專利名稱：用于治療和預防多毒素梭狀芽胞桿菌毒素導致的疾病的氨基酸序列的制作方法
治療和預防多毒素梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)毒素引起的疾病的氨基酸序列本發(fā)明的內容是從產生抗體的細胞、特別是產生單克隆抗體的雜交瘤細胞獲得可中和多毒素梭狀芽胞桿菌產生的內毒素和/或細胞毒素的氨基酸序列(多肽)。此外，對人體化的針對多毒素梭狀芽胞桿菌毒素的單克隆抗體以及單克隆抗體的多變區(qū)作了描述。最后，本文也講了獲得這些氨基酸序列(多肽)的途徑以及單克隆抗體的具體應用。
眾所周知，大環(huán)內酯抗菌素如克林達霉素(Clindamycin)可引起嚴重的腸道疾病，表現(xiàn)為腹瀉，嚴重時甚至有致死的假膜性結腸炎(PMC)出現(xiàn)。起先，這些疾病被稱為“克林達霉素相關的腹瀉”，現(xiàn)今，人們知道幾乎所有在臨床上采用的抗菌素和細胞抑制劑都可以導致PMC的臨床表現(xiàn)。
臨床上，嚴重腹瀉是PMC的突出癥狀，由于體液和電介質的嚴重損失而導致死亡。隨輕重不同，可出現(xiàn)腹部疼痛、血性腹瀉、高熱和白細胞增多。目前的治療是停用抗菌素并給予萬古霉素以及平衡液體和電解質。
很長時間，人們都沒有弄清楚假膜性結腸炎的病因。直到1977年，證實大便中存在有毒性作用，這種毒性作用對CHO-細胞(中國地鼠卵巢腫瘤細胞)有細胞毒作用。進一步的研究證實，假膜性結腸炎的原因是多毒素梭狀芽胞桿菌及其毒素。
多毒素梭狀芽胞桿菌是專性厭氧、革蘭氏染色陽性桿菌。它可形成近末端卵圓芽胞。其生化特點是可酵解單糖如葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神經氨酸，但不能酵解甘露糖、木糖和阿拉伯糖。由于缺乏神經氨酸酶、β-半乳糖甙酶或涎酸酶，多毒素梭狀芽胞桿菌不能將這些單糖從胃腸粘蛋白的側鏈上裂解開來。在正常人體中，由于其生化特性，梭狀芽胞桿菌在腸道不能構成危害。采用抗菌素或細胞抑制劑時，腸道正常菌叢因多毒素梭狀芽胞桿菌而失調，后果就是PMC。
多毒素梭狀芽胞桿菌產生兩種致病因子內毒素(A毒素)和細胞毒素(B毒素)。這兩種毒素的獲得、提純、特性以及它們在制造單克隆抗體方面的應用，在歐洲專利說明書153 519和209 273、美國專利說明書4 879 218和5 098 826以及國際專利登記WO91/18293中都有詳細說明。
顯然，抗體在防止多毒素梭狀芽胞桿菌感染的后果中起著很重要的作用。在PMC患者身上，可以查到針對A毒素和B毒素抗體。給地鼠抗菌素以后，再將其感染可產生毒素的多毒素梭狀芽胞桿菌，可以在它們身上觀察到典型的PMC，并且地鼠因此而死亡。如果事先用毒素對地鼠進行免疫，則它們不會患病。而毒素可以用抗體進行中和，這些抗體針對C-末端重復配體片段、中央移位片段或針對N-末端催化片段而發(fā)揮效用(片段結構請參見文獻〔1〕)。第一種情況防止了毒素和細胞受體的結合，后種遏制了毒素介導的糖酵解反應，而針對中央移位片段的抗體阻止毒素向細胞內侵入。
這樣，中和A毒素和/或B毒素的抗體提供了一個治療和/或預防多毒素梭狀桿菌引起的疾病的可能性，其作用方式不是滅菌，而是遏制毒素的作用。相應疾病的治療和預防是對因的。
以A毒素為例，DSM ACC 2322細胞系可產生TTC8抗體，此抗體不僅和A毒素結合，而且也可中和其生物作用。TTC8抗體和A毒素結合的位置已經確定是在重復配體片段內?？贵w和毒素的結合防止了后者和細胞受體的結合。單克隆抗體TTC8的結合位置是在A毒素的2480-2539氨基酸之間，其抗原序列(很可能)是TINGKYYF。美國US4879218號專利說明中的單克隆抗體PCG-4是和A毒素的2098-2141氨基酸之間的蛋白片段結合。
DSM ACC 2321細胞系產生的單克隆抗體2CV同樣是和B毒素的配體片段向結合。位置是在B毒素的2233-2366氨基酸之間的蛋白片段。單克隆抗體PCG-4和單克隆抗體TCC8都是小鼠抗體，它們雖不適于人體治療，但很適合作為診斷的輔助工具。
下面是我們實驗室生產的單克隆抗體及其特性針對目標毒素a)毒素b)催化片段b)1212 2612，2688，3110，1502，1115移位片段b)2825，2836，5288 2703，2740，2747，2754，5288，2784，2788配體片段b)2620，TTC8 2912，2914，2916，2926，2562 2CV注釋a)抗體在免疫電泳識別列舉區(qū)域的重組蛋白。
b)A毒素和(B)毒素的片段氨基酸位置催化片段1-879(1-877)；移位片段880-1848(878-1850)；配體片段1849-2681(1851-2360)。
所有上述講到的毒素特異單克隆抗體是從小鼠獲得的，除小鼠以外，在別的種屬(人或動物)這些抗體不能用于治療和預防疾病。小鼠外的種屬會識別這些抗體，因而產生免疫反應，造成抗體失活。因為目前不能確定這些抗體的變區(qū)和多變區(qū)，所以不能做到通過改良而使其適用于其他種屬，特別是人體。
