專利名稱:人類非小細(xì)胞肺癌及其它幾種癌癥的單克隆抗和抗原的制作方法
此項(xiàng)發(fā)明涉及一種新的單克隆抗體還涉及對于癌癥抗原具專一性的新的單克隆抗體的生產(chǎn)和使用方法。更為特別的是，本項(xiàng)發(fā)明的單抗對于與人類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及某些其它癌癥包括某些乳腺癌、結(jié)腸癌等聯(lián)合的蛋白質(zhì)抗原是免疫學(xué)特異的和(或)具有免疫學(xué)活性的。
此項(xiàng)發(fā)明的單抗能與NSCLC細(xì)胞及其它癌細(xì)胞(包括乳腺癌、結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌)的糖蛋白抗原決定簇反應(yīng)。本發(fā)明的單抗具有突出的特性和反應(yīng)能力，這使該抗體適合于體內(nèi)、體外臨床診斷之目的。此外，此單抗還適用于治療服用。例如，它可以作為許多試劑的靶向選擇載體，而這些試劑具有抗癌效應(yīng);這些試劑包括化療藥物，毒素，免疫反應(yīng)效應(yīng)物，以及放射性同位素但并不限于此。而且，生產(chǎn)這種單克隆抗體的雜交瘤可用重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾，以使所產(chǎn)生的抗體能介導(dǎo)依賴于抗體的細(xì)胞毒性，或者，可以在補(bǔ)體存在下溶解癌細(xì)胞。
2.
2.1人類肺癌死于癌癥的男性大部分是由于肺癌;在死于癌癥的女性中肺癌正超過乳腺癌而成為最常見的死因。按組織學(xué)類型這種疾病可分為四類;(1)表皮狀或鱗裝(30%)，(2)腺癌(35%)，(3)未分化的大細(xì)胞(15%)，(4)小細(xì)胞(20%)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括下列細(xì)胞類型;表皮樣癌細(xì)胞，腺癌細(xì)胞，大的未分化的癌細(xì)胞。
大多數(shù)肺癌不能用化療和放射法治愈。小細(xì)胞肺癌在化療和放療下可能縮小尺寸，但不能完全治好。最有效的治療可能只有手術(shù)切除瘤子。然而，不幸的是少于30%的肺癌病人的瘤子能在診斷后被完全切除。其中，在完全切除瘤子后，只有少于1/3的病人能存活五年。這種情形就要求有盡可能早期診斷肺癌的方法，確定癌癥擴(kuò)散程度的方法以及更有效的治療方法。
2.2單克隆抗體單克隆抗體是均一的抗體分子，它與具有特異性結(jié)合或親合常數(shù)的抗原上的單一分子位點(diǎn)(即表面決定簇)相結(jié)合，在現(xiàn)有技術(shù)中有三種制備它們的方法。
單克隆抗體可以用Kohler和Milstein設(shè)計(jì)的雜交瘤技術(shù)制備(1975，Nature 256;495;1976，Eur.J.Immunol.6;511)。通過將產(chǎn)生抗體細(xì)胞(脾淋巴細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞融合，Kohler和Milstein創(chuàng)造了雜交細(xì)胞，從這種雜交細(xì)胞得到了具有產(chǎn)生抗體的能力和在細(xì)胞培養(yǎng)基中永久生長的能力的永久細(xì)胞系。雜交瘤分泌一種單一類型的免疫球蛋白，這種免疫球蛋白的抗原特異性取決于淋巴細(xì)胞所暴露的抗原。
此外，單克隆抗體可用體外轉(zhuǎn)化哺乳類動物外圍血液B淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生。例如，使用非洲淋巴瘤病毒(EBV)。該病毒使產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞不死。文獻(xiàn)中可以見到這種轉(zhuǎn)化技術(shù)(例如，見Steinmetz et al.1977，Nature 269;420;Crawford et al.，1983，The Lancet，i386)。
最后，可以使用結(jié)合了EBV-不滅技術(shù)和細(xì)胞融合或雜交技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體?？茽柕热嗣枋隽藢⑷祟悵{細(xì)胞瘤或淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系與EBV轉(zhuǎn)化的給體淋巴細(xì)胞相融合的技術(shù)，這種給體淋巴細(xì)胞已予先建立了細(xì)胞(1985年，《單克隆抗體與癌癥治療》，Alan Liss，Inc.，第77-96頁)。在這個(gè)體系中，兩個(gè)親本細(xì)胞系都不死。因此，融合的雙方必須有適當(dāng)?shù)乃幬飿?biāo)記，以便在培養(yǎng)融合雜交瘤時(shí)對親本細(xì)胞進(jìn)行反選擇。所得到的EBV雜交瘤將產(chǎn)生具有所使用的EBV-淋巴細(xì)胞系特異性的抗體。
單克隆抗體可通過體外培養(yǎng)特定雜交瘤或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的方法大量生產(chǎn)。此外，將一雜交瘤細(xì)胞系植入適合的哺乳動物和小鼠的腹腔，便會產(chǎn)生腫瘤，該腫瘤將高濃度(1～20mg/ml)單克隆抗體分泌到腫瘤腹水液中，移出腹水，純化單克隆抗體，一只小鼠就可以提供足夠上千次診斷檢定所需要的抗體。
2.3與肺癌有關(guān)的單克隆抗體與抗原抗人類肺癌抗原的單克隆抗體已由下列研究者描述過Si Rora及同事(1981)，Brit.J.Cancer 43;696;Cuttita及同事(1981)，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 784591;Moody及同事(1981)，Science 2141246;Minna及同事，(1981)，In Vitro 171058;Kennel及同事(1981)，Cancer Res.413465;Chem.Abst.95(15)1308502;Baylin及同事，(1982)，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA794650;Carney及同事，(1982)，Pathobiology Annual 12115;Gazdar及同事，(1983)，Seminars in Oncology 103;Hollinshead及同事，(1983)，Cancer Detect.Prevent 6185;Mulshine及同事，(1983)，J.Immunol.131497;Huang及同事(1983)，Arch.Biochem.Biophys.220318;Saji及同事(1984)，Hybridoma 3119;Bio.Abst.79005569;Bosslet及同事，Behring.Inst.Mitt.7427;Chem.Abst.Ac101(9)706680;Roset及同事(1984)，Cancer Res;442052;Bio.Ast.79023605;Princler及同事，(1982)，Cancer Res.42843;Mazauric及同事(1982)，Cancer Res.42150;Braatz及同事(1982)，Cancer Res.42849;Sobel及同事(1982)，F(xiàn)ed.Proc.41;409;Cole及同事(1985)，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan Liss，Inc.，PP.77-96;Varki及同事(1985)，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan Liss，Inc.，P.207。
1984年11月2日提交的美國專利申請第667，521號;1985年10月7日提交的785，177號;1984年11月21日申請的684，759號;1985年10月18日申請的776，321號;1985年5月28日申請的738，612號，上述文件公開了某些抗人類非小細(xì)胞肺癌的單克隆抗體。
單克隆抗體可用作盡早診斷肺癌和更好地確定癌癥的擴(kuò)散程度的方法，以及更有效地治療肺癌之方法。但其先決條件是找到能對付在肺癌中比在其它正常組織中表達(dá)更強(qiáng)烈的抗原的抗體。考慮到已知的癌細(xì)胞種群的不均一性，同一抗原分子上存在著幾個(gè)決定簇，在作為診斷標(biāo)記和治療目標(biāo)的穩(wěn)定性方面抗原所具有的先天區(qū)別，以及對應(yīng)同一抗原的不同抗體的不同生物學(xué)特性，就需要能對付眾多抗原的眾多抗體。
3.
