專利名稱：類胡蘿卜素制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素分散在由脂肪酸和甘油酯化所得的油中的制劑。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及類胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素在中鏈甘油三酯油中的制劑。
本發(fā)明的背景技術(shù)近年來(lái)，不論是研究人員還是企業(yè)，對(duì)稱為類胡蘿卜素的這類化合物的研究興趣都在增加。類胡蘿卜素是廣泛存在于植物和動(dòng)物中的天然物質(zhì)，并且通常是有色化合物，它們大多使水果和蔬菜呈黃色到紅色。甲殼綱動(dòng)物例如龍蝦的紅色和奶油的乳色也是由于類胡蘿卜素所致。流行病學(xué)研究表明，類胡蘿卜素番茄紅素(番茄紅素的主要飲食來(lái)源是番茄)在人體內(nèi)具有抗癌作用。然而，到目前為止，沒有任何關(guān)于食用番茄紅素在已建立的動(dòng)物模型內(nèi)抑制腫瘤發(fā)展的能力的研究。
由于類胡蘿卜素在低濃度也具有高強(qiáng)度顏色，并且從天然物中提取它們的成本很高，所以在本世紀(jì)中葉，有機(jī)化學(xué)家成功地合成了一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素和角黃素以及一些衍生物已經(jīng)成為市售食用色素、食品強(qiáng)化劑和動(dòng)物色素前體，特別是由Europeancompanies Hoffman-LaRoche AG和BASF AG出售的商品。
類胡蘿卜素具有獨(dú)特的共軛碳-碳雙鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)。在主要的市售類胡蘿卜素中，有9個(gè)雙鍵，它們使得分子具有特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)。尤其是，類胡蘿卜素與氧和游離基的反應(yīng)性很強(qiáng)，因此類胡蘿卜素可歸為常用抗氧化劑。類胡蘿卜素存在于人、動(dòng)物和植物組織中。出于對(duì)環(huán)境的應(yīng)急狀態(tài)例如高于正常溫度和高光強(qiáng)度的反應(yīng)，一些生命體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生較高濃度的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素在水中的溶解度通常很低，因此其位于活細(xì)胞的膜和脂質(zhì)聚集體內(nèi)。在生命體內(nèi)，類胡蘿卜素的濃度通常相當(dāng)?shù)?，大約為10-100ppm。
在制備現(xiàn)在可從天然物中提取到以及可通過(guò)化學(xué)合成方法制得的高濃度市售類胡蘿卜素產(chǎn)品過(guò)程中，需要穩(wěn)定類胡蘿卜素以使其不被空氣中的氧氧化。類胡蘿卜素分子也會(huì)由于酶或微生物作用而降解，但是這種情況通常在低濃度(例如低于0.1％)和水環(huán)境下發(fā)生。氧化速率與類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。一些類胡蘿卜素的反應(yīng)性非常強(qiáng)，并且其均勻分散的高濃度晶體形式在空氣中能自動(dòng)引發(fā)反應(yīng)。番茄紅素是其中一種最易氧化的常見類胡蘿卜素，并且在制備市售產(chǎn)品的過(guò)程中，穩(wěn)定番茄紅素或含番茄紅素的組合物對(duì)于整個(gè)產(chǎn)品非常重要。不能防止一些類胡蘿卜素的氧化已給其帶來(lái)了商業(yè)化困難。
據(jù)證實(shí)，類胡蘿卜素的穩(wěn)定通常很困難。其中一種有助于防止氧化的手段是在惰性氣體中保存純的結(jié)晶類胡蘿卜素物質(zhì)，然而，這僅在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上有實(shí)際意義，并沒有商用價(jià)值。還已知將類胡蘿卜素組合物懸浮在甘油三酯油(例如大豆油)中以幫助防止氧化。雖然據(jù)證明使用用溶劑和大豆提取的大豆油(碳鏈長(zhǎng)主要為C16-C18的油)對(duì)一些類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素非常有效，但是在商業(yè)規(guī)模上其不能阻止其它類胡蘿卜素如番茄紅素的降解。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的目的是提供抗類胡蘿卜素氧化的方法。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素在由脂肪酸和甘油酯化所得的油(不是用溶劑從天然物中提取的油)中的懸浮液或分散液能減輕類胡蘿卜素的氧化。此外，已發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素在鏈長(zhǎng)為C6-C12的油(下文稱為“中鏈甘油三酯油”)中的懸浮液或分散液使類胡蘿卜素的氧化顯著下降。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明附

圖1圖解說(shuō)明了實(shí)施例1中所述的兩種組合物的穩(wěn)定性(各測(cè)試小瓶的平均值)。
附圖2描述了實(shí)施例2所述的10周試驗(yàn)的時(shí)間線以確定番茄紅素在雄性大鼠(結(jié)腸模型)和雌性大鼠(乳房模型)中的最大耐受劑量(MTD)。
附圖3表示海膽酮和番茄紅素的HPLC數(shù)據(jù)。
附圖4表示所有5種標(biāo)準(zhǔn)類胡蘿卜素，即玉米黃質(zhì)、角黃素、海膽酮、番茄紅素、和β-胡蘿卜素的HPLC數(shù)據(jù)。
附圖5表示用結(jié)晶番茄紅素和海膽酮產(chǎn)生的番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
附圖6表示番茄紅素懸浮液的HPLC分析結(jié)果。
附圖7表示番茄紅素懸浮液中存在的類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
附圖8-11表示番茄紅素對(duì)動(dòng)物體重增加的影響。