本發(fā)明的目的是獲得適用于人體和其他動物的多肽，這些多肽有中和毒素的特性，但沒有過強的免疫成分。多肽中和毒素作用的基礎是抗體變區(qū)和相應毒素的結合。結合主要是由多變區(qū)決定(CDRcomplementarity determing region)。所以，關鍵在于鑒別和改良和毒素結合并中和毒素作用的區(qū)域(變區(qū)和多變區(qū)(CDR))，改良的目的在于避免免疫反應。這些多肽既可用于治療也可用于預防多毒素梭狀芽胞桿菌引起的疾病，既適于人體也適于動物。
就目前的科研結果來看，多毒素梭狀桿菌的A毒素可導致典型的假膜性結腸炎(PMC)，而針對A毒素的單克隆抗體TTC8在活體(小鼠)可以中和其毒性作用。單克隆抗體TTC8屬于IgG2b，其和A毒素特異性識別是由重鏈和輕鏈的多變區(qū)介導的。也就是說，抗體的(或者多肽的)特定片段負責識別抗原。鑒別多變區(qū)可使我們將多肽結構整合到其他種屬的抗體序列上，從而使這些抗體適合于治療和預防多毒素梭狀芽胞桿菌引起的疾病，并且消除了從小鼠身上獲得的抗體會引起的副作用。
因此，問題在于查明核甙酸及其相應的氨基酸序列。以部分多肽的形式或適于人體的抗體形式(整合到人類抗體基因內)用來治療及預防人體疾病。如前面提到的對產生TTC8抗體的DSM2322細胞系的有關序列確定。TTC8抗體通過遏制A毒素的配體片段而中和其生物活性。
在DSM ACC 2322細胞系，多變區(qū)和變區(qū)多肽片段是SEQ ID No 1-12和/及SEQ ID No 13-16。這些片段在TTC8單克隆抗體起對毒素的中和作用。確定起中和作用抗體的變區(qū)可使生產相應的多肽成為可能。通過和多毒素梭狀芽胞桿菌的內毒素和/或細胞毒素結合，這些多肽可消除毒素的生物效應。如SEQ ID No 13和/或SEQ ID No 16序列可單獨或者整合到免疫球蛋白內用來治療及預防多毒素梭狀芽胞桿菌引起的疾病。要用于人體，則整合到人體球蛋白；用于動物，則整合到動物球蛋白。
這些多肽的衍生物可通過氨基酸的切斷、插入、增加或交換，也就是說通過對位基因變換而獲得，這些衍生物可和本來的多肽一樣通過和多毒素梭狀芽胞桿菌的內毒素和/或細胞毒素相結合而消除其生物活性，因而同樣可用來治療及預防多毒素梭狀芽胞桿菌引起的疾病。
從德國微生物及細胞株收集有限公司(DSMZ)的DSM ACC 2322細胞系分離的TTC8抗體多變區(qū)(CDRs＝complenentarity deternimingregions)已被確定。其氨基酸序列如下重鏈的CDRCDR-1-Asn-Tyr-Trp-Met-Asn-(SEQ ID No 2)
CDR-2-Arg-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asp-Gly-Asp-Ala-His-Tyr-Asn-Gly-Lys-Phe-Lys-Gly-(SEQ ID No 4)CDR-3-Gly-Gly-Asn-Tyr-Asp-Asn-Arg-Val-Phe-Asp-Tyr-(SEQ ID No 6)輕鏈的CDRCDR-4-Lys-Ala-Ser-Gln-Asn-Val-Gly-Thr-Asn-Val-Ala-(SEQ ID No 8)CDR-5-Ser-Pro-Ser-Tyr-Arg-Tyr-Ser-(SEQ ID No 10)CDR-6-Gln-Gln-Tyr-Asn-Ser-Tyr-Pro-Leu-Thr-(SEQ ID No 12)這些序列是這樣確定的第一步是先將產生TTC8抗體的雜交瘤細胞的整個RNA準備好，第二步是將mRNA從整個的RNA分離開來。采用的是和小(dt)25鏈結合的聚苯乙烯珠(Beads)。
從凈化的mRNA合成CDNA，然后通過多聚酶鏈式反應(PCR)得到單克隆抗體TTC8的VH基因和VL基因，它們編碼TTC8抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)。這里，要注意的是選擇有合適限制切點的多聚體，以便于克隆化的進行。
對單克隆抗體TTC8的VH基因和VL基因在puc 19進行克隆化，然后排序。由此找到了核甙酸(SEQ ID No 13和15)和相應的氨基酸序列SEQ ID No 14和SEQ ID No 16。
通過和胚層基因V102的比較，可鑒定出多變區(qū)，從重鏈基因(SEQID No 13)看出，重鏈的CDR-1包括5個氨基酸，從序列的30位開始。重鏈的CDR-2從49位開始，包括17個氨基酸。多變區(qū)的CDR-3從98位開始，包括11個氨基酸。
和胚層基因相比，單克隆抗體TTC8的VH-基因有36個等位基因變換。三個變換位于PCR-多聚體的結合區(qū)，可能是多聚體的序列所至。幾乎所有位于多變區(qū)的變換都導致氨基酸序列的變化，而大約位于框架區(qū)變換的一半不起作用。
