專利名稱：涉及先兆子癇和糖尿病診斷和治療的材料與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于先兆子癇和糖尿病診斷與治療的材料和方法，尤其涉及P型肌醇磷酸聚糖(IPG)在先兆子癇發(fā)生中的作用，診斷先兆子癇的方法以及P型IPG拮抗劑在先兆子癇治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
先兆子癇是一種胎盤疾病[1]，其特征在于子宮胎盤循環(huán)機(jī)能不全[2]，它影響著全部妊娠者的10-20％，是圍產(chǎn)死亡率的主要因素。有證據(jù)表明，一種或多種胎盤源性因子釋放到母體循環(huán)中，其直接或間接地導(dǎo)致母體內(nèi)皮功能失調(diào)，隨之發(fā)生母體異常，伴有凝血系統(tǒng)激活、血管通透性增加、以及繼發(fā)于血管收縮的母體器官缺血[3]。
發(fā)明概述本發(fā)明來自調(diào)查研究，這些研究旨在明確先兆子癇及其嚴(yán)重程度是否與先兆子癇受試者及其年齡和產(chǎn)次匹配的正常對照中肌醇磷酸聚糖(IPG)水平存在關(guān)聯(lián)。正如以往所發(fā)現(xiàn)的那樣[4]，先兆子癇時胎盤內(nèi)糖原積累大量增加，為了獲取資料了解這種碳水化合物代謝障礙的意義，與糖尿病孕婦進(jìn)行了比較，在后者中胎盤糖原積累也是一個顯著特征[4,5]，但不伴有象先兆子癇那樣危及生命的后發(fā)癥。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了P型肌醇磷酸聚糖(IPG)拮抗劑在用于先兆子癇治療藥物的制備中用途。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種在病人身上治療先兆子癇的方法，這種方法包括將一種治療有效量的P型IPG拮抗劑施用于病人。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，它包括一種與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合的P型IPG拮抗劑。
下面描述了P型IPG以及將其從人組織中分離出來的方法。這依次使得本領(lǐng)域普通的熟練技術(shù)人員能夠制備P型IPG拮抗劑。
在本發(fā)明中，“P型IPG拮抗劑”包括一種或多種具有下列特性的物質(zhì)(a)抑制P型IPG自胎盤中釋放；(b)通過一種針對胎盤源性IPG的IPG結(jié)合物質(zhì)(例如一種抗體或一種特異性結(jié)合蛋白質(zhì))，降低胎盤源性P型IPG的水平；和/或c)減弱胎盤源性P型IPG的效應(yīng)。
再進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種篩選P型IPG拮抗劑的方法，該方法包括(a)在一項(xiàng)測定P型IPG生物學(xué)特性的試驗(yàn)中，在使這種P型IPG能與候選拮抗劑競爭的條件下，使一種候選拮抗劑與一種P型IPG接觸；(b)測定P型IPG的生物學(xué)特性；以及，(c)選擇降低P型IPG生物學(xué)活性的候選拮抗劑。
P型IPG的某些生物學(xué)特性，以及上述篩選方法中可用的測定這些特性的檢測方法將在下文中描述。組合化學(xué)技術(shù)尤其適用于大量合成候選拮抗劑的生產(chǎn)，其活性可由上述方法篩選。
特別將重點(diǎn)放在測定先兆子癇和糖尿病孕婦的IPG排泄量上，涉及到在代謝途徑中處于關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位的這類化合物眾所知的重要性，其在不同組織導(dǎo)致不同的碳水化合物代謝方向，就P型IPG來說，向著氧化和糖原合成方向，或者，就A型IPG來說，向著脂肪生成方向；這種調(diào)節(jié)既是器官、又是器官之間相關(guān)聯(lián)的[6,9]。
在從GB-A-9618934.5要求優(yōu)先權(quán)的共同未決申請中，我們報告了糖尿病病人尿中的IPG含量，由此引出證據(jù)表明肌醇磷酸聚糖異常的關(guān)鍵作用，這種異常與X綜合征相關(guān)參數(shù)有關(guān)，如胰島素耐受、肥胖和高血壓。先兆子癇與X綜合征的代謝改變之間有相似之處[10]。
下述我們的研究結(jié)果表明(a)先兆子癇婦女尿中P型IPG24小時排泄量顯著高于(2-3倍)年齡、產(chǎn)次和妊娠期匹配的妊娠對照受試者。
(b)糖尿病孕婦與年齡、產(chǎn)次和妊期匹配的妊娠對照受試者相比，尿中P型IPG排泄量無顯著改變。
(c)與年齡匹配的非妊娠對照相比，妊娠本就與尿中P型IPG排泄量增加有關(guān)。
(d)在先兆子癇或糖尿病組中，每日尿中A型IPG排泄量未見顯著改變，除了在先兆子癇組，當(dāng)結(jié)果以每毫摩爾肌酸酐單位表示時，A型IPG增加。
(e)尿中P型IPG排泄與先兆子癇嚴(yán)重度標(biāo)志物、血漿丙氨酸天門冬氨酰轉(zhuǎn)氨酶、蛋白尿程度、及血小板計數(shù)有相關(guān)性。
(f)人胎盤含有很高濃度的P型IPG，比人或大鼠肝臟高出大約100倍?？磥硭€含有一種P型IPG活性抑制物，證據(jù)在于，當(dāng)增加在PDH磷酸酶系統(tǒng)測試的同一制劑的體積時，計算出的活性降低(圖7)。先兆子癇胎盤P型IPG的含量大約是正常妊娠受試者胎盤含量的兩倍。從胎盤分離出的A型IPG(pH1.3組分)，在被測試其刺激大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪生成的能力時，沒有顯示出活性。
(g)發(fā)現(xiàn)有證據(jù)提示，應(yīng)用避孕藥片可能與正常婦女尿中P型IPG增加有關(guān)。(每組只有5個值)。
(h)先兆子癇婦女的尿在-80℃存放10個月后，顯示P型活性增加(圖8A)，這表明尿中最初含有一種不穩(wěn)定的抑制物。從同一尿中分離的A型IPG產(chǎn)物活性降低(圖8B)。
(i)發(fā)現(xiàn)P型IPG與A型IPG的比例在非妊娠婦女與正常男性受試者之間有顯著差異；但兩組間P型IPG相似，A型IPG在婦女中要高5-6倍。
(j)與正常妊娠受試者相比，先兆子癇婦女尿中P型IPG增加2.7倍。與正常妊娠受試者相比，先兆子癇婦女的胎盤源性P型介質(zhì)增加2.7倍(見表5)。
(k)在先兆子癇中，P型IPG在尿中的高排泄反映了其在胎盤和循環(huán)中高的水平，這與在該病況時胎盤內(nèi)糖原積累直接相關(guān)，因?yàn)镻型IPG活化糖原合成酶磷酸酶。
(l)先兆子癇婦女尿中的P型介質(zhì)濃度在產(chǎn)后樣本中恢復(fù)到基線，(見圖6)，這證實(shí)在先兆子癇婦女中，相關(guān)的P型介質(zhì)的來源是胎盤。