附圖12表示從肝臟中提取的皂化有機(jī)提取物的HPLC-MS分析結(jié)果，該結(jié)果表明其中含有大量的番茄紅素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素及它們的幾何異構(gòu)體。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述一方面，本發(fā)明提供了包含胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素在由脂肪酸和甘油酯化所得的油中的懸浮液/分散液的制劑。使用這樣已酯化的油基本上減小了制劑中出現(xiàn)雜質(zhì)—即在用溶劑從天然物如大豆中提取的油中存在的雜質(zhì)的可能性。優(yōu)選使用基本上純凈的脂肪酸和甘油來(lái)進(jìn)行酯化。優(yōu)選通過(guò)蒸餾來(lái)純化脂肪酸。所用油優(yōu)選為中鏈甘油三酯油。甘油三酯是脂肪酸和甘油成的酯。脂肪和油的主要組分—甘油三酯具有通式CH2(OOCR1)CH(OOCR2)CH2(OOCR3)，其中R1、R2和R3可具有不同鏈長(zhǎng)。在本發(fā)明說(shuō)明書上下文中，優(yōu)選的甘油三酯的鏈長(zhǎng)為C6-C12、更優(yōu)選C8-C10。
另一方面，本發(fā)明提供了包含類胡蘿卜素組合物或類胡蘿卜素在中鏈甘油三酯油中的懸浮液/分散液的制劑。再一次優(yōu)選的是，中鏈甘油三酯油的鏈長(zhǎng)為C8-C10。所述中鏈甘油三酯油優(yōu)選用脂肪酸和甘油酯化制得。同樣，優(yōu)選使用基本上純凈的脂肪酸和甘油來(lái)進(jìn)行酯化，其中優(yōu)選通過(guò)蒸餾來(lái)純化脂肪酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的形式中，類胡蘿卜素組合物主要包含類胡蘿卜素。類胡蘿卜素優(yōu)選選自番茄紅素、β-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素和六氫番茄紅素或它們的混合物。番茄紅素是優(yōu)選的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素組合物和類胡蘿卜素優(yōu)選得自天然物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，中鏈甘油三酯油是市售的Delios VTM，這是由Grunan Lebensmitteltechnologie生產(chǎn)的中鏈甘油三酯油。另一優(yōu)選的中鏈甘油三酯油被登記為CAS 73398-61-5，這是用辛酸和癸酸制成的混合甘油三酯。該中鏈甘油三酯油可以其商品名Neobee從Stepan Co.，Northfield，lllinois購(gòu)得。中鏈甘油三酯油的酸單體優(yōu)選選自C6己酸、C8辛酸、C10癸酸和C12月桂酸或它們的混合物。優(yōu)選使用純化的脂肪酸和甘油來(lái)制備中鏈甘油三酯油，因?yàn)槭褂眠@些材料能減小油中含有還會(huì)引起類胡蘿卜素氧化的雜質(zhì)的可能性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，中鏈甘油三酯油得自天然物。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，類胡蘿卜素占制劑重量的高達(dá)10％。類胡蘿卜素優(yōu)選占制劑重量的4％-5％。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，油占制劑重量的高達(dá)98％、更優(yōu)選20％-80％、最優(yōu)選30％-70％。
組合物優(yōu)選含有油溶性抗氧化劑。加入抗氧化劑進(jìn)一步有助于防止類胡蘿卜素氧化?？寡趸瘎﹥?yōu)選選自生育酚、丁化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯、沒食子酸丙酯、乙氧喹、和抗壞血酸棕櫚酸酯以及其它可從草藥中得到的天然抗氧化劑提取物，優(yōu)選天然生育酚、及其混合物。生育酚優(yōu)選選自β-、γ-和δ-生育酚或它們的混合物。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗氧化劑占制劑重量的高達(dá)15％、優(yōu)選5％-10％。
對(duì)于口服給藥，本發(fā)明組合物還選擇性地還含有適于口服給藥的可藥用載體。本發(fā)明口服組合物可用制藥領(lǐng)域已知的常規(guī)混合方法制得，即將活性物質(zhì)與適于系統(tǒng)給藥并在口服劑型中常用的、可食用的可藥用無(wú)毒惰性、固態(tài)或液態(tài)載體和/或賦形劑混合?？诜幬锝M合物可以制成包括緩釋片劑在內(nèi)的片劑、錠劑、口香糖、和膠囊。最優(yōu)選軟明膠膠囊劑型。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域已知技術(shù)制備這些劑型，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990)，MackPublishing Co.，Easton，PA中描述的技術(shù)。
本發(fā)明還提供了提供生物可利用抗氧化劑的方法，包括將有效量懸浮或分散在中鏈甘油三酯中的番茄紅素對(duì)宿主口服給藥。在本發(fā)明說(shuō)明書上下文中，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)“宿主”不僅包括人，還包括非人動(dòng)物、尤其是哺乳動(dòng)物。該方法包括，將有效量的包含類胡蘿卜素的油懸浮液/分散液的組合物、例如以約1-1000μg/kg類胡蘿卜素的劑量給藥到患者體內(nèi)。優(yōu)選的劑量約為10-100μg/kg類胡蘿卜素。在實(shí)施本發(fā)明方法過(guò)程中，本發(fā)明組合物可每天給藥一次或每天給藥多次。治療方案可能需要在延長(zhǎng)的期間內(nèi)給藥。每次給藥劑量或總給藥劑量將由醫(yī)師根據(jù)例如疾病的類型和嚴(yán)重程度、患者的年齡及健康狀況、以及患者對(duì)該化合物的耐受性等因素確定。
本發(fā)明還提供了在需要治療的患者中治療或防止癌癥的方法。在本發(fā)明說(shuō)明書上下文中，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)“患者”不僅包括人，還包括非人動(dòng)物、尤其是哺乳動(dòng)物。該方法包括，將有效量的包含類胡蘿卜素的油懸浮液/分散液的組合物、例如以約1-1000μg/kg類胡蘿卜素的劑量給藥到患者體內(nèi)。優(yōu)選的劑量約為10-100μg/kg類胡蘿卜素。在實(shí)施本發(fā)明方法過(guò)程中，本發(fā)明組合物可每天給藥一次或每天給藥多次。治療方案可能需要在延長(zhǎng)的期間內(nèi)給藥。每次給藥劑量或總給藥劑量將由醫(yī)師根據(jù)例如疾病的類型和嚴(yán)重程度、患者的年齡及健康狀況、以及患者對(duì)該化合物的耐受性等因素確定。
可通過(guò)將本發(fā)明組合物本身、或?qū)⑵渑c包括其它抗氧化劑在內(nèi)的其它活性組分和/或治療劑在藥物組合物中一起給藥來(lái)實(shí)施該方法。其它適用于本發(fā)明的治療劑是能通過(guò)相同或其它機(jī)理有效地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的任一可配伍藥物，或其活性與本發(fā)明制劑或組合物的活性具有補(bǔ)充或協(xié)同作用的藥物。