輕鏈基因(SEQ ID No 15)的多變區(qū)確定如下CDR-4從22位開始，包括11個氨基酸；CDR-5從48位開始，包括7個氨基酸；CDR-6從87位開始，包括9個氨基酸。和單克隆抗體A23相比，單克隆抗體TTC8的VL-基因只有9個變換，其中4個位于多聚體的結合區(qū)。其他5個在核甙酸序列中的變換有2個變換在蛋白質水平不起作用。導致氨基酸序列變化的變換有一個在CDR-4，另外兩個在2和3結構區(qū)。
用同樣的方法，可以確定單克隆抗體2CV多變區(qū)的序列，2CV抗體由DSMZ提供的DSM ACC 2321號雜交瘤細胞系產生，此抗體可以識別多毒素梭狀芽胞桿菌的細胞毒素(B毒素)。
從小鼠獲得的單克隆抗體用于人體治療會導致免疫反應。為解決這個問題，可以將抗體加以改良以適于待治療的種屬(這里指人體)，也就是說，可以將抗體人體化。用相應的人體抗體成分來取代小鼠單克隆抗體中的免疫成分的方法很多，比如歐洲專利說明書中眾所周知的184187、171 496和173 494。
用這些方法獲得的人體化的單克隆抗體比從小鼠獲得的抗體更適于人體治療。
這些將抗體人體化的方法同樣也可用來改良TTC8單克隆抗體以及其他的中和A毒素和B毒素的單克隆抗體，使其成為人體化的單克隆抗體。這種人體化的單克隆抗體是由兩種成分構成的雜合子有中和作用的單克隆抗體TTC8的多變區(qū)(如TTC8的SEQ ID No 1-12)插入到人體免疫球蛋白的構造區(qū)。免疫球蛋白可以是IgG亞型(主要用于胃腸外)也可以是IgA亞型(主要用于口服)。和來源于DSM ACC 2322細胞系的TTC8抗體一樣，其他針對多毒素梭狀芽胞桿菌的單克隆抗體的多變區(qū)同樣可以克隆化、編序而用于生產人體化的抗體。
另外一個發(fā)明是，通過等位變換改變人類免疫球蛋白的變區(qū)和/或常區(qū)內輕鏈和/或重鏈的氨基酸序列，其和多毒素梭狀芽胞桿菌的A毒素和/或B毒素相結合的能力依然存在。
生產所發(fā)明的單克隆抗體的生物“構件”，除特別講明的以外，都有商品出售，如細胞系、質體、啟動基因和復制源等。如果沒有特別強調，這些生物“構件”對本發(fā)明沒有決定性的影響，因為可以用其他的合適成分來替代它們。病毒宿主細胞用來加強所發(fā)明的DNA序列，如埃希氏大腸桿菌或桿菌屬。
人體化抗體的生產可用真核生物細胞如酵母細胞、真菌或CHO(中國地鼠卵巢細胞)。如采用植物，則可用單子葉或雙子葉植物。
下面舉例說明用植物生產抗體的情況，其他類似。
用植物生產抗體的例子見〔2〕和國際專利說明書WO91/06320。用異基因植物生產單克隆抗體時，通過控制植物的一個或兩個啟動基因，在植物轉換介質內將單克隆抗體的基因或其重組衍生物基因或單鏈抗體基因克隆化。
最終的轉換介質中存在所有的待轉換到植物中的DNA序列，這些序列從介質中轉換到植物中去。另外一個途徑是，將重鏈和輕鏈的基因分開整合到植物轉換介質中，分別轉換到植物細胞中去，然后再組合成完整抗體。植物轉換可用多種合適的途徑進行，如借助于植物肥大病菌屬、直接基因轉換或粒子槍。
抗體的生產可有針對性的在細胞的不同隔室內進行。分離對信息肽編碼的序列時，從細胞漿提取抗體。為提高抗體的表現(xiàn)力，在基因的5’-末端聯(lián)結一段DNA-序列或保存已有的序列，此序列編碼輸送到內質網(wǎng)的信息多肽。為確定細胞室，可將對多肽序列編碼的DNA序列融合到基因中，如通過KDEL-序列實現(xiàn)在內質網(wǎng)的滯留。
抗體基因整合到多基因植物可通過植物染色體組DNA的分離和接著的諾登雜交進行分析和證實。基因的轉錄可用諾登電泳證實。生物合成的抗體可借助于特異次極抗體、針對常區(qū)多克隆或單克隆抗體、針對添加的序列(所謂Tag-序列)的單克隆或多克隆抗體在植物提取液中得到證明。
適合用的植物既有單子葉植物如大麥、小麥，也有雙子葉植物如土豆、芝麻、胡蘿卜和豌豆?？贵w的提取可在植物的不同器官如葉子、種子、塊莖等。
從植物提取的抗體可通過色譜方法而純化，而色譜法一般情況下用于純化從雜交瘤獲取的抗體。此外，含有Tag-序列的重組抗體可用專門的親合色譜方法如金屬螯合色譜進行純化。
所發(fā)明的人體化的單克隆抗體可經常規(guī)途徑給予病人，治療或預防多毒素芽胞桿菌導致的疾病。一般情況下，所發(fā)明的抗體經胃腸外給藥，但最好是口服。可以考慮將含有抗體的植物作為生的素食品直接給病人吃。至于劑量問題，要按病人的情況如體重、年齡和病情的不同而不同。劑量要由有經驗的醫(yī)生確定，正常情況下是0.1mg/kg到70mg/kg，每天一次或多次給藥，連給數(shù)天。
例子例1產生TTC8單克隆抗體的雜交瘤細胞DSM ACC 2322全部RNA的獲取用CsCl-梯度純化RNA時用胍硫氰酸鹽緩沖液打開細胞，然后機械打碎，細胞碎片離心分離，然后將溶液澆到CsCl-墊上(5.7M)。經過離心，RNA成球形沉積到試管的底部。用加熱過的手術刀將試管的底部切開后，用H2O溶解球狀的RNA。通過沉積對溶液作一步地濃縮，最后使溶液的總量在100μl H2O，RNA的濃度在1.5-3μg/μl之間。
