專利名稱：一種適應(yīng)非洲綠猴腎細胞的減毒的日本腦炎病毒以及日本腦炎疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種通過在非洲綠猴腎(Vero)細胞傳代來適應(yīng)Vero細胞的減毒的日本腦炎病毒以及包含所述減毒病毒的日本腦炎疫苗。
現(xiàn)有技術(shù)描述日本腦炎(JE)是亞洲地區(qū)對公眾健康非常重要的一種由蚊子攜帶的蟲媒病毒疾病。據(jù)報道，在亞洲每年有35000起以上的病例以及10000以上人死亡，但是官方的報道卻無疑低估了真實的病例數(shù)(Okuno，T.《世界健康狀況》(World Health Stat Q)3120-31，1978；Umenei，T.等人，Bull World Health Org.63625-31，1985)。疾病的表現(xiàn)是發(fā)熱頭痛癥狀、無菌性腦膜炎或腦炎，且約有一半的幸存者可能有持久的神經(jīng)學(xué)和精神病后遺癥(Burke，D.S.等人《蟲媒病毒流行病學(xué)和生態(tài)學(xué)》363-92，1988；Monath，T.P.病毒學(xué)763-814，1990)。
JE(日本腦炎)病毒是66中黃病毒中的一種，主要是載體攜帶的有包膜的正的有義單鏈RNA病毒(Chambers，T.J.等人，Ann.Rev.Microbiol.44649-88，1990)。從形態(tài)上講，黃病毒呈球形，直徑約為40nm，由圍繞在核殼外的脂質(zhì)雙層組成，該核殼含有與殼蛋白(C)復(fù)合的11kb基因組(Rice，C.M.等人，Science，229726-33，1985)。膜上的表面突出由糖基化的包膜(E)和膜(M)蛋白組成。在胞內(nèi)初生毒粒中的前M糖蛋白斷裂成在成熟的細胞外毒粒中發(fā)現(xiàn)的M蛋白。重要的生理活性與53kd E蛋白有關(guān)，這些活性包括血細胞凝集、病毒中和、毒粒裝配、膜融合以及病毒與細胞受體結(jié)合(Koshini，E.等人，Virol.188714-20，1992)。
現(xiàn)有三種人用JE疫苗(Tsai，T.等人，疫苗，671-713，1993)。其中只有在小鼠腦中產(chǎn)生的滅活的JE疫苗能在國際上購得。一個生產(chǎn)商，大阪大學(xué)微生物疾病研究基金會(Biken)生產(chǎn)了大多數(shù)國際上銷售的滅活JE疫苗；該病毒于1992年在美國獲得許可，由Connaught Laboratories，Inc.以JE-VAXTM的商品名銷售。在原代倉鼠腎(PHK)細胞中制得的滅活和活的減毒JE疫苗只在中國銷售。
在小鼠腦中產(chǎn)生的滅活的JE疫苗在1954年在日本獲得許可。由于它是通過注入幼鼠大腦來產(chǎn)生的，因此生產(chǎn)很費力，且涉及到引起疫苗相關(guān)神經(jīng)病學(xué)副作用的可能性。盡管對生產(chǎn)方法所作的一系列改進已經(jīng)提高了疫苗的純度和效力(Oye，A.疫苗接種理論和實踐，69-82，1975；Oya，A.Acta PediatrJpn.30175-84，1988；Takaku，K.Biken J.1125-39，1968)，但是直到最近還報道存在一定頻度的局部反應(yīng)和輕微的系統(tǒng)性反應(yīng)(Hoke，C.H.等人，New Engl J Med.319608-14，1988；Poland，J.D.等人，J InfectDis.161878-82，1990；Sanchez，J.L.等人，Lancet 335972-73，1990)。有20％的疫苗在注射部位產(chǎn)生局部觸痛、發(fā)紅和/或腫脹。據(jù)報道，有10-30％的疫苗產(chǎn)生了輕微的系統(tǒng)性癥狀，主要是頭痛、低燒、肌肉疼痛、不適和腸胃癥狀。自1989年起，已經(jīng)報道的明顯新的不良反應(yīng)包括蕁麻疹、血管性水腫、呼吸窘迫、多形性紅斑、結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nosodum)和嚴重的神經(jīng)病學(xué)疾病，這些主要是在澳州、歐洲和北美洲受疫苗接種的游客中發(fā)現(xiàn)(Anderson，M.M.等人，Lancet.3371044，1991；Ruff，T.A.等人，Lancet 228881-2，1991)。另外，在1992和1995年，Ohtaki報道說有7名兒童在經(jīng)JE疫苗接種后患急性播散性腦脊髓炎(ADEM)，并伴有磁共振圖象(MRI)變化(Ohtaki，E.等人，Pediatr Neutrol.8137-9，1992；Ohtaki，E.等人，J Neurol Neruosurg Psychiatry59316-7，1995)。還注意到用含動物腦組織的狂犬病疫苗接種會引起嚴重的神經(jīng)病學(xué)并發(fā)癥(Plotkin，S.A.等人，疫苗，661-2，1994)。出于這些原因，WHO已經(jīng)優(yōu)先考慮開發(fā)JE疫苗。
最近，已經(jīng)證實，中國的滅活和活的減毒JE疫苗是有效的，它誘發(fā)了高滴度的中和病毒的抗體，并提供了實體保護(Tsai，T.等人，疫苗，671-713，1993)。然而，制備中國疫苗的PHK細胞沒有被世界健康組織(WHO)批準用于生產(chǎn)病毒疫苗，也沒有被發(fā)達國家許可用于人用。用原代倉鼠細胞生產(chǎn)疫苗的主要缺點是疫苗質(zhì)量的不確定性。即使采用沒有特異性病原體的倉鼠，動物仍會被意外感染，這是疫苗生產(chǎn)中的一個問題。有時，這類感染能長時間內(nèi)不被檢測到。出于這些批評，需要對疫苗安全性作進一步的控制性研究，以使其廣泛的應(yīng)用可信。從原代細胞生產(chǎn)疫苗的另一個缺點是病毒收獲率低，成本高，且不能大量生產(chǎn)。
