專利名稱：具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)在制備用于創(chuàng)傷愈合的藥劑方面的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及催產(chǎn)素的新應用。
可能由下列因素而引起損傷或創(chuàng)傷或者由外部損傷(即因意外事故或手術(shù)操作而引起創(chuàng)傷)；或者由組織中的病理過程而引起創(chuàng)傷。潰瘍(例如消化性潰瘍和骨潰瘍)主要指皮膚或膜中的創(chuàng)傷。損傷還包括其它各種組織中的傷害，例如骨折。在本說明書中，“創(chuàng)傷”這個術(shù)語被用于人體或動物體中的各種損傷。創(chuàng)傷可被分成急性創(chuàng)傷或慢性創(chuàng)傷。
創(chuàng)傷愈合的機制大體上可分成四個階段，即止血、發(fā)炎、增殖和成熟。在發(fā)炎的過程中，白細胞聚集以便對抗細菌，并且脈管壁的滲透性被增大從而導致膨脹。所述物質(zhì)有很多還促進導致充血和發(fā)熱的改善的微循環(huán)。如果未發(fā)炎，則白細胞數(shù)將會減少并且被單細胞代替，所述單細胞是釋放生長因子(細胞因子)和一些化學物質(zhì)的巨噬細胞和淋巴細胞，其中所述化學物質(zhì)例如有組胺、5-羥色胺、前列腺素，它們是創(chuàng)傷愈合過程的開始和繼續(xù)的主要調(diào)節(jié)劑。最重要的調(diào)節(jié)細胞是巨噬細胞。在增殖階段中形成結(jié)締組織，其中生長新血管，于是受損傷的組織獲得再生。約一周后，成纖維細胞是優(yōu)勢細胞，發(fā)炎減少了，于是創(chuàng)傷的抗力迅速增大了。最后在成熟期，組織蛋白膠原被穩(wěn)定化，于是形成疤痕組織。該階段可能持續(xù)一長段時間，在此期間，例如神經(jīng)組織的強度得到改善，并且再生在繼續(xù)。為了達到最佳創(chuàng)傷愈合，應充分供應各種維生素和痕量元素以及營養(yǎng)物，并且氧的供應也應充分。
非妥協(xié)的細胞體內(nèi)平衡是創(chuàng)傷愈合和修復的基本因素，并且在愈合組織中需要某些條件而在形成肉芽組織和上皮芽生。體內(nèi)平衡條件包括水合度、足夠的血液灌流、各種生長因子的可獲得性、適當?shù)难醴謮骸⒎遣≡晕⑸飬^(qū)系的可接受的程度以及創(chuàng)傷和鄰近的正常皮膚之間電位梯度的維持。在體內(nèi)平衡環(huán)境中，細胞被泡在便于正常生長和修復過程的體液中。
慢性創(chuàng)傷或無痛的、未愈合的創(chuàng)傷可能由不同的原因而引起，包括感染、異物或毒性刺激物的存在、灼傷、長期施加于皮膚的壓力和受損傷的循環(huán)引起的血液供應不足。在慢性創(chuàng)傷中，組織體內(nèi)平衡和創(chuàng)傷環(huán)境被調(diào)和，于是，或者不出現(xiàn)愈合，或者愈合剛開始就停止了。所述條件中涉及的因素有組織壞死、脫水、慢性創(chuàng)傷水腫、纖維化硬結(jié)和小血管病。
腿潰瘍是一種慢性創(chuàng)傷，見于很大一部分人中，隨年齡增大而增多。該病程可持續(xù)從兩三個月到數(shù)十年，并且會給社會造成重大的代價以及使個體患者遭受很大的痛苦。壓力潰瘍(即褥瘡性潰瘍或褥瘡)是另一類慢性創(chuàng)傷，它主要傷害老年人。慢性非治愈性潰瘍是糖尿病患者中的嚴重問題。
為了提供體內(nèi)平衡環(huán)境，可用被設計成保持創(chuàng)傷濕潤的閉塞敷料覆蓋創(chuàng)傷。然而，這將帶來促使創(chuàng)傷感染的危險。
一種用于治療慢性開口創(chuàng)傷的最古老的療法是水療法，該方法現(xiàn)今可在渦流浴中進行。通過這樣可浸掉敷料并清創(chuàng)壞死的組織。
在慢性皮膚潰瘍和無痛潰瘍中，如果壞死的、脫水的組織阻塞它，則可能不會出現(xiàn)細胞從創(chuàng)傷周圍遷移。壞死的組織妨礙肉芽組織的形成并且防止上皮細胞遷移穿過創(chuàng)傷。因此需要清創(chuàng)(即從傷口消除壞死的組織)，不但為了除去上面生存了細菌的死組織從而能進行肉芽生成和膠原(上皮細胞可在其上遷移從而閉合傷口)成纖維樣沉積的愈合過程，而且為了除去很多可能存在的微生物。該清創(chuàng)作用可通過局部施用酶、促進自溶(即通過自然存在于創(chuàng)傷液中的酶自身消化壞死的組織)、應用合成敷料或通過手術(shù)切除來進行。一經(jīng)清創(chuàng)后，傷口通常將經(jīng)歷肉芽生成、收縮和上皮形成。