此項(xiàng)發(fā)明涉及到一類新單克隆抗體，用L20表示，其對與人類非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的一個(gè)糖蛋白抗原分子表面的一個(gè)決定簇具有特異性?！胺切〖?xì)胞”包括表皮樣癌細(xì)胞，腺癌細(xì)胞和未分化癌細(xì)胞的大細(xì)胞。該決定簇也能在其它一些癌細(xì)胞抗原分子上發(fā)現(xiàn)，如乳腺癌、結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌。因此，此項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的抗體也將結(jié)合于其它癌細(xì)胞上，可用于診斷和治療所有能表達(dá)抗體L20所識別的抗原的其它癌癥。這個(gè)單克隆抗體與正常成熟細(xì)胞的結(jié)合度遠(yuǎn)小于腫瘤細(xì)胞?！敖Y(jié)合度極小”是說其結(jié)合幾乎檢測不出，或用免疫組織化學(xué)檢測時(shí)只有非常弱的染色。因此，該抗體對于非小細(xì)胞癌及某些其它癌癥的抗原具有高度特異性。
此項(xiàng)發(fā)明還包括被抗體L20識別的新L20抗原以及與該抗原結(jié)合的抗體類型。這些抗體對L20抗原是免疫特異或具免疫活性的。此外還包括使用純化的或克隆化的L20抗原作為疫苗來免疫接種以使免患某些癌癥的方法。
此項(xiàng)發(fā)明還涉及某些采用此項(xiàng)發(fā)明的單克隆抗體的診斷方法。例如，該抗體用來確定人類肺組織和其它組織的惡性情況。這個(gè)方法包括檢查該組織是否出現(xiàn)被抗體L20識別的具有110，000道爾頓分子量的糖蛋白的一個(gè)抗原。例如，將組織與抗體接觸，該抗體能確定細(xì)胞相關(guān)抗原上的一個(gè)決定簇，而此抗原具有能被抗體L20識別的那種抗原的特性。這樣就可以檢測此抗體的一個(gè)功能等效物或一個(gè)片段，以及該抗體與抗原決定簇之間的任何反應(yīng)。一種辦法是確定所懷疑的樣品細(xì)胞中是否存在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。將該樣品與所述單克隆抗體接觸，這樣就能從存在于樣品中的其它細(xì)胞種類中識別這種細(xì)胞。這種接觸是在抗體與癌細(xì)胞結(jié)合的條件下進(jìn)行的。接觸以后就可以確定樣品中有無癌細(xì)胞與抗體結(jié)合。這種結(jié)合關(guān)系到樣品中有無非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞存在。通常樣品與單克隆抗體的標(biāo)記的特異結(jié)合配體接觸。這種標(biāo)記能產(chǎn)生可檢測的信號。
另一種診斷方法是體內(nèi)定位腫瘤，由給病人服用本發(fā)明的純化抗體或其片段，該抗體或其片段是用可給出檢測信號的試劑標(biāo)記的。然后用外部的閃爍照相術(shù)，X射線斷層術(shù)或放射性核掃描技術(shù)定位癌。這種方法還能為根據(jù)病變程度將癌癥患者分類、治療反應(yīng)中的變化提供更好的途徑。
此項(xiàng)發(fā)明還可應(yīng)用于治療方面，因?yàn)長20抗體及其相似抗體可以與在癌細(xì)胞表面高濃度出現(xiàn)的L20抗原相反應(yīng)。因而，抗體可以作為多種抗癌試劑的載體?？拱┰噭┌ǖ幌抻诨熕幬?，毒素，免疫反應(yīng)效應(yīng)物和放射性同位素。
此外，L20抗體可以被修飾，這樣，它可成為能夠介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性的抗體。(“抗體依賴的細(xì)胞毒性”簡記為ADCC)也就是說，它能在人類淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞存在下殺死非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(即NSCLC細(xì)胞)，或者在人類補(bǔ)體存在下可以溶解癌細(xì)胞。這種修飾可以用最近發(fā)展起來的產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)來完成。依照這一技術(shù)，將編碼L20抗體可變區(qū)的基因與人類編碼具有適當(dāng)生物學(xué)活性的抗體的Fc區(qū)的基因進(jìn)行拼接(所謂“適當(dāng)生物學(xué)活性”例如能激活人類補(bǔ)體和介導(dǎo)ADCC)。小鼠或人的新的抗體也可以做成對于L20抗原來說具有適當(dāng)生物學(xué)功能。
此項(xiàng)發(fā)明為一新的單克隆抗體，命名為L20，對人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及人類某些其它癌癥細(xì)胞表面抗原具有免疫特異性和(或)免疫反應(yīng)活性。這些癌癥包括結(jié)腸癌、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌。此項(xiàng)發(fā)明還包括產(chǎn)生這種新單克隆抗體的方法以及采用該抗體的診斷和治療方法。
此外，此項(xiàng)發(fā)明還與一種新的細(xì)胞表面抗原及其應(yīng)用有關(guān)，該抗原具有人類非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌，乳腺癌和小細(xì)胞肺癌的抗原的特性。
4.1產(chǎn)生抗NSCLC單克隆抗體的方法抗人類非小細(xì)胞肺癌和其它幾種癌癥的單克隆抗體可以通過雜交瘤融合技術(shù)、人類產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞的EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)或結(jié)合了上述兩種技術(shù)的方法來生產(chǎn)。