鑒于上述原因，需要有一種在標準的細胞系如非洲綠猴腎細胞或人二倍細胞(這些細胞已經(jīng)被認可作為人疫苗基質(zhì))中產(chǎn)生且成本較低的新的JE疫苗。Vero細胞是衍生自猴腎的經(jīng)轉(zhuǎn)化但不導(dǎo)致腫瘤的細胞。Vero細胞系比其它任何標準細胞系都更為有利，因為Vero細胞更容易適應(yīng)大規(guī)模細胞培養(yǎng)，并且作為一種轉(zhuǎn)化的細胞，它具有無限的生命。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，JE病毒能在Vero細胞培養(yǎng)中生長。在JE疫苗領(lǐng)域中，已經(jīng)作了相當(dāng)多的努力來從標準細胞生產(chǎn)疫苗，從而能進行大體積的細胞培養(yǎng)。然而，病毒的特性分析(包括遺傳穩(wěn)定性)、通過從Vero細胞培育來使疫苗商業(yè)化所需的得率和方法還決不能滿足人疫苗的需求。由于這些事實且難以將其它病毒培養(yǎng)獲得的知識用于JE病毒，現(xiàn)有技術(shù)并沒有成功地從傳代細胞系開發(fā)出在遺傳上穩(wěn)定的、且免疫原性高的JE病毒疫苗。所有這些研究至今均未能得出一種滿足本背景中所述標準的新的疫苗生產(chǎn)方法。
本發(fā)明提出了一種在傳代細胞(Vero細胞)中發(fā)育和增殖JE病毒用于生產(chǎn)疫苗的方法，該方法克服了以前在小鼠腦或原代細胞系中生產(chǎn)JE病毒的問題。本發(fā)明還確定了培育JE病毒的方法以及一種低成本生產(chǎn)疫苗的下游方法。
另外，本發(fā)明確定了對原先的商業(yè)化JE疫苗作下列方法上的改進。
1.安全性本發(fā)明的病毒通過Vero細胞培育沒有獲得毒性，減少了生產(chǎn)的危險，并為接受者提供了額外的安全性(除了嚴格控制病毒滅活方法所提供的安全性外)。以前的商業(yè)化的JE疫苗從未提供過這種優(yōu)點。
2.在更安全的生產(chǎn)基質(zhì)中的供應(yīng)量增加在牛血清不存在下生產(chǎn)本發(fā)明的JE疫苗，獲得了高的得率和廉價以及可放大規(guī)模的生產(chǎn)，這些是原來的商業(yè)化JE疫苗所不能實現(xiàn)的。
3.更少的反應(yīng)原性(reactogenicity)在本發(fā)明的JE疫苗中沒有摻入明膠穩(wěn)定劑，從而減少了象已有疫苗那樣(Saakaguchi M.等人，疫苗，68-69，1998)的疫苗反應(yīng)的危險。另外，有效地除去了摻入已有JE疫苗中的不需要的牛衍生成分?？傊郧暗腏E疫苗從未提供過本發(fā)明的這一安全性。
4.提高的效力Vero細胞大規(guī)模生產(chǎn)的成功、用于生產(chǎn)的添加物的不存在、以及有效的純化，這些使得在配制JE疫苗時能首先使用有效的佐劑。盡管在疫苗配方中應(yīng)用佐劑也適用于其它疫苗，但是將這一知識運用于JE疫苗是很困難的，因為沒有一種現(xiàn)有的JE疫苗能確保其安全的生產(chǎn)。
總之，至今還沒有產(chǎn)生一種新的疫苗能滿足JE疫苗商業(yè)化的上述優(yōu)點。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種安全有效的、在標準細胞基底中產(chǎn)生的JE疫苗，以提高其在許多國家的可接受性。本發(fā)明另一個目的是提供一種有效方法，用于生產(chǎn)高度純化的穩(wěn)定的疫苗以及用少量抗原配制高免疫原性的疫苗。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種通過在Vero細胞上傳代來適應(yīng)Vero細胞的減毒的日本腦炎病毒。本發(fā)明的減毒的日本腦炎病毒在文中稱為CJ50003，根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，于1998年4月20日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(Seoul，Korea)，按照保藏號KCCM-10125可以從該保藏機構(gòu)獲得該病毒的傳代培養(yǎng)物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種日本腦炎疫苗，它含有通過在Vero細胞上傳代來適應(yīng)Vero細胞的減毒的日本腦炎病毒。
附圖簡述在參看了下列描述、所附權(quán)利要求以及附圖后，就能更好地了解本發(fā)明的這些以及其它特征、方面和優(yōu)點，這些附圖如下

圖1顯示了JE病毒SA14-14-2(PDK)在Vero細胞中的傳代和適應(yīng)。用0.1moi的SA 14-14-2株(PDK)接種Vero細胞單層后第5天，收獲第一代病毒。在Vero細胞單層上進行噬斑試驗，測定JE病毒的滴度。隨后用第一代病毒作為起始材料，按照實施例1所述的進行連續(xù)病毒感染和滴定，傳代30代。
圖2顯示了在感染后第3天至第17天每隔一天在滾瓶中多次收獲JE病毒CJ50003。以每個細胞0.01噬斑形成單位(pfu)的感染復(fù)數(shù)感染Vero細胞單層。使病毒于35℃吸附2小時，然后用PBS洗滌細胞三次，加入100毫升無血清EMEM，35℃培育。在感染后第3天至第17天，每隔48小時用新鮮的無血清EMEM替換培養(yǎng)上清液。通過在Vero細胞單層上測定噬斑來進行收獲物的病毒感染性滴定。
