專利名稱：反義核苷酸序列的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使用反義核苷酸序列抑制蛋白質(zhì)合成的技術(shù)，尤其涉及能增強(qiáng)對蛋白質(zhì)合成的抑制作用的技術(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)已知功能性RNA(如為蛋白質(zhì)合成提供信息的信使RNA)可被具有與前述RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的RNA(統(tǒng)稱為反義RNA)抑制。正在進(jìn)行的研究著力于產(chǎn)生其中通過基因重組技術(shù)人工導(dǎo)入反義RNA的植物，以對應(yīng)于編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全長DNA序列(cDNA或基因組DNA)的序列在反義方向被連接到啟動(dòng)子下游的方式構(gòu)建了表達(dá)反義RNA的基因。
盡管已建議了多種反義技術(shù)，但值得一提的是下列技術(shù)(1)制備出重組的矮牽牛屬植物，所述植物可產(chǎn)生針對查耳酮合酶基因之RNA的反義RNA，所述基因參與花色素的合成，重組的矮牽牛屬植物表現(xiàn)出與野生型不同的花色(EP34-1885A)；(2)通過導(dǎo)入反義RNA抑制了使番茄果實(shí)失去其結(jié)實(shí)度的重要因子多聚半乳糖醛酸酶基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生了與野生型相比保存期更長的番茄(EP891115A)；(3)Melton等人將β-珠蛋白cDNA的全長序列用作反義基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:144-148(1985))；(4)Stockhaus等人將對應(yīng)于參與光合作用之光合系統(tǒng)的10KD蛋白質(zhì)cDNA全長的序列用作反義基因(EMBO J,9:3013-3021(1990))；(5)Alexander等人將對應(yīng)于參與花色素合成的查耳酮合酶cDNA全長的序列用作反義基因(自然，333:866-869(1988))；(6)Hamilton等人將對應(yīng)于乙烯合酶(ACC-氧化酶)cDNA全長的序列用作反義基因(自然，346:284-287(1990))；和(7)Smith等人將對應(yīng)于多聚半乳糖醛酸酶cDNA部分長度的序列用作反義基因(自然，334:724-726(1988))。
因此，在常規(guī)的反義相關(guān)技術(shù)中，以反義方向在啟動(dòng)子下游簡單地插入對應(yīng)于編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列之部分或全長的核苷酸序列以作為反義基因。
盡管已有幾篇報(bào)道建議使用反義RNA來降低所需蛋白質(zhì)的含量的方法，但至今無人報(bào)道過可成功地降低體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)的合成，例如植物種子內(nèi)的貯存蛋白的合成。為了確保使用反義RNA可降低體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)的含量，在其合成位點(diǎn)處必需提供大量的反義RNA。能滿足此需求的一個(gè)可能的方法是導(dǎo)入多拷貝的反義基因；然而，如果在宿主為植物的情況下需要純合子，問題是需要做大量工作以通過自體受精固定多拷貝導(dǎo)入的基因。另一可能的方法是增強(qiáng)表達(dá)所需反義基因之啟動(dòng)子的活性，但這也不容易實(shí)現(xiàn)。
因此，迄今為止所報(bào)道的反義基因不能提供一種簡單的方法來降低體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)的含量。
發(fā)明簡述一般而言，據(jù)信蛋白質(zhì)合成受抑制的程度隨相關(guān)反義基因表達(dá)的增加而增加(Melton D.A.等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:144-148；和Ecker J.R.等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5372-5376)。如上所述，通過例如增強(qiáng)用于表達(dá)反義基因所用啟動(dòng)子的活性或通過增加導(dǎo)入的反義基因的拷貝數(shù)可增加反義基因的表達(dá)，然而，兩種方法都會遇到上述問題。本發(fā)明的目的是提供一種反義基因，該基因不僅能更有效地抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，甚至也能降低體內(nèi)含量豐富的蛋白質(zhì)的含量。
如果以反義方向?qū)雽?yīng)于所需結(jié)構(gòu)基因之全長的核苷酸序列，實(shí)際上也可使降低所需蛋白質(zhì)合成的效力在一定程度上增加。然而，根據(jù)以反義方向?qū)雽?yīng)于所需結(jié)構(gòu)基因之全長的核苷酸序列的方法，可能會出現(xiàn)未知的開放閱讀框架，從而在宿主中誘導(dǎo)不期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)。特別是對于食用植物而言，必需認(rèn)真考慮兩個(gè)重要的因素，即對人的安全性和口味的變化?？赏ㄟ^使用對應(yīng)于結(jié)構(gòu)基因之部分的序列，即缺乏開放閱讀框架或從中人工缺失開放閱讀框架的部分序列來抑制不期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而解決這一問題。然而，如果所需結(jié)構(gòu)基因的部分作為單個(gè)單位被導(dǎo)入，由結(jié)構(gòu)基因降低蛋白質(zhì)合成的效力就不能達(dá)到想要的水平。在這種情況下，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，目的是開發(fā)一種通過降低所需蛋白質(zhì)的合成而不表達(dá)任何未知蛋白質(zhì)，從而解決上述問題的方法。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了這種方法，其中制備了反義核苷酸序列以使其含有按順序連接的多個(gè)所需的結(jié)構(gòu)基因或其片段，將所述序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因中；在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
圖的簡述

圖1圖示了體外RNA合成所用基因的結(jié)構(gòu)；圖2圖示了小麥胚芽提取物中翻譯產(chǎn)物分析的電泳模式；圖3圖示了谷蛋白合成量的變化；圖4圖示了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)；圖5圖示了轉(zhuǎn)化體PCR分析中的電泳模式，所述轉(zhuǎn)化體具有的序列含有導(dǎo)入其中的谷蛋白A反義基因的8個(gè)重復(fù)；圖6圖示了轉(zhuǎn)化體PCR分析中的電泳模式，所述轉(zhuǎn)化體具有導(dǎo)入其中的谷蛋白A反義基因的全長序列；圖7圖示了轉(zhuǎn)化體Northern分析中的電泳模式，所述轉(zhuǎn)化體具有的序列含有導(dǎo)入其中的谷蛋白A反義基因的8個(gè)重復(fù)；和圖8圖示了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可形成反義核苷酸序列以使其含有在反義方向上按順序連接的所需結(jié)構(gòu)基因或代表所述結(jié)構(gòu)基因的一部分的序列的兩個(gè)或更多單位，將所述序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因中以有效抑制由結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)表達(dá)，在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明一方面提供了反義核苷酸序列，其中兩個(gè)或更多單位的所需結(jié)構(gòu)基因或代表所述結(jié)構(gòu)基因的一部分的序列在反義方向上按順序連接。由本發(fā)明反義核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的反義RNA在分子中含有兩個(gè)或多個(gè)與編碼所需蛋白質(zhì)的mRNA部分互補(bǔ)的RNA序列的連續(xù)重復(fù)，因此，被轉(zhuǎn)錄的反義RNA會與編碼所需蛋白質(zhì)的mRNA鏈形成配對，從而增強(qiáng)了體內(nèi)抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的可能性。因此，與不具有這種序列單位重復(fù)的反義RNA相比，含有互補(bǔ)RNA序列重復(fù)的反義RNA能更有效地抑制所需蛋白質(zhì)的合成。