聯(lián)合治療所使用的化合物或活性劑可與本發(fā)明組合物在不同或同一制劑中同時(shí)給藥，或在不同時(shí)間給藥、例如依次給藥，這樣就達(dá)到了聯(lián)合治療的效果。給藥劑量和方案將由醫(yī)師調(diào)節(jié)，優(yōu)選先降低其標(biāo)準(zhǔn)劑量，然后確定所獲得的結(jié)果，來(lái)確定最佳給藥劑量和方案。
在下面本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述及后面所附權(quán)利要求中，進(jìn)一步解釋了本發(fā)明的特征，本發(fā)明的上述和其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征將變得更加清楚。
實(shí)施例實(shí)施例1制劑和穩(wěn)定性測(cè)試為了證實(shí)酯化油的改善了的抗氧化作用，用含有番茄紅素作為類胡蘿卜素的類胡蘿卜素組合物(“番茄紅素組合物”)進(jìn)行兩個(gè)比較試驗(yàn)。其中一個(gè)試驗(yàn)包括番茄紅素組合物在用溶劑從大豆中提取的大豆油中的懸浮液/分散液，另一試驗(yàn)包括番茄紅素組合物在由脂肪酸和甘油酯化所得的中鏈甘油三酯油中的懸浮液/分散液。然后比較試驗(yàn)結(jié)果。
材料試驗(yàn)所用番茄紅素組合物是從番茄中提取的。
所用中鏈甘油三酯油是通過(guò)將椰子油的脂肪酸分餾，然后將所選的具有8個(gè)和10個(gè)碳原子的脂肪酸的餾分與高純度甘油酯化而制得的。以這種方式形成油可減少在直接從動(dòng)植物中提取的油中所出現(xiàn)的雜質(zhì)。大豆油是從大豆中提取的標(biāo)準(zhǔn)油。
將兩批10千克番茄紅素組合物分別分散在作為稀釋劑或懸浮/分散油的各15千克大豆油(“組合物1”)和中鏈甘油三酯油(“組合物2”)中，用有效的混合方法將其混合來(lái)形成連續(xù)相。各取1克每一組合物的樣本放在玻璃小瓶中以測(cè)試。
測(cè)試過(guò)程和結(jié)果用分光光度計(jì)分別測(cè)定組合物1和組合物2中番茄紅素的濃度，以確定在下述時(shí)間番茄紅素的濃度0月(即組合物制備后不久)；1個(gè)月；2個(gè)月；和3個(gè)月。
(a)分析方法將各樣本溶解在氯仿中，并用環(huán)己烷稀釋至適當(dāng)濃度。在20℃、特定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由已知的消光系數(shù)計(jì)算濃度。
使用下述試劑和儀器配有10mm玻璃比色槽的分光光度計(jì)分析天平100ml容量瓶50ml容量瓶2.0ml球吸管氯仿，AR級(jí)環(huán)己烷在進(jìn)行測(cè)試時(shí)，藥物番茄紅素在光照下會(huì)緩慢降解，因此使用低閃光玻璃。對(duì)于每一樣本，都進(jìn)行下述操作。將各0.5-1.0克5％的番茄紅素油懸浮液分別精確稱重到100ml容量瓶中。加入約5ml氯仿，將試劑充分混合以使樣本溶解。
對(duì)著光觀察各樣本，以確保其完全溶解。
為了確保各樣本完全溶解，將其放置5分鐘，再加入5ml氯仿，并在熱自來(lái)水下保溫(如果需要的話)。
用環(huán)己烷將溶液稀釋至容量瓶體積并充分混合。此為溶液A。將2ml溶液A吸量到50ml容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至容量瓶體積并充分混合。此為溶液B。
將2ml溶液B吸量到50ml容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至容量瓶體積并充分混合；此為溶液C。
用環(huán)己烷在兩個(gè)比色槽中將分光光度計(jì)(具有2nm狹縫寬度)調(diào)零，以環(huán)己烷作為空白，在472nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液C的吸光度。該分析重復(fù)進(jìn)行兩次。
在計(jì)算結(jié)果過(guò)程中，使用下述標(biāo)準(zhǔn)A＝溶液C在472nm波長(zhǎng)處的吸光度m＝樣本重量E＝在472nm波長(zhǎng)處的消光系數(shù)E1％/1cm＝3450C＝番茄紅素的濃度(％)C＝(A×稀釋度)/(E×m)在測(cè)試的間隔期內(nèi)，兩種組合物都在25℃攝氏溫度下貯存。
在測(cè)試期間發(fā)現(xiàn)，貯存數(shù)月后番茄紅素趨于形成大晶體，有時(shí)晶體會(huì)達(dá)到2-3mm。因?yàn)樾纬傻拇缶w可能會(huì)由于取樣誤差而嚴(yán)重影響分析結(jié)果，所以玻璃小瓶中的1克該材料樣本是制備后立即采取的樣本，并在25℃溫度下貯存。每間隔一個(gè)月，取小瓶來(lái)檢測(cè)，并且檢測(cè)全部含量來(lái)克服結(jié)晶所帶來(lái)的取樣問(wèn)題。
(b)結(jié)果如附圖1和表1所示，將各個(gè)測(cè)試小瓶中的兩種組合物的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果平均表1
結(jié)果討論上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在3個(gè)月期間內(nèi)，番茄紅素在中鏈甘油三酯油(組合物2)中的濃度恒定，實(shí)際上，3個(gè)月后平均百分濃度與組合物2制備后的即時(shí)濃度相同。在3個(gè)月期間內(nèi)，番茄紅素在大豆油(組合物1)中的濃度測(cè)試結(jié)果表現(xiàn)為，番茄紅素的％重量濃度穩(wěn)步下降。
這些結(jié)果證實(shí)，由脂肪酸和甘油酯化所得的油(在本項(xiàng)試驗(yàn)中是中鏈甘油三酯油)具有防止番茄紅素氧化的穩(wěn)定作用。
實(shí)施例2番茄紅素的臨床前毒性和穩(wěn)定性本實(shí)施例試驗(yàn)的目的是確定食物中番茄紅素的生物可接收劑量范圍、攝取和組織分布。
具體目的確定在AIN-76A食物里給藥的番茄紅素在雄性和雌性Fischer 344大鼠中的最大耐受劑量，和評(píng)價(jià)食物中的番茄紅素在血液、糞便和不同器官如乳腺、前列腺、結(jié)腸和肺中的攝取和分布。
方法同系繁殖的雄性(n＝70)和雌性(n＝70)Fischer 344大鼠得自Taconic Farms，Germantown，NY.在大鼠長(zhǎng)到約35天大小時(shí)，將所有大鼠從隔離區(qū)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室中。然后用常規(guī)隨機(jī)法將大鼠分配成測(cè)試組，以確保各組包含具有相同平均體重的大鼠。
如表2及附圖2所示，進(jìn)行10周試驗(yàn)，來(lái)測(cè)定番茄紅素在雄性大鼠(結(jié)腸模型)和雌性大鼠(乳房模型)中的最大耐受劑量(MTD)。劑量范圍的選擇是根據(jù)已公開的β-胡蘿卜素的值。將含有5.7％類胡蘿卜素、其中包含3.7％純番茄紅素的混合的類胡蘿卜素組合物懸浮在中鏈甘油三酯中(該組合物在下文中稱為“番茄紅素懸浮液”)。把該番茄紅素懸浮液摻入 AIN-76A食物中。