圖3顯示了用SDS-PAGE和Western印跡來分析經(jīng)蔗糖梯度超離心純化的JE病毒CJ50003。將60毫升濃縮的培養(yǎng)上清加入40毫升15-60％蔗糖梯度，在45 Ti轉(zhuǎn)頭中12℃、22000rpm離心18小時。從試管底部收集2毫升樣品，并進行4-20％梯度的SDS-PAGE，將分辨的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。通過考馬斯亮藍(組A)或硝酸銀(組B)染色來顯色，抗原通過和JE病毒E蛋白有反應(yīng)性的單克隆抗體(組C)反應(yīng)來顯色。泳道1是預(yù)先染色的蛋白標準品(Novex SeeblueTM)，從頂部起代表250、98、64、50、36、30、16和6kDa的分子量；泳道2-10，超離心后來自底部的級分No.3-11；E，包膜蛋白；C，殼蛋白；M，膜蛋白。
圖4顯示了純化的JE病毒CJ50003的甲醛滅活動力學(xué)。在4℃或22℃用0.018％甲醛滅活純化的JE病毒制備物。通過在Vero細胞單層上直接顯示噬斑來滴定指定時間時所取樣品的殘余感染性病毒。另外，如下所述進行擴增試驗，以檢測低水平的病毒。用病毒滅活時間點的樣品接種含有Vero細胞單層的燒瓶(一式兩份)。35℃吸附2小時后，重新加入細胞并35℃培育。在感染后第7天和第14天重新加入細胞。收獲培養(yǎng)基并形成噬斑，以檢測感染性病毒。圖中顯示了兩個不同實驗的滅活時間點4℃(實心矩形)、22℃(實心圓形)。平行進行熱滅活(沒有甲醛)對照(4℃表示為空心矩形，22℃表示為空心圓形)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種具有用于制備JE疫苗所希望性質(zhì)的JE病毒株。所述病毒是一種減毒的病毒，能在傳代細胞系中增殖，該傳代細胞系是WHO認可作為人疫苗生產(chǎn)用細胞基底的Vero細胞。因此，預(yù)計所述病毒能用來制備比現(xiàn)有疫苗更安全的滅活的和活的JE疫苗。
本發(fā)明提供了一種滿足目前需要的疫苗。通過在不高于35℃下連續(xù)傳代，使JE病毒適應(yīng)Vero細胞。在Vero細胞中連續(xù)傳代導(dǎo)致病毒滴度升高至高于107pfu/毫升培養(yǎng)上清液，并減少了顯示病毒滴度峰值的培養(yǎng)時間。本發(fā)明涉及一種多次收獲方法的發(fā)展，該方法不需要血清作為添加物，產(chǎn)生病毒的產(chǎn)量得率高，這對于低成本大規(guī)模生產(chǎn)所述疫苗是商業(yè)上可行的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，在病毒培育時的多次收獲方法導(dǎo)致受感染細胞的細胞病變效應(yīng)(CPE)程度降低。由于CPE水平的減少，本發(fā)明的JE疫苗含有極少量的殘余細胞衍生成分。另外，預(yù)計本發(fā)明的JE疫苗將提供比現(xiàn)有JE疫苗增強的免疫原性和提高的抗病保護性。本發(fā)明的純化的JE疫苗與現(xiàn)有疫苗相比的主要優(yōu)點在于，從培養(yǎng)的Vero細胞純化的病毒滿足了人用疫苗的發(fā)展需要。
本發(fā)明還涉及制備所述疫苗的方法。該方法能提供高產(chǎn)量、高純度和高效力的所述疫苗。JE病毒CJ50003這樣獲得使JE病毒SA 14-14-2(PDK)在不高于35℃的溫度下在Vero組織培養(yǎng)細胞中適應(yīng)，傳代4次或更多代，選擇培養(yǎng)的病毒，同時根據(jù)在Vero和/或LLC-MK2細胞中形成的轉(zhuǎn)化灶的數(shù)量，監(jiān)測病毒的增殖。從該適應(yīng)方法獲得的病毒在每毫升培養(yǎng)Vero細胞的培養(yǎng)上清液中至少有1×107pfu的峰值滴度，并減少了收獲的培育期。JE病毒SA14-14-2是一種減毒的病毒株，它通過使蚊子的野生型JE病毒SA 14適應(yīng)原代倉鼠腎(PHK)組織培養(yǎng)細胞和原代狗腎(PDK)組織培養(yǎng)細胞來獲得(Kenneth H.Eckels，等人，疫苗，6513-518，1988)。但是PHK和PDK細胞沒有被WHO許可，因此它們不適于用來制備人用疫苗。Vero細胞受WHO許可用于人用，因此Vero適應(yīng)的JE病毒株CJ50003是生產(chǎn)人用疫苗的良好基礎(chǔ)。
已知SA 14-14-2(PDK)病毒屬于黃病毒，并具有下列理化性質(zhì)單鏈，正的有義RNA基因組，有5′甲基化的末端，3′端沒有poly A結(jié)構(gòu)。RNA基因組的大小約為11kb，基因組和13500Da的核殼(C)蛋白處于組合狀態(tài)。病毒另外還包括8700Da的膜(M)蛋白、53000的Da的包膜(E)蛋白以及非結(jié)構(gòu)性蛋白NS1、2a、2b、3、4a、5等。
使Vero適應(yīng)的JE病毒株CJ50003在Vero細胞中傳代30代以上。通過傳代，病毒滴度和噬斑形態(tài)學(xué)沒有改變，這提出病毒具有穩(wěn)定的表型特征。
為了了解JE病毒CJ50003的生物性質(zhì)的分子基礎(chǔ)，分析病毒的理化性質(zhì)。用cDNA克隆和測序法確定病毒基因組的堿基序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JE SA 14-14-2(PDK)的E蛋白基因中1032、1506和1704位的三個腺嘌呤以及1769位的鳥嘌呤堿基分別被JE CJ50003病毒中的三個鳥嘌呤和一個胸腺嘧啶取代。因此，E蛋白的氨基酸序列中19位的蘇氨酸、177位的蘇氨酸、243位的賴氨酸以及264位的谷氨酰胺分別變?yōu)楸彼?、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸。只要我們的研究繼續(xù)下去，在病毒在Vero細胞中傳代時，E蛋白的氨基酸變化就保持不變。