本發(fā)明另一方面提供了含有本發(fā)明反義核苷酸序列的表達(dá)載體，通過用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體，和抑制由結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)表達(dá)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的反義核苷酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因的步驟。
下文將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明的第一方面提供了反義核苷酸序列，其中兩個(gè)或更多重復(fù)的所需結(jié)構(gòu)基因或代表所述結(jié)構(gòu)基因的一部分的序列在反義方向上按順序連接。
本文所用術(shù)語“所需結(jié)構(gòu)基因”表示所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)需要被抑制的基因。表達(dá)受抑制的蛋白質(zhì)不局限于任何特定的類型，只要是體內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)即可；然而，優(yōu)選在體內(nèi)充分表達(dá)的蛋白質(zhì)，因?yàn)楸景l(fā)明的反義核苷酸序列將會工作得更有效。這種蛋白質(zhì)的例子是植物種子的貯存蛋白，更具體的例子包括谷類植物中谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白，白蛋白等等；尤其是種子中含量豐富的水稻谷蛋白，小麥谷蛋白，玉米醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白。其它例子包括大豆conglycinin,kindneybean云扁豆蛋白以及馬鈴薯patatin和甜馬鈴薯sporamin。
在下文給出的實(shí)施例中，使用了水稻中的貯存蛋白-谷蛋白A和B，但這兩種蛋白質(zhì)僅是作為本發(fā)明說明性實(shí)施方案。
在本發(fā)明中，可使用特定結(jié)構(gòu)基因的全長序列，或者也可使用代表所述基因的一部分的序列。在后一種情況下，優(yōu)選使用5’端附近的序列，因?yàn)閷?yīng)于結(jié)構(gòu)基因起始位點(diǎn)的互補(bǔ)序列能更有效地抑制所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如果使用的是部分序列，其大小不局限于任何特定的長度；通常優(yōu)選的序列長度為至少45個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選的序列長度為至少300個(gè)核苷酸(Tada等，(1996)，育種科學(xué)，46,403-407)。
在本發(fā)明的反義核苷酸序列中多個(gè)單位的上述序列在反義方向上按順序連接。
本文所用術(shù)語“反義方向”指的是至少一部分反義DNA序列為了提供與宿主細(xì)胞基因組DNA互補(bǔ)的區(qū)域而定的方向?；パa(bǔ)基因的轉(zhuǎn)錄物所具有的序列與對宿主而言為內(nèi)源性的RNA序列，尤其是mRNA序列互補(bǔ)。
本文所用術(shù)語“多個(gè)單位”指的是至少兩個(gè)單位，優(yōu)選至少為4個(gè)單位，更優(yōu)選至少為8個(gè)單位。
本文所用術(shù)語“按順序”指的是序列的相鄰單位不會被任何其它核苷酸所打斷，或任何間插序列不是啟動(dòng)子或其它對結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)會造成顯著影響的序列。
在本發(fā)明中，可通過基因工程技術(shù)中所用的任何常規(guī)方法連接多個(gè)單位的反義核苷酸序列，可使用適當(dāng)?shù)姆椒ǘ患尤魏翁厥庀薅ā?br> 在一個(gè)舉例用的方法中，將所需的結(jié)構(gòu)基因克隆至質(zhì)粒中，從質(zhì)粒中切下含有結(jié)構(gòu)基因全長或其片斷，含有結(jié)構(gòu)基因的一部分的序列(這種序列或其片斷被稱為插入物)。通過適當(dāng)?shù)姆椒?，如加入接頭可在切下的插入物的兩端導(dǎo)入不同的限制性位點(diǎn)。此時(shí)，重要的是需考慮隨后克隆步驟中所用載體(如質(zhì)粒載體)的克隆位點(diǎn)處的序列，以確保能以所得質(zhì)粒在反義方向上含有所需結(jié)構(gòu)基因的方式設(shè)計(jì)插入物兩端的限制性位點(diǎn)。隨后，將兩端具有不同限制性位點(diǎn)的載體和兩端具有相應(yīng)限制性位點(diǎn)的插入物連接在一起以產(chǎn)生含有一個(gè)反義核苷酸序列的基因構(gòu)建體。
下一步，通過用限制性酶處理使構(gòu)建體線性化，并在其兩端導(dǎo)入不同的限制性位點(diǎn)。按與前一段所述相同的方式，切下含有結(jié)構(gòu)基因全長或部分長度的另一個(gè)插入物，并在插入物的兩端導(dǎo)入相應(yīng)的限制性位點(diǎn)。將所得序列與線性化的構(gòu)建體連接，從而產(chǎn)生含有兩個(gè)反義序列的基因構(gòu)建體。
按需要將相同的方案重復(fù)多次以產(chǎn)生含有所需數(shù)目的反義核苷酸序列的基因構(gòu)建體。也可以從含有兩個(gè)反義核苷酸序列的基因構(gòu)建體入手，切下含有反義序列的片斷用作插入物，從而通過一個(gè)連接步驟得到含有四個(gè)反義序列的基因構(gòu)建體。類似地，可從含有四個(gè)反義序列的基因構(gòu)建體入手，通過一個(gè)連接步驟即可制備出含有八個(gè)反義序列的基因構(gòu)建體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了含有兩種或更多種不同類型的結(jié)構(gòu)基因或代表其部分的序列作為所需結(jié)構(gòu)基因的反義核苷酸序列。需特別指出的是如果不同類型的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)同時(shí)被抑制，也可以設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體，以使其含有多個(gè)單位的轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體的連接，所述構(gòu)建體各含有本發(fā)明的反義核苷酸序列，所述連接置于啟動(dòng)子的下游并緊接著終止子。由于每個(gè)所述的基因構(gòu)建體單位都含有定位于反義方向上的不同類型結(jié)構(gòu)基因的反義序列或其部分，因此通過使用單個(gè)轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體可抑制多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
本發(fā)明第二方面提供了含有本發(fā)明反義核苷酸序列的表達(dá)載體。
在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，可從基因工程技術(shù)常規(guī)使用的工具中適當(dāng)選擇如啟動(dòng)子和終止子的調(diào)節(jié)元件，和轉(zhuǎn)化載體，它們不局限于任何特定的類型。
例舉的啟動(dòng)子包括谷蛋白啟動(dòng)子，conglycinin啟動(dòng)子，云扁豆蛋白啟動(dòng)子，ADH啟動(dòng)子，熱激蛋白啟動(dòng)子，組織特異性啟動(dòng)子，與果實(shí)成熟相關(guān)的啟動(dòng)子，谷醇溶蛋白啟動(dòng)子，RUBP羧化酶小亞單位啟動(dòng)子，花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子等等。
例舉的終止子包括胭脂氨酸合酶終止子，花椰菜花葉病毒終止子等等。
例舉的載體包括pUC質(zhì)粒載體，pBR質(zhì)粒載體，Ti質(zhì)粒載體，Ri質(zhì)粒載體等等。
本發(fā)明第三方面提供了通過用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體。
被轉(zhuǎn)化的生物體不局限于任何特定的類型，可適當(dāng)?shù)剡x自植物，動(dòng)物，微生物等等。在本發(fā)明中，優(yōu)選轉(zhuǎn)化體是植物，尤其是如單子葉植物和雙子葉植物的高等植物；特別優(yōu)選為谷類植物(如水稻，小麥，玉米和大麥)，大豆，云扁豆以及馬鈴薯和甜馬鈴薯。
本發(fā)明第四方面提供了通過將本發(fā)明的反義核苷酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因而抑制由結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)表達(dá)的方法。