4.1.1融合技術(shù)根據(jù)此項(xiàng)發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，用雜交瘤融合技術(shù)生產(chǎn)抗NSCLC的單克隆抗體。例如，從胸膜滲出物中得到的人類肺癌細(xì)胞，移植的人類非小細(xì)胞肺癌的培養(yǎng)細(xì)胞，正常胎兒肺細(xì)胞或這些細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物都可以作為免疫原。在一個(gè)說明性的實(shí)施例中，從NSCLC中移植的細(xì)胞即人類肺腺癌＃3082作為免疫原(見5.1)。將該細(xì)胞注射給小鼠，在一段足夠時(shí)間后，殺死小鼠，并得到產(chǎn)生抗體的淋巴體細(xì)胞。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以從免疫好的動物的淋巴結(jié)、脾臟和外周血管得到。最好用脾細(xì)胞。小鼠的淋巴細(xì)胞與下面要敘述的小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，具有高百分比的穩(wěn)定的融合量。也能使用大鼠、兔子和青蛙的體細(xì)胞。通常在聚乙二醇的存在下融合，而使編碼所需要免疫球蛋白的脾細(xì)胞染色體不因脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而致死。幾種骨髓瘤細(xì)胞可用于生產(chǎn)融合的細(xì)胞雜種包括NSI-Ag4/1，X63-Ag8，MPC11-45.6TG1.7，X63-Ag.653，SP2/0-Ag14，F(xiàn)o，S194/5 XXO.Bu.1，(以上為從小鼠系派生)，210.RCY3.Ag1.2.3，U-226AR和GM1500GTGAL(從大鼠系派生)(Hammerling及同事，1981，“單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤”，見《免疫學(xué)研究專論》Vol.3，J.L.Turk，ed;Elsevier/North Holland Biomedical Press.New York).作為一個(gè)說明性的實(shí)施例中，使用NS1細(xì)胞(見5.1)，得到的細(xì)胞，包括已融合的細(xì)胞，使其在選擇性培養(yǎng)基如HAT-培養(yǎng)基中生長，用有限稀釋法使活下來的雜交瘤細(xì)胞在這種培養(yǎng)基上生長。該細(xì)胞在適當(dāng)?shù)娜萜髦腥缥⒖装鍍?nèi)生長，從上清液中篩選具有所需特性的單克隆抗體。
有很多常規(guī)方法用來分離純化單克隆抗體，以便將它們與其它蛋白質(zhì)和雜質(zhì)和雜質(zhì)分開。
4.1.2.EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)按照此項(xiàng)發(fā)明的另一具體實(shí)施方案，是采用EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)抗NSCLC單克隆抗體。例如，按Cole及其同事1984年在Camcer Res.442750所敘述的方法，使用EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)使帶有NSCLC的病人的邊緣血液，腫瘤排放的淋巴結(jié)，骨髓吸取液，癌滲出液或胸膜滲出液中所取得的淋巴細(xì)胞不死。正如Cole及其同事所述，肺癌病人缺少特異于癌癥抗原的B淋巴細(xì)胞。因此，通過預(yù)先篩選產(chǎn)生抗相關(guān)抗原抗體的淋巴細(xì)胞來增殖產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞數(shù)目是十分重要的。EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)包括下列兩個(gè)步驟(1)用已知抗原(即4.2.1中所描述的L20抗原)的受體進(jìn)行細(xì)胞富集;(2)用EBV感染這些細(xì)胞使它們不死。
4.1.3.EBV-雜交瘤技術(shù)根據(jù)此發(fā)明的另一實(shí)施方案，采用如Cole及同事(1985，《單克隆抗體與癌癥治療》，Alan R.Liss，Inc;PP.77-96)所敘述的將EBV轉(zhuǎn)化與雜交瘤融合的技術(shù)相結(jié)合的方法制備抗NSCLC單克隆抗體。例如，將一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系與NSCLC病人提供的供體淋巴細(xì)胞相融合，這種淋巴細(xì)胞已進(jìn)行了EBV轉(zhuǎn)化，建立了細(xì)胞系，能在培養(yǎng)條件下生長和繁殖。為了能夠篩選到EBV一雜交瘤融合細(xì)胞系，必須使融合雙方具有顯性選擇性藥物標(biāo)記，如烏本苷或新霉素抗性，以便在培養(yǎng)融合的雜交瘤細(xì)胞系時(shí)親本細(xì)胞(即未融合細(xì)胞)不生長。一種合適的細(xì)胞系是由Cole及同事(上述)敘述的硫代鳥嘌呤抗性GM-150，烏本苷抗性淋巴母細(xì)胞系，KR-4。得到的雜交瘤用常規(guī)技術(shù)克隆。
4.1.4.細(xì)胞增殖及抗體產(chǎn)生一旦所需的融合后的細(xì)胞雜交物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系已經(jīng)被選擇并被克隆成為個(gè)體抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，那么每個(gè)細(xì)胞系就可采用兩種常規(guī)方法進(jìn)行增殖。個(gè)體細(xì)胞系可以在體外增殖，比如在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)容器中，而含有高濃單一特異性單克隆抗體的培養(yǎng)基可通過傾析、過濾或離心而得到。也可以通過將雜交瘤注射入與提供原始融合所用體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的動物具有組織相容性的動物體內(nèi)而使單克隆抗體產(chǎn)量增加。分泌那種由融合細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤將在被注射的動物體內(nèi)生長。該動物的體液，例如腹水或血清，提供高濃度的單克隆抗體。如Cole及同事(上述)所述，當(dāng)使用人的雜交瘤或EBV-雜交瘤時(shí)，必須避免給動物(比如小鼠)注射時(shí)產(chǎn)生異種移植排斥?？梢允褂妹庖呷狈π∈蠡蚵闶?，或者首先將雜交瘤注射給照射過的裸鼠產(chǎn)生皮下實(shí)體瘤，這種實(shí)體瘤取出，體外培養(yǎng)然后腹腔注入照射過的，降植烷刺激過的裸屬，該鼠將發(fā)育成分泌大量特異性的人的單克隆抗體的腹水瘤。(見Cole及同事，上述)4.2.單克隆抗體本發(fā)明的抗體與一類新的細(xì)胞表面糖蛋白抗原(稱為L20抗原)結(jié)合，該抗原具有人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及其它幾種人類癌癥細(xì)胞的特性。(見4.2.1)該糖蛋白抗原在聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)時(shí)測得分子量為110，000道爾頓(見5.3).用聚糖酶消化L20抗原表明該抗原含有N-連接的寡糖鏈。