表2MTD試驗(yàn)
a基于番茄紅素MW＝536
在弱光下配制食物，并以4千克批量貯存在-4℃溫度下的密封容器中。AIN-76A食物的組成如表3所示。
表3標(biāo)準(zhǔn)AIN-76A食物
通過(guò)在飲食中補(bǔ)充適當(dāng)量的Neobee中鏈甘油三酯(Stepan Co.，Maywood，NJ)來(lái)控制各治療組所攝取的脂質(zhì)含的差異，這樣包括對(duì)照組在內(nèi)的所有大鼠就攝取了相同量的食用脂肪。
試驗(yàn)結(jié)束前，將各組中的3只大鼠置于代謝籠中，采集24小時(shí)內(nèi)的尿和糞便以進(jìn)行隨后的番茄紅素分析。通過(guò)在麻醉狀態(tài)下的心臟穿刺術(shù)采集血液來(lái)進(jìn)行番茄紅素分析，通過(guò)CO2麻醉將所有大鼠處死。在-20℃貯存血液和糞便。在尸體剖檢時(shí)，將所有主要器官系統(tǒng)進(jìn)行粗檢。把任一顯示異常的組織置于福爾馬林中，并保存以進(jìn)行以后的組織學(xué)檢查。
每周記錄一次大鼠體重，評(píng)價(jià)大鼠外貌(外表特征)和食物回避行為。通過(guò)集中，最大耐受劑量是導(dǎo)致平均體重下降＞10％的劑量。
表4檢測(cè)番茄紅素的HPLC方法
進(jìn)樣溶劑混合物40％乙腈20％甲醇20％己烷20％二氯甲烷通過(guò)HPLC定量測(cè)定番茄紅素
HPLC裝置、溶劑系統(tǒng)、和溶劑程序列在表4中。用類胡蘿卜素結(jié)晶作為標(biāo)準(zhǔn)，包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、和海膽酮(Hoffmann-LaRoche)。使用β-胡蘿卜素的酮衍生物海膽酮作為內(nèi)標(biāo)。用進(jìn)樣溶劑(表4)將標(biāo)準(zhǔn)物制備成濃度為30μg/ml的儲(chǔ)備溶液。
(1)番茄紅素(RO 01-9251-00)(2)玉米黃質(zhì)(RO 01-9371-000)(3)隱黃質(zhì)(RO 04-0763-000)(4)9-胡蘿卜素(RO 01-8300-000)(5)海膽酮(RO 04-2847-000)通過(guò)用5天時(shí)間比較從番茄紅素和海膽酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液取樣的多樣本來(lái)檢測(cè)該系統(tǒng)的變異性和可靠性(表5)。番茄紅素的保留時(shí)間從最低32.58分鐘變化到最高35.95分鐘；海膽酮的保留時(shí)間從最低28.54分鐘變化到最高30.64分鐘。番茄紅素/海膽酮的比例從最低1.12變化到最高1.20。當(dāng)比較曲線下積分面積時(shí)，發(fā)現(xiàn)了類似低水平的樣本內(nèi)差異(表5)。
通過(guò)使用番茄紅素結(jié)晶和海膽酮，產(chǎn)生了番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖5)。試驗(yàn)值是從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的，并且以ng/ml或ng/μg/g組織濕重來(lái)表示。
表5類胡蘿卜素HPLC測(cè)試變異性和可靠性測(cè)試程序 RT番茄紅素番茄紅素 海膽酮比值(番茄紅素/ 比值(番茄紅素/海膽酮)番茄紅素海膽酮 海膽酮)第一天1 33.1729.15 1.14 586,132720,121 0.812 32.912 8.89 1.14 567,339755,926 0.753 33.4929.86 1.12 527,365737,088 0.724 34.4830.47 1.13 532,491765,646 0.705 34.4730.45 1.13 527,024772,265 0.686 34.6430.64 1.13 496,268768,335 0.65第三天7 34.0528.30 1.20 511,111781,883 0.658 33.0429.03 1.14 551,826736,851 0.75第五天9 32.9928.78 1.15 624,986803,354 0.781032.5828.32 1.15 573,498793,606 0.721132.8128.54 1.15 562,057823,087 0.681235.9530.11 1.19 612,266859,039 0.711334.5029.86 1.16 543,684869,292 0.63X 33.7829.42 1.15 555,085783,576 0.71S 0.99 0.85 0.023 37,924 45,566 0.053C.V.(％) 2.9 2.92.06.85.8 7.5RT＝保留時(shí)間(分鐘)AREA＝曲線下的積分面積食物如下所述從食物中提取番茄紅素將含有番茄紅素的樣本懸浮在進(jìn)樣溶劑(表4)中，并在多管(polytron)勻漿器中勻漿。加入海膽酮作為內(nèi)標(biāo)，將混合物在4℃、3000rpm轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。傾出上清液，保存，并重復(fù)提取。然后將合并的提取物在氮?dú)庀掠?0℃干燥，將剩余物溶解在0.5ml進(jìn)樣溶劑中，然后進(jìn)行HPLC分析。同樣的方法，進(jìn)行最小的變化，適用于糞便和肺組織。提取番茄紅素的效率如表6A和B所示。在所有測(cè)試濃度下，提取效率從最高濃度的75％到最低番茄紅素濃度下的100％不等。
血清從血清中提取番茄紅素是這樣進(jìn)行的將1ml血清加到0.1ml海膽酮標(biāo)準(zhǔn)物和0.9ml乙醇的混合物中。然后把混合物渦旋振蕩20秒，加入2.0ml己烷，劇烈混合1分鐘。然后將此混濁的混合物在4℃、3000rpm轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，傾出澄清的己烷層。把上述步驟重復(fù)3-5次。合并己烷部分，然后在氮?dú)庀掠?0℃干燥，將剩余物溶解在0.5ml HPLC溶劑中，進(jìn)行HPLC分析。
組織乳房、肝臟和前列腺組織含有會(huì)干擾本項(xiàng)分析的脂質(zhì)。因此，組織的皂化步驟需要在器官提取之前進(jìn)行。將組織在加入海膽酮作為內(nèi)標(biāo)的20ml甲醇中勻漿。對(duì)于包含85％脂肪細(xì)胞的乳房組織，加入8.0ml 50％的NaOH和4.0ml 25％的抗壞血酸鈉，將混合物勻漿。對(duì)于含有較少脂質(zhì)的前列腺和肝臟組織，加入4.0ml 50％的NaOH和2.0ml 25％的抗壞血酸鈉，將混合物勻漿。皂化是在用氮?dú)膺^(guò)夜飽和的50ml管中、在溫度控制震動(dòng)器浴中于30℃進(jìn)行的。皂化后，向各管中加入10ml己烷，渦旋振蕩1分鐘。將混合物在4℃、2000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，傾出己烷層并保存。將該己烷提取步驟重復(fù)5-7次。合并己烷提取物，然后在氮?dú)庀掠?0℃干燥，將剩余物溶解在進(jìn)樣溶劑中，進(jìn)行HPLC分析。除了不進(jìn)行皂化以外，按相同方式從肺和結(jié)腸組織中提取番茄紅素。