有一些局部治療劑可能對創(chuàng)傷愈合速度有很深的影響。局部抗菌劑和清潔劑通常在創(chuàng)傷治療中被濫用，導致有害的細胞毒性效果以及最小的抗菌效果和清潔效果。作為這類治療劑的實例值得一提的有碘附、次氯酸鈉溶液、過氧化氫和氧化鋅。
已假定損傷的創(chuàng)傷愈合可能是由生長因子適當刺激的缺乏而引起的。實際上，生長因子已被用于臨床試驗而檢測它們是否能改善患慢性未愈合創(chuàng)傷的患者的傷口閉合。最近用生長因子對創(chuàng)傷愈合進行了有希望的動物實驗，但對人的慢性創(chuàng)傷的局部施用尚未成功。已建議應用與蛋白酶抑制劑組合的數(shù)種不同的生長因子。
另一種方法是單獨移植上皮細胞或者與成纖維細胞和胞外基質(zhì)成分一起移植。還推測了將調(diào)節(jié)治愈性多肽的合成的基因用于移植的細胞或者直接施用在傷口上。
大體上，促細胞分裂生長因子或者趨化生長因子或者促進一種或多種參與修復受損傷皮膚的細胞的分化的生長因子可促進皮膚愈合。成纖維細胞生長因子(FGFs)是九種已知的同源促細胞分裂原的一族，所述促細胞分裂原通過至少四種單一跨膜酪氨酸激酶受體及其備選的轉(zhuǎn)錄變體刺激中胚層和外胚層來源的細胞。酸性FGF(aFGF或FGF-1)似乎是鑒定了的FGFs中獨特的，是由于它高親和性地結(jié)合所有已知的FGF受體的能力。該廣范圍的受體專一性可能促成它的體外多細胞靶和組織修復的動物模型中多樣的治療相關的生物活性。aFGF是一種短多肽，它是來自皮膚成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和表皮角質(zhì)形成細胞(皮膚中的主細胞)的有效的促細胞分裂原。此外，aFGF在體外對血管內(nèi)皮細胞有趨化性并且誘導體內(nèi)新血管生長。在大鼠和小鼠中，外源性應用的aFGF促進全厚皮膚創(chuàng)傷的愈合并導致暫時增大切開的創(chuàng)傷中的抗張強度。Liying Sun等，“用aFGF cDNA的轉(zhuǎn)染改善了創(chuàng)傷愈合”，皮膚病學研究雜志(Journal of Investigative Dermatology)，Vol.108，No.3，1997。然而，aFGF的應用受到限制，這是因為需要施用較大量的重組aFGF，它通常由于焦痂的原因而受阻不能到達靶組織。aFGF的短半壽期是局部施用的另一個缺點，它要求頻繁施用。頻繁高劑量施用aFGF而克服擴散問題費用會很大。
另一族生長因子是轉(zhuǎn)化生長因子β，TGF-β包括種類繁多具有多生物活性的多肽。已闡述了TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3在創(chuàng)傷修復中的重要作用。TGF-β1是皮膚形態(tài)發(fā)生和皮膚創(chuàng)傷修復的重要調(diào)節(jié)子，并且已證實對創(chuàng)傷的外部施用可加速動物的創(chuàng)傷愈合過程。為了弄清TGF-β1的機制，已鑒定并克隆了培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞中由該因子調(diào)節(jié)的作用基因，參見B.Munz等，“依鈣結(jié)合蛋白I亞基膜聯(lián)蛋白II和pll在培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞中和在創(chuàng)傷修復期間的差異表達”，皮膚病學研究雜志，Vol.108，No.3，1997。此外，所述物質(zhì)還通過表皮生長因子(EGF)和角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)而增多，這兩種因子都刺激角質(zhì)形成細胞增殖。
P.Luppi等在“NGF在人妊娠期間被釋放入血漿；是催產(chǎn)素介導的響應嗎？”，神經(jīng)報導(Neuroreport)，4(8)，1063～5，1993中，已闡述了生物活性神經(jīng)生長因子(NGF)在婦女妊娠、勞動和哺乳期間的外周循環(huán)中增加五倍。由于在雌性大鼠中靜脈內(nèi)注射催產(chǎn)素也引起下丘腦中NGF量的增多，所以人們推測循環(huán)NGF量的增加可能與血漿中高含量的催產(chǎn)素或者與下丘腦-垂體-腎上腺軸的活化有關。