作為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，L20抗體用5.1中敘述的L20鼠雜交瘤生產(chǎn)。L20抗體屬于IgG1同型，親合力約為3×108(見5.2.2)。檢測不到它與正常細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞或主要器官中的表皮細(xì)胞結(jié)合。“檢測不到結(jié)合”意味著用免疫組織化學(xué)法檢測時(shí)只有很弱的染色或根本沒有染色。
本發(fā)明還包括極為有用的上述單克隆抗體的結(jié)合片段如Fab，F(xiàn)(ab′)2′，F(xiàn)v等?？贵w片段用常規(guī)技術(shù)即可得到。例如，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等肽酶消化抗體得到有用的結(jié)合片段。
相似抗體(包括不同的同型、不同親合力的抗體)和新的生物學(xué)功能(如在補(bǔ)體或如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞存在下殺死癌細(xì)胞的能力)也屬于本發(fā)明范圍。上述本發(fā)明的新抗體的具體實(shí)例是指出與相關(guān)抗原上某一特定決定位點(diǎn)結(jié)合的來自小鼠的屬于IgG1亞類的抗體，但這并不是限制范圍。上述抗體以及與它具有功能等價(jià)的抗體，不論其源于小鼠，或包括人在內(nèi)的哺乳類動物，或是其它來源，或是多種來源的綜合，都屬于本發(fā)明的范圍，其它同型的抗體也不例外?！肮δ艿葍r(jià)”指該抗體能結(jié)合于上述的抗原決定簇，并能與本發(fā)明的抗體在該區(qū)域進(jìn)行競爭。也就是說，當(dāng)該抗體與含有該抗原決定簇的細(xì)胞或細(xì)胞片段樣品結(jié)合時(shí)，本發(fā)明的抗體與該決定簇的結(jié)合將受到阻斷。此外，由于本項(xiàng)發(fā)明的抗原可有多個(gè)決定簇，此發(fā)明還包括那些能識別上述單克隆抗體所識別的抗原決定簇以外的決定簇的抗體，這些抗體可用本專業(yè)領(lǐng)域所知的順序免疫沉淀方法檢測。
本發(fā)明還包括對抗原決定簇起反應(yīng)的抗體，或L20抗體的個(gè)體基因型，因?yàn)檫@些抗一個(gè)體基因型抗體可以用來分析對于癌抗原的免疫應(yīng)答以便于診斷，并用以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以便于治療和預(yù)防癌癥。(Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.812664)。
4.2.1為單克隆抗體識別的L20抗原本發(fā)明的單克隆抗體所識別的抗原包括一類新的具有NSCLC細(xì)胞以及幾種其它癌癥細(xì)胞如乳腺癌，結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌的抗原特性的細(xì)胞表面糖蛋白抗原。該抗原分子量為110，000道爾頓。
這種新的糖蛋白抗原的氨基末端氨基酸順序?yàn)? 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表一個(gè)尚不清楚的氨基酸，其它字母代表常規(guī)單字母縮寫氨基酸。將此序列與貯存于當(dāng)今蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的那些序列比較(PIR Release 6.0，November 1985)，沒有發(fā)現(xiàn)任何與之具有明顯的序列同源性。
4.3.單克隆抗體與L20抗原的應(yīng)用4.3.1.診斷應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體可用作檢測人類NSCLC和其它人類癌癥分泌抗原的探針。本發(fā)明的方法之一是通過檢查人類肺組織或其它組織的具有L20抗原特性的糖蛋白抗原的有無表達(dá)情況來確定該組織中癌變惡性程度?！熬哂蠰20抗原特性”是指該抗原能與識別L20抗原的抗體進(jìn)行反應(yīng)。這種抗原的表達(dá)或不表達(dá)可以為臨床提供常規(guī)組織病理學(xué)技術(shù)所不能提供的可用信息。
本發(fā)明的單克隆抗體可以用來例如檢測組織樣品和細(xì)胞樣品的非小細(xì)胞肺癌。如，用5.4中敘述的免疫過氧化物酶染色技術(shù)可以使腺癌，表皮狀和小細(xì)胞肺癌的切除的組織樣品顯示強(qiáng)烈正染色。而正常的肺，脾臟，結(jié)腸，腎臟，肝臟，腦，心臟，皮膚，胸腺，睪丸，陰道和正常淋巴細(xì)胞則為負(fù)染色。
本發(fā)明的單克隆抗體的另一重量的體外診斷應(yīng)用是對NSCLC以外的其它癌癥能作出估價(jià)。該抗體已用來檢測乳腺癌，結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌的表位。這些組織的正常樣品不表達(dá)該因子。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可用來檢測這些癌細(xì)胞的抗原因子。這樣，該單克隆抗體對于乳腺癌，結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌可能是一種有用的診斷試劑。
此外，免疫熒光技術(shù)可用于檢測帶有本發(fā)明單克隆抗體的人類組織樣品。典型的程序就是，將擁有恒冷箱裝置的經(jīng)冷凍未固定活體組織或離體癌樣品或細(xì)胞學(xué)涂片的玻片經(jīng)空氣干燥并與該單克隆抗體室溫培養(yǎng)于濕度控制小室內(nèi)。細(xì)胞學(xué)涂片包括剝落的細(xì)胞樣品。“剝落”一詞是指該樣品包括分離的細(xì)胞或刮洗組織表面而得到的細(xì)胞群，這些細(xì)胞可以被單獨(dú)移去，或是鱗片般地剝落，或一層一層移去。剝落細(xì)胞樣品要與離體組織(如活組織檢查時(shí)得到的樣品)區(qū)別開。這個(gè)方法在從剝落細(xì)胞樣品中檢測確定癌變情況時(shí)找到效用，這些剝落細(xì)胞來自肺部(如痰樣品)，支氣管，胃腸道(包括口咽，嘴)以及頸涂片等。
干燥以后，載玻片上鋪一層預(yù)備好的抗該單克隆抗體的抗體，一般如果該單克隆抗體是用小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合而產(chǎn)生的，則抗體采用某種類型的抗小鼠IgG的抗體。采用常規(guī)技術(shù)將此抗小鼠IgG抗體與某種化合物如堿性蕊香紅或熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合，在特定波長發(fā)出熒光。樣品內(nèi)部染色的圖形和強(qiáng)度用熒光顯微鏡檢術(shù)來確定，并可隨意照像記錄。