表6A&B從AIN-76A食物中提取番茄紅素的效率6A組號(hào) 番茄紅素在食物中的濃度 提取物 進(jìn)樣量 提取后番茄紅素的濃度樣本重量體積(μg/g) (g) (ml)(μl)(μg/g)1 1,280 0.5 100 20 975 (76％)2 512 0.5 100 20 321 (63％)X403 (79％)3 256 0.5 50 20 192 (75％)4 128 0.5 50 50 122 (95％)X101 (86％)5 511.0 50 50 62 (100％)X52 (100％)6B編號(hào) 海膽酮 番茄紅素比值(番茄紅素/ 濃度海膽酮) (μg/g)曲線下面積標(biāo)準(zhǔn) 2,590,8062,191,3320.852,754,2532,505,1140.9112,891,2114,493,4991.55 97522,980,7581,527,3160.51 321X2,618,2661,663,1870.64 40332,804,0031,705,1600.61 19242,236,7102,179,3220.97 122X2,636,0442,087,9830.80 10152,647,4782,620,9000.99 62X2,613,3852,171,0470.83 52I.番茄紅素懸浮液的分析當(dāng)番茄紅素懸浮液(Henkel Corporation，La Grange，IL)是通過(guò)有機(jī)提取法提取的時(shí)，主要的類胡蘿卜素是番茄紅素，但也存在許多其它已知在番茄中存在的類胡蘿卜素、α-和β-胡蘿卜素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素(附圖6和7)。用安裝有光電二極管陣列檢測(cè)器的上述HPLC系統(tǒng)對(duì)番茄紅素懸浮液中的類胡蘿卜素進(jìn)行定量分析。6種主要組分如表7所示。
表7番茄紅素懸浮液的類胡蘿卜素定量分析μg/gm％(g/100g) 占類胡蘿卜素總量的％1.番茄紅素 375043.7504662.β-胡蘿卜素124431.2443223.六氫番茄紅素 3349 0.334964.八氫番茄紅素 2794 0.279455.ζ-胡蘿卜素440 0.04400.76. 2，6-環(huán)番茄紅素-1，5-二醇 471 0.04400.7類胡蘿卜素總量 570015.7 100番茄紅素的含量是3.7％，然而，類胡蘿卜素的總含量約為5.7％。因此，當(dāng)以占類胡蘿卜素總量的％表示時(shí)，番茄紅素占67％，β-胡蘿卜素占20％；番茄紅素的前體—六氫番茄紅素和八氫番茄紅素分別占5％，ζ-胡蘿卜素和2，6-環(huán)番茄紅素-1，5-二醇分別占0.7％。按照5.72％(而不是4％)的類胡蘿卜素總含量重新計(jì)算番茄紅素在食物中的濃度，結(jié)果得到了下述各治療組的濃度組1，1280；組2，512；組3，256；組4，128；和組5，51(mg/kg食物)。因此，番茄紅素懸浮液不是純番茄紅素制劑，該懸浮液含有5.9％番茄紅素、α-和β-胡蘿卜素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素(番茄紅素的前體)懸浮在中鏈甘油三酯中的懸浮液。對(duì)于化學(xué)預(yù)防研究這實(shí)際上是有利的，因?yàn)榉鸭t素懸浮液的這種類胡蘿卜素組成和含量接近于市售番茄中類胡蘿卜素的組成和含量(參見Khachik，F(xiàn)，Beecher，G.R.食物要素國(guó)際會(huì)議(International Conference on Food Factors)化學(xué)與癌癥預(yù)防。將類胡蘿卜素在水果和蔬菜中的分布作為選擇化學(xué)預(yù)防劑的準(zhǔn)則。H.Ohigashi(ed.)，Springer-Verlag，Tokyo，1996(印刷))。
II.在食物中的穩(wěn)定性一經(jīng)將番茄紅素懸浮液摻入到食物中，就馬上用兩種方法測(cè)定其穩(wěn)定性。第一種方法是將含有該懸浮液的食物在4℃的黑暗中放置3周(表8A，B)。
表8A & 8B食物中番茄紅素的穩(wěn)定性試驗(yàn)a8A組號(hào) 日期#天數(shù)(在冰箱中) 番茄紅素濃度(μg/g) ％b1 5/1 1748 1012 5/8 8728 983 5/14 14 672 904 5/21 21 534 72aAIN-76A食物b以食物的濃度(04/40)，744μg/g作為100％8B組號(hào)海膽酮a番茄紅素 比值(番茄紅素/海膽酮)濃度(μg/g)曲線下面積標(biāo)準(zhǔn) 246164921179040.861 230436124862901.08 7482 242213425459731.05 7283 232537922650870.97 6724 233494717876560.77 534a內(nèi)標(biāo)在不同時(shí)間，采取食物樣本，并如下所述提取番茄紅素將約0.5-1.0g樣本加到15ml由40％的乙腈、20％的己烷、20％的甲醇和20％的二氯甲烷組成的提取溶劑中。將混合物超聲處理2分鐘，然后放置5分鐘。傾出微紅-橙色澄清上清液。將該操作重復(fù)4次，在重復(fù)過(guò)程中得到的上清液是無(wú)色的。然后加入溶劑至25-100ml，將混合物離心，傾出上清液。然后將所有上清液混合。上述溶劑起兩個(gè)作用首先，對(duì)于提取番茄紅素它是最有效的混合物，其次，它是與用于將番茄紅素樣本注射到HPLC中的溶劑相同的溶劑。如表8所示，在4℃的黑暗中放置3周后，番茄紅素降解至約為第1天含量的72％；2周后約降解了10％。這表明，對(duì)于本項(xiàng)進(jìn)食試驗(yàn)，2周的貯存時(shí)間將是最好的。
第二種方法是，將含有番茄紅素的食物暴露在空氣和光中，照這種方式，進(jìn)行實(shí)際的進(jìn)食試驗(yàn)。番茄紅素在暴露于空氣和光的食物杯子中的穩(wěn)定性如表9所示。
表9AIN-76A食物中的番茄紅素在室溫下的穩(wěn)定性日期在食物杯中放置的天數(shù)濃度 (μg/g)4/300 7445/2 2 7025/3 3 6165/6 6 5475/7 7 4395/9 9 6245/1010 5765/1313 4495/1414 4195/1515 4255/1717 4315/2020 3855/2121 376顯然，在48小時(shí)內(nèi)，番茄紅素僅有少量減少。72小時(shí)后，番茄紅素約減少了20％。3周后，初始量的番茄紅素已有一半檢測(cè)不到。根據(jù)這些結(jié)果，將食物在食物杯中放置不超過(guò)48小時(shí)。