(m)源于胎盤的P型IPG的高循環(huán)水平可能有旁分泌效應(yīng)，例如刺激其它內(nèi)分泌腺，和/或影響內(nèi)皮細(xì)胞，這在先兆子癇綜合征的發(fā)病中可能起一定作用。
本發(fā)明特別提供一種治療先兆子癇的方法(1)抑制P型介質(zhì)從胎盤釋放；(2)通過針對胎盤源性IPG的抗體而降低胎盤源性P型IPG的水平；(3)通過P型拮抗劑而減弱胎盤源性P型IPG的效應(yīng)。
這種物質(zhì)可作為單獨(dú)的活性物質(zhì)施用，或作為其他治療形式的輔助。由于其分子量小，對熱和酸穩(wěn)定，IPG應(yīng)適合于口服施用，但其它形式的施用方法也包括在考慮中。至于可能不適合于口服的抗體，或其它蛋白質(zhì)或物質(zhì)，可采用其他方法如非腸道施用。根據(jù)已知的技術(shù)，施用的抗體優(yōu)選是人的或“人源化的”。這在下面將進(jìn)一步討論。
本發(fā)明還構(gòu)思測定血液或尿中的P型IPG作為先兆子癇的一種診斷方法。因此，再進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種在一位病人中診斷先兆子癇的方法，該方法包括測定來自病人的生物樣本中的P型IPG水平。因此，通過將這種水平與P型IPG的已知水平相聯(lián)系就能作出診斷。
在一種實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟(a)將一種取自病人的生物樣本與一種其上固定了結(jié)合劑的固體支持物接觸，該結(jié)合劑具有對一種或多種P型IPG特異的結(jié)合位點(diǎn)；(b)將固體支持物與一種標(biāo)記的顯影劑接觸，這種顯影劑能夠與未被占用的結(jié)合位點(diǎn)、已結(jié)合的P型IPG或被占用的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；(c)檢測在步驟(b)中特異性結(jié)合的顯影劑標(biāo)記，以獲得一個代表樣本中P型IPG水平的值。
正如下文所陳述的那樣，在本發(fā)明的這一方面，應(yīng)用一個與P型IPG相關(guān)的標(biāo)志物能進(jìn)一步確定P型IPG的水平。
現(xiàn)在將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，而且不限于參考附圖。
附圖簡述

圖1(A,B)顯示了先兆子癇組、糖尿病組中的孕婦，及其各自匹配的正常妊娠組和非妊娠組婦女尿中P型IPG濃度(單位/毫摩爾肌酸)的個值，以及(C,D)先兆子癇組、糖尿病組中的孕婦，及其各自匹配的正常妊娠組和非妊娠組婦女尿中A型IPG濃度(單位/毫摩爾肌酸)的個值。
圖2A,B顯示了避孕藥片對非妊娠對照受試者P型IPG和A型IPG尿排泄量的影響。
圖3A,B顯示P型與妊娠期的關(guān)系，其中樣本取自先兆子癇組、糖尿病組和匹配的對照孕婦。
圖4顯示了(A)先兆子癇尿中P型IPG與尿蛋白質(zhì)的關(guān)系，(b)尿P型IPG與谷氨酸天冬氨酰轉(zhuǎn)氨酶血漿水平升高的關(guān)系，以及(c)先兆子癇中尿P型IPG與血小板計數(shù)的關(guān)系。
圖5顯示了(A)和(B)先兆子癇產(chǎn)前和產(chǎn)后樣本中尿P型IPG的濃度，以及(C)先兆子癇產(chǎn)前和產(chǎn)后樣本的尿量。
圖6顯示的圖解說明了在先兆子癇和糖尿病中調(diào)節(jié)胎盤糖原代謝的因素。
圖7顯示了測定中所用的組織重量和體積對評價正常受試者胎盤中P型IPG的影響。
圖8A,B顯示了在正常的先兆子癇受試者孕婦尿中存在一種不穩(wěn)定P型IPG抑制物的證據(jù)，以及尿樣本在-80℃存放10個月對P型IPG和A型IPG活性的影響。
圖9和10顯示了在正常和先兆子癇受試者中，P型IPG產(chǎn)量與所提取的胎盤組織重量的關(guān)系。
發(fā)明詳述IPG
研究顯示，A型介質(zhì)調(diào)節(jié)許多象cAMP依賴蛋白激酶(抑制)、腺苷酸環(huán)化酶(抑制)和cAMP磷酸二酯酶(刺激)這樣的胰島素依賴酶的活性。相反，P型介質(zhì)調(diào)節(jié)象丙酮酸脫氫酶磷酸酶(刺激)和糖原合成酶磷酸酶(刺激)這樣的胰島素依賴酶的活性。A型介質(zhì)模仿胰島素對脂肪細(xì)胞的脂肪生成活性，而P型介質(zhì)模仿胰島素對肌肉的糖生成活性。當(dāng)加入到無血清培養(yǎng)基的成纖維細(xì)胞中時，A型和P型介質(zhì)部都具有促有絲分裂活性。如果細(xì)胞用EGF-受體轉(zhuǎn)染的話，這些介質(zhì)刺激成纖維細(xì)胞增殖的能力得到加強(qiáng)。A型介質(zhì)能刺激小雞耳蝸前庭神經(jīng)節(jié)中的細(xì)胞增殖。
具有A型IPG和P型IPG活性的可溶性IPG組分已從多種不同的動物組織中獲得，包括大鼠組織(肝、腎、肌肉、腦、脂肪、心、胎盤)和牛肝。在人肝和胎盤、瘧疾寄生的RBC和分枝桿菌屬也檢測到A型IPG和P型IPG的生物活性。抗-肌醇聚糖抗體抑制胰島素對人胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層和BC3H1肌細(xì)胞的作用，或牛源性IPG對大鼠橫膈和小雞神經(jīng)節(jié)的作用，提示許多結(jié)構(gòu)特征有種屬間保守性。然而，盡管現(xiàn)有技術(shù)包括在某些生物組分中有A型IPG和P型IPG活性的報告，但負(fù)責(zé)這種活性的介質(zhì)的純化或表征并未公開，指明這一點(diǎn)是重要的。
在從GB-A-9618930.3和GB-A-9618929.5要求優(yōu)先權(quán)的、我們的共同未決專利申請中，我們描述了P型IPG和A型IPG的分離和表征。
A型IPG物質(zhì)是含環(huán)多醇的碳水化合物，也含有Zn2+離子和任選的磷酸，具有調(diào)節(jié)脂肪生成活性及抑制cAMP依賴蛋白質(zhì)激酶的特性。它們可能還抑制腺苷酸環(huán)化酶，加入到無血清培養(yǎng)基中的EGF轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中時，有促有絲分裂活性，且刺激脂肪細(xì)胞中的脂肪生成。
P型IPG物質(zhì)是含環(huán)多醇的碳水化合物，也含有Mn2+和/或Zn2+離子及任選的磷酸，具有調(diào)節(jié)糖原代謝和活化丙酮酸脫氫酶磷酸酶的特性。它們可能還刺激糖原合成的磷酸酶活性，加入到無血清培養(yǎng)基的成纖維細(xì)胞中時，有促有絲分裂活性，且刺激丙酮酸脫氫酶磷酸酶。