當(dāng)將在Vero細胞中傳代數(shù)不同的病毒注射入幼鼠大腦內(nèi)時，JE病毒CJ50003不會殺死小鼠。因此，可以說，適應(yīng)Vero的JE病毒CJ50003是一種減毒和穩(wěn)定的病毒株，它沒有或只有很少的神經(jīng)毒性。這是將所述病毒用于活的JE病毒疫苗和/或滅活疫苗的關(guān)鍵因素之一。
本發(fā)明還提供了一種從細胞培養(yǎng)物純化病毒而不用冷凍粗制物或期間的純度物質(zhì)的方法。所述方法包括下列步驟除去細胞碎片，濃縮病毒，通過沉淀細胞源物質(zhì)和進行蔗糖梯度超離心來純化，分級梯度，并測定病毒級分。更具體地說，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)純化JE病毒的方法，該方法包括，在血清蛋白添加物存在或不存在下，在傳代細胞系中將病毒增殖至高滴度，用超離心純化病毒，并合并病毒陽性級分。
在Vero組織培養(yǎng)細胞中增殖所述病毒。用CJ50003病毒感染在滾瓶中生長至鋪滿的Vero細胞并作培育?？捎枚啻问斋@方法收獲病毒。在感染后第2或第3天(根據(jù)感染復(fù)數(shù))，開始收獲培養(yǎng)上清液，向培養(yǎng)物中重新加入新鮮的培養(yǎng)基。培育重新加入的培養(yǎng)物2天后，再次收獲培養(yǎng)上清液。收獲可在感染后8或9天重復(fù)4次，病毒滴度維持在高于107pfu/毫升培養(yǎng)上清液。多次收獲方法提供了較高的每單位滾瓶的病毒得率，從而使得本發(fā)明更適應(yīng)市場的規(guī)律。另外，該方法還導(dǎo)致受感染細胞的CPE程度降低。降低的CPE水平賦予本發(fā)明JE疫苗中極低水平的殘余細胞衍生成分。收獲的培養(yǎng)上清液能4℃保藏直至純化開始。收獲的培養(yǎng)上清液可用本領(lǐng)域已知的常用方法來實現(xiàn)澄清化，這些方法包括，例如，1500g低速離心10分鐘，和/或通過孔徑為0.45的濾膜過濾。4℃保藏收獲的培養(yǎng)液至濃縮。為使病毒濃縮，對培養(yǎng)液進行超濾，然后收集保留物。在另一濃縮方法中，將聚乙二醇(PEG)8000溶解在培養(yǎng)液中至10％，將沉淀物溶解在合適的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液，PBS，pH7.0)中。進行魚精蛋白硫酸鹽沉淀，以除去DNA或來自細胞的其它物質(zhì)，這可通過將魚精蛋白硫酸鹽加入濃縮的病毒溶液中并高速離心(例如12000g)5分鐘來實現(xiàn)。為進一步純化病毒，密度在15-60％連續(xù)或多步蔗糖梯度上進行密度梯度超離心。分級蔗糖梯度，測定級分中的病毒。測定含病毒陽性級分的方法包括噬斑試驗、血細胞凝集試驗、聚丙烯酰胺凝膠電泳、和抗原試驗(如免疫試驗)。根據(jù)高病毒滴度和其它雜質(zhì)的低水平，合并級分以便進一步處理。通過測試來源于Vero細胞的染色體DNA和蛋白質(zhì)，估計合并的純化病毒的純度。結(jié)果表明，每5微克純化JE病毒的宿主細胞DNA和蛋白質(zhì)的含量分別低達2.5pg和2ng，這表明上述純化方法有效地除去了病毒抗原中的其它雜質(zhì)。估計1升感染培養(yǎng)液的JE病毒得率約為2.3毫克。
本發(fā)明還提供了一種滅活JE病毒以破壞其感染性同時保留其抗原性的方法。所述方法包括，加入有效量的甲醛，使所述病毒和所述試劑在一定條件下培育，從而使得所述病毒被滅活。具體地說，用合適的緩沖液(例如PBS)將級分合并物稀釋至合適的蛋白濃度，向稀釋的級分合并物中加入甲醛。和甲醛的培育在22℃或4℃下進行。在22℃或4℃下，完全破壞病毒感染性而不喪失病毒抗原性至少分別需要4天或46天。為了大規(guī)模培養(yǎng)的簡便，宜選擇在22℃下滅活JE病毒的方法，并將培育時間延長至7天，以提供安全的寬裕量。然而，有效的滅活劑的例子包括但不局限于甲醛。通常，這能通過化學(xué)或物理方式來實現(xiàn)?；瘜W(xué)滅活可通過用(例如)酶、β丙酸內(nèi)酯、乙烯亞胺或其衍生物、以及有機溶劑(如Tween、Triton、脫氧膽酸鈉和磺基海啶(sulphohetain))處理來實現(xiàn)。如果需要，隨后可中和滅活材料；例如，被甲醛滅活的材料可用硫代硫酸鹽中和。物理滅活宜通過使病毒受高能輻射(如UV光、X輻射或x輻射)實現(xiàn)。
JE疫苗可制成可液體溶液或懸液形式的注射劑。可以加入穩(wěn)定劑如糖類(山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖等)、蛋白質(zhì)(白蛋白、酪蛋白等)、含蛋白試劑(牛血清、脫脂牛奶等)和緩沖液(如堿金屬磷酸鹽)。制備物在加入穩(wěn)定劑后可以凍干，它能真空或氮氣保藏。如果需要，可以加入具有佐劑作用的一種或多種化合物。用于此目的的合適的化合物例如是氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、礦物油(如Bayol，Marcol 52)和皂素。另外，如果需要，病毒材料中還可加入一種或多種乳化劑，例如Tween和span。
通過測定針對病毒的中和抗體量，確定佐劑的效果，該中和抗體通過給予疫苗中也吸附于佐劑的無活性病毒產(chǎn)生。有效的佐劑例子包括，但不局限于，氫氧化鋁。用所述疫苗免疫的小鼠血清進行噬斑減少中和測試(PRNT)和用神經(jīng)毒性病毒直接攻擊免疫的小鼠，研究所得疫苗的效力。結(jié)果表明，所述疫苗具有和可比疫苗相同或更佳的誘發(fā)中和抗體的效力。