上面敘述指出了本發(fā)明的抗體在免疫熒光技術(shù)方面的主要應(yīng)用。然而，該抗體還可應(yīng)用在大多數(shù)抗原一抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)上。檢測可以是均一或非均一的。均一檢測中樣品可以是溶胞后和澄清除去碎屑的組織。免疫反應(yīng)通常包括特異性抗體，標(biāo)記物和要檢測的樣品?；诳贵w與標(biāo)記物的結(jié)合，標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號直接或間接地得到修飾。免疫反應(yīng)及其程度檢測反應(yīng)都在均一溶液中進(jìn)行。所采用的免疫化學(xué)標(biāo)記包括自由基，熒光染料，酶，噬菌體，輔酶等。
在非均一檢測研究中，試劑通常就是樣品，特異性抗體及產(chǎn)生可檢測信號的工具。該單克隆抗體通常被覆蓋于固態(tài)支持物或固相上。接著液相樣品與固相上的單克隆抗體相接觸。然后固相支持物與液相分開，采用產(chǎn)生可檢測信號的工具對固相或液相進(jìn)行檢測。信號是與樣品中待分析物的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的。產(chǎn)生可檢測信號的方法包括使用放射活性標(biāo)記物，熒光物質(zhì)，酶等。非均一免疫檢測的例子有放射免疫檢測，免疫熒光方法，酶聯(lián)檢測等。
有關(guān)免疫檢測技術(shù)的更為詳細(xì)的討論見《酶免疫檢測》，Edward T.Maggio，1980，CRC.Press，Ins，Boca Raton，F(xiàn)lorida。另外還可參閱美國專利號3，690，834;3，791，932;3，817，837;3，850，578;3，853，987;3，867，517;3，901，654;3，935，074;3，984，533;3，996，345及4，098，896等，但并不局限于此。
本發(fā)明的抗體還可用于體內(nèi)診斷應(yīng)用。例如，抗體或由抗體制備的片段，即Fab和F(ab′)2片段可用來反映癌癥現(xiàn)象，用與Larson及同事1983，J.Nucl.Mecl.24123及1983，J.Clin.Invest，722101所述檢測惡性黑素瘤相似的方法檢查NSCLC病人代謝排泄物。純化的抗體或抗體片段用一種給出可檢測信號的試劑標(biāo)記，例如放射性同位素131I，并以適當(dāng)載體(如靜脈注入)給病人。癌結(jié)合的抗體的位置可通過外部的閃爍照相、X射線斷層照相或放射核掃描(如γ射線照相)技術(shù)來檢測。
4.3.2.治療應(yīng)用本發(fā)明的抗體還可用于治療。該單克隆抗體可與廣泛的藥物或細(xì)胞毒性試劑結(jié)合使用。例如，抗體可與某種毒素結(jié)合形成免疫毒素(Jansen及同事，1982，Immunol.Rev.62185)或與放射性活性物質(zhì)結(jié)合如I，I等(Order，1984，Compr.Ther.109;Larson及同事，1983，J.Clin.Invest.722101;Carrasquillo及同事，1984，Cancer Treatment Reports，68317)。還可與藥物結(jié)合形成放射性藥物或普通藥物(Rowland及同事，1985，Cancer Immunol.Immunother.191)。結(jié)合的抗體給病人服用，通過化療藥物的細(xì)胞毒性作用而達(dá)到加強(qiáng)抗癌效應(yīng)，這些化療藥物是基于與其結(jié)合的抗體對癌細(xì)胞的親合作用而釋放到該腫瘤。
本發(fā)明的抗體的所謂“嵌合抗體”分子可被制備成含有與人類抗體不變區(qū)相結(jié)合的小鼠抗原一結(jié)合區(qū)(Morrison及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.816851;Takeda及同事，1985，Nature，314452)，這項(xiàng)研究可用于構(gòu)建新的抗體分子，它具有合乎需要的效應(yīng)基因的功能，如能激活人類補(bǔ)體并介導(dǎo)ADCC(Neuberger及同事，1984，Nature 312604)。
該單克隆抗體另一治療上的應(yīng)用是采用L20抗體作為免疫原制備抗個(gè)體型抗體。(如見Nepom及同事，1984，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.812864;Lee及同事，1985，Proc.Nat'l Acad.Sci.826286)。
本項(xiàng)發(fā)明的吸引人的方面便是該抗體能將別的抗體結(jié)合到NSCLC或其它腫瘤上，如在美國專利申請?zhí)?67，521，1984年11月2日申請;684，759，1984年12月21日申請及738，612，1985年5月28日申請文件中所公布的那些抗體。這種結(jié)合對于檢測上面提到的非小細(xì)胞肺癌的類型，即大細(xì)胞未分化肺癌，腺癌和表皮樣肺癌是有效的。
本發(fā)明的單克隆抗體還確定與其它癌癥如乳腺癌，結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺癌相關(guān)的抗原的決定簇。(見第5節(jié)表1)。因此，該抗體可對于指向這些癌癥的治療方法及治療產(chǎn)物方面找到用途。
本發(fā)明的新抗原，稱為L20的抗原也可用于治療。該抗原可從癌中純化，或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生(Brown及同事，Copending U.S.Patent Application Serial№827313，Attorney Docket №5624-008，1986年2月7日申請，包含于本文參考文獻(xiàn)中。)編碼L20抗原的基因可通過首先富集L20抗原的mRNA而克隆。通過這樣的方法，多核糖體(包括mRNA，核糖體和新生多肽鏈)可以通過與識別新生肽鏈上L20抗原決定簇的抗體進(jìn)行免疫親和層析而純化。mRNA通過與例如L20抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)而分離，而cDNA則克隆到一適宜的表達(dá)載體中。此外，L20抗體或抗L20抗原的抗血清可用來采用一種表達(dá)載體篩選cDNA庫。純化的或克隆化的L20抗原可以單獨(dú)作為免疫原或與合適的免疫佐劑一起施用。此外，編碼該抗原的基因可以插入一種病毒的基因中，如牛痘病毒，來產(chǎn)生作為免疫原的重組DNA產(chǎn)物。(Brown及同事，Copending U.S.Patent Application Serial №827313，Attorney Docket №5624-008 1986年2月7日申請)。
4.4診斷試劑盒本發(fā)明還包括采用上述所揭示并實(shí)現(xiàn)的方法做成的診斷試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該診斷試劑盒包括(a)以上更為詳細(xì)限定的單克隆抗體，(b)為該單克隆抗體所結(jié)合的一個(gè)特異性配偶體與能產(chǎn)生可檢測信號的一種標(biāo)記物的結(jié)合物。