將本發(fā)明的反義核苷酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因的方法不局限于任何特定的方式，根據(jù)特定的生物體可使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)。
例如，可使用根瘤農(nóng)桿菌，電穿孔至原生質(zhì)體，脂質(zhì)體融合，微量注射等將本發(fā)明的反義核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組基因中。
可通過適當(dāng)技術(shù)，如抗生素抗性細(xì)胞的篩選來選擇其中已成功導(dǎo)入反義核苷酸序列的植物細(xì)胞。培養(yǎng)所得的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以再生為完整的植株。通過常規(guī)的育種技術(shù)可將再生的植株固定為品種。
可通過電穿孔，脂質(zhì)體融合，微量注射和其它適當(dāng)?shù)姆椒▽⒎戳x核苷酸序列導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的基因組基因中。
可通過鈣方法，電穿孔和其它適當(dāng)?shù)姆椒▽⒎戳x核苷酸序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的基因組基因中。
給出下列實(shí)施例僅為了進(jìn)一步地闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明。
實(shí)施例在實(shí)施例中，嘗試?yán)梅戳xRNA來抑制水稻貯存蛋白，谷蛋白以降低水稻胚乳中的谷蛋白含量。至于谷蛋白，水稻在其基因組中含有10個(gè)或更多個(gè)編碼谷蛋白A或谷蛋白B的基因。谷蛋白A和B核苷酸序列的同源性為65％。降低水稻谷蛋白的含量可為啤酒廠提供較好品質(zhì)的水稻。
實(shí)施例中所用的步驟簡述如下除非特別說明，方法可根據(jù)ManiatisT等(分子克隆，冷泉港(1982))。
(a)分離水稻貯存蛋白-谷蛋白A和谷蛋白B的全長cDNA(Okita等，(1989),Joumal Biochemical Chemistry,264:12573-12581)。谷蛋白A和谷蛋白B cDNA的完整核苷酸序列分別示于SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
(b)在反義方向上連接得自谷蛋白A全長cDNA5’上游的多個(gè)312bp序列。
(c)將含有連接的反義基因用作體外轉(zhuǎn)錄的模板以制備相應(yīng)的反義RNA。
(d)將上述反義RNA與谷蛋白A的有義RNA混合，并將混合溶液用于體外翻譯以研究谷蛋白A合成的量。
(e)將蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)導(dǎo)入谷蛋白啟動(dòng)子的下游；將得自谷蛋白A全長cDNA 5’上游的8個(gè)重復(fù)的312bp序列置于所述內(nèi)含子的下游。另外加入胭脂氨酸合酶的終止子以提供表達(dá)質(zhì)粒載體。類似地制備含有得自谷蛋白B全長cDNA 5’上游的8個(gè)重復(fù)的287bp序列的反義基因，然后將該反義基因?qū)胨龅谋磉_(dá)質(zhì)粒載體。
(f)使用表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化水稻植株并研究水稻種子中的谷蛋白含量。
實(shí)施例1. 串聯(lián)重復(fù)的反義RNA的體外作用(1)體外合成RNA(1-1)合成谷蛋白A的有義mRNA在有義方向上將全長的谷蛋白A cDNA插入位于Bluescript質(zhì)粒(Toyobo公司產(chǎn)品)T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ/BamHⅠ(圖1,Glu有義RNA)。在反應(yīng)混合物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所述反應(yīng)混合物中含有上述質(zhì)粒(50μl中含5μg DNA)，其中還加入了各為20mM的ATP,CTP和GTP(4μl),2.5mM GTP(1μl),5mM Cap類似物(5μl),0.5M DTT(1μl),RNA酶抑制劑(50個(gè)單位)和T7 RNA聚合酶(10個(gè)單位)。將反應(yīng)混合物在37℃保溫30分鐘，加入20mM GTP(1μl)之后再在37℃保溫4.5小時(shí)。
(1-2)合成谷蛋白A反義RNA在反義方向上將全長的谷蛋白A cDNA插入位于Bluescript質(zhì)粒(Toyobo公司產(chǎn)品)T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ/BamHⅠ(反義-全長RNA)。類似地，按下述在反義方向上將得自谷蛋白AcDNA序列5’末端的單個(gè)(反義×1個(gè)RNA)，4個(gè)重復(fù)的(反義×4個(gè)RNA)，或8個(gè)重復(fù)的(反義×8個(gè)RNA)312bp片段插入Bluescript質(zhì)粒(圖1)。首先，在谷蛋白A cDNA序列5’末端下游312bp處存在的StuⅠ位點(diǎn)加入XbaⅠ接頭(CTCTAGAG)，通過在位于Bluescript質(zhì)粒(Toyobo公司產(chǎn)品)T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)XbaⅠ/BamHⅠ插入其BamHⅠ/XbaⅠ片段可構(gòu)建質(zhì)粒反義×1個(gè)RNA。接著在位于谷蛋白A cDNA序列5’末端下游312bp處的StuⅠ位點(diǎn)加入BamHⅠ接頭(CGGATCCG)，將從中分離出的BamHⅠ/ScaⅠ片段插入上述質(zhì)粒反義×1個(gè)RNA的BamHⅠ/SmaⅠ位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒反義×2個(gè)RNA。在XbaⅠ位點(diǎn)消化質(zhì)粒，用DNA聚合酶處理以補(bǔ)平粘性末端，隨后用EcoRⅠ處理可得到含有兩個(gè)約312bp的所述5’末端序列的片段。另外，在PstⅠ位點(diǎn)消化質(zhì)粒反義×2個(gè)RNA，通過DNA聚合酶補(bǔ)平并用EcoRⅠ裂解。通過將上述片段插入此EcoRⅠ位點(diǎn)構(gòu)建出質(zhì)粒反義×4個(gè)RNA，類似地，用DNA聚合酶處理以補(bǔ)平XbaⅠ切割位點(diǎn)，然后從質(zhì)粒反義×4個(gè)RNA中切下XhoⅠ片段，將所述片段插入質(zhì)粒反義×4個(gè)RNA的HincⅡ/XhoⅠ位點(diǎn)可構(gòu)建出質(zhì)粒反義×8個(gè)RNA。
通過于37℃在反應(yīng)混合物中保溫5小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所述反應(yīng)混合物中含有質(zhì)粒(5μg DNA)，其中還加入了各為20mM的ATP,CTP,UTP和GTP(5μl),0.5M DTT(1μl)，RNA酶抑制劑(50個(gè)單位)和T7RNA聚合酶(10個(gè)單位)。
(2)使用小麥胚芽提取物進(jìn)行體外翻譯反應(yīng)使用小麥胚芽提取物(Amersham)進(jìn)行翻譯實(shí)驗(yàn)。按下述在具有谷蛋白翻譯活性的Glu有義RNA(2皮摩爾)中加入針對谷蛋白有義RNA的反義RNA提供量分別為0.2,0.5,1和2皮摩爾的反義-全長RNA,反義×1個(gè)RNA，反義×4個(gè)RNA或反義×8個(gè)RNA。在含有2μl 1mM氨基酸混合物(除甲硫氨酸外的19種氨基酸)和0.5μl 35S-甲硫氨酸(1,000Ci/mmol)的混合物中加入15μl小麥胚芽提取物之后，于30℃進(jìn)行翻譯反應(yīng)1小時(shí)。通過加入20％SDS(2.5μl)然后于95℃加熱5分鐘來終止反應(yīng)。在13％聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離翻譯產(chǎn)物。使用Imaging分析儀(富士膠片公司)檢測和測量放射性。
(3)反義RNA作用的體外分析使用Imaging分析儀分析在反義RNA存在的條件下由小麥胚芽提取物合成的翻譯產(chǎn)物的量(圖2)，如果未加入RNA則不會出現(xiàn)帶(泳道1)，而當(dāng)僅加入谷蛋白有義RNA時(shí)出現(xiàn)了谷蛋白帶(泳道2)，然而，所加入的反義RNA的摩爾數(shù)越大，谷蛋白帶的強(qiáng)度越小(泳道3-6)。
由谷蛋白帶的放射性可測定給定條件下合成的谷蛋白的量。圖(圖3)中以與不含反義RNA的對照相比的百分?jǐn)?shù)來顯示給定條件下合成的谷蛋白的量的結(jié)果。谷蛋白的減少取決于所連接的谷蛋白A cDNA 5’上游312bp序列的數(shù)目。相對于使用全長谷蛋白反義RNA而言，在反義RNA含有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)或8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的5’上游312bp序列的情況下谷蛋白減少得更多。