為了研究傳代次數(shù)不同的Vero適應(yīng)的病毒免疫原性可能的變化，制得不同傳代次數(shù)的疫苗并比較每一疫苗的效力。不管在Vero細胞中連續(xù)傳代，從不同傳代次數(shù)的病毒制得的疫苗其效力之間沒有顯著的差別。因此可以說，Vero適應(yīng)的JE病毒株CJ50003具有穩(wěn)定的免疫原性。
下列實施例描述了本發(fā)明的適應(yīng)Vero細胞的減毒JE病毒以及包含本發(fā)明的所述減毒病毒的JE疫苗。相信本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前述描述和后文實施例完全實施本發(fā)明。
實施例1SA 14-14-2(PDK)病毒在Vero細胞中的適應(yīng)用JE SA 14-14-2(PDK)，狗腎細胞培養(yǎng)第8代SA 14-14-2病毒，來啟動在Vero細胞培養(yǎng)中的連續(xù)傳代。用JE SA 14-14-2(PDK)以每細胞0.1pfu的感染復(fù)數(shù)接種Vero細胞單層。在約5％CO2的空氣氣氛下，在不高于約35℃的溫度(通常約32℃至35℃，較佳的約35℃)下，使受感染的細胞培養(yǎng)在含5毫升營養(yǎng)物培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中生長，該培養(yǎng)基由Eagle的極限必需培養(yǎng)基組成，其中添加了10％胎牛血清。通過顯微鏡觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)以及用各種試驗(如紅細胞吸附試驗(HA)、空斑試驗、和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA))確定病毒抗原的存在，來監(jiān)測病毒生長。在感染后第5天，培養(yǎng)物表現(xiàn)出病毒滴度峰值時，收獲JE病毒，并離心澄清。從澄清化上清液中純化單噬斑并在Vero細胞中擴增。用擴增的病毒重新感染Vero細胞，作進一步傳代。隨后通過如上所述的連續(xù)病毒感染、滴定和噬斑純化，進行連續(xù)傳代30代。如圖1所示，在Vero細胞中傳4代后，病毒滴度達到約4×107pfu/毫升培養(yǎng)上清液，并在以后的傳代中維持接近該水平。另外，病毒收獲的最佳期間從第一代的5天縮短至第4代的2-3天。病毒得率的明顯提高(從約105pfu/ml到超過107pfu/ml)以及培育時間的縮短導(dǎo)致選擇Vero細胞中第4代JE作為用于制備候選JE疫苗的起始材料。將Vero細胞中第4代JE標為CJ50003(Vero，PS4)?？s寫PS指在指定細胞中的病毒傳代數(shù)。
實施例2CJ50003病毒的特性分析；包膜基因的測序和神經(jīng)毒性研究為了了解CJ50003株生物特性的分子基礎(chǔ)，測定具有主要中和表位的編碼包膜蛋白(E)基因的1500個核苷酸序列，并和親代疫苗株SA14-14-2(PDK)、SA 14-14-2(PHK)和野生型SA14病毒(Aihira，S.等人，Virus Genes，595-109，1991；Ni，H.等人，JGen Virol.76401-407，1995；Ni，H.等人，J Gen Virol.76409-413，1995；Nitayaphan，S.等人，Virology 177541-542，1990)的序列比較。用CJ50003病毒(Vero，PS4)作序列分析。結(jié)果表明，C端區(qū)域(氨基酸280-500)完全保守，而N端區(qū)域(氨基酸1-279)表現(xiàn)出病毒株之間有序列差異。N端區(qū)域中的突變大多數(shù)是平均分布的。CJ50003的E蛋白基因的核苷酸序列與SA14/CDC有8個核苷酸不同(7個氨基酸不同)，而SA14-14-2(PDK)與SA14/CDC有7個核苷酸不同(5個氨基酸不同)。結(jié)果歸納在表1中。
CJ50003病毒的序列在5處位置與已經(jīng)公開的SA 14-14-2(PDK)病毒不同1032、1506、1704和1769位的核苷酸變化導(dǎo)致SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒有4個氨基酸不同989位的核苷酸變化沒有導(dǎo)致氨基酸替代。較高代數(shù)的CJ50003病毒(即15代至30代)未揭示額外的核苷酸變化。因此，CJ50003和親代病毒SA 14-14-2(PDK)之間有5個明顯的核苷酸變化和4個明顯的氨基酸變化。這些變化在該病毒在細胞培養(yǎng)中傳代時是穩(wěn)定的。SA 14-14-2(PDK)中243位的Lys殘基是與其它減毒JE病毒相比唯一不同的殘基，它在CJ50003中被Glu殘基替代。
CJ50003序列與公開的SA 14-14-2(PHK)病毒序列(Aihira，S.等人，Virus Genes，595-109，1991)也不同。1032位的核苷酸差別導(dǎo)致E19位的氨基酸不同，但是989位核苷酸的變化沒有引起氨基酸替代。CJ50003病毒中1506和1704位的核苷酸與SA14-14-2(PHK)中那些位置的核苷酸相同，但與SA 14-14-2(PDK)中那些位置的核苷酸不同。CJ50003和SA 14-14-2(PHK)E基因的N端區(qū)域替代方式是基本上相同的，除了E19處的氨基酸替代外。
與親代SA 14病毒的序列相比，SA 14-14-2(PHK)、SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒在E107、E138、E176和E279位有4個相同的氨基酸替代。其中E138和E176位的氨基酸(Ni，H.等人，J Gen Virol.76409-413，1995)(已知這兩個氨基酸對減毒有貢獻)在Vero適應(yīng)后仍然保守，這提示CJ50003沒有喪失其減毒特征。
