專利名稱：Foxp3及調節(jié)性ｔ細胞的調節(jié)因子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物和生物醫(yī)藥領域。更具體而言，本發(fā)明涉及泛素化途徑相關因子、其激動劑或拮抗劑在調節(jié)？(《 3活性、11^2活性和/或0^-^活性中的用途。本發(fā)明尤其涉及調節(jié)F0XP3活性的負調節(jié)因子、及其通過下調F0XP3活性對免疫系統(tǒng)進行調節(jié)， 從而治療或預防與F0XP3活性過高相關的疾病或癥狀的用途以及作為免疫佐劑的用途。
背景技術：
Fox轉錄因子家族是一個以具有叉頭螺旋結構(forkhead/winged helix,FKH)為特征，功能各異的轉錄因子大家族。這個家族成員在細胞發(fā)育的各個進程中起著不同的作用(參考文獻1和2)。F0XP3是調節(jié)性T細胞(Treg，regulatory T cells)特異性轉錄因子，對iTreg的發(fā)育和功能起著重要的調節(jié)作用，具有下調免疫應答的功能。F0XP3介導的Treg的免疫調節(jié)功能是通過F0XP3與若干轉錄共調節(jié)蛋白(例如轉錄因子、共抑制因子、共激活因子、組蛋白以及染色質重建因子)形成蛋白復合體以動態(tài)調控基因的特異性轉錄(參考文獻3和 4)。在不同刺激條件下，F(xiàn)0XP3蛋白復合體的不同狀態(tài)及其轉錄活性對Treg及免疫系統(tǒng)調節(jié)都有不同的效果(參考文獻3和4)。F0XP3+調節(jié)性T細胞(F0XP3+Tregs)屬于T淋巴細胞中表達⑶4、⑶25及轉錄因子F0XP3的一類T細胞亞型，其正常功能對于人體免疫穩(wěn)態(tài)的動態(tài)調節(jié)必不可少。調節(jié)性 T細胞的發(fā)育及功能失調，與多種重大免疫相關性疾病，包括自身免疫性疾病、炎癥反應、急性及慢性傳染性疾病、腫瘤免疫耐受、移植排斥以及過敏性疾病的生理病變進程密切相關 (參考文獻1和參考文獻2)。盡管本研究領域近年來進展很快，但許多重大及根本性的問題仍然尚待回答，例如在細胞水平上調節(jié)性τ細胞如何調節(jié)其它免疫細胞活性，以及在分子水平上F0XP3采用何種機制使得調節(jié)性T細胞獲得免疫抑制活性。不斷積累的實驗證據(jù)顯示，F(xiàn)0XP3基因表達的水平及持續(xù)狀態(tài)對于天然調節(jié)性T 細胞的發(fā)育成熟及功能至關重要。此外，F(xiàn)0XP3結合多重轉錄因子以及具有酶學活性的組蛋白乙酰轉移酶/脫乙?；笍秃象w，這對于抑制T細胞中促炎癥類細胞因子的轉錄激活是必需的。并且，F(xiàn)0XP3蛋白翻譯后修飾、轉錄復合體裝配及其修飾酶類的活性受到T細胞受體及炎癥細胞因子受體信號的動態(tài)調節(jié)。先前的研究發(fā)現(xiàn)F0XP3是一個賴氨酸乙?；鞍?，并且F0XP3富含脯氨酸的N端可以直接招募組氨酸乙酰轉移酶TIP60(Tat interaction protein，60kDa)，從而介導F0XP3的轉錄抑制活性(參見參考文獻6以及圖1)。IL-2是一種淋巴細胞因子，通常由凝集素或抗原激活的T淋巴細胞產(chǎn)生。可使細胞毒性T細胞，自然殺傷細胞和淋巴因子活化的殺傷細胞增殖，并使其殺傷活性增強，還可以促進淋巴細胞分泌抗體和干擾素，具有抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用。人重組IL-2在腫瘤、炎癥反應、急性傳染性疾病或慢性傳染性疾病中已有相應運用。INF-Y是水溶性二聚體的細胞因子，通常由自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞及細胞毒性T細胞產(chǎn)生。INF-Y是固有及適應性免疫系統(tǒng)中抗病原體及細菌感染的重要細胞因子，能直接抑制病毒體內(nèi)復制，具有抗病毒、免疫調節(jié)及抗腫瘤特性。INF-Y結合激活其受體調節(jié)JAK-STAT通路，激活抗原提呈細胞，通過上調轉錄因子T-bet而促進I型輔助T細胞(Thl細胞)的分化等功能；能誘導抗病毒蛋白合成，治療性病等病毒性疾病；能降低肝內(nèi)I、III型膠原mRNA水平，阻止和減慢肝纖維化的發(fā)生，表明對慢活肝及肝硬化有效。因此，深入研究調節(jié)性T細胞及轉錄因子F0XP3、以及IL-2和IFN- γ的生化活性、 生理功能及其調控的分子機理，對于治療性控制人體內(nèi)調節(jié)性T細胞的免疫活性以及基于調節(jié)性T細胞的免疫治療皆至關重要。這為將基礎免疫研究轉化為臨床研究，以及理解人類特有的重大傳染性疾病提供了新的研究命題與挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的之一是提供泛素化途徑相關因子及其激動劑或拮抗劑在調節(jié) 0乂 3活性、11^-2活性和/或0^-^活性中的用途。本發(fā)明的另一目的在于提供這些調節(jié)因子在調節(jié)？(《 3活性、11^-2活性和/或0^-^活性、從而調控免疫系統(tǒng)中的用途。本發(fā)明的另一目的還在于提供一種采用本發(fā)明所述調節(jié)因子治療調節(jié)性T細胞相關疾病的方法及應用。