實(shí)施例2．由谷蛋白A反義基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和分析(1)構(gòu)建8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因以用于轉(zhuǎn)化將含有蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)的SmaⅠ/XbaⅠ片段插入谷蛋白啟動(dòng)子(Takaiwa等，(1987),FEBS Lett,221:43-47)下游的ScaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)；然后以反義方向?qū)⒑?個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A cDNA 5’上游312bp的XbaⅠ/SacⅠ片段插入所述內(nèi)含子的下游。另外在其中加入含有胭脂氨酸合酶(Depicker等，(1982)，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志，561-573)終止子的SacⅠ/EcoRⅠ片段，然后將所形成的反義基因插入具有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒載體，從而產(chǎn)生pSBHCI×8A(圖4)。插入質(zhì)粒中的內(nèi)含子增強(qiáng)了谷蛋白A反義基因的表達(dá)。
(2)構(gòu)建全長的谷蛋白A反義基因以用于轉(zhuǎn)化將含有蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)的SmaⅠ/XbaⅠ片段插入谷蛋白啟動(dòng)子下游的ScaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)；然后以反義方向?qū)⒑泄鹊鞍譇 cDNA的SacⅠ/XbaⅠ片段插入所述內(nèi)含子的下游。另外在其中加入含有胭脂氨酸合酶終止子的SacⅠ/EcoRⅠ片段，然后將所形成的反義基因插入具有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒載體，從而產(chǎn)生pSBHCI-FA(圖4)。
(3)轉(zhuǎn)化水稻植物根據(jù)Hiel等人(植物學(xué)雜志，6,271-282(1994))的方法，用攜有上述質(zhì)粒pSBHCI×8A或pSBHCI-FA的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化水稻植物品種“Tsukinohikari”。按Hiel等人(文獻(xiàn)同上)的描述，在潮霉素存在的條件下選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
(4)制備DNA和RNA在將再分化的秧苗轉(zhuǎn)移至密閉溫室中進(jìn)行花盆培養(yǎng)之前，由所述秧苗制備轉(zhuǎn)基因植物的DNA。
通過SDS-苯酚法(Uchimiya等，植物基因工程手冊，Kodansha公司，東京，日本)制備RNA。
(5)轉(zhuǎn)基因植物的PCR和Northern分析通過用PCR擴(kuò)增基因之后檢測谷蛋白反義基因可證實(shí)轉(zhuǎn)化?；旌匣蚪MDNA(120ng)，四種dNTP(各200μM)，引物(10pmol/反應(yīng))和Taq DNA聚合酶(Takara Biomedicals公司)(1個(gè)單位)。在第一個(gè)循環(huán)中分別于94℃,50℃和72℃將混合物加熱2分鐘，隨后在各個(gè)溫度下加熱1分鐘進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。為了擴(kuò)增8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白反義基因，使用了下列引物5’-AGTGGGCTGCAGGAATTCGATATCAGCTT-3’(SEQ ID NO:3)5’-AGTACATAGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO:4)類似地，為了擴(kuò)增全長的谷蛋白A反義基因，使用了下列引物5’-TACATAGCTTTACTGATATCTGA-3’(SEQ ID NO:5)5’-AGTACATAGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO:6)通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離出總RNA(20μg)之后，根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行Northern分析，為了此分析，從經(jīng)證實(shí)含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體，或僅被潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)化的對照植物開花后8天不成熟的種子中制備總RNA。探針是衍生自谷蛋白A cDNA的5’上游312bp序列。
進(jìn)行Northern分析之前，使用Ready Prime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)，用32P標(biāo)記探針(25ng DNA片段)。
(6)產(chǎn)生具有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體通過再生已被8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因轉(zhuǎn)化的潮霉素-抗性愈傷組織可得到20個(gè)單獨(dú)的再分化品系。如圖5所示，通過PCR，接著進(jìn)行瓊脂糖電泳可證實(shí)被反義基因轉(zhuǎn)化。在含有反義基因的質(zhì)粒用作PCR模板的泳道中(圖5，泳道2)，帶如所期望的那樣出現(xiàn)在約1.2kbp的位置。所有20個(gè)轉(zhuǎn)化的品系在1.2kbp處出現(xiàn)了相同的帶(圖5，泳道3-22)。當(dāng)未經(jīng)轉(zhuǎn)化的品系中的DNA用作PCR反應(yīng)的模板時(shí)，未檢測到這種帶(圖5，泳道23)。
因此，我們得出結(jié)論上述20個(gè)轉(zhuǎn)化體攜有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因。
(7)產(chǎn)生具有全長谷蛋白反義基因的轉(zhuǎn)化體通過再生已被全長谷蛋白A反義基因轉(zhuǎn)化的潮霉素-抗性愈傷組織可得到18個(gè)單獨(dú)的再分化品系。圖6顯示了PCR之后的瓊脂糖電泳結(jié)果，可證實(shí)導(dǎo)入了反義基因。在含有反義基因的質(zhì)粒用作模板的泳道中(圖6，泳道2)，帶如所期望的那樣出現(xiàn)在約1.7kbp的位置。所有18個(gè)轉(zhuǎn)化體在1.7kbp處出現(xiàn)了相同的帶(圖6，泳道3-20)。當(dāng)未經(jīng)轉(zhuǎn)化的品系中的DNA用作PCR反應(yīng)的模板時(shí)，未檢測到這種帶(圖6，泳道21)。
因此，我們得出結(jié)論上述18個(gè)轉(zhuǎn)化體攜有全長的谷蛋白A反義基因。
(8)分析源自轉(zhuǎn)化植物的不成熟種子中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物圖7顯示出5個(gè)對照品系和10個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)化品系的Northern分析結(jié)果。與5個(gè)對照品系(圖7，泳道1-5)相比，攜有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化品系明顯產(chǎn)生了較少量的谷蛋白A mRNA(圖7，泳道6-15)。表1顯示出通過Bio-imaging分析儀BAS1000(富士膠片公司)測定的信號強(qiáng)度，結(jié)果表示為與5個(gè)對照品系的平均值相比的百分?jǐn)?shù)，因此，我們證實(shí)了通過經(jīng)導(dǎo)入的8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白反義基因的作用使得轉(zhuǎn)化體不成熟種子中的谷蛋白AmRNA的含量顯著降低。