表1 JE病毒株、SA14、SA 14-14-2(PHK)、SA 14-14-2(PDK)和CJ50003之間的核苷酸和氨基酸序列比較位置 核苷酸 氨基酸NTAASA14/SA14/SA14/SA14-14-SA14-14-CJ50003SA14/SA14/SA14/SA14-14-SA14-14-CJ50003USA CDC JAP 2/PHK2/PDK USA CDC JAP 2/PHK2/PDK989 E4GGGUUGLeu Leu Leu Leu Leu Leu1032 E19 AAAAAGThr Thr Thr Thr Thr Ala1052 E25 GAAAAALeu Leu Leu Leu Leu Leu1061 E28 UUUCCCAsp Asp Asp Asp Asp Asp1217 E80 CCUUCCAla Ala Ala Ala Ala Ala1296 E107 CCCUUULeu Leu Leu Phe Phe Phe1389 E138 GGGAAAGlu Glu Glu Lys Lys Lys1503 E176 AAAGGGIle Ile Ile Val Val Val1506 E177 AAAGAGThr Thr Thr Ala Thr Ala1704 E243 GGGGAGGlu Glu Glu Glu Lys Glu1708 E244 GAAAAAGly Gly Gly Gly Gly Gly1769 E264 GGGAGUGln Gln Gln His Gln His1813 E279 AAAUUULys Lys Lys Met Met Met1921 E315 CUCUUUAla Val Ala Val Val Val1977 E334 CCUCCCPro Pro Ser Pro Pro Pro2293 E439 AGAGGGLys Arg Arg Arg Arg Arg2441 E488 GAGAAAGly Gly Gly Gly Gly GlyAA氨基酸；NT核苷酸位置鏈。
通過注射入4周齡BALB/c小鼠大腦內(nèi)(i.c.)，測試CJ50003和親代SA 14-14-2(PDK)的小鼠神經(jīng)毒性。結(jié)果顯示在表2中。與野生型SA 14病毒相比，SA 14-14-2(PDK)和CJ50003病毒對于幼成年小鼠的致死性沒有顯著差別，都非常低。因此，導(dǎo)入Vero細胞基底沒有為SA 14-14-2(PDK)提供神經(jīng)毒力表型，且CJ50003病毒仍具有減毒特性。
表2.接種了Vero傳代的CJ50003病毒的4周齡小鼠的大腦內(nèi)毒性。PS代表在PDK或Vero細胞中的傳代數(shù)。
病毒 PFU接種量Log LD50ml-1LD50/PFU比SA14(PDK，PS3) 2×1076.5 0.17*SA14-14-2(PDK，PS8)1.3×106＜1.5b＜0.00002*CJ50003(Vero，PS6) 3.4×107＜1.5b＜0.00001CJ50003(Vero，PS15)3.2×107＜1.5b＜0.00001CJ50003(Vero，PS30)3.6×107＜1.5b＜0.00001aKenneth H.Eckels等人(Vaccine 6513-518，1988)。
b接種了未稀釋的病毒后，10只小鼠無一死亡。
大腦內(nèi)注射接種體積為每只小鼠0.03毫升。
實施例3病毒生長和純化在Vero細胞中的第5代病毒[CJ50003(Vero，PS5)]中制備生產(chǎn)種子，并深凍保藏。Vero細胞在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的Eagle極限必需培養(yǎng)基(EMEM，Gibco)中生長。用生產(chǎn)種子病毒以0.01-0.1pfu/細胞的感染復(fù)數(shù)感染Vero細胞單層的滾瓶培養(yǎng)物。在病毒吸附2小時后，用PBS洗滌培養(yǎng)物3次，加入不含血清的EMEM，并35℃培育。在感染的Vero細胞培養(yǎng)中，病毒在感染后2至3天達到約107至108pfu/ml的滴度。盡管從感染后2或3天開始到感染后8或9天內(nèi)每隔2天共收獲病毒4次，病毒滴度仍維持在超過107pfu/ml，且CPE非常弱。但是在感染9天后，滴度低于107pfu/ml(圖2)。8000rpm離心合并的收獲物15分鐘，使上清液通過0.45微米濾膜過濾。用超濾(Ultrasette，F(xiàn)iltron，100k)或PEG沉淀濃縮病毒上清液。離心收集PEG法沉淀的病毒并懸于PBS或STE(10mM Tris pH7.2，1mM EDTA，150mM NaCl)緩沖液中。將超濾后的保留物濃縮至250毫升，用100毫升PBS洗滌盒。在加入0.5-2毫克/毫升魚精蛋白硫酸鹽后，使病毒濃縮液在冰上驟冷2小時，10000rpm離心5分鐘，獲得上清液。通過蔗糖梯度上超離心來純化濃縮的病毒。超離心在38000g下進行18小時。使級分在含有洗滌劑十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠上電泳(SDS-PAGE)。在SDS-PAGE中看到核殼蛋白(C，13500Da)、膜蛋白(M，8700Da)和包膜蛋白(E，53000Da)條帶(圖3，組A)。用小鼠抗JE病毒單克隆抗體通過Western印跡檢測包膜抗原(E)(圖3，組C)。合并銀染凝膠中未顯現(xiàn)出除病毒蛋白外的其它蛋白條帶的病毒陽性級分(級分4至9)(圖3，組B)，用Lowry方法測定蛋白濃度。表3和表4顯示了從感染的Vero培養(yǎng)經(jīng)兩種純化方法(切向流超濾或PEG8000沉淀)的詳細結(jié)果。用兩倍體積的PBS稀釋純化的病毒，加Tween80至最終濃度為0.01％，通過0.22微米濾膜來過濾。