還發(fā)現(xiàn)A型IPG和P型IPG物質(zhì)具有以下特性1．在用4/1/1的丁醇/乙醇/水為溶劑的下行紙層析中，遷移在起點(diǎn)附近。2．這些物質(zhì)含有與活性直接相關(guān)的磷酸。3．游離的GPI前體對GPI-PLC的裂解有抗性。4．它們可與Dowex Ag50(H+)陽離子交換樹脂結(jié)合。5．它們可與AG3A陰離子交換樹脂結(jié)合。6．其活性對鏈霉蛋白酶有抗性。7．應(yīng)用一種Dionex層析系統(tǒng)可檢測出它們。8．P型IPG物質(zhì)在C-18親和樹脂上被部分滯留。
A型IPG和P型IPG物質(zhì)可從人肝或胎盤中獲得，通過(a)用熱和酸處理肝勻漿制備提取物，勻漿是由在液氮中迅速冷凍的組織加工而成的；(b)離心及活性碳處理后，將生成的溶液與一種AG1-X8(甲酸鹽形式)陰離子交換樹脂相互作用過夜；(c)用50mM HCl洗脫柱子，收集具有A型IPG活性的級分，或用10mM HCl洗脫柱子收集具有P型IPG活性的級分；(d)中和至pH4(不超過pH7.8)，凍干級分以分離物質(zhì)；(e)用4/1/1的丁醇/乙醇/水為溶劑進(jìn)行下行紙層析；(f)應(yīng)用吡啶/乙酸/水高壓紙電泳純化；(g)應(yīng)用Dionex陰離子交換層析純化或應(yīng)用Vydac 301 PLX575HPLC層析純化和分離。
獲得這些IPG的方法的更多細(xì)節(jié)提供在所述專利申請中，其內(nèi)容在此引入作為參考。拮抗劑如上所述，無論是天然的還是合成的P型活性拮抗劑，包括具有一種或多種下列特性的物質(zhì)
(a)能夠抑制從胎盤釋放P型介質(zhì)的物質(zhì)；(b)能夠通過一種針對胎盤源性IPG的IPG結(jié)合物質(zhì)(例如一種抗體或特異性結(jié)合蛋白質(zhì))降低胎盤源性P型IPG水平的物質(zhì)；和/或，(c)能夠減弱胎盤源性P型IPG效應(yīng)的物質(zhì)。
在一個實(shí)施方案中，IPG拮抗劑是特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。通過從生物樣本中篩選與IPG結(jié)合的蛋白質(zhì)，可獲得天然的特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。
在另一個實(shí)施方案中，拮抗劑是抗體。多克隆和單克隆抗體的制備是本領(lǐng)域中的成熟技術(shù)，典型方案將在下面的例子中陳述。單克隆抗體可經(jīng)過重組DNA技術(shù)，以生成保留了原抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。各種技術(shù)可包括將編一種抗體免疫球蛋白可變區(qū)、或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA插入另一種免疫球蛋白的恒定區(qū)、或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)。參見例如，EP-A-184187、GB-A-2188638或EP-A-239400。一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可經(jīng)過遺傳突變或其它改變，這可能會也可能不會改變所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。
抗體可應(yīng)用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。制備抗體的方法包括用蛋白質(zhì)或其片段免疫一種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或猴)?？贵w可應(yīng)用本領(lǐng)域中已知的多種不同技術(shù)中的任何一種從被免疫動物中獲得，優(yōu)選應(yīng)用抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合可對其進(jìn)行篩選。例如，可應(yīng)用Western印跡技術(shù)或免疫沉淀法(Armitage等人，自然(Nature),357:80-82,1992)。從一種動物分離抗體和/或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可伴隨殺死動物這一步驟。
作為用肽免疫哺乳動物的另一選擇或補(bǔ)充，對一種蛋白質(zhì)特異的抗體可從重組產(chǎn)生的已表達(dá)的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域文庫中獲得，例如，應(yīng)用λ噬菌體或絲狀噬菌體，其表面呈現(xiàn)有功能性免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；例如見WO92/01047。文庫可以是原初的，即由取自未經(jīng)任何蛋白質(zhì)(或片段)免疫過的生物體的序列所構(gòu)建，或者可以是一個由取自已接觸過目標(biāo)抗原的生物體的序列所構(gòu)建的文庫。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可經(jīng)許多方式修飾。實(shí)際上“抗體”這一術(shù)語應(yīng)被看作覆蓋任何具有所需特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合物質(zhì)。因此，本發(fā)明覆蓋抗體片段、衍生物、功能等價物以及抗體同系物，包括合成分子以及形狀類似一種抗體使其能夠與一種抗原或表位結(jié)合的分子。
能夠結(jié)合一種抗原或其它結(jié)合配偶體的抗體片段的實(shí)例是Fab片段，其由VL、VH、C1和CH1結(jié)構(gòu)域組成；Fd片段由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段由一種抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段由一個VH結(jié)構(gòu)域組成；經(jīng)分離的CDR區(qū)和F(ab＇)2片段是一種二價片段，其包括在鉸鏈區(qū)由一個二硫鍵連結(jié)的兩個Fab片段。單鏈Fv片段也包括在內(nèi)。
源自非人類的CDR移植到人類構(gòu)架區(qū)上，典型的是通過改變某些構(gòu)架氨基酸殘基，以提供比原來的非人類抗體免疫原性更低的抗體，這種人源化抗體也包括在本發(fā)明中。