表1．不成熟種子中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平泳道數(shù)目對照 6 7 8 9 10 1112131415100 31.1 11.9 13.1 11.7 10.0 7.78.2 3.8 3.0 1.2(9)測定種子中的蛋白質(zhì)含量將自體受精的水稻植物的未去皮種子(unpolished seed)磨碎，從50mg粉末中提取蛋白質(zhì)，在14％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離出蛋白質(zhì)，通過考馬斯亮藍(lán)染色可觀察之，并用GS-670型光密度計(jì)(Bio-RadLaboratories)測定谷蛋白相對于對照植物的含量。
結(jié)果表示為與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的，對照水稻植物的自體受精種子中谷蛋白含量相比的百分?jǐn)?shù)(表2和3)。
含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至63.2％，含有全長谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至75.4％。
另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)與含有全長谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體相比，含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體中谷蛋白的含量顯著更低(p＜0.10)。
表2．經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中的谷蛋白水平(對照的百分?jǐn)?shù))含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白反義基因的轉(zhuǎn)化體
表3．經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中的谷蛋白含量(對照的百分?jǐn)?shù))含有全長的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體
實(shí)施例3．含有谷蛋白A和谷蛋白B反義基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和分析(1)構(gòu)建8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白AB反義基因以用于轉(zhuǎn)化將含有蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)的SmaⅠ/XbaⅠ片段插入谷蛋白啟動(dòng)子下游的ScaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)；然后以反義方向?qū)⒑?個(gè)串聯(lián)重復(fù)的全長谷蛋白B cDNA5’上游287bp的XbaⅠ/SphⅠ片段插入上述序列的下游。在連接了含有胭脂氨酸合酶終止子的SphⅠ/HindⅢ片段之后，將序列插入實(shí)施例2構(gòu)建的質(zhì)粒載體pSBHCI×8A的HindⅢ位點(diǎn)產(chǎn)生pSBHCI×8AB(圖8)。
(2)構(gòu)建全長的谷蛋白AB反義基因以用于轉(zhuǎn)化將含有蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)的SmaⅠ/XbaⅠ片段插入谷蛋白啟動(dòng)子下游的ScaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)；然后以反義方向?qū)⒑腥L谷蛋白B cDNA的SphⅠ/XbaⅠ片段連接到所述序列的下游。連接了含有胭脂氨酸合酶終止子的SphⅠ/HindⅢ片段之后，將序列插入實(shí)施例2構(gòu)建的質(zhì)粒載體pSBHCI-FA的HindⅢ位點(diǎn)，產(chǎn)生了pSBHCI-FAB(圖8)。
(3)轉(zhuǎn)化水稻植物根據(jù)Hiel等人(植物學(xué)雜志，6,271-282(1994))的方法，用攜有上述質(zhì)粒pSBHCI×8AB或pSBHCI-FAB的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化水稻植物品種“Tsukinohikari”。按Hiel等人(文獻(xiàn)同上)的描述，在潮霉素存在的條件下選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
(4)測定種子中的蛋白質(zhì)含量將自體受精的經(jīng)轉(zhuǎn)化水稻植物的未去皮種子磨碎，從50mg粉末中提取蛋白質(zhì)，在14％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離出蛋白質(zhì)，通過考馬斯亮藍(lán)染色可觀察之，并用GS-670型光密度計(jì)(Bio-Rad Laboratories)測定谷蛋白相對于對照植物的含量。
結(jié)果表示為與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的，對照水稻植物的自體受精種子中谷蛋白含量相比的百分?jǐn)?shù)(表4)。
含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白AB反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至57.1％，含有全長谷蛋白AB反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至69.3％。
另外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)與含有全長谷蛋白AB反義基因的轉(zhuǎn)化體相比，含有8個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白AB反義基因的轉(zhuǎn)化體中谷蛋白的含量顯著更低(p＜0.10)。
表4．谷蛋白含量平均值
實(shí)施例4．含有谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生和分析(1)構(gòu)建2個(gè)串聯(lián)重復(fù)和4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因以用于轉(zhuǎn)化將含有蓖麻籽過氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Ohta S等，(1990)，植物細(xì)胞生理學(xué)，31,805-813)的SmaⅠ/XbaⅠ片段插入谷蛋白啟動(dòng)子下游的ScaⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)；然后以反義方向?qū)⒑?個(gè)串聯(lián)重復(fù)或4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的全長谷蛋白AcDNA5’上游312bp的XbaⅠ/SacⅠ片段插入上述序列的下游。在連接了含有胭脂氨酸合酶終止子的ScaⅠ/EcoRⅠ片段之后，將序列插入含潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體中，分別產(chǎn)生pSBHCI×2A和pSBHCI×4A。
(2)轉(zhuǎn)化水稻植物根據(jù)Hiel等人(植物學(xué)雜志，6,271-282(1994))的方法，用攜有上述質(zhì)粒pSBHCI×2A或pSBHCI×4A的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化水稻植物品種“Tsukinohikari”。按Hiel等人(文獻(xiàn)同上)的描述，在潮霉素存在的條件下選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
(3)測定種子中的蛋白質(zhì)含量將自體受精的轉(zhuǎn)基因水稻植物的未去皮種子磨碎，從50mg粉末中提取蛋白質(zhì)，在14％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離出蛋白質(zhì)，通過考馬斯亮藍(lán)染色可觀察之，并用GS-670型光密度計(jì)(Bio-Rad Laboratories)測定谷蛋白相對于對照植物的含量。結(jié)果表示為與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的，對照水稻植物的自體受精種子中谷蛋白水平相比的百分?jǐn)?shù)(表5和6)。
含有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至71.7％，含有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體使谷蛋白含量平均降低至71.5％。
表5．轉(zhuǎn)基因植物中的谷蛋白含量(對照的百分?jǐn)?shù))含有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體
表6．轉(zhuǎn)基因植物中的谷蛋白含量(對照的百分?jǐn)?shù))含有4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的谷蛋白A反義基因的轉(zhuǎn)化體
本發(fā)明的效果本發(fā)明的反義核苷酸序列代表在反義方向上按順序連接的所需結(jié)構(gòu)基因或其片段的單拷貝串聯(lián)重復(fù)。由反義核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的反義RNA由多個(gè)重復(fù)的RNA序列組成，所述RNA序列各自與靶蛋白質(zhì)mRNA的相應(yīng)部分互補(bǔ)，因此，反義RNA具有較高的與mRNA雜交從而抑制蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達(dá)的能力，因此含有這種串聯(lián)重復(fù)的本發(fā)明的反義RNA在抑制靶蛋白質(zhì)合成方面優(yōu)于沒有任何這種重復(fù)的反義RNA。
主要在抑制植物蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)上描述了本發(fā)明，然而無需多說，本發(fā)明的反義序列也可以抑制如特殊的乳蛋白或以治療免疫學(xué)或病原體疾病為目的的特殊蛋白質(zhì)的動(dòng)物蛋白質(zhì)的合成。
序列表(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1644個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的cDNA(cDNA to mRNA)(ⅵ)來源(A)生物體(ⅸ)特征谷蛋白AcDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1AAGTACGACG AAAATTCATT AGTACTACA CAAC ATG GCA TCC ATA AAT CGC CCC55Met Ala Ser Ile Asn Arg Pro1 5ATA GTT TTC TTC ACA GTT TGC TTG TTC CTC TTG TGC AAT GGC TCT CTA103Ile Val Phe Phe Thr Val Cys Leu Phe Leu Leu Cys Asn Gly Ser Leu10 15 20GCC CAG CAG CTA TTA GGC CAG AGC ACT AGT CAA TGG CAG AGT TCT CGT151Ala Gln Gln Leu Leu Gly Gln Ser Thr Ser Gln Trp Gln Ser Ser Arg25 30 35CGT GGA AGT CCA AGA GAA TGC AGG TTC GAT AGG TTG CAA GCA TTT GAG199Arg Gly Ser Pro Arg Glu Cys Arg Phe Asp Arg Leu Gln Ala Phe Glu40 45 50 55CCA ATT CGG AGT GTG AGG TCT CAA GCT GGC ACA ACT GAG TTC TTC GAT247Pro Ile Arg Ser Val Arg Ser Gln Ala Gly Thr Thr Glu Phe Phe Asp60 65 70GTC TCT AAT GAG CAA TTT CAA TGT ACC GGA GTA TCT GTT GTC CGT CGA295Val Ser Asn Glu Gln Phe Gln Cys Thr Gly Val Ser Val Val Arg Arg75 80 85GTT ATT GAA CCT AGA GGC CTT CTA CTA CCC CAT TAC ACT AAT GGT GCA343Val Ile Glu Pro Arg Gly Leu Leu Leu Pro His Tyr Thr Asn Gly Ala90 95 100TCT CTA GTA TAT ATC ATC CAA GGG AGA GGT ATA ACA GGG CCA ACT TTC391Ser Leu Val Tyr Ile Ile Gln Gly Arg Gly Ile Thr Gly Pro Thr Phe105 110 115CCA GGC TGT CCT GAG TCC TAC CAA CAA CAG TTC CAA CAA TCA GGC CAA439Pro Gly Cys Pro Glu Ser Tyr Gln Gln Gln Phe Gln Gln Ser Gly Gln120 125 130 135GCC CAA TTG ACC GAA AGT CAA AGC CAA AGT CAA AAG TTC AAG GAT GAA 487Ala Gln Leu Thr Glu Ser Gln Ser Gln Ser Gln Lys Phe Lys Asp Glu140 145 150CAT CAA AAG ATC CAC CGT TTC AGA CAA GGA GAT GTA ATT GCA TTG CCT 535His Gln Lys Ile His Arg Phe Arg Gln Gly Asp Val Ile Ala Leu Pro155 160 165GCT GGT GTA GCT CAT TGG TGC TAC AAT GAT GGT GAA GTG CCA GTT GTT 583Ala Gly Val Ala His Trp Cys Tyr Asn Asp Gly Glu Val Pro Val Val170 175 180GCC ATA TAT GTC ACT GAT CTC AAC AAC GGT GCT AAT CAA CTT GAC CCT 631Ala Ile Tyr Val Thr Asp Leu Asn Asn Gly Ala Asn Gln Leu Asp Pro185 190 195AGG CAA AGG GAT TTC TTG TTA GCT GGA AAT AAG AGA AAC CCT CAA GCA 679Arg Gln Arg Asp Phe Leu Leu Ala Gly Asn Lys Arg Asn Pro Gln Ala200 205 210 215TAC AGG CGT GAG GTT GAG GAG CGG TCA CAG AAC ATA TTT AGT GGC TTT 727Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Arg Ser Gln Asn Ile Phe Ser Gly Phe220 225 230AGC ACT GAA CTA CTT AGC GAG GCT CTT GGC GTA AGC GGC CAA GTG GCA 775Ser Thr Glu Leu Leu Ser Glu Ala Leu Gly Val Ser Gly Gln Val Ala235 240 245AGG CAG CTC CAA TGT CAA AAT GAC CAA AGA GGA GAA ATT GTC CGT GTC 823Arg Gln Leu Gln Cys Gln Asn Asp Gln Arg Gly Glu Ile Val Arg Val250 255 260GAA CAC GGG CTC AGT TTG CTG CAG CCA TAT GCA TCA TTG CAG GAG CAG 871Glu His Gly Leu Ser Leu Leu Gln Pro Tyr Ala Ser Leu Gln Glu Gln265 270 275GAA CAA GGA CAA GTG CAA TCA AGA GAG CGT TAT CAA GAA GGA CAA TAT 919Glu Gln Gly Gln Val Gln Ser Arg Glu Arg Tyr Gln Glu Gly Gln Tyr280 285 290 295CAG CAA AGT CAA TAT GGA AGT GGC TGC TCT AAC GGT TTG GAT GAG ACC 967Gln Gln Ser Gln Tyr Gly Ser Gly Cys Ser Asn Gly Leu Asp Glu Thr300 305 310TTT TGC ACC CTG AGG GTA AGG CAA AAC ATC GAT AAT CCT AAC CGT GCT1015Phe Cys Thr Leu Arg Val Arg Gln Asn Ile Asp Asn Pro Asn Arg Ala315 320 325GAT ACA TAC AAT CCA AGA GCT GGA AGG GTT ACA AAT CTC AAC ACC CAG1063Asp Thr Tyr Asn Pro Arg Ala Gly Arg Val Thr Asn Leu Asn Thr Gln330 335 340AAT TTC CCC ATT CTC AGT CTT GTA CAG ATG AGT GCA GTC AAA GTA AAT1111Asn Phe Pro Ile Leu Ser Leu Val Gln Met Ser Ala Val Lys Val Asn345 350 355CTA TAC CAG AAT GCA CTC CTT TCA CCA TTT TGG AAC ATC AAC GCT CAC1159Leu Tyr Gln Asn Ala Leu Leu Ser Pro Phe Trp Asn Ile Asn Ala His360 365 370 375AGC GTC GTG TAT ATT ACT CAA GGC CGT GCC CGG GTT CAA GTT GTC AAC1207Ser Val Val Tyr Ile Thr Gln Gly Arg Ala Arg Val Gln Val Val Asn380 385 390AAC AAT GGA AAG ACA GTG TTC AAC GGC GAG CTT CGC CGC GGA CAG CTG1255Asn Asn Gly Lys Thr Val Phe Asn Gly Glu Leu Arg Arg Gly Gln Leu395 400 405CTT ATT ATA CCA CAA CAC TAC GCA GTT GTA AAG AAG GCA CAA AGA GAA1303Leu Ile Ile Pro Gln His Tyr Ala Val val Lys Lys Ala Gln Arg Glu410 415 420GGA TGT GCT TAC ATT GCA TTC AAG ACC AAT CCT AAC TCT ATG GTA AGC1351Gly Cys Ala Tyr Ile Ala Phe Lys Thr Asn Pro Asn Ser Met Val Ser425 430 435CAC ATT GCA GGA AAG AGT TCC ATC TTC CGT GCT CTC CCA AAT GAT GTT1399His Ile Ala Gly Lys Ser Ser Ile Phe Arg Ala Leu Pro Asn Asp Val440 445 450 455CTA GCA AAT GCA TAT CGC ATC TCA AGA GAA GAG GCT CAG AGG CTC AAG1447Leu Ala Asn Ala Tyr Arg Ile Ser Arg Glu Glu Ala Gln Arg Leu Lys460 465 470CAT AAT AGA GGA GAT GAG TTC GGT GCA TTC ACT CCA ATC CAA TAC AAG1495His Asn Arg Gly Asp Glu Phe Gly Ala Phe Thr Pro Ile Gln Tyr Lys475 480 485AGC TAC CAA GAC GTT TAT AAT GCG GCA GAA TCC TCT TAG GTCGGCTTGC GG 1546Ser Tyr Gln Asp Val Tyr Asn Ala Ala Glu Ser Ser Stop490 495 500ATAAAGAATA ACTAAATAAA TAAATTGCAA GCAATTGTTT TGCTGCTATG TACTGTCCAG 1606TCTTTCGACT AATGATGATA AAGCCTCTCT TTATCCTT 1644(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1634個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的cDNA(cDNA to mRNA)(ⅵ)來源(A)生物體(ⅸ)特征谷蛋白B cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2GTACAAATAG CT ATG GCG AGC TCC GTT TTC TCT CGG TTT TCT ATA TAC TTT51Met Ala Ser Ser Val Phe Ser Arg Phe Ser Ile Tyr Phe1 5 10TGT GTT CTT CTA TTA TGC CAT GGT TCT ATG GCC CAG CTA TTT AAT CCC 99Cys Val Leu Leu Leu Cys His Gly Ser Met Ala Gln Leu Phe Asn Pro15 20 25AGC ACA AAC CCA TGG CAT AGT CCT CGG CAA GGA AGT TTT AGG GAG TGT 147Ser Thr Asn Pro Trp His Ser Pro Arg Gln Gly Ser Phe Arg Glu Cys30 35 40 45AGA TTT GAT AGA CTA CAA GCA TTT GAA CCA CTT CGG AAA GTG AGG TCA 195Arg Phe Asp Arg Leu Gln Ala Phe Glu Pro Leu Arg Lys Val Arg Ser50 55 60GAA GCT GGG GTG ACT GAG TAC TTC GAT GAG AAG AAT GAA TTA TTC CAG 243Glu Ala Gly Val Thr Glu Tyr Phe Asp Glu Lys Asn Glu Leu Phe Gln65 70 75TGC ACG GGT ACT TTT GTG ATC CGA CGT GTC ATT CAG CCT CAA GGC CTT 291Cys Thr Gly Thr Phe Val Ile Arg Arg Val Ile Gln Pro Gln Gly Leu80 85 90TTG GTA CCT CGA TAC ACA AAT ATT CCT GGC GTG GTC TAC ATC ATC CAA 339Leu Val Pro Arg Tyr Thr Asn Ile Pro Gly Val Val Tyr Ile Ile Gln95 100 105GGG AGA GGT TCT ATG GGT TTA ACC TTC CCC GGT TGC CCT GCG ACT TAC 387Gly Arg Gly Ser Met Gly Leu Thr Phe Pro Gly Cys Pro Ala Thr Tyr110 115 120 125CAG CAA CAA TTC CAA CAA TTT TCA TCT CAA GGC CAA AGT CAG AGC CAA 435Gln Gln Gln Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gln Gly Gln Ser Gln Ser Gln130 135 140AAG TTT AGA GAT GAG CAC CAA AAG ATT CAT CAA TTT AGG CAA GGA GAC 483Lys Phe Arg Asp Glu His Gln Lys Ile His Gln Phe Arg Gln Gly Asp145 150 155ATT GTT GCT CTC CCA GCT GGT GTT GCA CAT TGG TTC TAC AAT GAT GGT 531Ile Val Ala Leu Pro Ala Gly Val Ala His Trp Phe Tyr Asn Asp Gly160 165 170GAT CGC CAT ATT GTT GCC GTA TAT GTT TAT GAC GTA AAC AAC AAC GCC 579Asp Arg His Ile Val Ala Val Tyr Val Tyr Asp Val Asn Asn Asn Ala175 180 185AAT CAG CTT GAA CCT AGG CAA AAG GAG TTC CTA TTA GCC G6C AAC AAC 627Asn Gln Leu Glu Pro Arg Gln Lys Glu Phe Leu Leu Ala Gly ASn Asn190 195 200 205AAT CGG GCT CAA CAA CAA CAA GTA TAT GGT AGC TCA ATT GAG CAA CAC 675Asn Arg Ala Gln Gln Gln Gln Val Tyr Gly Ser Ser Ile Glu Gln His210 215 220TCT GGG CAA AAC ATA TTC AGC GGA TTT GGT GTT GAG ATG CTA AGT GAG 723Ser Gly Gln Asn Ile Phe Ser Gly Phe Gly Val Glu Met Leu Ser Glu225 230 235GCT TTA GGC ATC AAC GCA GTA GCA GCA AAG AGG CTA CAG AGC CCA AAT 771Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Ala Lys Arg Leu Gln Ser Pro Asn240 245 250GAT CAA AGA GGA GAG ATC ATA CAT GTG AAG AAT GGC CTT CAA TTG TTG 819Asp Gln Arg Gly Glu Ile Ile His Val Lys Asn Gly Leu Gln Leu Leu255 260 265AAA CCG ACT TTG ACA CAA CAG CAA GAA CAA GCA CAA GCA CAA GAT