G.Jansen等在“針刺后的大鼠中局部缺血性肌皮瓣存活率的增加”，斯堪的納維亞生理學學報(Acta Physiol.Scand.)，135，555～558，1989中研究了針刺療法對大鼠皮瓣存活率的影響，證實手工針刺和電針刺使所述皮瓣的存活率與未處理的對比物相比顯著增高了。
現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)了催產(chǎn)素具有創(chuàng)傷愈合效果。該愈合效果至少部分是由于這一事實，即催產(chǎn)素激活對不同組織的愈合重要的生長因子。尤其現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF型生長因子和/或它們的受體通過施用催產(chǎn)素而被活化。
本發(fā)明涉及具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)在制備用于祛病治療或預防包括人在內(nèi)的哺乳動物創(chuàng)傷的藥物組合物方面的應用。
一個優(yōu)選的應用是治療皮膚、骨、粘液、腱、肌、神經(jīng)、脈管和結(jié)締組織中的創(chuàng)傷。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的應用是治療慢性創(chuàng)傷。
催產(chǎn)素是待分離和測序的第一肽激素之一。它是一種具有兩個半胱氨酸殘基的九肽，如下式所示，所述兩個半胱氨酸殘基在位置1和位置6之間形成二硫鍵
曾經(jīng)在很長一段時間中認為催產(chǎn)素的作用只是它對排乳和子宮收縮的刺激效果，但在近數(shù)十年中，證實了催產(chǎn)素在CNS中產(chǎn)生的寬范圍的效果。有人提出，催產(chǎn)素參與控制記憶和學習過程和各種行為(例如攝食、運動)，以及母性行為和性行為。還有人認為催產(chǎn)素參與心血管功能、體溫調(diào)節(jié)、痛覺閾和流體平衡的控制。還有跡象表明，催產(chǎn)素與各種免疫過程的控制有關。最近已證實，在重復施用后，催產(chǎn)素注射引起血壓降低和體重增加的長期效果。
有合成催產(chǎn)素的不同方法，工業(yè)方法例如被描述于美國專利2,938,891和3,076,797中。
在人體內(nèi)，催產(chǎn)素是在下丘腦的室旁核(PVN)和視上核(SON)中產(chǎn)生的。它與加壓素(它也是在這些核中產(chǎn)生的)不同之處僅在于兩個氨基酸。SON和PVN的大細胞的催產(chǎn)素能神經(jīng)元將投射物送入垂體后葉腺(催產(chǎn)素或加壓素就是從該腺體分泌入循環(huán)的)。發(fā)源于PVN中的小細胞神經(jīng)元投射入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的多區(qū)。產(chǎn)生催產(chǎn)素的細胞受神經(jīng)支配，即受膽堿能神經(jīng)元、兒茶酚胺能神經(jīng)元和肽能神經(jīng)元的支配。催產(chǎn)素在腦外不同組織(例如子宮、卵巢、睪丸、胸腺、腎上腺髓質(zhì)和胰腺)中的存在已被證實，并且人們認為催產(chǎn)素在這些器官內(nèi)產(chǎn)生局部效果。
催產(chǎn)素平行分泌入大腦區(qū)和分泌入循環(huán)是響應某種刺激(例如哺乳)而發(fā)生的，但其它刺激作用可引起催產(chǎn)素能神經(jīng)元的獨立的活化，在大腦或垂體中終止。
在這里，催產(chǎn)素，只要適用，除了指催產(chǎn)素外還指表現(xiàn)相同性能的前體、代謝衍生物、催產(chǎn)素興奮劑或類似物。
本發(fā)明具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)可通過通式I描述
其中W選自Ile、Cha、Val、Hoph和Phe；X選自Gln、Ser、Thr、Cit、Daba和Arg；Y選自Leu、Ile、Arg、Hos、Daba、Cit和Val；其中Leu、Ile和Val給出催產(chǎn)素類似物，而Arg、Hos、Daba和Cit則給出加壓素類似物；以及Z選自Gly和Ala。
所述物質(zhì)中的非天然氨基酸具有下列結(jié)構(gòu)Cha(環(huán)己基丙氨酸)
Hoph(高苯丙氨酸)
Cit(瓜氨酸)
Daba(二苯基丁酸)
Hos(高絲氨酸)
所述氨基酸全部可商購，例如可從Bachem和Sigma商購。
本發(fā)明的物質(zhì)中的氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。
本發(fā)明的物質(zhì)還包括具有帶反向肽鍵的序列的九肽。這些序列優(yōu)選是反向序列，更優(yōu)選包括D-氨基酸。
認為式I的九肽由于與具有下式的催產(chǎn)素的結(jié)構(gòu)相似性而表現(xiàn)出催產(chǎn)素活性
在該催產(chǎn)素結(jié)構(gòu)中，位置1、2、5、6和7保持未變，也就是說，所述二硫鍵和被認為是穩(wěn)定所述鍵因而對性能至關重要的氨基酸(即位置2中的Tyr、位置5中的Asn和位置7中的Pro)保持未變。在位置3中，疏水性Ile可用其它疏水性氨基酸更換，并且在位置4中，親水性Gln可用其它親水性氨基酸更換。在位置8中，如果Leu被疏水性氨基酸Ile或Val更換則獲得催產(chǎn)素類似物；并且如果用親水性氨基酸Arg、Hos、Cit或Daba更換Leu則獲得加壓素類似物。本發(fā)明的九肽已通過下列文獻中所述方法而編譯了S.Hellberg等，“肽定量結(jié)構(gòu)-活性關系，一種多變的方法”，醫(yī)療化學雜志(J.Med.Chem.)，1987，30，1126以及J.Jonsson等，“55個編碼的和非編碼的氨基酸的多變量參數(shù)化”，Quant.Struct.-Act.Relat.，8，204～209(1989)。所述肽可按已知方法合成[例如由Streitwieser和Heathcock在“有機化學導論”(Introduction to OrganicChemistry)(第3版)，p.949～950中描述的‘Merrifields固相合成法’]。具有反向肽鍵的序列也可通過例如‘向后-逆向修飾’(retro-inversomodification)(例如參見S.Muller等，PNAS Vol 94，No.97，12545～12550)制備。
催產(chǎn)素的應用構(gòu)成本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是具有下列結(jié)構(gòu)式的物質(zhì)即鳥催產(chǎn)素、硬骨魚催產(chǎn)素、加壓素或8-精加壓催產(chǎn)素的應用Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Ile-Gly-NH2(鳥催產(chǎn)素)(當在式I中時W＝Ile，X＝Gln，Y＝Ile和Z＝Gly)Cys-Tyr-Ile-Ser-Asn-Cys-Pro-Ile-Gly-NH2(硬骨魚催產(chǎn)素)(當在式I中時W＝Ile，X＝Ser，Y＝Ile和Z＝Gly)Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(加壓素)(當在式I中時W＝Phe，X＝Gln，Y＝Arg和z＝Gly)
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2(8-精加壓催產(chǎn)素)(當在式I中時W＝Ile，X＝Gln，Y＝Arg和Z＝Gly)用于本發(fā)明的應用的其它優(yōu)選的物質(zhì)有Cys-Tyr-Cha-Cit-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2，Cys-Tyr-Val-Thr-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2Cys-Tyr-Hoph-Thr-Asn-Cys-Pro-Val-Gly-NH2，Cys-Tyr-Phe-Cit-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，Cys-Tyr-Cha-Arg-Asn-Cys-Pro-Hos-Ala-NH2，Cys-Tyr-Val-Daba-Asn-Cys-Pro-Daba-Ala-NH2，Cys-Tyr-Hoph-Daba-Asn-Cys-Pro-Cit-Ala-NH2和Cys-Tyr-Phe-Arg-Asn-Cys-Pro-Val-Ala-NH2.
實驗已證明，催產(chǎn)素通過中樞作用的方式提高大鼠中的中樞α2受體的活性。這些受體具有抑制作用并且對抗腦中主要經(jīng)由α1受體(它們激活環(huán)化AMP)介導的去甲腎上腺素的活化方面。當α2受體刺激超過α1受體刺激時，則活性通過舒張而交換，能量朝向生長和愈合分流傳送，即能量未被用于應力或肌收縮和活動。結(jié)果，副交感神經(jīng)音超過交感神經(jīng)音，于是，肌肉系統(tǒng)就松弛了?？赏茰y催產(chǎn)素也在人體中產(chǎn)生類似的效果。在乳房喂養(yǎng)(一種以重復分泌催產(chǎn)素為特征的情況)過程中，見到了在重復施用催產(chǎn)素后的實驗動物中觀察到的所有效果。不知道催產(chǎn)素對α2受體的作用是如何被介導的，但可能不是通過傳統(tǒng)的催產(chǎn)素受體介導的作用。
催產(chǎn)素的效果可這樣延長或增強與增大催產(chǎn)素和/或一些受體(例如雌激素)的釋放的藥物或具有α2興奮效果的藥物(例如可樂定)組合施用。
本發(fā)明還涉及與雌激素組合的催產(chǎn)素在制備用于治療性或預防性創(chuàng)傷愈合的藥物組合物方面的應用。催產(chǎn)素和雌激素或者被一起施用或者先施用雌激素再施用催產(chǎn)素。雌激素增大催產(chǎn)素的釋放和合成、催產(chǎn)素受體的合成，并且它還上調(diào)α2受體的活性。
催產(chǎn)素的短期效果(例如短期解痛、短期鎮(zhèn)靜和激素釋放)是通過催產(chǎn)素拮抗劑逆轉(zhuǎn)的，于是可被描述成直接效果。
長期效果(達數(shù)天～數(shù)月的減輕，是在數(shù)周～數(shù)月的時間間隔重復治療3～10天、優(yōu)選5～8天后獲得的)從一般觀點來看也是出乎意外的，并且以前尚未報道過其它任何藥物在患者中的長期效果。當獲得所述效果之后，例如可通過每周一次的治療而保持它。該長期效果是通過α2拮抗劑逆轉(zhuǎn)和通過α2興奮劑增強的。
所述含催產(chǎn)素的藥物組合物可被配制成供局部的、離子電滲療法的、鼻的、肺內(nèi)的、腸胃外的(例如皮下的、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的或腦室內(nèi)的)施用。優(yōu)選的施用方式是局部用藥和鼻內(nèi)用藥。腸胃外的組合物例如是供皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射的溶液或乳液。局部組合物可以是洗劑、乳膏、軟膏或凝膠(例如被摻入膏藥)。
局部施用中應給出的劑量可以是1～1000μg/cm2，優(yōu)選10～100μg/cm2；腸胃外施用中為0.05～1mg/kg；而鼻內(nèi)施用中則是1～100IU/天，優(yōu)選是25～50IU/天。1IU(或國際單位)相當于2μg。對于患臍絞痛的兒童來說，優(yōu)選的劑量可以是20～50IU/天、更優(yōu)選25～30IU/天(經(jīng)鼻施用)，優(yōu)選在1～2小時中施用2～3次。在i.c.v或i.t.施用中，劑量一般是腸胃外劑量的1/10～1/1000。
市場上現(xiàn)在有供注射和噴鼻的商品溶液供應。


圖1是在皮下施用催產(chǎn)素和催產(chǎn)素拮抗劑后大鼠的肌皮瓣存活率的條線圖。生物試驗一個已有的創(chuàng)傷愈合模型旨在研究大鼠的肌皮瓣存活率。在整形外科學中，重構(gòu)問題通常是通過外科皮瓣解決的。手術(shù)皮瓣的主要缺點是其造成局部缺血和最后遠端部分壞死的傾向。該并發(fā)癥最終會破壞手術(shù)后看來優(yōu)良的結(jié)果。進行了很多研究致力于解釋外科皮瓣存活的機制以及如何預防和消除既成的局部缺血。
為了研究皮膚創(chuàng)傷治愈劑對慢性未愈合皮潰瘍的效果，已產(chǎn)生突變型C57BL/Ks-db/db糖尿病小鼠作為可能相關的愈合-損傷的模型。這些基因上純合的糖尿病小鼠發(fā)展成胰島素抗性的肥胖和高血糖癥，它與人II型糖尿病相似。它們還顯示糖尿病跡象，例如過量飲水和排尿以及大為升高的尿葡萄糖含量。這些小鼠中的創(chuàng)傷在細胞浸潤、肉芽組織形成和傷口閉合方面表現(xiàn)出顯著延遲。以前的研究應用了該模型來評定aFGF的制劑。試驗1.施用催產(chǎn)素后大鼠中皮瓣的存活率。
本研究的目的是研究催產(chǎn)素對大鼠肌皮瓣存活率的影響。
將71只雌性白化大鼠(Sprague-Dawley，重180～220g)用水合氯醛(0.4g/kg)麻醉，剃光背部，隆起一塊基于顱背側(cè)的標準皮瓣(2×7cm)然后在適當位置縫合。所述皮瓣是從肌的深筋膜處隆起的并且包括表面筋膜、肉膜、皮下組織和皮膚。分別在手術(shù)前24小時和1小時以及手術(shù)后24小時用1mg/kg催產(chǎn)素(s.c.)(n＝20)、催產(chǎn)素拮抗劑[即1-脫氨基-2-D-Tyr-(OEt)-4-Thr-8-Orn-催產(chǎn)素，以1mg/kg的量(n＝15)]、用1mg/kg所述催產(chǎn)素拮抗劑處理這些大鼠；再在30分鐘后用1mg/kg催產(chǎn)素(n＝16)或者用鹽水(n＝20)處理。
在手術(shù)后六天估測所述皮瓣的存活率。與鹽水處理的對比組(p＜0.05)相比，催產(chǎn)素處理過的大鼠具有高得多的皮瓣存活率。當先施用催產(chǎn)素拮抗劑再注射催產(chǎn)素時，則該效果被消除了。與鹽水處理過的大鼠(不顯著，p＝0.13)和催產(chǎn)素處理過的大鼠(p＜0.05)相比，單獨的催產(chǎn)素拮抗劑降低了皮瓣存活率。
該研究的結(jié)果被闡述于圖1中，圖1示出皮下處理過的大鼠肌皮瓣的存活率，即用鹽水(NaCl)、催產(chǎn)素(Ox)、催產(chǎn)素拮抗劑(OxA)和催產(chǎn)素拮抗劑+催產(chǎn)素(OxA+Ox)處理過。結(jié)果以平均值±SD表示。用單向ANOVA接著通過學生t-檢驗進行了統(tǒng)計估測。試驗2.施用催產(chǎn)素后的糖尿病小鼠中創(chuàng)傷的愈合11周大小的雌性C57BL/Ks-db/db糖尿病小鼠得自JacksonLaboratories(Bar Harbor，ME)。將小鼠關在具有無菌水和墊層的無菌微型隔離盒中(每盒四只)，并且保持在半封閉的檢疫設施內(nèi)。在引起創(chuàng)傷后用電熱板以每盒一半提供增補的熱從而防止降溫并減小死亡率。
腹膜內(nèi)注射每kg體重為110mg的氯胺酮和9mg的賽拉嗪而麻醉小鼠。剃光背中部和胸廓的皮膚，并用2％氯己定外科擦洗液接著用70％乙醇消毒。在中背區(qū)應用一塊直徑為1.6cm的模板標記一個2.0cm2的圓圈，用已滅菌的彎曲虹膜剪通過平端摘除造成一個全厚傷口。在損傷后不久，傷口面積一般增大到約2.3cm2，可能是因為真皮沿傷口周邊收縮的緣故。應用完全無菌的技術(shù)在層流罩超靜臺中進行所有的外科操作和隨后的愈合分析操作。在損傷前連續(xù)5天，以及損傷后第0、3和7天施用劑量。分別以不同的劑量(0.001、0.01、0.1、1.0、10.0和100.0μg/cm2)給每個劑量為16只小鼠的組施用催產(chǎn)素。用半透明Bioclusive敷料(Johnson & Johnson Products，New Brunswick，NJ)覆蓋傷口從而保護傷口、保持濕潤的環(huán)境和防止形成痂。在損傷后第10天取傷口液體樣并進行需氧微生物和厭氧微生物培養(yǎng)。從本研究分析中排除表現(xiàn)出每個傷口多于50個菌落的動物。防止甚至輕度的或亞臨床的感染導致一致的最大愈合損害，于是為評定治療效果提供大的創(chuàng)傷愈合窗。
用照相方法記錄傷口外觀并將傷口周邊印在無菌載玻片上，即在預先用一滴無菌生理鹽水潤濕后直接將所述載玻片印在裸露的傷口表面。在引起創(chuàng)傷后立即地并且隨后一周兩次地進行測定直至傷口完全閉合。應用計算機化圖象分析從載玻片印跡測定傷口面積和周長。應用不成對的兩尾學生t-檢驗(unpaired two-tailed Student t-test)估算組間差異的統(tǒng)計顯著性。
以初始面積減小的百分數(shù)表示的愈合被轉(zhuǎn)化成從傷口周邊的線性內(nèi)生長，方法是以時序間隔將傷口面積的差值除以平均傷口周長。在特定時間總的內(nèi)生長值是直到該時刻為止增加的內(nèi)生長距離之和。該轉(zhuǎn)化將閉合作為時間的函數(shù)線性化，于是能以隨時間恒定的動力學速度表述愈合。
當不再出現(xiàn)濕肉芽組織(指示一層功能性表皮水滲透性屏障)時，就認為創(chuàng)傷(每周兩次地檢查從而監(jiān)測全部閉合的時間)完全愈合了。還從組織學上進一步證實閉合。通過用耶茲矯正的x2-統(tǒng)計分析愈合傷口對未愈合傷口分數(shù)的時間點對比，并且通過不成對的兩尾學生t-檢驗分析各只動物完全閉合的絕對天數(shù)的組對比。
作為對在引起創(chuàng)傷后第一周內(nèi)施用的三次各為10μg/cm2(初始傷口面積)的劑量的響應，直徑為1.6cm的全厚皮切口閉合得比用相應的介質(zhì)對照的處理組快得多。早在損傷后第7天就見到并且在整個試驗期間繼續(xù)見到處理過的傷口愈合速度的統(tǒng)計顯著性的增強(p≤0.01)。從損傷后第14天，在催產(chǎn)素處理過的傷口和介質(zhì)處理過的傷口之間出現(xiàn)50％的最大差異(以初始面積的百分數(shù)計)。該差異相當于在第14天，處理過的小鼠傷口尺寸與接受相應的PBS/肝素介質(zhì)的小鼠相比要小10倍。雖然接受液體介質(zhì)的創(chuàng)傷比未接受任何物質(zhì)的創(chuàng)傷愈合得稍快些，但用PBS或生理鹽水處理后的愈合速度與用含肝素的PBS介質(zhì)處理過的相當(未示出數(shù)據(jù))。
傷口閉合作為時間的函數(shù)是非線性的，所以催產(chǎn)素處理的效果大小似乎隨時間而變。由于這些全厚傷口是通過從傷口周邊逐漸愈合而閉合的，所以我們將所述數(shù)據(jù)從初始傷口面積的百分數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)閺某跏紓谥苓呴_始的平均線性愈合長度。該計算將初始3天延遲后的平均愈合速度線性化了。在全部時間間隔，用催產(chǎn)素處理顯著(p≤0.01)增大了從傷口周邊愈合的線性速度。對每只動物測定了作為時間的函數(shù)的累積線性愈合長度的斜率。按處理分組的這些斜率表明，10μg/cm2催產(chǎn)素將平均線性愈合速度從0.18mm/天(在介質(zhì)處理過的組中觀測到的)增大到0.45mm/天(p≤0.01)。
用所述劑量的催產(chǎn)素處理還明顯減少了達到整個傷口閉合的時間。在第14天見到整個閉合中統(tǒng)計顯著性(p≤0.05)增大了。完全閉合的中間時間從介質(zhì)處理過的創(chuàng)傷的52天減少到在損傷后第一周中用三次催產(chǎn)素劑量處理過的創(chuàng)傷的僅僅23天(p≤0.0001)。
三次局部施用氧(每次劑量在1～100μg/cm2范圍內(nèi)，在損傷后第一周中施用)導致愈合速度比成對的介質(zhì)對比組顯著劑量相關的增大。0.001μg/cm2、0.01μg/cm2和0.1μg/cm2的劑量都無效，于是確定“無效”量在0.001～1μg/cm2之間。
劑量響應關系還從傷口完全閉合的時間看出。施用每次劑量為1～100μg/cm2顯著減少了這些傷口完全閉合所需的時間。在1.0～10.0μg/cm2的劑量范圍內(nèi)，創(chuàng)傷愈合得比它們各自的介質(zhì)對比組大約快10天。該閉合速度、0.001μg/cm2(未示出)和0.01μg/cm2劑量在減少達到完全閉合的時間方面是無效的。
在損傷后7天，比較了從用10μg/cm2催產(chǎn)素處理過的十只小鼠和用PBS處理過的十只小鼠的損傷區(qū)(“潰瘍”)取的皮膚活組織檢查中FGF的濃度。結(jié)果表明，催產(chǎn)素處理過的小鼠合成的FGF-1比用PBS介質(zhì)處理過的小鼠合成的多162％。該濃度的增大具有高度的顯著性(p＜0.001)并且有力地支持了這一假設，即催產(chǎn)素通過FGF-1的增大的表達和合成加速了創(chuàng)傷愈合。