一種產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可經(jīng)過遺傳突變或其它改變。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員還將理解，一種單克隆抗體可經(jīng)過重組DNA技術(shù)以產(chǎn)生保留了原抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可包括將編碼一種抗體免疫球蛋白可變區(qū)，或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA插入另一種免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)。參見例如，EP-A-184187,GB-A-2188638或EP-A-0239400。嵌合抗體的克隆和表達(dá)在EP-A-0120694和EP-A-012023中描述。
能夠產(chǎn)生具有所需結(jié)合特征抗體的雜交瘤落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)，含有編碼抗體的核酸(包括抗體片段)并能夠使其表達(dá)的宿主細(xì)胞，無論是真核的或是原核的，也均落入此范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供生產(chǎn)抗體的方法，其包括將一個能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)，在此條件下可產(chǎn)生抗體，優(yōu)選地抗體可被分泌。
上述抗體也可用于本發(fā)明的診斷方面，通過給它們標(biāo)上標(biāo)記或報告分子(它們能直接或間接地產(chǎn)生可檢測的以及優(yōu)選可測量的信號)。報告分子的連接可以是直接的或間接的、共價的(例如通過一個肽鍵)、或非共價的。通過一個肽鍵連接，可能是編碼抗體和報告分子的融合基因重組表達(dá)的結(jié)果。
一種受歡迎的方式是，通過每一個抗體與單獨(dú)的、具有各自不同的光譜吸收或發(fā)射特征的熒光色素、磷光體或激光染料共價連接。合適的熒光色素包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和德克薩斯紅。合適的產(chǎn)色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。
其它報告分子包括大分子膠體顆?；蝾w粒材料，如有色的膠乳珠、磁性的或順磁性的，以及生物或化學(xué)活性劑，其能直接或間接產(chǎn)生可檢測信號，以便肉眼觀察、電子檢測或用其它方法記錄。例如，這些分子可以是酶，催化例如產(chǎn)生或改變顏色或引起電特性改變的反應(yīng)。它們可能在分子上是可激發(fā)的，如此能級之間的電子躍遷導(dǎo)致特征性光譜吸收或發(fā)射。它們可能包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實(shí)體。生物素/抗生物素或生物素/鏈霉抗生物素以及堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)均可以應(yīng)用。
在另一個實(shí)施方案中，IPG拮抗劑是合成的化合物。它們可通過常規(guī)化學(xué)技術(shù)或應(yīng)用組合化學(xué)生產(chǎn)，然后篩選其IPG拮抗劑活性。這些化合物本身可以是有用的，或可用于模擬物設(shè)計，為藥品開發(fā)提供候選的前導(dǎo)化合物。當(dāng)合成化合物比較容易合成，或者它們具有的特性使之適合于作為藥品使用時期望合成的化合物，例如當(dāng)拮抗劑是肽時，如果它們在消化道被蛋白酶降解，則它們作為口服組合物可能是不合適的活性劑。通常用模擬設(shè)計、合成及測試以避免從大量分子中隨機(jī)篩選一種目標(biāo)特性。單克隆抗體的生產(chǎn)應(yīng)用順序薄層層析(TLC)從大鼠肝臟純化的肌醇磷酸聚糖(IPG)，被用來通過常規(guī)方法免疫新西蘭兔和Balb/c小鼠。
免疫后，通過小鼠脾細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml)與突變型骨髓瘤細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)融合的方法制備單克隆抗體。所用的骨髓瘤細(xì)胞株是缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的篩選方法根據(jù)一種非競爭性固相酶免疫測定，其中抗原(IPG)被固定于固相。加入培養(yǎng)上清液，然后選擇陽性雜交瘤細(xì)胞。
通過有限稀釋法制備單個細(xì)胞克隆。選擇三種單克隆抗體(2D1,5HG和2P7)的雜交瘤。應(yīng)用EK-5050試劑盒(Hyclone)確定所有的單克隆抗體都是IgM。
為了檢測所有單克隆抗體都識別的IPG，使用了一種非競爭性固相酶免疫測定。Fq6 Polysorp Nunc-Immuno板被用于該測定。建議這些測定使用Polysorp表面，其中某些抗原被固定。
稀釋至1∶800的固定抗原從培養(yǎng)上清液、腹水中捕獲單克隆抗體，以及在應(yīng)用純化的單克隆抗體時捕獲單克隆抗體。
檢測方法使用抗小鼠IgM、生物素化全抗體(來自山羊)以及鏈霉抗生物素-生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合物(Amersham)、ABTS和ABTS緩沖液(Boehringer Mannheim)。
同樣的免疫測定被用來評價多克隆抗體。在這種測定中，檢測方法使用抗兔Ig、生物素化種屬特異性全抗體(來自驢)。
抗體可應(yīng)用以下方法純化?？焖俚鞍踪|(zhì)液相層析(PharmaciaFOLC Systgem)，其帶有一個梯度編程器GP-250Plus和高精密泵P-500，被用來純化多克隆IPG抗體。
一種HiTrap蛋白質(zhì)A親和柱被用來從兔血清中純化多克隆IPG。應(yīng)用一種Micro BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。
單克隆IgM抗體的純分分兩步。硫酸銨沉淀是選擇的第一步方法。組織培養(yǎng)上清液用硫酸銨(50％飽和)處理。將稀釋于PBS中的沉淀轉(zhuǎn)移到透析袋中，然后是第二步。
由于硫酸銨沉淀不適用于單一步驟純化，因此其后接著凝膠過濾層析-在PBS中的抗體溶液置于Pharmacia Sepharose 4B柱中過柱。在一個Perkin-Elmer□2UV/VIS分光光度計220-280nm處讀吸光度，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。夾心ELISA方法以下方法描述了一種間接的、非競爭性固相酶免疫測定(夾心ELISA)，以對生物體液如人血清中的肌醇磷酸聚糖(IPG)進(jìn)行定量測定。