例2mRNA的分離按Dynal的方法用小(DT)25珠將mRNA雜交而從其他的RNA分離。珠子的結合力是每mg結合2μg RNA，mRNA占全部RNA量的1-5％，所以1mg的小珠表面結合有80μg的RNA，純化按照Dynal公司的辦法，但略有不同結合的mRNA先用緩沖液清洗兩次，緩沖液的成分是10mMTris/HCl(pH值7.5)、0.15mM LiCL、1mM EDTA、1％SDS。然后再用鹽成分較低的緩沖液洗兩次〔5mM Tris/HCL(pH值7.5)、75mM LiCl、0.5mM EDTA〕。其他步驟和Dynal公司一樣，添加SDS并用低鹽緩沖液加洗一次可提高mRNA的純度。
例3cDNA的合成采用MMLV-反轉錄酶(Moloney Murine Leukemia Virus)從純化的mRNA合成cDNA，為提高雜交mRNA-小(dT)分子的含量，小(dT)12-18聚合物的量比需要的高出兩倍，反應時三磷酸吡啶核甙酸的濃度為1mM，為防止溶液中RNA的分解，添加了人體胎盤核糖核酸酶抑制劑。所獲的ssDNA用于增加單克隆抗體TTC8的多變區(qū)的PCR-反應。
例4為增加cDNA的多聚酶鏈式反應cDNA的增加按照歐洲專利說明書0 388 914中的方法進行。根據(jù)一系列的文獻設計了用于增加小鼠單克隆抗體多變區(qū)的聚合物，如下重鏈(畫線部分表示添加的SalI切點)VH5Prim5’-AGGTCGACCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG-3’VH3Prim5’-ACGGTGACAGTCGACCCTTGGCCCC-3’輕鏈(畫線部分表示添加的SacI切點)VL5Prim5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’VL3Prim5’-GTTTGAGCTCCAGCTTGGTCCC-3’獲取多變區(qū)的聚合物最佳濃度是0.5μM，dNTP的最終濃度是400μM。
第二個重要的參數(shù)是PCR-溫度，VH的反應順序為變性1分鐘，92℃；恢復1.5分鐘，50℃；伸長3分鐘，72℃，如此循環(huán)30次。VL的反應順序是變性1分鐘92℃；恢復1.5分鐘60℃；伸長3分鐘，72℃，如此循環(huán)30次。
例5單克隆抗體TTC8的VH-基因和VL-基因的克隆化PCR-產物用SalI(VH)或SacI(VL)切開并用瓊脂凈化。克隆化在pUC19內均勻切點進行。目的克隆是通過控制消化確定的pVHT8和pVLT8.10構造物，它們有VH或VL-序列，這些序列和pUC19的啟動基因成正序。
例6單克隆抗體TTC8多變區(qū)的編序插入物pVHT8的大小是341bp，pVLT8.10克隆的大小是312bp。兩種克隆都具有在整個插入物延伸的閱讀系統(tǒng)。PCR-聚合物的序列和切點很容易被鑒別。
通過序列的比較可將VH-片段歸到J558多基因族，它和胚層序列V102有極大程度的相似性。
單克隆抗體TTC8的VL-區(qū)基因和來源于胚層基因vk19d的抗體有94％的一致性，所以TTC8的VL-區(qū)也應歸結到這一基因族。
例7人體化的單克隆抗體的生產為避免用來源于其他種族(下面成為非人類抗體)的抗體時在人體導致免疫反應，必須將抗體的免疫區(qū)用人體的相應區(qū)域來替代。為此，有兩種途徑1)小鼠/人體雜合抗體，其中決定抗原性的變區(qū)是非人類抗體，而常區(qū)則來源于人類抗體。
2)單克隆抗體的完全人體化。單克隆抗體變區(qū)的構件區(qū)域由相應的人體序列來替代，只是CDR-區(qū)域保留或通過點變換的形式保留。
有大量的文獻對此有報道，而且也為本領域的專業(yè)人員所熟知。
說明1)雜合抗體是在適當?shù)慕橘|中，將人體抗體的常區(qū)和非人類抗體的變區(qū)相結合?？梢陨a一個完整的雜合抗體，也可生產雜合抗體的一部分，稱之為Fab-殘片〔3〕。生產雜合抗體的優(yōu)點是方法較為簡便，由于小鼠抗體被部分保留的緣故，其有較高的抗原性，但在經口服時不會成為問題。
說明2)非人體單克隆抗體的完全人體化時，首先通過序列比較和3維模型找到一個人體抗體，此人體抗體的結構和非人體單克隆抗體的結構相似。然后，通過應用五個和人體抗原(VL或VH)的變區(qū)結合的小核甙酸聚合物以及三個含有小鼠抗體的CDR-區(qū)域序列的核甙酸，借助于PCR-反應生產完全人體化的抗體變區(qū)的基因〔4〕。另外一個改良過的方法是，將數(shù)個有部分重復的對目的序列編碼的小核甙酸合成基因〔方法參見4〕。兩種抗體的構造區(qū)的氨基酸可通過有針對性的基因變換而一致化〔5〕。這樣改良的抗體有其種族特異性的變化，而此變化可以通過反變換而得到平衡〔5〕。最后一種生產完全人體化抗體的方法比較復雜，但在人體幾乎沒有免疫反應〔6〕。