表3.通過切向流超濾濃縮純化JE病毒樣品 總體積總pfu 得率％ 總蛋白 ％得率(蛋 比活(毫升) (pfu)(毫克) 白) (pfu/mg)合并培養(yǎng)上清液 10,000 4.4×1011100 600 100 7.3×107過濾濃縮液 200 4.0×101190 280 47 1.4×108蔗糖梯度合并物 500 3.8×101186 42 7 9.0×1090.22微米過濾 50 2.4×101155 23 3.8 1.0×1010表4.通過PEG8000沉淀濃縮純化JE病毒樣品 總體積總pfu 得率％ 總蛋白 ％得率(蛋 比活(毫升) (pfu)(毫克) 白) (pfu/mg)合并培養(yǎng)上清液 10,000 4.4×1011100 600 100 7.3×107PEG沉淀200 2.7×101161 40 6.7 6.8×109蔗糖梯度合并物 500 2.5×101156 15 2.5 1.7×10100.22微米過濾 50 1.6×101141 12 2 1.3×1010用比活測定(即pfu/毫克蛋白)比較病毒制備物的相對純度。通過超濾從濃縮液純化獲得的病毒與通過PEG8000沉淀從濃縮液純化獲得的病毒有大致相同的活性。另外還通過測試來自Vero細胞的染色體DNA和蛋白來估計合并的純化病毒的純度。結(jié)果表明，無論是那種濃縮方法，每5微克純化JE病毒中的宿主細胞DNA和蛋白質(zhì)含量分別低達2.5pg和2ng，這證明上述兩種純化方法均有效地從病毒抗原中除去了其它雜質(zhì)。然而在純化病毒的蛋白得率方面，采用超濾的純化方法比采用PEG8000沉淀的純化方法好兩倍。
實施例4病毒滅活將純化的病毒直接用于在PBS透析后制備活性減毒疫苗或用于甲醛滅活來制備滅活的疫苗。用0.018％甲醛滅活在22℃或4℃進行。定時間隔取樣，并通過噬斑滴定來直接測定感染性病毒(圖4)。使在直接噬斑試驗中呈陰性的樣品在Vero細胞單層上盲傳代(blind passage)，以便擴增低水平的病毒，然后重新進行噬斑測定。發(fā)現(xiàn)完全滅活感染性在22℃時需要4天，在4℃時需要46天(表5和6)。在滅活期間，通過用抗原斑點印跡和多克隆抗血清測試樣品來監(jiān)測病毒抗原性。通過該實驗表明，在接觸0.018％甲醛10天(22℃)或15天(4℃)后，沒有檢測到抗原性有損失。
在下列條件下進行甲醛滅活22℃至少7天或4℃至少60天，給出了安全性寬裕量。在滅活后，加入0.038％偏亞硫酸氫鈉中和樣品中游離的甲醛。同時用PBS透析，然后通過0.22微米濾膜過濾。
表5.在4℃用甲醛滅活JE病毒CJ50003天JE病毒(-HCHO)JE病毒(+HCHO)擴增0 3.2×1083.2×108+0.5 2.6×1083.2×106+1 1.52×1087.9×105+1.5 2.4×1084.8×105+2 2.8×1086.4×104+3 2.6×1084.3×103+4 1.9×1081300 +5 2.4×108285 +6 2.8×108480 +7 1.5×108200 +111.5×1080+221.4×1080+321.2×1080+461.0×1080-601.0×1080-
表6在22℃用甲醛滅活JE病毒小時JE病毒(-HCHO)JE病毒(+HCHO)擴增0 3.2×1083.2×108+3 3.0×1081.3×106+6 2.7×1081.1×105+12 2.5×1083.5×105+24 1.2×108140 +36 1.2×1080+48 1.2×1080+72 1.1×1080+96 1.1×1080-360 1.0×1080-實施例5CJ50003的純化的、滅活的病毒(PIV)和活的減毒病毒(LAV)在小鼠中的免疫原性然后在小鼠中用已經(jīng)商業(yè)化的Biken滅活疫苗測試LAV和PIV的免疫原性。用三種免疫原對一組20只6周齡BALB/c小鼠作腹膜內(nèi)(i.p.)免疫。用兩種接種物、沒有佐劑間隔2周進行免疫。第二次免疫后兩周，從各組小鼠獲得血清，合并并隨后用PRNT方法測試中和抗體的存在(表7)。如表7所示，接受三種免疫原的各組之間的中和抗體滴度沒有顯著差異。
表7.在PIV或LAV免疫的小鼠中誘導(dǎo)中和抗體免疫原 劑量 中和抗體的滴度aPIV 5微克 1∶320PIV 10微克1∶320LAV 5微克 1∶320LAV 10微克1∶640Biken疫苗b1劑 1∶320a中和抗體的滴度定義為導(dǎo)致小鼠腦傳代的Nakayama病毒噬斑減少50％的血清稀釋度的倒數(shù)。
b根據(jù)生產(chǎn)商的說明，Biken疫苗1劑含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。
進一步測試PIV在小鼠中的免疫原性。用各種稀釋度的滅活病毒和或不和鋁佐劑一起免疫成年近交小鼠。用在鹽水中或含氫氧化鋁(Rehydragel)的鹽水中的500、50和5ng PIV皮下免疫一組20只6周齡BALB/c小鼠。小鼠接受兩次接種(相隔3周)。在第二次免疫后3周，合并各組小鼠的血清，用小鼠腦傳代Nakayana病毒株作為中和病毒，測試中和抗體的存在(表8)。PIV在所有劑量上均優(yōu)于Biken疫苗，并且佐劑明顯使小鼠對50和500ng PIV的免疫應(yīng)答分別提高了約4和8倍。