在測定中，單克隆IgM抗體被固定在固相上。組織培養(yǎng)上清液、通過腹膜內(nèi)注入雜交瘤細(xì)胞誘發(fā)腹膜腫瘤小鼠的腹水、以及純化的單克隆抗體用于免疫測定。這些測定使用的是F96 Maxisorp Nunc-Immuno板。其中蛋白質(zhì)，特別是象抗體這樣的糖蛋白結(jié)合到塑料上時建議使用Maxisorp表面。
這種固定抗體從待測樣本(人血清或用來做如陽性對照的IPG)中捕獲抗原。
需用橋連抗體(來自兔的純化多克隆IPG抗體)來聯(lián)結(jié)生物素化的抗-抗體與抗原。
檢測方法應(yīng)用一種抗兔Ig、生物素化種屬特異性全抗體(來自驢)、以及一種鏈霉抗生物素-生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合物(Amersham)、ABTS和ABTS緩沖液(Boehringer Mannheim)。
ELISA測定可按如下進(jìn)行1．在所有步驟中每孔加100μl。
2．在一個F96Maxisorp Nunc-Immuno板中，加入在PBS中稀釋至1∶100的單克隆抗體。在4℃孵育至少2天。
3．用PBS洗三次。
4．加入一種溶在蒸餾水中(1∶9)的ELISA封閉劑(BoehringerMannheim)，室溫2小時。
5．用PBS-吐溫20(0.1％)洗三次。
6．加一種純化的多克隆抗體(PBS中稀釋至1∶100),4℃過夜。
7．用PBS-吐溫20(0.1％)洗三次。
8．加入一種抗兔Ig，用PBS中稀釋至1∶1000的生物素化種屬特異性全抗體(來自驢)(Amersham)，室溫1小時30分。
9．用PBS-吐溫20(0.1％)洗三次。
10．加入一種用PBS稀釋至1∶500的鏈霉抗生物素-生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合物(Amersham)，室溫1小時30分。
11．用PBS洗三次。
12．將2.2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6))二銨鹽結(jié)晶(ABTS)(Boehringer Mannheim)加至ABTS緩沖液(BM)中ABTS緩沖液加到蒸水中(1∶9v/v)。1mgABTS加到1ml稀釋的ABTS緩沖液中。
13．在5-15分鐘內(nèi)用一種405mm濾片在Multiscan Plus P2.01上讀出吸光度。藥物組合物本發(fā)明的拮抗劑可配制在藥物組合物中。除一種或多種P型拮抗劑外，這些組合物還可能包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑、或其它本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所熟知的其它材料。這種材料應(yīng)是無毒的，而且不應(yīng)干擾有效成分的效能。載體或其它材料的確切性質(zhì)可根據(jù)給藥途徑而定，例如口服、靜脈、皮膚或皮下、經(jīng)鼻、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)途徑。
用于口服的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉劑或液體形式。片劑可能包括一種固體載體，如明膠或一種佐劑。液體藥物組合物通常包括一種液體載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。生理鹽水、葡萄糖或其它糖溶液或乙二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇均可包括在內(nèi)。
對于靜脈、皮膚或皮下注射，或在病變部位注射，有效成分將是一種非腸道可接受的水溶液形式，這種水溶液不含致熱原、具有適當(dāng)?shù)膒H、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)熟練的技術(shù)人員都能夠制備合適的溶液，例如應(yīng)用等滲溶媒如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸鹽林格氏注射液。根據(jù)需要，防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑可包括在內(nèi)。
無論是多肽、抗體、肽、小分子，還是根據(jù)本發(fā)明的、將給予個體使用的其它藥物組合物，其施用優(yōu)選以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”(根據(jù)具體情況，盡管預(yù)防可被認(rèn)為是治療)，這種劑量足以在該個體顯示益處。實(shí)際用藥量、用藥的速度和療程，將取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重度。治療的處方，例如劑量的決定等，是全科醫(yī)師和其他醫(yī)生的職責(zé)，一般要考慮到所治療的疾病、病人個體的狀況、給藥部位、用藥方法以及全科醫(yī)師所知的其它因素。上述技術(shù)和方法的實(shí)例可見于Remington氏藥物科學(xué)，第16版，Osol,A(編)，1980.(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)組合物可單獨(dú)施用或與其它治療聯(lián)合施用，根據(jù)所治療的疾病，或同時施用或順序施用。診斷方法確定來自個體的生物樣本中分析物濃度的方法為本領(lǐng)域周知，而且在本發(fā)明中可被用來確定某一個體是否有P型IPG水平升高，從而確定是否具有或處于先兆子癇的危險。這種分析的目的可被用于診斷或預(yù)后，以幫助醫(yī)生確定先兆子癇的嚴(yán)重度或可能的病程，和/或盡可能使其治療得以完善。診斷方法實(shí)例在以下實(shí)驗(yàn)部分中描述。
優(yōu)選的診斷方法依賴于P型IPG的檢測，發(fā)現(xiàn)其水平升高與先兆子癇有關(guān)。這些方法中可使用生物樣本如血液、血清、組織樣本(尤其是胎盤)或尿液。
確定P型IPG濃度的測定方法典型的是采用結(jié)合劑，其結(jié)合位點(diǎn)能夠優(yōu)先于其它分子與一個或多個P型IPG特異性結(jié)合。結(jié)合劑的例子包括抗體、受體以及其它能夠特異地結(jié)合P型IPG的分子。為了方便，結(jié)合劑被固定在固體支持物上，例如在一處限定的位置上，以使在測定時，易于操作。