CAA 867Lys Pro Thr Leu Thr Gln Gln Gln Glu Gln Ala Gln Ala Gln Asp Gln270 275 280 285TAT CAA CAA GTT CAA TAC AGT GAA CGA CAG CAA ACA TCT TCT CGA TGG 915Tyr Gln Gln Val Gln Tyr Ser Glu Arg Gln Gln Thr Ser Ser Arg Trp290 295 300AAC GGA TTG GAG GAG AAC TTT TGC ACG ATC AAG GTG AGA GTA AAC ATT 963Asn Gly Leu Glu Glu Asn Phe Cys Thr Ile Lys Val Arg Val Asn Ile305 310 315GAA AAT CCT AGT CGT GCT GAT TCA TAC AAC CCA CGT GCC GGA AGG ATA1011Glu Asn Pro Ser Arg Ala ASp Ser Tyr Asn Pro Arg Ala Gly Arg Ile320 325 330ACA AGT GTC AAT AGT CAG AAG TTC CCC ATC CTT AAC CTC ATC CAA ATG1059Thr Ser Val Asn Ser Gln Lys Phe Pro Ile Leu Asn Leu Ile Gln Met335 340 345AGC GCT ACC AGA GTA AAC CTA TAC CAG AAT GCT ATT CTC TCG CCG TTC1107Ser Ala Thr Arg Val Asn Leu Tyr Gln Asn Ala Ile Leu Ser Pro Phe350 355 360 365TGG AAC GTC AAT GCT CAT AGT TTG GTC TAT ATG ATT CAA GGG CGA TCT1155Trp Asn Val Asn Ala His Ser Leu Val Tyr Met Ile Gln Gly Arg Ser370 375 380CGA GTT CAA GTC GTT AGT AAC TTT GGA AAG ACT GTG TTT GAT GGT GTC1203Arg Val Gln Val Val ser Asn Phe Gly Lys Thr Val Phe Asp Gly Val385 390 395CTT CGC CCA GGA CAA TTA TTG ATC ATT CCG CAA CAT TAT GCT GTC TTG1251Leu Arg Pro Gly Gln Leu Leu Ile Ile Pro Gln His Tyr Ala Val Leu400 405 410AAG AAA GCA GAG CGT GAA GGA TGC CAA TAT ATC GCA ATC AAG ACA AAC1299Lys Lys Ala Glu Arg Glu GLy Cys Gln Tyr Ile Ala Ile Lys Thr Asn415 420 425GCT AAC ACC TTC GTC AGC CAC CTT GCA GGG AAA AAC TCA GTA TTC CGT1347Ala Asn Thr Phe Val Ser His Leu Ala Gly Lys Asn Ser Val Phe Arg430 435 440 445GCC TTG CCA GTT GAT GTA GTC GCT AAT GCG TAT CGC ATC TCA AGG GAG1395Ala Leu pro Val Asp Val Val Ala Asn Ala Tyr Arg Ile Ser Arg Glu450 455 460CAA GCC CGA AGC CTC AAG AAC AAC AGG GGA GAA GAG CAC GGT GCC TTC1443Gln Ala Arg Ser Leu Lys Asn Asn Arg Gly Glu Glu His Gly Ala Phe465 470 475ACT CCT AGA TTT CAA CAA CAA TAC TAC CCA GGA TTA TCG AAT GAG TCC1491Thr Pro Arg Phe Gln Gln Gln Tyr Tyr Pro Gly Leu Ser Asn Glu Ser480 485 490GAA AGC GAG ACC TCA GAG TAA TGTAATGTAA TTGAGAACTA GTATCGGCGT AGAG 1546Glu Ser GLu Thr Ser Glu Stop495 500TAAAATAAAA CACCACAAGT ATGACACTTG GTGGTGATTC TGTTCGATAT CAGTACTAAA 1606TAAAGGTTAC AAACTTCTTA ATTTTCCT 1634(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3AGTGGGCTGC AGGAATTCGA TATCAAGCTT 30(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4AGTACATAGC AGCAAAACAT 20(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5TACATAGCT TAACTGATAA TCTGA25(2)SEQ ID NO:6的資料
(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6AGTACATAGC AGCAAAACAT 20
權(quán)利要求
1．反義核苷酸序列，其包括所需結(jié)構(gòu)基因或其片段在反義方向上的兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)重復(fù)。
2．權(quán)利要求1所要求的反義核苷酸序列，所述序列含有所需基因5’區(qū)域序列的兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)重復(fù)。
3．權(quán)利要求2所要求的反義核苷酸序列，其中5’區(qū)域的序列含有至少45個(gè)核苷酸。
4．權(quán)利要求2所要求的反義核苷酸序列，其中5’區(qū)域的序列含有至少300個(gè)核苷酸。
5．權(quán)利要求1至4中任一個(gè)所要求的反義核苷酸序列，所述序列含有所需結(jié)構(gòu)基因或其片段的至少4個(gè)重復(fù)序列。
6．權(quán)利要求1至4中任一個(gè)所要求的反義核苷酸序列，所述序列含有所需結(jié)構(gòu)基因或其片段的至少8個(gè)重復(fù)序列。
7．權(quán)利要求1至6中任一個(gè)所要求的反義核苷酸序列，所述序列含有所需結(jié)構(gòu)基因或其片段在反義方向上的不同套的兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)重復(fù)。
8．權(quán)利要求1至7中任一個(gè)所要求的反義核苷酸序列，其中所述所需基因是編碼植物種子貯存蛋白的基因。
9．權(quán)利要求8所要求的反義核苷酸序列，其中貯存蛋白是谷蛋白A或谷蛋白B。
10．一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求1至9中任一個(gè)所要求的反義核苷酸序列。
11．被權(quán)利要求10所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因宿主。
12．權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因宿主，其是植物。
13．權(quán)利要求11或12的轉(zhuǎn)基因宿主，其是水稻植物。
14．抑制由結(jié)構(gòu)基因編碼的所需蛋白質(zhì)的體內(nèi)表達(dá)的方法，所述方法包括將針對所述結(jié)構(gòu)基因的權(quán)利要求1至9中任一個(gè)所述的反義核苷酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的基因組基因。
全文摘要
一種在抑制蛋白質(zhì)合成的方法中利用反義核苷酸序列增強(qiáng)抑制效應(yīng)的新的方法。具體地,本發(fā)明提供了含有在反義方向上連續(xù)連結(jié)的所需結(jié)構(gòu)基因或其片段的兩個(gè)或多個(gè)序列的反義堿基序列,含有所述反義堿基序列的表達(dá)載體,上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,和利用所述的反義堿基序列抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。
文檔編號A61K38/00GK1226930SQ98800612
公開日1999年8月25日 申請日期1998年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月10日
發(fā)明者丸田嘉幸, 齋藤秀章 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社