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序列記錄(1)一般說明(i)申請人(A)姓名克里斯托夫·馮·埃歇爾—史泰伯(Christoph vonEichel-Streiber)(B)街道賓根路15號(C)城市施韋珀豪森(D)聯(lián)邦州萊菌蘭—法耳茨(E)國家聯(lián)邦德國(F)郵政編碼55444(G)電話號碼06724/3398(H)傳真號碼06724/941078(ii)發(fā)明名稱治療和預防多毒素梭狀芽胞桿菌毒素導致的疾病的氨基酸序列(iii)序列數(shù)量16(iv)計算機閱讀版本(A)數(shù)據(jù)載體軟盤(B)機型IBM個人電腦兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatenIn Release #1.0，Version #1.30(EPA)(vi)原始申請資料(A)申報號碼DE 19739685.2(B)申報日期1997年9月10日(2)SEQ ID No 1說明(i)序列標志(A)長度15個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學特征不明
(ii)分子種類cDNA(iii)假定的不(iv)ANTISENSE不(v)殘片種類重鏈CDR1(vi)原始來源D(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編號CDS(B)位置1……15(xi)序列描述SEQ ID No 1AAC TAC TGG ATG AACAsn Tyr Trp Met Asn1 5(2)SEQ ID No 2說明(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子的種類重鏈CDR1蛋白序列(xi)序列描述SEQ ID No 2Asn Tyr Trp Met Asn1 5(2)SEQ ID NO 3說明(i)序列特征(A)長度51個堿基對。
(B)種類核甙酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學不明(ii)分子種類cDNA(iii)假定不(iv)ANTISENSE不(v)殘片種類重鏈CDR2(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……51(xi)SEQ ID No 3描述CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GCG AAG TTC AAGArg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys510 15GGC5Gly(2)SEQ ID No 4的說明(i)序列特征(A)長度17個氨基酸。
(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子種類CDR2——重鏈的蛋白序列(xi)SEQ ID No 4的描述Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys1 510 15Gly(2)SEQ ID No 5的說明(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲不明(ii)分子種類cDNA(iii)假定沒有(v)殘片的種類重鏈CDR3(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……33(xi)SEQ ID No 5的序列描述GGGGGGAATTACGACGACAGGGTCTTTGACTACGlyGlyAsnTyrAspAspArgValPheAspTyr1 5 10(2)SEQ ID No 6說明(i)序列特征(A)長度11個氨基酸。
(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子種類CDR3重鏈蛋白序列
(xi)SEQ ID No 6的序列描述GlyGlyAsnTyr AspAspArgValPheAspTyr15 10(2)SEQ ID No 7說明(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學不明(ii)分子種類cDNA(v)殘片的種類輕鏈多變區(qū)(CDR)(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……33(xi)SEQ ID No 7的序列描述AAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCLysAlaSerGlnAsnValGlyThrAsnValAla5 10(2)SEQ ID No 8的說明(i)序列特征(A)長度11個氨基酸。
(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型
(ii)分子的種類輕鏈CDR1蛋白序列(xi)SEQ ID No 8序列描述LysAlaSerGlnAsnValGlyThrAsnValAla15 10(2)SEQ ID No 9的說明(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲不明(ii)分子類型cDNA(iii)假定不是(v)殘片的種類輕鏈CDR2(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……21(xi)SEQ ID No 9的序列說明TCGCCATCCTACCGGATCAGTSerProSerTyrArgTyrSer5(2)SEQ ID No 10的說明(i)序列特征(A)長度7個氨基酸。
(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子的類型輕鏈CDR2蛋白序列(xi)SEQ ID No 10的序列描述SerProSerTyrArgTyrSer1 5(2)SEQ ID No 11的說明(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲不明(ii)分子的種類cDNA(iii)假定沒有(iv)ANTISENSE不(v)殘片的種類輕鏈CDR3(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……27(xi)SEQ ID No 11的描述CAG CAA TAT AAT AGC TAT CCT CTT ACGGln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr(2)SEQ ID No 12的說明(i)序列特征(A)長度9個氨基酸。
(B)種類氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子的種類輕鏈CDR3蛋白序列(xi)SEQ ID No 12的序列描述Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr1 5(2)SEQ ID No 13的說明(i)序列特征(A)長度341個堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲不明(ii)分子的種類cDNA(iii)假定不是(v)殘片的種類重鏈多變區(qū)VH(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1……341(IX)特征(A)名稱/編碼primer_bind
(B)位置1……21(D)其他說明/label＝VH5PRIM(ix)特征(A)名稱/編碼primer_bind(B)位置325……341(D)其他說明/label＝VH3PRIM(xi)SEQ ID No 13的序列描述GTC GAC CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCC TCAVal Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 510 15GTG AAG ATT TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC GCA TTC AGT AAC TAC TGGVal Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp20 25 30ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA AAG GGT CTT GAG TGG ATT GGAMet Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly35 40 45CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAGArg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys50 55 60GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATGGly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAC TTC TGT GCAGln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala85 90 95AGA GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGGArg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110TCG ACSer(2)SEQ ID No 14說明(i)序列特征(A)長度113個氨基酸(B)種類氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子的種類重鏈的變區(qū)VH蛋白序列。
(xi)SEQ ID No 14的序列描述Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 510 15Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp20 25 30Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly35 40 45Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys50 55 60Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala85 90 95Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Ser(2)SEQ ID No 15的說明(i)序列特征(A)長度312堿基對(B)種類核甙酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲不明(ii)分子的種類cDNA(iii)假設不是(iv)ANTISENSE不是(v)殘片的種類輕鏈的變區(qū)(vi)原始來源(B)株單克隆抗體TTC8(H)細胞系雜交瘤(vii)直接來源(A)庫DSM ACC 2322(ix)特征(A)名稱/編碼primer_bind(B)位置1……18(D)其他說明/label＝VL5Prim(ix)特征(A)名稱/編碼primer_bind(B)位置289……312
(D)其他說明/label＝VL3PRIM(ix)特征(A)名稱/編碼CDS(B)位置1…312(xi)SEQ ID No 15的描述GAG CTC ACC CAG TCT CCA AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGGGlu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg1 510 15GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCCVal Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala20 25 30TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGG CAA TCT CCT AAA ACA CTG ATT TAC TCGTrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser35 40 45CCA TCC TAC CGG TAC AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGAPro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly50 55 60TCT GGG ACG GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AAT GTG CAG TCT GTT GACSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Val Asp65 70 75 80TTG GCA GAG TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAT AGT TAT CCT CTT ACG TTCLeu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe85 90 95GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAG CTCGly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu100(2)SEQ ID No 16的說明(i)序列特征(A)長度104個氨基酸(B)種類氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子的種類輕鏈的多變區(qū)VL蛋白序列。
(xi)SEQ ID No 16的描述Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg1 510 15Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala20 25 30Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser35 40 45Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly50 55 60Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Val Asp65 70 75 80Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe85 90 95Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu100
權利要求
1.完全或部分從可和多毒素梭狀芽胞桿菌的A毒素和/或B毒素或者和多毒素梭狀芽胞桿菌A毒素和/或B毒素的重組殘片相結合的抗體多變區(qū)序列獲得的氨基酸序列(多肽)。
2.權利要求1和多毒素梭狀芽胞桿菌的A毒素和/或B毒素相結合而中和毒素的生物效應的氨基酸序列(多肽)。
3.按權利要求1和2中可以通過聚合物對VH5Prim/VH3Prim或VL5Prim/VL3Prim經多聚酶鏈式反應而獲得的DNA-序列和由此得出的氨基酸序列(多肽)。
4.權利要求3中的可以通過和聚合物VH5Prim、VH3Prim、VL5Prim、VL3Prim其中的一個或幾個相似的聚合物對而獲得的DNA-序列以及相應的氨基酸序列(多肽)。
5.權利要求的1和4中的用多毒素芽胞梭狀桿菌的A毒素和/或B毒素或者這些毒素的重整殘片免疫以后，這些氨基酸序列確定編碼抗體變區(qū)的基因氨基酸序列。
6.編碼權利要求5中的氨基酸序列的DNA-序列。
7.權利要求1和2中的以單價或多價識別和A毒素和/或B毒素的一個或數(shù)個配體片段、移位片段或催化片段的抗原區(qū)的氨基酸序列。
8.編碼7中的氨基酸序列的DNA-序列。
9.由權利要求1到8中的氨基酸序列通過點變換(氨基酸交換、插入、去掉或添加)而得的氨基酸序列。
10.權利要求1和2中的部分或完全含有DSM AC 2322細胞系的SEQID No1-12(CDR-序列)和/或SEQ ID No 13-16(屬VL和/或VH的變區(qū))氨基酸序列。
11.和權利要求10中提到的來源于DSM AC 2322細胞系變區(qū)一致的氨基酸序列。
12.權利要求1和2中的含有部分或完整的DSM AC 2321細胞系VL和/或VH變區(qū)序列的氨基酸序列。
13.和權利要求12中提到的來源于DSM AC 2321細胞系變區(qū)序列一致的氨基酸序列。
14.人體化的由DNA重組技術而得，含有整合到人體抗體機構區(qū)(FRs)的全部或單個來源于其他種屬并且和多毒素梭狀芽胞桿菌的內毒素和/或細胞毒素相結合的抗體輕鏈和/或重鏈的多變區(qū)(CDRs)的單克隆抗體。
15.權利要求14中提到的構造區(qū)(Frs)和人體抗體的gamma或alpha亞型一致的人體化抗體。
16.權利要求14和15中提到的人體化的通過改良和多毒素梭狀芽胞桿菌的A毒素和/或B毒素相結合的抗體且改良的方法是保留或改善其結合力，通過在氨基酸內部點變換改變抗體輕鏈和重鏈的變區(qū)和常區(qū)而獲得的單克隆抗體。
17.權利要求14到16中提到的部分或完全含有來源于DSM ACC2321或2322細胞系的單克隆抗體的多變區(qū)的人體化單克隆抗體。
18.權利要求14到17中提到的多變區(qū)(CDRs)有氨基酸序列ID No.1到No.12或經其點變換而得的序列的人體化單克隆抗體。
19.和權利要求14和18中提到的含有家畜的結構區(qū)的抗體相似的抗體。
20.權利要求1和2中提到的用生化方法通過多肽合成而得、用于預防和治療人體和動物的氨基酸序列。
21.獲得在真核生物及前核生物細胞內權利要求1和2中提到的用于預防和治療的多肽的方法以及獲得權利要求14到19中提到的種族適應的單克隆抗體的方法。
22.權利要求21中提到的用革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的前核生物的方法。
23.權利要求21中提到的用酵母、真菌、和動植物真核生物的方法。
24.權利要求23中提到的用單子葉和雙子葉植物的方法。
25.權利要求24中提到的反應在植物的確定器官內進行的方法。
26.權利要求23和24中提到的方法的具體應用包括經植物獲得的氨基酸序列或抗體分離和純化后或者作為生的素食品用來治療和預防多毒素梭狀芽胞桿菌內毒素或細胞毒素引起的疾病。
27.含有權利要求1到13中提到的多肽或含有權利要求14到19中提到的種族適應的單克隆抗體的藥物的合成。
28.權利要求27中提到的胃腸外給藥的藥物合成。
29.權利要求27中提到的經口給藥的藥物合成。
全文摘要
講述識別多毒素梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile)內毒素(A毒素)或細胞毒素(B毒素)配體片段的抗原決定區(qū)、移位片段和催化片段并且可中和這些毒素的單克隆抗體。以及單克隆抗體的生產和在治療、預防相應毒素導致的疾病方面的應用。
文檔編號A61P31/04GK1273588SQ98808996
公開日2000年11月15日 申請日期1998年9月10日 優(yōu)先權日1997年9月10日
發(fā)明者克里斯托夫·馮·艾克爾－施特賴伯, 麥克爾·默斯 申請人:克里斯托夫·馮·艾克爾－施特賴伯