在本發(fā)明的第一方面中，提供了泛素化途徑相關因子、其激動劑或拮抗劑在制備調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物中的用途，其中所述泛素化途徑相關因子選自=Toll樣受體、泛素化連接酶、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，對F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的所述調節(jié)是正調節(jié)或負調節(jié)，其中，所述泛素化途徑相關因子或其激動劑用于負調節(jié)F0XP3活性和正調節(jié)IL-2活性和/或IFN- γ活性，所述泛素化途徑相關因子的拮抗劑用于正調節(jié) F0XP3活性和負調節(jié)IL-2活性和/或IFN- γ活性。在一個優(yōu)選例中，所述激動劑為IL-6。在另一個優(yōu)選例中，所述拮抗劑為MG-132。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述促炎癥細胞因子家族受體選自IL_6R、TGFii 受體、IL-2受體、TNF- α受體或GITR。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述用途是泛素化途徑相關因子在制備負調節(jié) F0XP3活性的組合物中的用途，其中所述泛素化途徑相關因子選自Toll樣受體、泛素化連接酶和/或它們的編碼序列。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述泛素化連接酶是選自下組中的一種或多種 STUBl、TRAF6、Smurf U Smurf2, TRAF2、TRAF3、TRAF4、p300、RNF31 或 RBCKl0在一個優(yōu)選例中，所述泛素化連接酶優(yōu)選為STUBl。在另一個優(yōu)選例中，所述泛素化連接酶是復合體，其還兼具分子伴侶活性。在另一個優(yōu)選例中，所述泛素鏈接酶為Toll樣受體信號通路激活下游蛋白，優(yōu)選 TRAF6。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述Toll樣受體是選自下組中的一種或多種 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8 或 TLR9。
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在一個優(yōu)選例中，所述iToll樣受體選自TLR3、TLR7、TLR8或TLR9。在另一個優(yōu)選例中，所述Toll樣受體信號通路下游激酶IRAKI可促進F0XP3泛素化。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物用于治療和/或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述活性失調是活性過高或活性過低。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀選自腫瘤、炎癥反應、急性傳染性疾病或慢性傳染性疾病。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述腫瘤選自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質瘤、 腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、橫紋肌癌、舌鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盤絨毛癌、神經(jīng)膠質瘤、淋巴瘤、白血病、直腸腺癌或黑色素瘤。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述炎癥反應選自過敏性炎癥、毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、肝炎、腎炎、痤瘡、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、 超敏反應、炎性腸道疾病、盆腔炎、再灌注損傷、類風濕關節(jié)炎、移植排斥反應、血管炎或間質性膀胱炎。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述傳染性疾病選自鼠疫、霍亂、傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、手足口病、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結膜炎、麻風病、 流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、或真菌感染。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述調節(jié)F0XP3、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物進一步用作疫苗佐劑或疫苗。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述疫苗選自治療或預防病毒感染、細菌感染、 炎癥、寄生蟲感染或腫瘤的疫苗，例如手足口病疫苗。在一個優(yōu)選例中，所述疫苗選自破傷風疫苗、白喉、破傷風、百日咳疫苗、流感疫苗、黃熱病疫苗、脊髓灰質炎疫苗、結核疫苗、麻疹疫苗、風疹疫苗、甲型腦膜炎疫苗、狂犬病疫苗、乙肝疫苗、麻疹、腮腺炎、風疹三聯(lián)疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、傷寒疫苗、甲肝疫苗、 宮頸癌疫苗、肺炎疫苗、水痘疫苗、流腦疫苗、乙腦疫苗、痢疾疫苗、霍亂疫苗、艾滋病疫苗、 丙肝疫苗，戊肝疫苗、手足口病疫苗、支氣管炎疫苗、A群流腦疫苗或人禽流行性感冒疫苗。在另一個優(yōu)選例中，所述疫苗是DNA疫苗、重組載體疫苗、滅活或減毒的基于病原體的疫苗、亞單位疫苗或癌細胞疫苗。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物是藥物組合物、保健品組合物或疫苗組合物。在一個優(yōu)選例中，所述組合物中調節(jié)因子的含量為0.05-99. 5重量％，優(yōu)選 0. 1-95重量％，更優(yōu)選1-90重量％，更優(yōu)選5-80重量％。在另一個優(yōu)選例中，所述組合物中還包含泛素化所需的分子伴侶，所述分子伴侶優(yōu)選為HSP70、HSC70 或 HSP90。在另一個優(yōu)選例中，所述組合物還包含藥學上、保健品學上或免疫學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述組合物是注射劑、片劑、顆粒劑、粉劑或膠囊。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種調節(jié)(如負調節(jié))F0XP3活性、IL-2活性和/ 或IFN-Y活性的組合物，其包含(a) 一種或多種選自下組的泛素化途徑相關因子泛素化連接酶、Toll樣受體、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列；和/或所述泛素化途徑相關因子的激動劑或拮抗劑；(b)藥學上、免疫學上或保健品學上可接受的載體。在一個優(yōu)選例中，所述組合物用于治療或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調(即活性過高或活性過低)相關的疾病或癥狀或用作疫苗佐劑。在另一個優(yōu)選例中，所述組合物進一步用于制備疫苗組合物，所述疫苗組合物中還包含具有免疫原性的活性物質。在一個優(yōu)選例中，所述組合物還包含一種或多種可調節(jié)F0XP3、IL-2和/或IFN- γ 的其它活性物質，優(yōu)選ΤΙΡ60。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述泛素化連接酶是選自下組中的一種或多種 STUBl、TRAF6、Smurf U Smurf2, TRAF2、TRAF3、TRAF4、p300、RNF31 或 RBCKl0在一個優(yōu)選例中，所述泛素化連接酶優(yōu)選為STUBl。在另一個優(yōu)選例中，所述泛素化連接酶是復合體，其還兼具分子伴侶活性。在另一個優(yōu)選例中，所述泛素鏈接酶為Toll樣受體信號通路激活下游蛋白，優(yōu)選 TRAF6。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述Toll樣受體是選自下組中的一種或多種 TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8 或 TLR9。在一個優(yōu)選例中，所述Toll樣受體選自TLR3或TLR9。在另一個優(yōu)選例中，所述Toll樣受體信號通路下游激酶IRAKI可促進F0XP3泛素化。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物用于治療和/或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述與活性失調相關的疾病或癥狀選自腫瘤、炎癥反應、急性傳染性疾病或慢性傳染性疾病。所述腫瘤、炎癥反應、急性傳染性疾病或慢性傳染性疾病可如上文所述。在另一個優(yōu)選例中，所述疫苗是DNA疫苗、重組載體疫苗、滅活或減毒的基于病原體的疫苗、亞單位疫苗或癌細胞疫苗。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物是藥物組合物、保健品組合物或疫苗組合物。在本發(fā)明的其它方面中，提供了一種調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的方法，所述方法包括給予選自下組的一種或多種調節(jié)因子或其激動劑或拮抗劑泛素化連接酶、Toll樣受體、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列。在一個優(yōu)選例中，所述泛素化連接酶是選自下組中的一種或多種STUB1、TRAF6、 Smurfl、Smurf2、TRAF2、TRAF3、TRAF4、p300、RNF31 或 RBCKl，優(yōu)選 STUBl。在另一個優(yōu)選例中，所述iTo 11樣受體是選自下組中的一種或多種TLR1、TLR2、TLR3、TLR9、TLR4、TLR5、TLR7 或TLR8，優(yōu)選TLR3或TLR9。在另一個優(yōu)選例中，所述促炎癥細胞因子家族受體是選自下組中的一種或多種IL-6R、TGF3受體、IL-2受體、TNF-α受體或GITR。在另一優(yōu)選例中，所述方法進一步用于治療或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN-γ 活性失調相關的疾病或癥狀。在另一優(yōu)選例中，所述方法進一步用于提高疫苗的免疫原性。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1 現(xiàn)有技術中已知的F0XP3抑制劑的應用模型。圖1㈧F0XP3抑制劑能夠抑制F0XP3功能復合體的蛋白(如Tip60)的結合，從而抑制Treg的功能；圖1 (B) :F0XP3抑制劑能夠作為疫苗佐劑，增強疫苗的免疫原性。圖2 :F0XP3轉錄活性模型。運用細胞水平螢光酶系統(tǒng)，通過檢測不同抑制劑下的螢光酶活性來反映抑制劑對F0XP3轉錄活性的影響。圖2(A)采用8ΧΠ(螢光素酶報告系統(tǒng)檢測F0XP3轉錄活性的模型；圖2(B)采用5XGal螢光素酶報告系統(tǒng)檢測F0XP3轉錄活性的模型。圖3 =TLR信號及其下游激活蛋白對F0XP3的影響。圖3 (A) =TLR信號對F0XP3表達量的影響。圖3⑶TLR信號下游激活蛋白TRAF6對F0XP3泛素化的影響。圖3 (C) =TLR信號下游激活蛋白IRAKI對F0XP3泛素化的影響。圖 4 :F0XP3 結合 STUBl 和其它 E3。圖4(A)左圖HA-F0XP3a和Myc-STUBl共轉入293T細胞，分別用HA和Myc抗體雙向免疫共沉淀，并用免疫印跡法進行檢測；右圖反向驗證試驗中，用Flag-F0XP3與 Myc-STUBl共轉染細胞，分別用Flag和Myc抗體雙向免疫共沉淀，并用免疫印跡法進行檢測。圖4 (B)其它免疫信號通路可通過將E3與Flag_F0XP3a，HA-Ubi共轉入細胞進行檢測。細胞裂解液用Flag抗體免疫沉淀，用Myc抗體檢測。圖5 =STUBl能夠導致F0XP3泛素化。圖 5(A) =Myc-STUBUHA-Ub 與 Flag_F0XP3a 或 Flag-FOXPl 共轉入 293T 細胞。細胞裂解液用HA抗體免疫沉淀，通過免疫印跡檢測泛素化的蛋白；圖5 (B) =Myc-STUBl, HA-Ub 和 Flag_F0XP3a 共轉入 Jurkat T 細胞，細胞裂解液用 HA抗體免疫沉淀并用免疫印跡檢測。圖6 STUBl促進F0XP3泛素化降解。圖6(A) :Flag-F0XP3a, HA-Ub 和 Myc-STUBl 共轉入 293T 細胞。細胞收樣前，用5 μ M MG132處理不同時間。裂解液用Myc抗體免疫沉淀并用免疫印跡檢測；圖6 (B) :Flag-F0XP3a, HA-Ub和Myc-STUBl及其突變體共轉入細胞。細胞用 5 μ M MG132處理4小時后，用HA抗體免疫沉淀并用免疫印跡檢測。圖7 STUBl抑制F0XP3轉錄活性。圖7(A)用8 XFK螢光素酶報告系統(tǒng)檢測F0XP3活性，將F0XP3、STUBU8XFK螢光素酶報告基因和MSV- β -Gal對照共轉入細胞，螢光素酶活性用β -Gal活性標準化后，取三次獨立實驗的結果用平均值士標準偏差表示；圖7(B)用pBind系統(tǒng)，將pBind_F0XP3、STUBl和pGal5_螢光素酶報告基因和 MSV- β -Gal對照共轉入細胞，螢光素酶活性用β -Gal活性標準化后，取三次獨立實驗的結果用平均值士標準偏差表示。圖7 (C)過表達HSP70及STUBl對F0XP3介導的IL-2啟動子驅動的螢光素酶報告基因表達水平的轉錄抑制作用。圖7 (D)采用慢病毒介導的轉染方法在原代⑶4+T細胞中表達全長F0XP3蛋白和 STUBl，研究STUBl是否能夠緩解F0XP3對IL-2表達的抑制作用。圖8 與STUBl相互作用的F0XP3關鍵區(qū)域鑒定(圖8 (A))、分子伴侶在相互作用中的作用(圖8(B)、8(C))及可能的機理(圖8(D))。圖9 =STUBl體外負調控F0XP3蛋白表達和小鼠原代Treg細胞功能的研究。過表達 STUBl降低細胞內(nèi)F0XP3的表達量(圖9(A))，同時提高炎癥因子IL_2(圖9(B))和IFN-γ 的表達(圖9(C))；細胞增殖實驗結果(圖9(D))，曲線1代表僅加入CD25-，曲線2代表 GFP+⑶25-，曲線3代表未活化⑶25-。圖10 實驗性結腸炎小鼠模型體內(nèi)Treg細胞中過表達STUBl能減弱Treg細胞的免疫抑制功能。圖11 通過^festern blotting實驗證明IL-6和TGF-beta的協(xié)同作用能夠促進 F0XP3的降解。圖11 (A) IL-6刺激下的F0XP3降解；圖11 (B) IL-6/TGF- β刺激下的F0XP3降解。圖12 通過FACS實驗證明TGF- β和IL-6刺激對IL-6受體表達水平的影響。圖 12(A) TGF-β刺激下的IL-6受體表達水平；圖12(B) TGF-β刺激下的IL-6受體表達水平。圖13 通過FACS實驗證明TGF- β和IL-6/TGF- β刺激對F0XP3表達水平的影響。 圖13(A) =TGF-β刺激下的F0XP3表達水平；圖13(B) :IL_6/TGF-0刺激下的F0XP3表達水平。以上圖中，IP是指免疫沉淀(immunoprecipitation)，IB是指免疫印跡 (immuno-blotting)。
具體實施例方式發(fā)明人認為F0XP3會受到一系列時間和空間上的調控，包括轉錄后修飾、翻譯或修飾以及蛋白相互作用等，其中有一類因子包括酶、小分子化合物等作為F0XP3的負調節(jié)因子，在不同的信號刺激下能夠下調F0XP3的活性，從而調控整個免疫系統(tǒng)。通過長期而深入的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了泛素化途徑相關因子可下調F0XP3活性，這些泛素化途徑相關因子為F0XP3負調節(jié)因子——Toll樣受體、泛素化連接酶、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列。具體而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在天然免疫信號作用下，比如不同的TLR信號(如TLR3和 TLR9)，會促使F0XP3蛋白降解，這說明存在F0XP3蛋白的負調節(jié)因子。并且，發(fā)明人通過進一步研究還發(fā)現(xiàn)另一重要的翻譯后修飾——泛素化，也存在于F0XP3蛋白中。經(jīng)過進一步研究，發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)了 TLR信號途徑與泛素化之間存在密切的聯(lián)系TLR信號下游泛素化鏈接酶如TRAF6，或蛋白激酶如IRAKI、以及多種細胞模式識別受體(如IL-6等)皆可以促進F0XP3蛋白的泛素化。泛素化修飾普遍發(fā)生于許多生理調節(jié)中，導致修飾底物蛋白的活性和功能的改變，并且泛素化降解也是蛋白降解中一個很主要的途徑，比如K48-多泛素化會導致蛋白通過蛋白酶體的降解。免疫信號通路中，有許多重要的泛素化連接酶(E3)，比如TLR通路中的 TRAF6、TGF- β 信號下的 Smurfl。發(fā)明人在對這些Ε3的逐一檢測中發(fā)現(xiàn)，Ε3能夠促使F0XP3的泛素化修飾。例如，受壓力信號激活的Ε3，STUBl (STIP1同源和U_box域包含蛋白，STlPlhomology and U-box containing protein 1)/CHIP (Hsc70 相互作用蛋白的 C 末端，C terminus of Hsc70-interacting protein)，能夠明顯的導致F0XP3的泛素化降解。STUBl能夠在分子伴侶的介導下結合F0XP3蛋白。K30A突變的STUBl不能和分子伴侶蛋白結合，也就無法結合F0XP3 ；而H260突變的STUBl失去了 E3的活性，仍能結合 F0XP3，但不能促進其泛素化修飾。發(fā)明人在F0XP3轉錄活性模型中發(fā)現(xiàn)，過量表達STUBl 能夠顯著降低F0XP3的轉錄活性?？梢姡诜g后修飾水平上，STUBl能作為F0XP3的一個負調節(jié)分子，通過分子伴侶的介導促使F0XP3的泛素化降解。并且，體內(nèi)外實驗均進一步證實了 STUBl可負調控F0XP3蛋白表達和小鼠原代 iTreg細胞的功能。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)STUBl的過表達還可提高炎癥因子IL-2和IFN- γ的表達，且可反轉F0XP3對IL2表達的抑制作用。由此，確定了泛素化途徑相關因子、其激動劑或拮抗劑還可用于調節(jié)IL-2活性和/或IFN- γ活性。基于上述研究，本發(fā)明人在本發(fā)明中提供了首次揭示了泛素化途徑相關因子——泛素化連接酶、Toll樣受體、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列及其激動劑或拮抗劑作為F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性調節(jié)因子的用途。這些調節(jié)因子的確定與應用，為通過調節(jié)F0XP3、IL-2和/或IFN- γ的活性來調控調節(jié)性T細胞， 治療和/或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀(例如腫瘤)提供了新途徑，同時也提供了利用這些調節(jié)因子作為疫苗佐劑，提高病毒感染的免疫原性的新方法。在此基礎上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。gm涂徑相關因子、其激云MI丨或拮抗劑如本文所用，術語“調節(jié)因子”或“活性調節(jié)因子”是指泛素化途徑相關因子或其激動劑或拮抗劑，它們可通過影響泛素化途徑來調節(jié)F0XP3、IL-2和/或IFN- γ的活性，從而進一步用于與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀的預防和/或治療中。如本文所用，術語“泛素化途徑相關因子”是指可通過影響泛素化途徑來降低F0XP3的活性的因子。在本發(fā)明中，泛素化途徑相關因子包括泛素化連接酶、細胞模式識別受體(如Toll樣受體)、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列。如本文所用，術語“Tol 1樣受體”或“TLR"可互換使用，均是指是天然免疫系統(tǒng)中特異的I-型跨膜受體及病原模式識別受體，在急性炎癥反應、細胞信號轉導和細胞凋亡中起重要作用。目前在人體中已鑒定了 10種TLR的功能型家族成員(TLR1-TLR10)。根據(jù)染色體分布、基因結構及其氨基酸序列的保守性，人的TLRs受體可以分為5個亞群，即TLR2、TLR3、 TLR4、TLR5 和 TLR9 亞群。TLR2 亞群包括 TLR1、TLR2、TLR6 和 TLRlO ；TLR9 亞群包括 TLR7 和TLR9 ；TLR3, TLR4和TLR5各自形成一個亞群。本發(fā)明中首次揭示了 TLR對F0XP3的負調節(jié)作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中所采用的 TLR 包括(但不限于):TLR3、TLR9、TLRl、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7 或 TLR8，優(yōu)選 TLR2、TLR3 及 TLR9 亞群的 TLR，更優(yōu)選 TLR3、TLR7、TLR8 或 TLR9。如本文所用，術語“泛素化連接酶”或“E3，，可互換使用，均是指泛素與靶蛋白結合所需要的第三個酶，其可選擇性的識別并結合特異的靶蛋白，在泛素介導的降解靶蛋白底物的選擇性方面具有重要作用。根據(jù)識別靶蛋白序列中結構域不同，E3可分為兩大類型 (I)HECT結構域家族的泛素連接酶(HECT E3s)，包括Smurf2、E6、AP、ARF、BPl等；(2) RING結構域家族的泛素連接酶(RING E3s)，RING結構域家族最典型的特點是具有環(huán)指結構域，也是該家族具有泛素連接酶作用的重要因素，RING E3s包括大量成員，如Mdm2 (Hdm2)、APC、 SCF, IAP, Skp2 等等。本發(fā)明中首次揭示了 E3對F0XP3的負調節(jié)作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中所采用的 E3 包括(但不限于):STUB1、TRAF6、SmurfU Smurf2, TRAF2、TRAF3、TRAF4、p300 或RBCKl，優(yōu)選STUBl。優(yōu)選本發(fā)明所采用的E3同時兼具結合分子伴侶的功能或活性。 STUBl (STIP1 homology and U-Box containing protein 1，STIPl 同源和 U-Box 域包含蛋白)兼有輔助分子伴侶功能和E3泛素-蛋白連接酶活性，是異常蛋白降解的泛素-蛋白酶系統(tǒng)和溶酶體系統(tǒng)二者間轉換的分子開關，能夠協(xié)調細胞內(nèi)蛋白質量控制系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定，在蛋白質量控制中起關鍵作用。如本文所用，泛素化途徑相關因子的“激動劑”是指能夠促進泛素化途徑相關因子的表達或提高泛素化途徑相關因子的活性的物質，在本發(fā)明中也可稱之為“促效劑”。可用于本發(fā)明中的激動劑包括但不限于IL6。如本文所用，泛素化途徑相關因子的“拮抗劑”是指能夠抑制泛素化途徑相關因子的表達或降低泛素化途徑相關因子的活性的物質，在本發(fā)明中也可稱之為“抑制劑”?？捎糜诒景l(fā)明中的拮抗劑包括但不限于MG-132。本發(fā)明的上述蛋白質或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。應理解，本發(fā)明的上述術語定義中也包括所述蛋白質或多肽的保守性變異多肽、 或其同源多肽。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述蛋白質或多肽來自人或其它真核生物，例如小鼠、大鼠、?；蚝锏?，且它們之間具有高度的保守性。本發(fā)明蛋白質或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳的1-30個，更佳的1-20個，最佳的1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨
基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質或多肽的功能。本領域技術人員可根據(jù)本領域常識和/或常規(guī)試驗很容易的確定這些變異方式，而不會影響蛋白或多肽的活性。在本發(fā)明中，“保守性變異多肽”指與已知的TLR或E3氨基酸序列相比，有至多20 個，較佳的至多10個，更佳的至多5個，最佳的至多3個氨基酸被性質相似或相近氨基酸所替換而形成，且仍具有原TLR或E3相同或類似功能的多肽。如本文所用，術語“編碼序列”是指編碼本發(fā)明所述的泛素化連接酶或Toll樣受體的序列，或是它們的高度同源序列或在嚴格條件下與所述序列雜交的分子或與上述分子高度同源的家族基因分子。如本文所用，術語“嚴格條件”是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補序列。本發(fā)明的編碼序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA 庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。組合物本發(fā)明的調節(jié)因子還可用于制備治療性或預防性的藥物組合物、保健品組合物或疫苗組合物。因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明的調節(jié)因子；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明調節(jié)因子的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳的為100-1000微克/劑。本文所用的術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體被本領域普通技術人員所熟知。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑及其組合。
治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外， 這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預防或治療的對象可以是動物；尤其是人。本發(fā)明的含本發(fā)明調節(jié)因子的治療或預防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經(jīng)口服、皮下、皮內(nèi)、靜脈注射等方式應用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。本發(fā)明的主要優(yōu)點(1)本發(fā)明中首次揭示了泛素化途徑相關因子——泛素化連接酶、Toll樣受體、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列作為F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性調節(jié)因子的用途；(2)本發(fā)明調節(jié)因子的確定與應用，為通過調節(jié)F0XP3、IL_2和/或IFN-γ的活性來調控調節(jié)性T細胞，治療和/或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀(例如腫瘤等)提供了新途徑；(3)本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的調節(jié)因子作為疫苗佐劑，以提高疫苗免疫原性的新方法。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員可對本發(fā)明做出適當?shù)男薷摹⒆儎?，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)或按照供應商所建議的條件。DNA的測序方法為本領域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。材料與方法1.質粒和載體N端HA-、Myc-、FLAG-標簽的F0XP3、不同F(xiàn)0XP3片段真核表達載體、STUBl、Ub (泛素)及 pIPMyc2-STUBl、pIPHA2-F0XP3、其它 E3 質粒(pIPHA2、pIPMyc2、pIPFLAG2 是真核表達載體；pET28a和pET21-MBP是原核表達載體)和慢病毒包裝載體質粒(FUGW，del8. 9和 VSV-G)由發(fā)明人實驗室克隆構建(參照參考文獻4)。El、W^cffib和HSP70基因從人類外周血單核細胞cDNA文庫中擴增獲得。根據(jù) Genbank下載的序列設計引物如下
權利要求
1.泛素化途徑相關因子、其激動劑或拮抗劑在制備調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或 IFN-Y活性的組合物中的用途，其中所述泛素化途徑相關因子選自Toll樣受體、泛素化連接酶、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，對F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN-γ活性的所述調節(jié)是正調節(jié)或負調節(jié)，其中，所述泛素化途徑相關因子或其激動劑用于負調節(jié) F0XP3活性和正調節(jié)IL-2活性和/或IFN- γ活性，所述泛素化途徑相關因子的拮抗劑用于正調節(jié)F0XP3活性和負調節(jié)IL-2活性和/或IFN- γ活性。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述促炎癥細胞因子家族受體選自IL-6R、 TGF β受體、IL-2受體、TNF- α受體或GITR。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是泛素化途徑相關因子在制備負調節(jié)F0XP3活性的組合物中的用途，其中所述泛素化途徑相關因子選自Toll樣受體、泛素化連接酶和/或它們的編碼序列。
5.如權利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于，所述泛素化連接酶是選自下組中的一種或多種STUB1、TRAF6、Smurfl、Smurf2, TRAF2、TRAF3、TRAF4、p300、RNF31 或 RBCKl。
6.如權利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于，所述Toll樣受體是選自下組中的一種或多種TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8 或 TLR9。
7.如權利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于，所述調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物用于治療和/或預防與F0XP3、IL-2和/或IFN- γ活性失調相關的疾病或癥狀。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述活性失調是活性過高或活性過低。
9.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述與F0XP3、IL-2和/或IFN-γ活性失調相關的疾病或癥狀選自腫瘤、炎癥反應、急性傳染性疾病或慢性傳染性疾病。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質瘤、腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、橫紋肌癌、舌鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盤絨毛癌、神經(jīng)膠質瘤、淋巴瘤、白血病、直腸腺癌或黑色素瘤；所述炎癥反應選自過敏性炎癥、毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、肝炎、腎炎、痤瘡、哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、超敏反應、炎性腸道疾病、盆腔炎、再灌注損傷、類風濕關節(jié)炎、移植排斥反應、血管炎或間質性膀胱炎；所述傳染性疾病選自鼠疫、霍亂、傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、手足口病、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結膜炎、麻風病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、 包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、或真菌感染。
11.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或 IFN-Y活性的組合物進一步用作疫苗佐劑或疫苗。
12.如權利要求11所述的用途，其特征在于，所述疫苗選自治療或預防病毒感染、細菌感染、炎癥、寄生蟲感染或腫瘤的疫苗。
13.如權利要求11所述的用途，其特征在于，所述疫苗是手足口病疫苗。
14.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物是藥物組合物、保健品組合物或疫苗組合物。
15.一種調節(jié)F0XP3活性、IL-2活性和/或IFN- γ活性的組合物，其包含(a)一種或多種選自下組的泛素化途徑相關因子泛素化連接酶、Toll樣受體、促炎癥細胞因子家族受體和/或它們的編碼序列；和/或所述泛素化途徑相關因子的激動劑或拮抗劑；和(b)藥學上、免疫學上或保健品學上可接受的載體。
16.如權利要求15所述的組合物，其特征在于，所述泛素化連接酶是選自下組中的一種或多種STUB 1、TRAF6、Smurf 1、Smurf2、TRAF2、 TRAF3、TRAF4、p300、RNF31 或 RBCKl ；所述iToll樣受體是選自下組中的一種或多種TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、 TLR8 或 TLR9 ；所述促炎癥細胞因子家族受體選自IL_6R、TGF β受體、IL-2受體、TNF-α受體或 GITR0
全文摘要
本發(fā)明涉及FOXP3及調節(jié)性T細胞的調節(jié)因子及其應用。具體而言，本發(fā)明涉及泛素化途徑相關因子、其激動劑或拮抗劑在制備調節(jié)FOXP3、IL-2和/或IFN-γ活性的組合物中的用途，其中所述泛素化途徑相關因子選自Toll樣受體、泛素化連接酶、促炎癥細胞因子家族受體和/或其編碼序列。本發(fā)明的新型調節(jié)因子可通過調節(jié)FOXP3、IL-2和/或IFN-γ活性，調控調節(jié)性T細胞和調控免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的調節(jié)因子及其衍生物還可用作免疫佐劑，提高疫苗的免疫原性，用于治療或預防重大疾病(如感染性疾病、腫瘤等)。
文檔編號A61K45/00GK102309757SQ20111019241
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權日2010年7月9日
發(fā)明者李志遠, 李斌, 林芳, 潘帆, 陳祚珈 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所