試劑還包括一些輔助試劑如緩沖劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如多糖等。需要時(shí)診斷試劑盒還包括信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其它組分，如消減背景干擾的試劑，對照試劑，完成一次檢測所需的設(shè)備等。在另一具體實(shí)施方案中，診斷試劑盒包括本發(fā)明的單克隆抗體與一能產(chǎn)生可檢測信號物質(zhì)的結(jié)合物。上面提到的輔助試劑也包括于其中。
5.實(shí)例本發(fā)明由下列并非限定的實(shí)例詳細(xì)說明。
5.1單克隆抗體的制備單克隆抗體用Yeh及同事1979，Int.J.Cancer 29299先前敘述的雜交瘤融合技術(shù)產(chǎn)生。用從人類肺腺癌中移植的培養(yǎng)細(xì)胞作為免疫原(稱為3082)，免疫一只三月令的Balb/c小鼠。小鼠接受四次約107(細(xì)胞量的腹腔注射。最后一次免疫后三天，取出其脾臟，懸浮于培養(yǎng)基中，并與NS1小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合(Kohler及Milstein，上述)。接種該混合物以形成來源于單個(gè)融合細(xì)胞(克隆)的低密度培養(yǎng)物。
用ELISA方法或自動射線照相間接125I標(biāo)記蛋白質(zhì)A方法篩選雜種細(xì)胞上清液，獲得對肺癌細(xì)胞系直接親合能力。(Brown及同事1979，J.Immunol.Meth.，31201)。用Colcher及同事1981，Cancer Res.421451;Yeh及同事上述所述的修改的程序，制備用于免疫反應(yīng)的癌細(xì)胞膜提取物。用PBS液沖洗組織，將從完整癌組織得來的細(xì)胞壓過不銹鋼篩而制得其懸浮液。此后加入含1mM苯甲基磺酰氟(Calbiochem-Behring Corp.，San Diego，CA)的1mM Na HCO3溶液，該物質(zhì)在冰上用Dounce勻漿器勻漿，B研桿研磨50次。以27，000xg離心15分鐘后，移去上清，片狀沉淀物于PBS中懸浮，超聲1分鐘，貯于-70℃。
生產(chǎn)與細(xì)胞膜提取物結(jié)合的抗體的雜交瘤在體外克隆、增殖，并進(jìn)一步檢測抗體特異性。那些產(chǎn)生對人類肺癌具有明顯特異性的抗體的雜交瘤再克隆。增殖并注射入降植烷激發(fā)的三月令的BALB/c小鼠，在那里，它們生長成腹水瘤。
在這程序之后，可得到雜交瘤細(xì)胞系L20，克隆，并注射到小鼠以產(chǎn)生腹水瘤。分泌入腹水的抗體于蛋白質(zhì)A-瓊脂糖上純化(Ey及同事，1978，Immunochemistry，15429)或于Sephaeryl S-300上進(jìn)行凝膠過濾而純化。鑒定純化抗體之特性。
5.2 L20單克隆抗體的特性5.2.1. L20與培養(yǎng)細(xì)胞檢測與結(jié)合測定抗體在非離子型去污劑滲透前或滲透后與細(xì)胞的結(jié)合來確定抗原的亞細(xì)胞位置。用125I標(biāo)記抗體的直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Brown及同事，1981，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.，78539)或用熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS)Ⅱ熒光檢測方法來識別與完整培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合的抗體。與細(xì)胞內(nèi)抗原位置結(jié)合的抗體用下列技術(shù)確定125I標(biāo)記的抗體與細(xì)胞直接結(jié)合;用多聚甲醛固定;用非離子型去污劑NP-40滲透。
為用放射標(biāo)記的抗體做結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Brown及同事，上述)，將所培養(yǎng)細(xì)胞(106)與106cpm的125I標(biāo)記的抗體于100μl結(jié)合緩沖液中冰浴培養(yǎng)30分子。懸浮液按層取成0.2ml dinonylph alatedibutylph alate(11v/v)，并離心。以125I對片狀測定物及水相計(jì)數(shù)。為測量非特異性結(jié)合，未標(biāo)記抗體作為競爭試劑進(jìn)行平行培養(yǎng)。(Brown及同事，上述)表Ⅰ 放射性碘標(biāo)記L20抗體與培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)合細(xì)胞 特異性結(jié)合Calu-1肺腺癌 45，400H3082肺腺癌 50，100H2981肺腺癌 64，100H2984肺腺癌 119，300MCF7乳腺癌 78，8003017黑素瘤 2，200正常T細(xì)胞 200Jurkat T白血病 200Daudi B淋巴瘤 2005.2.2. L20抗體同型確定采用下述技術(shù)確定L20雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生免疫球蛋白類型(a)Ouchterlony免疫擴(kuò)散特定的雜交瘤細(xì)胞上清液的等分試樣被加入到25%瓊脂糖凝膠板中心孔。其它孔中加入單一特異性兔抗小鼠Ig同型抗體(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)，該板室溫培養(yǎng)2小時(shí)4℃過夜。
(b)ELISA同型Dynatech Immuolon 96孔板孔用抗血清濃度1μg/ml的PBS溶液50μl覆蓋，留有覆蓋的4℃過夜。該板用PBS/吐溫20，0.05%沖洗，室溫下每孔加100μl培養(yǎng)基予以封閉(1小時(shí))。沖洗完畢，將L20雜交瘤上清液加入孔中，室溫培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS沖洗后，牛血清清蛋白板與過氧化物酶偶聯(lián)的單一特異性兔抗鼠Ig同型抗體在37℃下溫浴2小時(shí)。沖洗后，板與含1mg/ml鄰苯二胺及0.03%H2O2的pH4.5的0.1M檸檬酸緩沖液培育。630nm處光密度可在Dynatec ELISA酶標(biāo)板讀出器上確定。
L20單克隆抗體屬于IgG1同型。