權(quán)利要求
1.具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)在制備用于祛病治療或預防包括人在內(nèi)的哺乳動物創(chuàng)傷的藥物組合物方面的應用。
2.權(quán)利要求1的物質(zhì)的應用，其特征在于，該物質(zhì)具有下式I的結(jié)構(gòu)
其中W選自Ile、Cha、Val、Hoph和Phe；X選自Gln、Ser、Thr、Cit、Daba和Arg；Y選自Leu、Ile、Arg、Hos、Daba、Cit和Val；其中Leu、Ile和Val給出催產(chǎn)素類似物，而Arg、Hos、Daba和Cit則給出加壓素類似物；以及Z選自Gly和Ala；以及具有反向肽鍵的序列。
3.權(quán)利要求1或2的應用，其特征在于，所述物質(zhì)是催產(chǎn)素。
4.權(quán)利要求1或2的應用，其特征在于，所述物質(zhì)是鳥催產(chǎn)素、硬骨魚催產(chǎn)素、加壓素或8-精加壓催產(chǎn)素。
5.權(quán)利要求1或2的應用，其特征在于，所述物質(zhì)選自下組序列Cys-Tyr-Cha-C1t-Asn-Cys-pro-Arg-Gly-NH2，Cys-Tyr-Val-Thr-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，Cys-Tyr-Hoph-Thr-Asn-Cys-Pro-Val-Gly-NH2，Cys-Tyr-Phe-Cit-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，Cys-Tyr-Cha-Arg-Asn-Cys-Pro-Hos-Ala-NH2，Cys-Tyr-Val-Daba-Asn-Cys-Pro-Daba-Ala-NH2，Cys-Tyr-Hoph-Daba-Asn-Cys-Pro-Cit-Ala-NH2和Cys-Tyr-Phe-Arg-Asn-Cys-Pro-Val-Ala-NH2.
6.權(quán)利要求1～5任一項的催產(chǎn)素在治療皮膚、骨、粘液、腱、肌、神經(jīng)、脈管和結(jié)締組織中的創(chuàng)傷方面的應用。
7.權(quán)利要求1～6的催產(chǎn)素在治療慢性創(chuàng)傷方面的應用。
8.權(quán)利要求1-8任一項的與雌激素組合的催產(chǎn)素的應用。
9.權(quán)利要求1～8任一項的應用，其中所述藥物組合物包括與藥物惰性載體組合的催產(chǎn)素。
10.權(quán)利要求1～9任一項的應用，其中所述藥物組合物被配制供鼻或局部施用。
11.權(quán)利要求1～10任一項的應用，其中所述藥物組合物呈鼻噴霧劑的形式。
12.治療創(chuàng)傷的方法，該方法包括施用治療有效劑量的具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)或催產(chǎn)素興奮劑，尤其是催產(chǎn)素。
13.權(quán)利要求12的方法，該方法包括每天經(jīng)鼻施用5～100IU、優(yōu)選25～50IU的催產(chǎn)素。
全文摘要
具有催產(chǎn)素活性的物質(zhì)可被用于制備供祛病治療或預防創(chuàng)傷(例如慢性創(chuàng)傷)的藥物組合物。創(chuàng)傷愈合效果可通過將催產(chǎn)素與雌激素組合而增強或延長。
文檔編號A61K31/56GK1251530SQ9880376
公開日2000年4月26日 申請日期1998年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月27日
發(fā)明者托馬斯·倫德伯格, 謝斯廷·烏納斯姆伯格 申請人:介入技術(shù)醫(yī)學股份公司