含有番茄紅素懸浮液的食物在20℃貯存7個(gè)月后，測(cè)定其中存在的所有主要類胡蘿卜素(表10)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄紅素懸浮液中存在的所有主要類胡蘿卜素與番茄紅素代謝物以相同的相對(duì)比例存在于食物中。然而，7個(gè)月后，處理組1-5的番茄紅素的凈損失分別為66％、38％、40％、44％和60％；而在相同時(shí)間內(nèi)，與初始值相比，β-胡蘿卜素濃度僅下降了10％。
表10用番茄紅素懸浮液補(bǔ)充的食物中的類胡蘿卜素含量aμg/gm(ppm)食物mM/kgβ- ξ- 六氫番茄紅素八氫番茄紅素2，6-食物 番茄紅素 胡蘿卜素 胡蘿卜素 環(huán)番茄紅素-1，5-二醇1 2.5 472284 1 587022 1.0 348138 9 28231.43 0.5 16869 4 140.32 0.764 0.2592 37 2 8 5 0.465 0.1022 80 2 1 0.146 0 0 00 0 0 0a 食物在-20℃貯存7個(gè)月III.預(yù)進(jìn)食試驗(yàn)用類胡蘿卜素含量為2.5mM番茄紅素(+其它類胡蘿卜素)/kg食物的食物給一只雄性大鼠喂養(yǎng)3周。在該高劑量下，沒有發(fā)現(xiàn)體重或食物消耗量有任何變化。糞便呈現(xiàn)出顯著的紅色，部分外皮也呈現(xiàn)出紅色。尾部是棕色。在尸體剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝臟呈深紅色，盲腸和小腸也是如此。在腹部脂肪組織或前列腺和小囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)了小程度的變色。
24小時(shí)內(nèi)糞便團(tuán)中的番茄紅素分析(表11)表明，所進(jìn)食的食物中總的番茄紅素大約有55％分泌到糞便內(nèi)。這表明剩余的番茄紅素被吸收到腸中。還必須考慮一些番茄紅素在提取前的貯存過(guò)程中降解的可能性。發(fā)現(xiàn)在提取番茄紅素前將糞便團(tuán)冷凍干燥是提取番茄紅素的最有效方法。這毫無(wú)疑問(wèn)是因?yàn)榧S便團(tuán)中存在水并且糞便團(tuán)具有幾何形狀。一經(jīng)冷凍干燥，糞便團(tuán)即可容易地粉末化，這使溶劑能更容易地進(jìn)入到糞便基層內(nèi)。
表11糞便中番茄紅素的分析食物中的 食物消耗量番茄紅素 24小時(shí)排泄糞便中24小時(shí)糞便中 排泄量％效率番茄紅素的估計(jì)總是 的糞便重量 番茄紅素含量番茄紅素總量 進(jìn)食量(μg/g) (g/24h) (μg)(g)(μg/g) (μg)有機(jī)提取744 13-159,7841.442,992 4,309 4.309 449,784冷凍干燥+744 13-159,7841.443,754 5,406 5.405 55有機(jī)提取9,784
IV.進(jìn)食試驗(yàn)(1)體重增加番茄紅素對(duì)動(dòng)物體重增加的影響如表12和13、圖8-11所示。當(dāng)通過(guò)分析重復(fù)測(cè)試差異來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，在用補(bǔ)充有不同劑量番茄紅素的食物喂養(yǎng)的大鼠之間，體重增加沒有任何不同。在10周末，對(duì)照組大鼠的體重增加程度比番茄紅素補(bǔ)充組大鼠要高一點(diǎn)，但這種差異不超過(guò)10％，一般的截止點(diǎn)表示食物回避或毒性。
表12食物中的番茄紅素對(duì)雌性F344大鼠a體重增加的影響組番茄紅素混合物(ppm)體重(g×SD)周0周81 1280 86±5 168±102 521 86±5 169±93 251 86±5 171±134 128 86±5 173±85 51 86±5 168±136 對(duì)照 86±5 172±15aN＝10/組表13食物中的番茄紅素對(duì)雄性F344大鼠a體重增加的影響組番茄紅素混合物(ppm)體重(gms×SD)周0周81 1280 113±6 276±302 512 113±6 280±193 256 113±6 279±264 128 113±6 279±125 51 113±6 280±226 對(duì)照 113±6 285±21
aN＝10/組(2)組織和血清攝取肝臟與血清或其它器官相比，番茄紅素在肝臟中要濃100-1000倍。在最高劑量番茄紅素(1280ppm)下，肝臟中番茄紅素水平為33-120μg/g濕重(表14)。
表14用補(bǔ)充有番茄紅素懸浮液a的食物喂養(yǎng)的大鼠的肝臟中類胡蘿卜素含量雌性大鼠μg/gm (ppm)mM/kg 2，6-環(huán)番茄紅素ξ-胡蘿卜素 八氫番茄紅素食物 食物 番茄紅素 β-胡蘿卜素 六氫番茄紅素 -1，5-二醇1 2.5120 1117 10666 92 1.0646 848 35 53 0.5668 750 40 74 0.25 497 246 46 45 0.10 424 433 38 66 0 0 0 00 0 0雄性大鼠1 2.5333 530 23 42 1.05 1 15 4 .393 0.5605 584 21 44 0.25 3 1 1- - .285 0.10 121 110 10 .346 0 0 0 00 0 0通過(guò)HPLC-MS測(cè)定肝臟的皂化有機(jī)提取物，結(jié)果表明其中存在大量的番茄紅素、六氫番茄紅素和八氫番茄紅素及其幾何異構(gòu)體(附圖12)。另外，還檢測(cè)到低水平的ζ-胡蘿卜素、所有反-β-胡蘿卜素、9-順-β-胡蘿卜素和13-順-β-胡蘿卜素。
在肝臟樣本中還定量檢測(cè)到了已經(jīng)在前面人血清中檢測(cè)到的番茄紅素的兩種氧化代謝物—即2，6-環(huán)番茄紅素-1，5-二醇I和II，和在人血清中未檢測(cè)到的其環(huán)氧化物前體2，6-環(huán)番茄紅素-1，5-環(huán)氧化物I和II，檢測(cè)到前述代謝物表明，2，6-環(huán)番茄紅素-1，5-二醇除了來(lái)源自食物以外，肝臟也能將番茄紅素代謝成這些代謝物。雌性大鼠肝臟中番茄紅素的量一般比雄性高，在雄性大鼠中表現(xiàn)出非線性劑量-反應(yīng)曲線，但在雌性中則沒有。這些結(jié)果表明，番茄紅素懸浮液中的類胡蘿卜素被吸收并貯存在肝臟中，番茄紅素以類似于在人中所發(fā)現(xiàn)的方式在大鼠中代謝。
血清血清番茄紅素水平為從80到370ng/ml不等。在用補(bǔ)充有番茄紅素懸浮液的食物喂養(yǎng)的雄性和雌性大鼠中，番茄紅素在血清中的濃度與劑量呈非線性關(guān)系(表15)。令人驚奇的是，在雌性大鼠中，在組3(200ppm)和組4(100ppm)而不是所預(yù)期的組1(1000ppm)中發(fā)現(xiàn)了最高濃度。相類似的是，在雄性大鼠中，最高濃度是在組3中。在雌性大鼠中，低番茄紅素(40ppm)組表現(xiàn)出最低的血清番茄紅素濃度，但是在雄性大鼠中，在最高和最低番茄紅素組之間則沒有不同。