5.3. L20抗體所識別的抗原為了鑒定蛋白質(zhì)抗原，肺癌細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞表面放射性碘標(biāo)記或用S-蛋氨酸進(jìn)行代謝標(biāo)記。將溶胞產(chǎn)物與單克隆抗體培養(yǎng)，加入山羊抗小鼠IgG，吸附于金黃葡萄球菌，從中即可分離抗原。沖洗免疫沉淀物，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，凝膠濃度10～20%。電泳后凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色(重量百分比0.5%～10%乙酸和30%異丙醇)，于乙酸(5%，v/v)和甲醇(17%，v/v)溶液中脫色。染過的L20抗原條帶用剃刀片切下，迅速用電洗脫機(jī)/濃縮機(jī)ECU-040進(jìn)行電洗脫(C.B.S.Scientific Co.，San Diego，CA)，方法如Hunkapiller及同事，1983，Methods in Enzymol.91227-236所述。
用約23皮摩爾L20抗原(取決于已鑒定的L-1的產(chǎn)量)于一氣相序列儀(470A型，Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)上進(jìn)行自動Edman降解。乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸衍生物用反相高分辨率液相色譜(HPLC)技術(shù)分析，所用為120A型HPLC單元(Applied Biosystems，Inc.)及PTH-C18柱(2.1×220mm，Applied Biosystems，Inc.)，用醋酸鈉/四氫呋喃/乙腈梯度洗脫。
氨基末端氨基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20T-D-A-X-L其中X代表一個(gè)尚未鑒定出來的氨基酸。
與已貯存于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的順序相比，(PIR Release 6.0，Nov.1985)，沒有揭示出與其它任何已知序列有任何明顯的同源性。
被L20抗體識別的抗原是一分子量為110，000道爾頓的糖蛋白分子。
5.4體外免疫組織化學(xué)應(yīng)用用Garrigues及同事，1982，Int.J.Cancer 29511修改過的Sternberger，1979，Immunochemistry，John wiley & Sons，New York，PP104-169所敘述的未標(biāo)抗體技術(shù)已用于對冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。手術(shù)得到用于這些試驗(yàn)的靶向組織，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷在液氮中的異戊烷中冰凍4小時(shí)。然后組織被貯存于液氮中或零下70℃直到用時(shí)。兔抗鼠IgG使用時(shí)稀釋至1/50。(Sternberger-Meyer Immunochemicals，Inc.，Jarettsville，MD)。含有2mg/ml經(jīng)純化的PAP小鼠過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物(PAP，Sternberger-Meyer Immunochemicals，Inc.)用時(shí)稀釋至1/80。冰凍切片制備，干燥，用丙酮處理，并干燥(Garrigues及同事，上述)。用于組織學(xué)評價(jià)的切片用蘇木精染色。為降低非特異性背景，切片預(yù)先與稀釋至1/5的正常人血清培養(yǎng)(Garrigues及同事，上述)。小鼠抗體，山羊抗小鼠IgG，以及小鼠PAP均于10%正常人血清和3%兔血清溶液中稀釋。
染色程序包括用特異的或?qū)φ湛贵w處理序列切片2.5小時(shí)，與稀釋至1/50的兔抗小鼠IgG培養(yǎng)30分鐘，暴露于稀釋至1/80的小鼠PAP復(fù)合物30分鐘。每次用抗體處理后，載玻片用PBS洗兩次。用新鮮制備的0.5%3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(該藥品為Sigma，St.Louis，Mo)和含0.01%H2O2的0.05M Tris緩沖液pH7.6開始免疫組織化學(xué)反應(yīng)8分鐘。于1%O3O4蒸餾水溶液浸泡20分鐘可以加強(qiáng)染色。切片浸入水，用乙醇脫水，用二甲苯洗凈，固定載玻片上。
載玻片在編號情況下，對每個(gè)均檢查確定，編有號碼的樣品由單獨(dú)的研究者檢驗(yàn)。典型的載玻片用干涉反差顯微鏡照相(Zeiss-Nomarski)?？贵w染色程度記作0(無活性)，+(有幾個(gè)弱陽性細(xì)胞)，++(至少有1/3細(xì)胞為陽性)，+++(大多數(shù)細(xì)胞陽性)，++++幾乎所有細(xì)胞顯示很強(qiáng)陽性)。因?yàn)?和0之間差別比+和++染色差別顯得更不清楚，所以具有++或高于++的級別就認(rèn)為是“陽性”。贅生細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均可在癌樣品中觀察到。而記錄下的染色是癌細(xì)胞的，因?yàn)榛|(zhì)細(xì)胞幾乎不被染色，或染色程度比癌細(xì)胞弱得多。
表Ⅱ.癌細(xì)胞和正常組織樣品與L20單克隆抗體進(jìn)行免疫過氧化物酶染色組織類型 陽性數(shù)/試驗(yàn)數(shù)肺癌腺癌 18/20表皮樣癌 3/3支氣管 0/1小細(xì)胞 4/4肺癌細(xì)胞系 3/3乳腺癌 4/7結(jié)腸癌 5/8黑素瘤 5/8腎癌 1/1脂肉瘤 0/1正常肺 3個(gè)樣品中有1個(gè)弱染色正常脾 陰性正常乳腺 陰性正常結(jié)腸 陰性正常腎 陰性正常肝 陰性正常腦 陰性正常心臟 陰性正常皮膚 陰性正常胸腺 陰性正常睪丸 陰性正常陰道 陰性正常淋巴球 陰性所有檢查的樣品均為手術(shù)得到的組織冰凍切片。免疫組織學(xué)方法的詳細(xì)說明見正文。兩個(gè)+號染色(代表至少1/3細(xì)胞陽性)就認(rèn)為為是陽性。
顯然，如上述所闡明的那樣，對于本發(fā)明作多處修正和改變將不會超出本發(fā)明的基本思想和范圍。僅以實(shí)例給出了特別的具體描述，本發(fā)明僅限于由附加權(quán)限條款所限定的那些。
這里所描述的L20細(xì)胞系已存入American Type Tissue Culture Collection，Rockville，Maryland，登記號為ATCC NoHB8913。此處描述和要求的發(fā)明并不限于所存入的細(xì)胞系，因?yàn)樗嫒氲木唧w實(shí)例僅為本發(fā)明一個(gè)方面的描述，而任何能產(chǎn)生功能等價(jià)單克隆抗體的等價(jià)活細(xì)胞都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。事實(shí)上，除了這里描述的以外的對于本發(fā)明的各種修改顯然將屬于前文所述的范圍。這些修改都在所要求權(quán)項(xiàng)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.