通常使樣本在適當(dāng)條件下與結(jié)合劑接觸，如此存在于樣本中的P型IPG能與組合劑結(jié)合。然后，便可應(yīng)用一種或數(shù)種顯影劑或試劑確定該結(jié)合劑之結(jié)合位點(diǎn)的占據(jù)百分?jǐn)?shù)。一般，顯影劑是被標(biāo)記的(例如用放射活性、熒光或酶標(biāo)記)，如此可應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)檢測它們。這樣，放射活性標(biāo)記可應(yīng)用閃爍計數(shù)器或其它放射計數(shù)裝置檢測，熒光標(biāo)記則應(yīng)用激光和聚焦顯微鏡，酶標(biāo)記則通過底物上的酶標(biāo)記作用檢測，一般是產(chǎn)生一種顏色變化。顯影劑可用于競爭性方法，其中顯影劑與分析物(P型IPG)競爭結(jié)合劑上的占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)，或者可用于非競爭性方法，其中被標(biāo)記的顯影劑與被結(jié)合劑結(jié)合了的分析物結(jié)合或與被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。兩種方法都可顯示出被分析物占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，因此通過例如與含有已知濃度分析物的樣本相比較得出樣本中分析物的濃度。實(shí)驗(yàn)描述A．實(shí)驗(yàn)1．A型IPG和P型IPG活性測定應(yīng)用特異性生物測定方法研究了尿和胎盤提取物中的P型IPG和A型IPG活性。P型IPG的測定應(yīng)用PDH磷酸酶活化法[11]。PDH復(fù)合物和PDH磷酸酶(金屬依賴型)是根據(jù)Lilley等人[11]的描述從牛心制備的，根據(jù)這些作者描述的兩階段方法分光光度變化進(jìn)行磷酸酶活化測定。這種測定被認(rèn)為是P型IPG的一個特征(參見Larner等人。[12])。A型IPG的測定是通過刺激脂肪生成，其方法是測量通過[U14C]葡萄糖摻入脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)中，脂肪細(xì)胞是根據(jù)Rodbell[13]的方法從附睪脂肪墊中分離的。已發(fā)現(xiàn)這種生物測定對A型IPG具有高度特異性。
加入的IPG與PDH磷酸酶活性刺激(P型IPG)和完整脂肪細(xì)胞的脂肪生成(A型IPG)之間得出直線相關(guān)性；這種相關(guān)性保持至少高達(dá)+250％的刺激作用。這些觀察資料為一個單位的制定及其用于比較不同組織和尿樣本的IPG產(chǎn)量提供了基礎(chǔ)。加入的IPG與反應(yīng)的百分變化之間的線性關(guān)系已被其他人(參見Lilley等人[11]及Newman等人[14]觀察到，盡管Asplin等人[15]在其對正常和糖尿病受試者尿中IPG的研究中沒有指出線性，這種效應(yīng)在用A型IPG(pH1.3級分)時尤為明顯。2．尿中P型IPG和A型IPG的提取根據(jù)Asplin等人[15]的描述提取尿液。最終級分凍干，貯存于-20℃。應(yīng)用時，將IPG級分重新懸浮于水中，立即測定，這樣10μl重新溶解的IPG相當(dāng)于10ml尿液。
考慮到不同組別的妊娠和先兆子癇受試者可能排泄大量、以及不同數(shù)量的IPG，以及為了確保樹脂的容量大大超過裝載量，進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)以確定樹脂與起始尿體積的最佳比率。高達(dá)每18g樹脂100ml尿液時回收量呈線性。在本研究中，保持80ml尿液對18g樹脂的比率，以備IPG含量的變化。3．胎盤的準(zhǔn)備在初步研究中，取2個正常胎盤并按如下處理(ⅰ)第一個胎盤在分娩后40分鐘內(nèi)收集，冷凍鉗夾組織樣本，在固體CO2中貯存和運(yùn)送。
(ⅱ)第二個胎盤在分娩后的30分鐘時收集，立即冷凍鉗夾一個15g的樣本。剩余的一分為二，一半保存在室溫下，另一半貯存在冰中。在1、3和5小時后，從兩個樣品中分別取10g樣本，冷凍鉗夾并按上述方法處理。
這些樣本貯存于-80℃，直到提取。4．胎盤中肌醇磷酸聚糖的提取提取步驟包括在液氮中粉碎冷凍組織(5g)，然后用50mM甲酸在100℃提取3分鐘。離心后的上清液級分用活性炭(10mg/ml)處理，再次離心。將活性炭上清液通過一個微孔濾器，用水稀釋5倍，然后用氨水調(diào)至pH6。離心后，將提取物加入15gAG1-X8中，置0℃過夜。然后將樹脂移至柱中，先后用40ml水和40mlpH3的HCl沖洗。P型IPG用100mlpH2.0的HCl洗脫，A型IPG用100mlpH1.3的HCl洗脫。提取物用氨水調(diào)至pH4，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5ml，然后移至較小的試管中，凍干。使用前一直將其以這種狀態(tài)在-20℃貯存。這一提取步驟是根據(jù)Nestter等人[16]描述的方法。
不同組織肌醇磷酸聚糖含量的巨大差異[9]，促使以下初步檢查(ⅰ)在P型IPG和A型IPG的離析和分離中使用的相對于樹脂重量的最佳胎盤組織重量，以及(ⅱ)在生物測定系統(tǒng)中使用的分離組分的量，以確保測定落入劑量-反應(yīng)曲線的線性部分。
業(yè)已明確，使用含18ml樹脂的柱子，當(dāng)胎盤樣本少于0.3g時可回收最大的P型IPG活性(圖9和10)，以及當(dāng)如此獲得的P型IPG重懸于100μl水中時，最終測定是最可靠的，其中1或2μl水用于PDH磷酸酶活化系統(tǒng)的測定中。在這些條件下，獲得了高達(dá)+300％的刺激作用，而且反應(yīng)在所給定的參數(shù)范圍內(nèi)是線性的。當(dāng)使用的胎盤重量超過0.3g,P型IPG的產(chǎn)量(按每克提取物計算)急劇下降，這或是由于同時提取了一種強(qiáng)有力的抑制物，或是由于存在一些競爭樹脂上可用的結(jié)合位點(diǎn)的材料。
正如在大鼠脂肪細(xì)胞刺激脂肪生成所證實(shí)的那樣，沒有檢測到A型IPG活性。從胎盤中制備了6份不同的pH1.3提取物，檢測了4份提取物(全部一式三份)。同時對大鼠肝進(jìn)行的平行提取產(chǎn)生的值是1.92單位/g，而且同時測定的胰島素標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的刺激作用超過基線+258％。5．結(jié)果的表示IPG的一個單位被定義為在測試系統(tǒng)的基線水平引起50％活化的量。
尿中IPG的產(chǎn)量根據(jù)三種不同的基礎(chǔ)表示(ⅰ)10μl最終尿液提取物(Col1)對測試系統(tǒng)的刺激百分比，允許與Asplin等人[15]的資料進(jìn)行直接比較。
(ⅱ)每1mmol肌酸酐IPG的單位數(shù)。
(ⅲ)在24小時采集的尿液樣本中得到的IPG單位數(shù)；即在妊娠期每日總排泄量。