表15大鼠血清中番茄紅素的濃度(ng/ml)a組編號(hào) x±SD 中值 范圍雌性大鼠1 187±043205 123--2322 169±042180 109--2113 245±083210 174--3664 313±047308 262--3695 145±053152 081--2076 0 0 0雄性大鼠1 168±036160 134--2302 227±068225 148--3263 278±066285 174--3724 231±064215 153--3285 171±049177 100--2386 0 0 0a N＝6這些結(jié)果表明，血清番茄紅素水平由體內(nèi)平衡機(jī)制調(diào)節(jié)，該機(jī)制包括肝臟貯存機(jī)制和以類似于維生素A的方式釋放。此處所提供的大鼠中血清番茄紅素水平也在所報(bào)導(dǎo)的食用正常水平的番茄或番茄產(chǎn)品的人的范圍內(nèi)，即0.1-5μg/ml血清(100-5000ng/ml)。
乳腺雌性大鼠乳房頰脂墊中的番茄紅素濃度為從139到460ng/g濕重不等(表16)。與血清不同，發(fā)現(xiàn)在乳房組織和飲食番茄紅素?cái)z取量之間有常規(guī)的劑量-反應(yīng)作用(表4)。
表16大鼠乳腺中的番茄紅素含量(ng/g)a組編號(hào)x±SD 中值范圍1 309±131235232--4602 200±030197172--2313 215±062220139--2824 229±054217181--2885 174±057143139--2396 0 0 01N＝3前列腺雄性大鼠前列腺中的番茄紅素濃度為從32到147ng/g濕重不等(表17)。番茄紅素在前列腺組織中的平均濃度比在乳房組織中的濃度低一個(gè)數(shù)量級(jí)。攝取的劑量相關(guān)模式在前列腺中很明顯(表17)。
表17大鼠前列腺中的番茄紅素含量(ng/g)a組編號(hào)x±SD 中值范圍1 97±179979-1122 95±488354--1473 50±373523--934 52±265226--775 47±164732--636 0aN＝3肺雄性和雌性大鼠肺中的番茄紅素濃度為從124到424ng/g濕重不等(表18和19)。在雌性大鼠中，在組1-4之間有高頂效應(yīng)，然后在最低組(組5)有明確的降低。在雄性大鼠中，獲得了除了沒有組4中的增加以外的相似結(jié)果。
表18雄性大鼠肺中的番茄紅素濃度(ng/g)a食物中番茄紅素 (ngs/gm)組編號(hào) 大鼠編號(hào) 單個(gè)濃度的濃度 平均濃度11280 36-119319036-21872512 41-117021441-22573256 46-132537546-24244128 51-123920151-216255156-11715156-213560 61-10061-20
表19雌性大鼠肺中的番茄紅素濃度(ng/g)a物中番茄紅素(ngs/gm)組編號(hào) 大鼠編號(hào)單個(gè)濃度的濃度 平均濃度1 12801-11842271-22702 512 6-12802466-22113 256 11-1 24319311-2 1424 128 16-1 20821116-2 2145 51 21-1 14413421-2 1246 0 26-1 0026-2 0結(jié)腸對(duì)于結(jié)腸組織，不能獲得精確值，因?yàn)轭惡}卜素進(jìn)入粘膜小間隙，這使得不能評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)(吸收的)類胡蘿卜素和腔內(nèi)(未吸收的)類胡蘿卜素。結(jié)腸值一般與肺和乳房的值相似。
谷胱甘肽分析測(cè)定谷胱甘肽的原理是，該三肽硫醇—谷胱甘肽(Glu-Cys-Gly)的還原形式直接參與幾種重要的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，包括防止自由基損害的保護(hù)作用。與位于脂相中的類胡蘿卜素不同，谷胱甘肽位于細(xì)胞的水相中，很明顯，脂相和水相中的抗氧化劑彼此之間能以下述方式相互作用高水平的抗氧化劑可“節(jié)約”或限制其它抗氧化劑的消耗。分析血液、肝臟和腎中的所有(還原和氧化的)谷胱甘肽(表20-22)。
表20全血中谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果-總結(jié)谷胱甘肽 (μmol/g)*番茄紅素(ppm) 雌性大鼠 雄性大鼠01.010±0.0627 0.936±0.088851 0.832±0.158+1.030±0.0387128 0.890±0.202 0.920±0.169256 0.848±0.0988 0.910±0.106512 0.930±0.123 0.990±0.1411280 1.080±0.104 0.948±0.294*數(shù)值是平均值±S.D.，n＝5+與對(duì)照的顯著性差異，p＜0.05表21肝臟中谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果-總結(jié)谷胱甘肽(μmol/g)*番茄紅素(ppm) 雌性大鼠 雄性大鼠0 5.45±0.366 6.13±0.516516.01±0.309 6.77±1.53128 6.54±1.09+5.38±0.363256 4.87±1.14 4.59±1.37512 5.88±0.492 6.90±1.0981280 7.38±0.705+7.16±1.95+*數(shù)值是平均值±S.D.，n＝5+與對(duì)照的顯著性差異，p＜0.05
表22腎中谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果-總結(jié)谷胱甘肽 (μmol/g)*番茄紅素(ppm)雌性大鼠 雄性大鼠0 0.774±0.154 0.592±0.234510.900±0.101 0.688±0.316128 0.950±0.0758 0.686±0.170256 1.030±0.414+0.624±0.104512 1.090±0.163+0.854±0.055+1280 0.089±0.045+0.828±0.128+*數(shù)值是平均值±S.D.，n＝5+與對(duì)照的顯著性差異，p＜0.05谷胱甘肽的測(cè)定是通過(guò)具有雙重電化學(xué)檢測(cè)的HPLC進(jìn)行的(參見K1einman，W.A.& Richie，J.P.，《色譜雜志》(J.Chromatogr)B67273-80，1995)。僅在最高番茄紅素水平情況下有谷胱甘肽水平的顯著增加，并且這種情況僅發(fā)生在肝臟中。在肝臟、腎或全血中，谷胱甘肽沒有表現(xiàn)出與劑量有關(guān)的變化。
肝臟中維生素A和維生素E分析研究補(bǔ)充番茄類胡蘿卜素對(duì)兩種重要脂溶性維生素即視黃醇和α-生育酚的吸收和貯存的影響。使用已建立的HPLC法，發(fā)現(xiàn)在雌性R-344大鼠中，肝臟中番茄紅素的含量與視黃醇和α-生育酚的濃度都有很強(qiáng)的線性劑量-反應(yīng)關(guān)系(表23)。
表23視黃醇和α-生育酚在大鼠肝臟中的濃度食物中的番茄紅素 肝臟組編號(hào)mM/kg 食物 mg/kg 食物 視黃醇(μg/gm) α-生素酚(μg/gm)雌性大鼠1 2.5 1280 1302 472 1.0 512768 383 0.5 256858 394 0.25 128888 465 0.10 51 555 326 0 0 120 13雄性大鼠7 2.5 1280 388 288 1.0 512119 89 0.5 256584 2310 0.25 128--11 0.10 51 454 14對(duì)照組 0 0 16 0對(duì)于視黃醇，對(duì)照組和最高番茄紅素劑量組之間有10倍的差異；對(duì)于α-生育酚，對(duì)照組和最高番茄紅素劑量組之間有4倍的差異。雄性大鼠的數(shù)據(jù)也是類似于此。因?yàn)檠a(bǔ)充物含有很少或不含有視黃醇和維生素E，因此所有在肝臟中發(fā)現(xiàn)的視黃醇和維生素一定是來(lái)自AIN-76A食物。因此，類胡蘿卜素補(bǔ)充物改變了肝臟對(duì)維生素A和維生素E的攝取和貯存。
總結(jié)(1)由番茄制得的番茄紅素懸浮液中的主要組分是番茄紅素(70％)，還含有一些包括α-和β-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、黃體素、八氫番茄紅素和六氫番茄紅素在內(nèi)的其它類胡蘿卜素。
(2)在雄性或雌性大鼠中，番茄紅素在所用劑量范圍對(duì)食物攝取或體重增加沒有不利影響。
(3)在室溫光照下，番茄紅素在食物中能穩(wěn)定地保存7天；在4℃、黑暗條件下能穩(wěn)定地保存21天。
(4)每天所食入的估計(jì)量的番茄紅素大約有55％分泌到糞便中。
(5)番茄紅素易于在大鼠肝臟中吸收和貯存。番茄紅素還在肝臟中代謝，并且代謝途徑類似于在人中發(fā)現(xiàn)的途徑。血清中番茄紅素水平不與食物攝取量呈線性關(guān)系，這表明血清番茄紅素水平有相當(dāng)嚴(yán)格的體內(nèi)平衡控制。番茄紅素在血清中濃度比在肝臟中濃度低2個(gè)數(shù)量級(jí)。在肺、前列腺、結(jié)腸和乳房組織中，番茄紅素是以ng數(shù)量被檢測(cè)到。攝取通常是與劑量有關(guān)，最低濃度一般是在喂養(yǎng)最少番茄紅素的雄性和雌性組中、尤其是肝臟番茄紅素濃度中發(fā)現(xiàn)的。
(6)除從以最高番茄紅素水平喂養(yǎng)的大鼠測(cè)得的肝臟結(jié)果以外，在雄性和雌性大鼠中，全血、肝臟和腎中的谷胱甘肽濃度都與對(duì)照組相似。
(7)攝取番茄類胡蘿卜素補(bǔ)充物后，肝臟中維生素E和維生素A濃度發(fā)生了與劑量有關(guān)的改變。因?yàn)檠a(bǔ)充物中既不含有維生素E也不含有維生素A，所以在肝臟中發(fā)現(xiàn)的水平增加的維生素E和維生素A是從食物中選擇性攝取的。
最后，在F-344大鼠中，很明顯摻入到AIN-76A半純化食物中的番茄紅素懸浮液中的整個(gè)類胡蘿卜素易于吸收、進(jìn)入循環(huán)中，并沉積在所有測(cè)試組織中。食物中的番茄紅素大部分被吸收并貯存在肝臟中，番茄紅素在肝臟中以類似于在人中所發(fā)現(xiàn)方式代謝。沒有然后證據(jù)表明番茄紅素在所用劑量范圍內(nèi)具有毒性。
雖然通過(guò)上述具體材料、操作和實(shí)施例描述并舉例說(shuō)明了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些特定的材料、材料的組合、和實(shí)施本發(fā)明所選的特定操作。這些詳述的眾多變化可以是暗含的，并且將能被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。
權(quán)利要求
1.類胡蘿卜素組合物，其中含有懸浮或分散在中鏈甘油三酯中的番茄紅素。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所示中鏈甘油三酯是由中鏈脂肪酸和甘油酯化而得到的。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述中鏈脂肪酸是C6-C12脂肪酸。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述中鏈脂肪酸是C8-C10脂肪酸。
5.權(quán)利要求2的組合物，其中所述中鏈脂肪酸選自辛酸、癸酸、月桂酸、和它們的混合物。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中含有占組合物重量高達(dá)10％的番茄紅素。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中含有占組合物重量4％-5％的番茄紅素。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中含有占組合物重量高達(dá)98％的中鏈甘油三酯。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中含有占組合物重量20％-80％的中鏈甘油三酯。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中含有占組合物重量30％-70％的中鏈甘油三酯。
11.權(quán)利要求8的組合物，其中還含有油溶性抗氧化劑。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述油溶性抗氧化劑選自生育酚、丁化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯、沒食子酸丙酯、乙氧喹、和抗壞血酸棕櫚酸酯、天然生育酚、及它們的混合物。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述生育酚選自β-、γ-和δ-生育酚和它們的混合物。
14.權(quán)利要求11的組合物，其中所述抗氧化劑占組合物重量的高達(dá)15％。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述抗氧化劑占組合物重量的高達(dá)5％-10％。
16.提供生物可利用抗氧化劑的方法，包括將有效量懸浮或分散在中鏈甘油三酯中的番茄紅素對(duì)宿主口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了分散在由脂肪酸和甘油酯化所得的中鏈甘油三酯油中的番茄紅素的組合物。
文檔編號(hào)A61K31/01GK1272059SQ98807515
公開日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1998年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月22日
發(fā)明者L·施利帕利劉斯, M·斯特拉漢, D·X·赫萊, E·G·斯佐克 申請(qǐng)人:亨克爾公司