H B8913性狀的雜交瘤，通過使(i)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即人工培養(yǎng)細(xì)胞，或非小細(xì)胞肺癌患者的肺組織與(ii)骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤；和b)收集由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。
2.按照權(quán)利要求
1的方法，其中雜交瘤在活體內(nèi)增殖。
3.按照權(quán)利要求
2的方法，其中通過給BALB/C鼠注射準(zhǔn)備好的姥鮫烷并使腹水腫瘤生長來增殖雜交瘤，分泌到腹水中的單克隆抗體通過在蛋白A瓊脂糖上的吸附或凝膠過濾得到純化。
4.按照權(quán)利要求
1的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓并且具有下列氨基末端的氨基酸順序1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑒定出的氨基酸。
5.按照權(quán)利要求
4的方法，其中雜交瘤包括雜交瘤細(xì)胞株L20，A.T.C.C.HB8913號。
6.按照權(quán)利要求
5的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG類。
7.按照權(quán)利要求
6的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG1亞類。
8.一種生產(chǎn)與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖通過使得自非小細(xì)胞肺癌患者的抗體產(chǎn)生細(xì)胞不滅而獲得的轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系;和b)收集由轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
9.按照權(quán)利要求
8的方法，其中通過愛潑斯坦-巴氏病毒(EBV)感染使抗體產(chǎn)生細(xì)胞不滅。
10.一種生產(chǎn)與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖通過使(ⅰ)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞株與(ⅱ)骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤，轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞株是通過使得自非小細(xì)胞肺癌患者的抗體產(chǎn)生細(xì)胞不滅而獲得的;和b)收集由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。
11.按照權(quán)利要求
10的方法，其中通過EBV感染使抗體產(chǎn)生細(xì)胞不滅。
12.按照權(quán)利要求
8的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓并且氨基末端的氨基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑒定出的氨基酸。
13.按照權(quán)利要求
10的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓并且氨基末端的氨基酸順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑒定出的氨基酸。
14.按照權(quán)利要求
4的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG類。
15.按照權(quán)利要求
12的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG類。
16.按照權(quán)利要求
13的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG類。
17.按照權(quán)利要求
14，15或16的方法，其中產(chǎn)生的單克隆抗體屬于IgG1亞類。
18.一種生產(chǎn)與人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測得抗原的分子量約為110，000道爾頓并且氨基末端的順序如下1 5 10 15L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-20T-D-A-X-L其中X代表未鑒定出的氨基酸，該方法包括a)增殖雜交瘤細(xì)胞株L20，A.T.C.C.HB8913號，該雜交瘤細(xì)胞株是通過使(ⅰ)得自用人的肺癌3082細(xì)胞免疫的BALB/C鼠的脾臟的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與(ⅱ)NS1鼠骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
19.按照權(quán)利要求
1，8或10的方法，其中單克隆抗體與人的乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合。
20.按照權(quán)利要求
1，8或10的方法，其中單克隆抗體與人的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合。
21.一種生產(chǎn)與人的胸癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.HB8913號性狀的雜交瘤，該雜交瘤是通過使(ⅰ)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即人工培養(yǎng)細(xì)胞，或非小細(xì)胞肺癌患者的肺組織與(ⅱ)骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
22.一種生產(chǎn)與人的結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞表面糖蛋白抗原上的決定簇位點(diǎn)結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括a)增殖具有A.T.C.C.HB8913號性狀的雜交瘤，該雜交瘤是通過使(ⅰ)來自用胸膜滲出液免疫的動物脾的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，即人工培養(yǎng)細(xì)胞，或非小細(xì)胞肺癌患者的肺組織與(ⅱ)骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的;和b)收集由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
23.一種檢測可能含有惡性細(xì)胞的樣品中的惡性細(xì)胞的方法，包括a)在使單克隆抗體與決定簇位點(diǎn)結(jié)合的反應(yīng)條件下使樣品與按照權(quán)利要求
1，4，5，8或10的方法生產(chǎn)的單克隆抗體接觸;b)從樣品中除去未結(jié)合的單克隆抗體分子;和c)檢驗(yàn)樣品中結(jié)合的單克隆抗體的存在，其中單克隆抗體的結(jié)合表明樣品中惡性細(xì)胞的存在。
24.按照權(quán)利要求
23的方法，其中惡性細(xì)胞包括非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
25.按照權(quán)利要求
24的方法，其中樣品包括肺組織。
26.按照權(quán)利要求
23的方法，其中惡性細(xì)胞包括胸癌細(xì)胞。
27.按照權(quán)利要求
23的方法，其中惡性細(xì)胞包括結(jié)腸癌細(xì)胞。
28.按照權(quán)利要求
23或24的方法，其中通過免疫組織學(xué)染色檢測結(jié)合。
29.一種在活體內(nèi)確定人的非小細(xì)胞肺癌的位置的方法，包括a)提純按照權(quán)利要求
1，4，5，8或10的方法生產(chǎn)的單克隆抗體;b)放射標(biāo)記單克隆抗體;c)用合適的載體供給患者這種單克隆抗體;和d)通過外閃爍法，放射X線斷層術(shù)或放射性核掃描確定單克隆抗體的位置。
30.非小細(xì)胞癌的免疫治療方法，包括a)提純按照權(quán)利要求
1，4，5，8或10的方法生產(chǎn)的單克隆抗體;b)使單克隆抗體與細(xì)胞毒素劑，即一種毒素，或放射性藥物結(jié)合;和c)用合適的載體供給肺癌患者這種結(jié)合的單克隆抗體。
31.一種治療表達(dá)由L20抗體所限定的抗原的腫瘤的免疫治療方法，包括a)提純按照權(quán)利要求
1，4，5，8或10的方法生產(chǎn)的單克隆抗體;b)制備對單克隆抗體的抗個(gè)體基團(tuán)型抗體;和c)用合適的載體供給肺癌患者這種抗個(gè)體基因型抗體。
專利摘要
本項(xiàng)發(fā)明涉及一類新的單克窿抗體，其能與某種蛋白質(zhì)抗原強(qiáng)烈結(jié)合，該抗原與人類非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”)，小細(xì)胞肺癌及包括結(jié)腸癌、乳腺癌在內(nèi)的其它癌癥相關(guān)聯(lián)。該抗體在諸如檢測與NSCLC結(jié)合的惡性細(xì)胞的診斷方法方面以及在治療帶有NSCLC及其它幾種癌癥的治療方面找到了用途。還公布了在人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面及其它幾種癌癥細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了分子量為110,000道爾頓的一種新的糖蛋白抗原。該抗原氨基末端氨基酸順序?yàn)?br> 1
5
10
15
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-
20
T-D-A-X-L 其中X代表一未確定的氨基酸。
文檔編號C12N5/00GK87100927SQ87100927
公開日1988年10月5日 申請日期1987年3月14日
發(fā)明者卡爾·埃里克·赫爾斯特羅姆, 約瑟夫·P·布朗, 英吉格·赫爾斯特羅姆 申請人:昂科金公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan