(dòng)物仍然存活。同樣，通過鼻／口途徑用1μg的重組鼠IL-15對(duì)成年鼠每天一次共計(jì)4天的治療導(dǎo)致致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物有30％的存活率。用1μg的重組鼠GM-CSF通過鼻／口途徑對(duì)成年鼠治療4天每天一次導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物也有20％的存活率。
通過鼻／口途徑用重組鼠IL-12治療成年的瑞士鼠也被發(fā)現(xiàn)提高了用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物的存活率，盡管比施用相同量的IL-2或IL-15存活程度較低。用1μg的重組鼠IL-12通過鼻／口途徑每天一次通過鼻口內(nèi)的／口的途徑對(duì)成年鼠治療4天導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物大約有20％的存活率。
臨床觀察表明，所有干擾素治療的，IL-2，IL-12和IL-15治療的和GM-CSF治療的在86天存活的動(dòng)物將繼續(xù)存活，并具有正常的壽命。
相反，用1μg重組鼠IL-4或IL-10通過鼻／口途徑每天一次對(duì)動(dòng)物治療4天沒有使用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物的存活率顯著提高。所有的IL-4和IL-10治療的鼠在病毒感染后8天死亡，也就是說在病毒感染動(dòng)物未經(jīng)治療或用賦形治療的24小時(shí)內(nèi)。
實(shí)施例5Th1和Th2細(xì)胞因子對(duì)用致死劑量的EMCV接種的動(dòng)物的效果將10組，6周齡瑞士鼠用100倍LD50的EMCV進(jìn)行感染。病毒感染后，將鼠或者不予治療，或者通過鼻／口途徑用體積為10μl的Ferimmune賦形劑中的鼠IFNα／β，重組鼠IL-5，IL-13，或IL-18，或單獨(dú)用10μl的賦形劑作為對(duì)照，每天治療一次，共計(jì)4天。
成年鼠通過鼻／口途徑用鼠干擾素α／β進(jìn)行治療導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物存活率明顯提高。在致死劑量的EMCV感染后52天，用1000IU的鼠干擾素α／β治療的動(dòng)物百分之五十仍然存活，在所有沒有接受治療或者用賦形劑治療的情況下，感染病毒的動(dòng)物在第六天死亡。通過鼻／口途徑每天用1μg的重組鼠IL-18對(duì)成年鼠治療4天導(dǎo)致用致死劑量的EMCV感染的動(dòng)物存活率也產(chǎn)生明顯的提高。病毒感染后52天，通過鼻／口途徑用重組鼠IL-18治療的動(dòng)物，其中20％存活。
臨床觀察表明，所有的在第52天存活的用干擾素和IL-18治療的動(dòng)物將仍然存活，并具有正常的壽命。
相反，通過鼻／口途徑用1μg的重組鼠IL-5，或IL-13治療4天每天施藥一次，導(dǎo)致EMCV的致死劑量感染的動(dòng)物的存活率沒有明顯提高。所有用IL-5和IL-13治療的鼠在病毒感染后低9天死亡，即在病毒感染的動(dòng)物未經(jīng)治療或用賦形劑治療的72小時(shí)內(nèi)。
通過鼻／口途徑，用1000IU的IFNα／β或1μg的重組鼠IL-5，IL-13或IL-18每天一次治療4天，沒有一個(gè)動(dòng)物表現(xiàn)出可檢測(cè)到的中毒征兆，表明口腔粘膜途徑提供了一種有效的沒有明顯毒性的施用細(xì)胞因子的方法。
IL-4和IL-10，兩者都是Th2反應(yīng)的有效刺激子，在通過鼻／口途徑施用后發(fā)現(xiàn)它們?nèi)狈共《镜幕钚?，表明在口腔粘膜施用后在誘導(dǎo)Th1的活性和誘導(dǎo)抗病毒活性之間存在密切的聯(lián)系。
實(shí)施例6IFN對(duì)用豚草花粉致敏的鼠的效果本研究中所使用的干擾素α／β制劑(批號(hào)RT6)用泡狀口炎病毒(Vesicular Stomatitis virus，VSV)接種的鼠L929細(xì)胞測(cè)得的滴度是1×107IU／ml，比活是5×107IU／mg蛋白。(Tovey等，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．，1974，146406-415)施藥前將鼠IFNα／β溶在牛血清白蛋白／磷酸鹽緩沖液賦形劑(BSA／PBS)中。
將四組，八周齡瑞士或Balb／c雄鼠用200μg非脫脂無熱原豚草花粉變應(yīng)原(Greer Laboratories，Lenoir,USA)以明礬(Imject Alum，PierceLaboratories)為輔劑在第0天和第4天通過腹膜內(nèi)注射進(jìn)行免疫。然后，在第11天通過氣管內(nèi)途徑用CoCa氏緩沖液(0．085M NaCl，0．064MNaHCO3，pH8．1)中的200μg的豚草變應(yīng)原將小鼠致敏。用1000IU在10μl模擬干擾素中的鼠IFNα／β，或單獨(dú)地用10μl模擬干擾素(Tovey等，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．，1974，146406-415)通過口腔粘膜途徑從0到第6天每天一次進(jìn)行試驗(yàn)組動(dòng)物的治療。另外的組用200μl的模擬干擾素中的103IU的鼠IFNα／β或單獨(dú)的200μl模擬干擾素(對(duì)照)通過腹膜內(nèi)的方式從0始至第六天每天一次進(jìn)行治療。也用10μl或200μl模擬干擾素中的1000IU鼠IFNα／β，或單純用10μl或200μl模擬干擾素(對(duì)照)分別通過口粘膜或腹內(nèi)膜途徑治療試驗(yàn)組動(dòng)物，在第11天治療2次，第12天治療一次。將其它一些組的試驗(yàn)動(dòng)物在第0天至第六天和第11天至第12天進(jìn)行上述治療。在第十四天將所有的試驗(yàn)動(dòng)物殺死，并收集外周血樣和支氣管肺泡(BAL)的洗滌樣。
將外周血樣收集在含有EDTA(B．D．，產(chǎn)品號(hào)No．367624)的真空管中，在4℃，800xg離心10分鐘，收集血清，用酶連免疫吸附測(cè)定(ELISA)分析豚草花粉特異抗體IgG或IgE的存在。
總而言之，用PBS按1∶100預(yù)稀釋血清樣品，再用0．1M NaHCO3pH8．5在豚草花粉(20μg／ml)包被的微孔滴度板(Maxisorb，Nunc)中進(jìn)行系列稀釋。用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG或生物素結(jié)合的大鼠單克隆抗小鼠IgE抗體，接著用堿性磷酸酶結(jié)合的鏈霉抗生素分別地檢測(cè)豚草特異性IgG或IgE。用平行的樣品測(cè)定平均光吸收(405nm)。
在第0天和第4天通過腹膜內(nèi)注射用無熱源豚草花粉變應(yīng)原免疫8周齡Balb／c雄鼠，接著在11天通過氣管內(nèi)接種，在第14天測(cè)定，產(chǎn)生了高水平的IgG或IgE豚草花粉特異性抗體。
從0至6天和在第11天至12天，每天一次用1000IU的鼠IFNα／β通過口粘膜途徑對(duì)動(dòng)物治療，與用模擬干擾素治療的動(dòng)物相比，導(dǎo)致IgE變應(yīng)原特異抗體的產(chǎn)生出現(xiàn)了明顯地抑制作用。口粘膜干擾素治療盡管比抑制IgE應(yīng)答的程度較低但還是抑制了變應(yīng)原特異抗體IgG應(yīng)答。用1000IU的鼠IFNα／β通過口粘膜的途徑僅從0至6天或僅在11天至12天給動(dòng)物施藥，與合并施藥的結(jié)果相比，抗體產(chǎn)生的抑制作用不明顯。
用1000IU的鼠IFNα／β，從0至第6天和11-12天，或僅在11至12天通過口粘膜途徑每天一次對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，與用1000IU的鼠IFNα／β通過動(dòng)物腹內(nèi)膜注射相比，導(dǎo)致對(duì)IgE變應(yīng)原特異性的抗體形成產(chǎn)生了較大的抑制作用。
用1000IU的鼠IFN α／β，從0至第6天加上第11至第12天，每天一次通過口粘膜途徑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，與用模擬干擾素治療的動(dòng)物相比，導(dǎo)致存在于外周血的嗜曙紅細(xì)胞的數(shù)目產(chǎn)生了三倍的抑制。用1000IU的鼠IFNα／β通過口粘膜的途徑進(jìn)行動(dòng)物治療與用1000IU的鼠IFNα／β腹膜內(nèi)注射動(dòng)物相比，導(dǎo)致嗜署紅細(xì)胞的數(shù)目產(chǎn)生了二倍以上的顯著抑制。用1000IU鼠IFNα／β僅在第11和第12天通過口粘膜或腹膜內(nèi)途徑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，結(jié)果沒有對(duì)存在于外周血中循環(huán)的嗜曙紅細(xì)胞的數(shù)目產(chǎn)生任何可檢到的抑制作用，而且在口粘膜干擾素治療的情況下相對(duì)于用模擬干擾素治療，其嗜曙紅細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)甚至略有增加。
口粘膜的IFNα治療對(duì)變應(yīng)原特異性IgE應(yīng)答，和變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞量，與以前報(bào)導(dǎo)的在相同的變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘動(dòng)物模型中用IL-12測(cè)試相比好像是不太明顯(Sur等，J．Immunol，1996，157，4173-4180)。對(duì)于較高劑量的IFN可能會(huì)觀察到比本文描述的使用相對(duì)低的單一的1000IU劑量具有較大的效果，按體重的比例比Sur等使用的IL-12低200倍(J-Immunol．，1996，1 57，4173-4180)。當(dāng)在過敏階段的早期進(jìn)行治療時(shí)，盡管IL-12是變應(yīng)原誘導(dǎo)的特應(yīng)性哮喘的動(dòng)物模型中被測(cè)定為最有效的細(xì)胞因子之一，但是，在肺部超敏炎癥響應(yīng)的疾病發(fā)展的后期進(jìn)行治療，IL-12在降低變應(yīng)原特異性IgE反應(yīng)中總體上是無效的。相反，口粘膜干擾素α治療，即使在疾病的發(fā)展后期開始治療，在降低變應(yīng)原特異性IgE應(yīng)答中它也是有效的。還有，腎癌患者臨床使用IL-12具有很大的毒性(Cohen，J．，Science，1995，270，908)。
本研究的結(jié)果表明用普通的人的豚草花粉變應(yīng)原致敏的動(dòng)物中，通過口粘膜的IFNα治療明顯地降低了變應(yīng)原特異性IgE應(yīng)答和變應(yīng)原誘導(dǎo)的嗜曙紅細(xì)胞量?？谡衬さ腎FN治療特應(yīng)性哮喘的效果表明口粘膜IFNα治療可以在哮喘病的治療上得到應(yīng)用，盡管由鼠的模型外推到臨床環(huán)境，甚至當(dāng)使用普通的人的變應(yīng)原時(shí)還是應(yīng)當(dāng)持慎重態(tài)度。
Th1特異性細(xì)胞因子在口粘膜途徑施藥后的表現(xiàn)表明口腔粘膜施用細(xì)胞因子可被用于誘導(dǎo)全身性Th1活性，已知它在防御病毒感染和腫瘤疾病中其著重要的作用。
口腔粘膜施用生物活性的但具有較差的耐受性的Th1細(xì)胞因子對(duì)于治療病毒和腫瘤疾病是相當(dāng)重要的?？谇徽衬な┯肨h1細(xì)胞因子也可用于治療諸如哮喘和適應(yīng)性皮炎的疾病?？谇徽衬な┯肨h2細(xì)胞因子已顯示出在治療對(duì)口腔粘膜Th1細(xì)胞因子應(yīng)答的癌癥和病毒疾病中是無效的。這一結(jié)果與已知的Th1和Th2在宿主防御機(jī)制中的作用相一致。對(duì)Th2細(xì)胞因子應(yīng)答的疾病是那些具有Th1過刺激的特征的疾病，例如，自身免疫疾病類。口腔粘膜施用Th2細(xì)胞因子可應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，Ⅰ型糖尿病，狼瘡，多發(fā)性硬化癥和牛皮癬。
權(quán)利要求
1．Th1刺激細(xì)胞因子，不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素，或Th2刺激細(xì)胞因子，不包括與一種抗炎藥物組合的白細(xì)胞介素-4，在制備用于通過口腔粘膜接觸刺激宿主防御機(jī)制的藥物中的應(yīng)用，所說的藥物不包括膠原蛋白。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中Th1剌激細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死因子β，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；或者其中，Th2刺激細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10和白細(xì)胞介素-13。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，在于刺激哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中該藥物包含有效量的從每公斤體重約0．01μg至約150μg的細(xì)胞因子。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
7．根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
8．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Th1刺激細(xì)胞因子的應(yīng)用。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中該藥物包含有效量的從每公斤體重約0．01μg至約150μg的細(xì)胞因子。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
12．根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
13．不包括干擾素的Th1刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物的腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
15．不包括干擾素的Th1刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物病毒感染的藥物中的應(yīng)用，所說的藥物不包括膠原。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
17．不包括干擾素的Th1刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物過敏疾病的藥物中的應(yīng)用。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
19．不包括干擾素的Th1刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物哮喘的藥物中的應(yīng)用。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
21．Th1刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物特應(yīng)性皮炎的藥物中的應(yīng)用。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子選自干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
23．Th2刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸刺激宿主防御機(jī)制的藥物中的應(yīng)用。
24．Th2刺激細(xì)胞因子在制備用于通過口腔粘膜接觸刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
25．根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的應(yīng)用，其中該藥物包含有效量的從每公斤體重約0．01μg至約150μg的細(xì)胞因子。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
27．根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
28．根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
29．不包括白細(xì)胞介素-4的Th2刺激細(xì)胞因子與抗炎藥物組合在制備用于通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物自體免疫疾病的藥物中的應(yīng)用。
30．根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-4(排除和抗炎藥物結(jié)合的)，白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10，和白細(xì)胞介素-13。
31．根據(jù)權(quán)利要求1-30的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞因子包含重組的細(xì)胞因子。
32．一種用于口腔粘膜刺激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的藥物組合物，它包含不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子，或不包括與一種抗炎藥物組合的白細(xì)胞介素-4的TH2刺激細(xì)胞因子，和至少一種藥物上能接受的用于口腔粘膜投送的賦形劑，所說的組合物不包括膠原蛋白。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述藥物組合物，包含TH1剌激細(xì)胞因子，它選自白細(xì)胞介素-2，自細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因了(GM-CSF)；或TH2剌激細(xì)胞因子，它選自由細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10，和白細(xì)胞介素-13。
34．根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的藥物組合物，它是適于口腔粘膜施用的單位劑量形式，包含約0．01μg-約10000μg的TH1或TH2刺激細(xì)胞因子和藥學(xué)上可接受的載體。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的藥物組合物，包含約10μg至約10000μg的細(xì)胞因子。
36．根據(jù)權(quán)利要求32至35中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，包含一種TH1剌激細(xì)胞因子。
37．根據(jù)權(quán)利要求32至35中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，包含一種TH2剌激細(xì)胞因子。
38．一種用于刺激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的方法，包含通過口腔粘膜接觸對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素的TH1剌激細(xì)胞因子組合物，或有效量的不包括與一種抗炎藥物組合的白細(xì)胞介素-4的TH2刺激細(xì)胞因子組合物，所說的組合物不包括膠原蛋白。
39．一種用于刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包含通過口腔粘膜接觸對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子組合物，或有效量的不包括與一種抗炎藥物組合的白細(xì)胞介素-4的TH2刺激細(xì)胞因子組合物。
40．按照權(quán)利要求38或39所述的方法，其中，TH1刺激細(xì)胞因子選白白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或其中TH2刺激細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10，白細(xì)胞介素-13。
41．根據(jù)權(quán)利要求38至40的任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞因子的有效量為每公斤體重約0．01μg至約150μg的細(xì)胞因子。
42．根據(jù)權(quán)利要求38至41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
43．根據(jù)權(quán)利要求38至41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
44．根據(jù)權(quán)利要求38至41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
45．一種用于通過口腔粘膜接觸刺激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的方法，包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子。
46．一種用于通過口腔粘膜接觸刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括重組鼠白細(xì)胞介素-12和干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子。
47．根據(jù)權(quán)利要求45或46的方法，其中，細(xì)胞因子的有效量按每公斤體重計(jì)為約0．01μg-約150μg細(xì)胞因子。
48．根據(jù)權(quán)利要求45至47中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
49．根據(jù)權(quán)利要求45至47中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
50．根據(jù)權(quán)利要求45至47中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
51．一種通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物腫瘤病的方法，包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子。
52．根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中，細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
53．一種通過口腔粘膜接觸治療病毒感染的方法，該方法包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括干擾素的TH1刺激細(xì)胞因子。
54．根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中，細(xì)胞因子包含白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
55．一種通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物過敏紊亂的方法，該方法包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括干擾素的TH1剌激細(xì)胞因子。
56．一種按照權(quán)利要求55的方法，其中，細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
57．一種通過口腔粘膜接觸治療哮喘的方法，該方法包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括干擾素的TH1剌激細(xì)胞因子。
58．按照權(quán)利要求57的方法，其中，細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
59．一種通過口腔粘膜接觸治療特應(yīng)性皮炎的方法，該方法包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的TH1剌激細(xì)胞因子。
60．一種按照權(quán)利要求59的方法，其中，細(xì)胞因子選自干擾素-α，干擾素-β，干擾素-ω，干擾素-γ，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，白細(xì)胞介素-18，腫瘤壞死細(xì)胞因子β和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
61．一種通過口腔粘膜接觸剌激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的方法，包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的TH2剌激細(xì)胞因子。
62．一種通過口腔粘膜的接觸刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的TH2刺激細(xì)胞因子。
63．根據(jù)權(quán)利要求61或62的方法，其中，細(xì)胞因子的有效量按每公斤體重計(jì)為約0．01μg至約150μg細(xì)胞因子。
64．根據(jù)權(quán)利要求61至63中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子有效量是以一個(gè)單一劑量施用的。
65．根據(jù)權(quán)利要求61至63中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)以多個(gè)小劑量的形式施用的。
66．根據(jù)權(quán)利要求61至63中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞因子的有效量是在一段足以引發(fā)與單一劑量產(chǎn)生的刺激相當(dāng)?shù)拇碳さ臅r(shí)間內(nèi)連續(xù)施用的。
67．一種通過口腔粘膜接觸治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的方法，該方法包含對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的不包括與一種抗炎藥物組合的白細(xì)胞介素-4的TH2刺激細(xì)胞因子。
68．一種按照權(quán)利要求67的方法，其中，細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素-4(排除和抗炎藥物結(jié)合的)，白細(xì)胞介素-5，白細(xì)胞介素-10，和白細(xì)胞介素-13。
69．根據(jù)權(quán)利要求38至68的任一項(xiàng)要求的方法，其中，細(xì)胞因子包含一種重組細(xì)胞因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于口腔粘膜接觸刺激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的藥物組合物,它含有有效量的Th1或Th2刺激細(xì)胞因子,和用這種組合物進(jìn)行治療的方法。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1281368SQ98812023
公開日2001年1月24日 申請(qǐng)日期1998年10月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月10日
發(fā)明者麥克爾·杰拉得·特維 申請(qǐng)人:太平洋制藥有限公司