表8.用含或不含氫氧化鋁的PIV免疫的小鼠中中和抗體的滴度比較免疫原劑量中和抗體的滴度aPIV 500ng 1∶160PIV 50ng1∶40PIV 5ng 1∶20PIV+鋁500ng 1∶1280PIV+鋁50ng1∶160PIV+鋁5ng 1∶20Biken疫苗 1/10劑 1∶80Biken疫苗 1/100劑 1∶10Biken疫苗 1/1000劑1∶10a中和抗體的滴度定義為導(dǎo)致小鼠腦傳代的Nakayama病毒噬斑減少50％的血清稀釋度的倒數(shù)。
b根據(jù)生產(chǎn)商的說明，Biken疫苗1劑含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。
然后在BALB/c小鼠中測試PIV的體內(nèi)保護效力。為了進行保護試驗，在一組10只3周齡BALB/c小鼠的后腿皮下接種鹽水或含氫氧化鋁(Rehydragel)鹽水中的滅活JE病毒。年齡匹配的對照用PBS或含鋁的非特異性抗原接種。三周后用等效劑量強化小鼠。免疫后3周，通過顱內(nèi)接種含500pfu小鼠神經(jīng)毒性JE病毒(Nakayama，適應(yīng)小鼠大腦)的30微升PBS來攻擊小鼠。每天監(jiān)測受攻擊的小鼠的發(fā)病率和死亡率至第21天。如表9所示，經(jīng)50ng PIV免疫的小鼠表現(xiàn)出90％受保護。另外，經(jīng)50和5ng PIV與鋁的混合物免疫的小鼠分別表現(xiàn)出100％和70％的保護作用，而1/100劑的Biken疫苗只保護了50％的受免疫小鼠。相比，對照組中的所有小鼠均在攻擊后5-7天開始發(fā)病和死亡。
表9受疫苗小鼠抗Nakayama病毒a免疫原攻擊的保護作用免疫原 劑量 存活數(shù)對照bN/A 0/10PIV 500ng 10/10PIV 50ng 9/10PIV 5ng 3/10PIV+鋁 500ng 10/10PIV+鋁 50ng 10/10PIV+鋁 5ng 7/10Biken疫苗c1/10劑10/10Biken疫苗 1/100劑 5/10Biken疫苗 1/1000劑 3/10a小鼠用測試疫苗接種2次(相隔3周)免疫，然后用500pfu小鼠神經(jīng)毒性Nakayama病毒攻擊。
b年齡匹配的對照用PBS或含鋁的非特異性抗原接種。
c根據(jù)生產(chǎn)商的說明，Biken疫苗1劑含有5微克病毒蛋白(能用TCA沉淀)。
為了研究CJ50003病毒在Vero細胞傳代時的免疫學(xué)穩(wěn)定性，獨立純化在Vero細胞中傳代數(shù)不同的病毒，用表8所述的方法評價免疫原性。如表10所示，在Vero細胞中不同病毒傳代數(shù)的病毒制得的疫苗之間，其引發(fā)中和抗體的能力沒有顯著差別，這表明CJ50003病毒在免疫原性方面在Vero細胞代數(shù)上非常穩(wěn)定。
表10用Vero細胞中不同病毒傳代數(shù)的JE病毒制得的疫苗的效力免疫原a劑量中和抗體的滴度S.d.cPIV-4ps0.5微克 1∶15020PIV-6ps0.5微克 1∶14515PIV-15ps 0.5微克 1∶13028PIV-20ps 0.5微克 1∶14018PIV-30ps 0.5微克 1∶16013a免疫原(PIV-Xps)；從CJ50003病毒制得的純化的滅活的疫苗，病毒在Vero細胞中的傳代數(shù)是X。
b中和抗體的滴度定義為導(dǎo)致小鼠腦傳代的Nakayama病毒噬斑減少50％的血清稀釋度的倒數(shù)，取三個分開實驗的結(jié)果的平均值。50％端點用Reed和Muench方法確定。
c標準偏差本文示出的結(jié)果表明，采用CJ50003株的滅活JE病毒疫苗以及活的減毒疫苗均是有前途的。本發(fā)明為在Vero細胞中生長JE病毒、將它們濃縮和純化至適用于人體的程度、以及將它們滅活而抗原性沒有可測定損失提供了相當(dāng)快速的、有效的方法。發(fā)現(xiàn)這些制備物在小鼠體內(nèi)有免疫原性和保護作用。
權(quán)利要求
1.一種減毒的日本腦炎病毒，它通過在Vero細胞上傳代培育來適應(yīng)Vero細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒的日本腦炎病毒，其特征在于，在Vero細胞中的復(fù)數(shù)大于1×107PFU/毫升，對幼成年小鼠的LD50/pfu低于0.000001。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的減毒的日本腦炎病毒，其中該病毒是CJ50003。
4.一種日本腦炎疫苗，它包含權(quán)利要求1所述的日本腦炎病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中用滅活劑來滅活病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中病毒是未經(jīng)滅活劑處理的活的減毒的日本腦炎病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6所述的疫苗，它還包含藥學(xué)上可接受的添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過在Vero細胞上傳代來適應(yīng)Vero細胞的減毒的日本腦炎病毒,以及包含所述減毒病毒的日本腦炎疫苗。
文檔編號A61K39/12GK1272879SQ98809797
公開日2000年11月8日 申請日期1998年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月28日
發(fā)明者金炫洙, 劉王敦, 金壽玉, 李星熙, 文祥帆, 洪璿杓, 申營喆, 鄭用周, K·H·埃克爾斯, B·英尼斯, J·R·普特納克, L·N·賓尼, A·K·斯里瓦斯塔瓦, D·R·杜波依斯 申請人:第一制糖株式會社, 沃爾脫里德軍事研究院