結(jié)果以均數(shù)±SEM表示，其評價根據(jù)對應(yīng)的配對樣本，選擇在妊娠期、產(chǎn)次和年齡上相匹配的受試者，或根據(jù)對非參數(shù)資料的Mann-Whitney秩檢驗(yàn)。6．實(shí)驗(yàn)設(shè)計被研究的10名先兆子癇和妊娠糖尿病婦女，每人都與一名正常的婦女對照受試者在妊娠期(±13天)、產(chǎn)次(0,1-3,4+)和年齡(±4歲)上匹配。妊娠期范圍在先兆子癇組為26～37周，在糖尿病妊娠組為31～38周。正常的育齡非妊娠婦女包括在內(nèi)是為了評價妊娠本身對肌醇磷酸聚糖尿排泄的影響。
在先兆子癇中肌醇磷酸聚糖的變化與病情的嚴(yán)重相關(guān)。
尿液肌酸酐、尿素、Na+、K+、Ca++、蛋白質(zhì)和體積/24小時。
血液肌酸酐、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(肝酶標(biāo)志)、血小板計數(shù)。
生物資料年齡、妊娠齡、產(chǎn)次、血壓、出生體重、胎盤重量。R．結(jié)果1．從胎盤中分離的肌醇磷酸聚糖的穩(wěn)定性來自第一個胎盤的材料中P型IPG產(chǎn)量非常高，沒有發(fā)現(xiàn)A型IPG活性。這個胎盤是從分娩室拿到后立即冰凍鉗夾的。
來自第二個胎盤的即時樣本中的活性明顯減少，但仍然含有大約7單位活性/克。來自該胎盤的樣本在室溫貯存1、3或5小時后，全部沒有P型IPG活性。在冰上貯存1小時的樣本與立即冰凍鉗夾的樣本相比，大約喪失了一半活性，而貯存3或5小時的樣本產(chǎn)量均不是1單位活性/克。結(jié)果斷定，在未經(jīng)處理的組織中，即使在0℃IPG也是高度不穩(wěn)定的。2．足月分娩胎盤中的肌醇磷酸聚糖人胎盤、人肝和大鼠肝中提取的P型IPG和A型IPG的數(shù)值，單位/克組織，見表1所示。胎盤中P型IPG非常高的數(shù)值顯而易見。
胎盤中出現(xiàn)非常高的P型IPG是與這種推定的胰島素介質(zhì)在該組織中對類固醇生成的已知功能相一致的，而且是與所報道的P型IPG在活化糖原合成酶磷酸酶中的作用相一致的[16,17]。進(jìn)一步，作為第一種近似估計，可以認(rèn)為妊娠時尿中P型IPG增加，無論是在正常妊娠、糖尿病或先兆子癇受試者中，都來源于胎盤。因此，P型IPG濃度和24小時日排泄量的測定可能是這種介質(zhì)在胎盤生成的一種指示。
對先兆子癇和正常胎盤組織的對比研究證實(shí)，在先兆子癇胎盤中P型IPG增加2.7倍(參見表5)。
來自被研究的全部6個胎盤的pH1.3級分不能刺激大鼠脂肪細(xì)胞的脂肪生成，這可能說明胎盤A型IPG具有高度組織特異性，以及胎盤A型IPG具有非常?；墓δ?。3．先兆子癇和糖尿病尿中的肌醇磷酸聚糖先兆子癇或妊娠糖尿病和對照受試者尿中肌醇磷酸聚糖的濃度和每日總排泄量顯示于表2。結(jié)果以10μlP型IPG(pH2.0)或A型IPG(pH1.3)對生物測定系統(tǒng)產(chǎn)生的刺激作用表示，以允許同Asplin等人[15]的資料相比較。結(jié)果也用單位/mmol肌酸酐和24小時日排泄量的單位表示。最顯著的差異見于先兆子癇組中的P型IPG，它比匹配的對照組高2～3倍。與相同妊娠期的對照組相比，糖尿病沒有引起尿中肌醇磷酸聚糖的顯著差異。顯示先兆子癇、糖尿病和對照組數(shù)值范圍的個體值見圖1A、B。
本觀察結(jié)果中存在一個有趣的差異，即先兆子癇和糖尿病非妊娠對照組與妊娠對照組的受試者相比，P型IPG濃度和每日總排泄量較低(參見表2)。這些差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
在妊娠婦女中僅先兆子癇組顯示P型IPG顯著增加，而在非妊娠組中P型IPG較低，這一引人注目的結(jié)果提供了證據(jù)表明，先兆子癇與這種肌醇磷酸聚糖的生成之間有關(guān)聯(lián)。
所有的妊娠受試者與非妊娠對照相比P型IPG值升高，而且胎盤本身具有非常高的內(nèi)源性P型IPG濃度(參見表5)，本觀察結(jié)果強(qiáng)烈提示尿P型IPG增加來源于胎盤。
先兆子癇受試者及其匹配對照與正常非妊娠受試者相比具有較高的P型IPG排泄率，如果將此與胎盤對尿P型IPG的作用等同起來(表2)，那么先兆子癇的影響就更加突出了，就所有的表達(dá)方式而言，先兆子癇的值比先兆子癇對照“為先兆子癇組而設(shè)的對照”高出大約5～6倍(表3)。當(dāng)對A型IPG進(jìn)行類似計算時，這一解釋更得到加強(qiáng)。在這種情況下，沒有“過量的”A型IPG可歸因于胎盤的存在，這一結(jié)果與本研究不能證實(shí)這種組織中A型IPG的存在(參見表1)是一致的。還有，數(shù)值在產(chǎn)后降低，如圖6所示。
記錄在表2和圖1C,D中尿A型IPG唯一的顯著差異是，當(dāng)結(jié)果以單位/mmole肌酸酐表示時，先兆子癇受試者數(shù)值升高。在這種情況下，A型IPG的24小時排泄量未見差異。4．非妊娠受試者的肌醇磷酸聚糖這項(xiàng)研究中的10名非妊娠受試者中包括5名服用避孕藥片者，而且為了確定激素背景改變是否會影響肌醇磷酸聚糖的狀況，這兩個亞組予以分別考慮。這些資料見圖2所示，從中可看出，有一定證據(jù)表明服避孕藥片組P型IPG產(chǎn)量較高。每個亞組中的受試者數(shù)太少，不能據(jù)此得出確鑿結(jié)論，然而結(jié)果提示擴(kuò)大這一觀察是值得的。
在一個獨(dú)立的項(xiàng)目中，對在Middlesex醫(yī)院門診部就診的男性糖尿病受試者IPG的變化進(jìn)行研究，其中納入了一組正常男性。將那項(xiàng)研究的資料與本研究中正常非妊娠女性的資料比較，得出一個有趣的結(jié)果雖然兩組的P型IPG/mmol肌酸酐相似，但A型IPG在正常女性尿樣本中顯著增高達(dá)5～6倍(表4)。P型IPG/A型IPG比值有顯著差異，婦女為0.6，而男子為3.1。5．肌醇磷酸聚糖與妊娠期隨著接近妊娠結(jié)束，許多參與葡萄糖代謝的胎盤酶活性降低，胎盤糖原含量減少[5,18-20]，考慮到這一證據(jù)，對本資料在尿肌醇磷酸聚糖方面進(jìn)行檢查，就采取樣本的妊娠期而言有所不同，在26～37周之間。
盡管由于妊娠早期的樣本數(shù)量較少以及26周時一個非常高的值可能加權(quán)，這些資料的解釋需謹(jǐn)慎，但某些趨勢是顯而易見的。
妊娠期與先兆子癇受試者尿P型IPG之間有顯著相關(guān)性(r=0.609；P＜0.05)(圖3A),P型IPG的最高值見于第三個三月期的開始，先兆子癇和年齡匹配的對照組的數(shù)值在35～37周期間非常接近。在糖尿病或正常對照組沒有見到這樣的相關(guān)性(參見圖3B)。此外，尿A型IPG與妊娠期之間也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。
在本研究中，在妊娠26～37周期間的不同階段進(jìn)行了單一24小時尿收集。先兆子癇組及其匹配對照之間尿P型IPG的差異是否反映了在先兆子癇受試者細(xì)胞的相對不成熟[4,21]，以及隨著接近妊娠結(jié)束P型IPG的生成自然減少，或者在先兆子癇組，P型IPG值顯著升高是否就是先兆子癇嚴(yán)重程度的一個特異性標(biāo)志物，均是可供推測的。不同妊娠期尿中P型IPG的可能變化這一問題，尚有待通過對同一受試者在妊娠期間定期間隔的尿IPG的測定來回答。6．尿肌醇磷酸聚糖與先兆子癇標(biāo)志物6.1 P型IPG與先兆子癇標(biāo)志物聯(lián)系先兆子癇的標(biāo)志物對排泄的P型IPG進(jìn)行檢查，包括尿蛋白質(zhì)、血漿丙氨酸天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和血壓，已知它們在先兆子癇時都升高，以及血小板計數(shù)降低。
這些不同的標(biāo)志物與先兆子癇受試者P型IPG/mmole肌酸酐的相關(guān)性見圖4A型IPGC所示。概況起來，這些結(jié)果顯示(ⅰ)尿蛋白質(zhì)-與P型IPG正相關(guān)，P＜0.01。
(ⅱ)丙氨酸天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶-正相關(guān)，P＜0.05。
(ⅲ)血小板計數(shù)-與P型IPG負(fù)相關(guān)，P＜0.05。6.2 A型IPG與先兆子癇標(biāo)志物從表2看出，A型IPG在先兆子癇受試者中呈上升趨勢，盡管這種趨勢只有在以A型IPG/mmol肌酸酐為基礎(chǔ)時才有顯著性，而且不如P型IPG明顯。盡管在一個10名受試者的樣本中現(xiàn)有較小的差異，使得由此結(jié)果得出的結(jié)論僅是臨時性的，但發(fā)現(xiàn)增加的A型IPG與收縮期血壓之間存在正相關(guān)(P＜0.05)。這一觀察結(jié)果也許得到另一項(xiàng)關(guān)于31名糖尿病男性受試者的研究中發(fā)現(xiàn)的平行相關(guān)性的支持，其中A型IPG與升高的血壓之間存在明確的相關(guān)。然而，很有可能的是，在所有的先兆子癇受試者血壓受到嚴(yán)格控制，掩蓋了本研究中IPG與血壓之間可能的根本聯(lián)系。C．討論肌醇磷酸聚糖在調(diào)節(jié)葡萄糖和糖原代謝及類固醇生成方面作為胎盤中信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分可能是特別重要的，這種可能性源于以下證據(jù)(ⅰ)這一類的胰島素介質(zhì)能從胎盤質(zhì)膜[22]和冷凍鉗夾的完整胎盤組織(表1)中分離出；(ⅱ)P型IPG活化糖原合成酶磷酸酶和丙酮酸脫氫酶磷酸酶[6,7,11,17]；(ⅲ)發(fā)現(xiàn)肌醇磷酸聚糖在人胎盤類固醇生成的調(diào)節(jié)上是一種信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[16,23]。
本結(jié)果清楚地顯示，人胎盤是P型IPG一個特別豐富的來源，而且非妊娠和妊娠組之間的差異提供有力證據(jù)表明，在正常妊娠和先兆子癇尿中含量升高來源于胎盤。對胎盤樣本的直接分析證實(shí)了這一點(diǎn)。先兆子癇組尿中P型IPG超出匹配的對照組，極顯著的2～3倍升高，這一差異在妊娠早期更為顯著(圖3A)，證明與先兆子癇的標(biāo)志物相關(guān)(圖4A型IPGC)。此外，P型IPG升高可解釋在先兆子癇胎盤中糖原明顯積累(圖解1)。
有假設(shè)認(rèn)為，在先兆子癇和糖尿病中，不同的機(jī)制參與胎盤中的糖原積累(參見圖解1)。與先兆子癇相反，沒有證據(jù)說明妊娠糖尿病受試者與其匹配對照相比尿中P型IPG升高，在這種狀況中糖原積累增加可能與這種組織中葡萄糖和葡萄糖6-磷酸增加有關(guān)，正如Shafrir等人[5,24]所證實(shí)的那樣。正如這些作者所指出的那樣，葡萄糖和葡萄糖6-磷酸都是糖原合成酶活化劑，因而糖原積累增加與母體高血糖有關(guān)。在這方面，糖尿病中的胎盤與糖尿病中的腎臟反應(yīng)有某種類似，后者的葡萄糖和葡萄糖6-磷酸含量升高，而且也積累糖原。因此，兩種組織在糖尿病中都顯示出葡萄糖過度利用的特征[25]。
盡管本結(jié)果顯示先兆子癇標(biāo)志物與P型IPG的濃度和日排泄量之間有密切相關(guān)性，但我們不知道這是‘原因’還是‘結(jié)果’。有可能的是，在先兆子癇血漿中P型IPG的循環(huán)濃度也是增加的。如果實(shí)驗(yàn)資料證實(shí)了這一假設(shè)，那么就可以提出這個問題一個能活化旁分泌和自分泌信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的介質(zhì)循環(huán)水平的升高，是否可能會影響其它組織和內(nèi)分泌器官的功能。
被廣泛認(rèn)為在先兆子癇中功能異常[3]的內(nèi)皮細(xì)胞與高水平的P型IPG接觸，可能在胎盤中P型IPG生成與全身作用之間的關(guān)聯(lián)中是關(guān)鍵性的。肌醇磷酸聚糖看來有自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)功能，影響胎盤類固醇生成[16]、豬卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)胰島素-依賴性孕酮合成[23]、FSH和HCG對顆粒細(xì)胞的刺激[26]。牛腎上腺細(xì)胞ACTH信號傳導(dǎo)[27]、TSH對甲狀腺細(xì)胞的刺激[28]、IGF1對BALB/C3T3顆粒細(xì)胞的刺激[29]、轉(zhuǎn)化生長因子B對軟骨細(xì)胞的作用[30]、以及人血小板活化[31]。
本研究一個特別有趣的方面是，6個胎盤及一個胎盤的多種樣本中明顯缺乏可提取的A型IPG[表1]?？商岢鲈S多解釋來。也許是A型IPG在第三個三月期時顯著減少，也許在生后和冷凍及提取前的胎盤中其較不穩(wěn)定，也許它具有高度組織特異性，在脂肪細(xì)胞測定系統(tǒng)中沒有活性，或者，更有趣的是，也許在胎盤中它的確非常少。與P型IPG截然不同，受A型IPG影響的酶包括許多以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化為中心的，包括腺苷酸環(huán)化酶和cAMP依賴性蛋白質(zhì)激酶抑制作用以及一種膜結(jié)合低KmcAMP磷酸二酯酶活化作用[6,7]。
可論證說明，胎盤基本上是一個單向系統(tǒng)，從母體轉(zhuǎn)移營養(yǎng)物至胎兒循環(huán)以及在糖原貯存和釋放中作為葡萄糖的緩沖系統(tǒng)。在肝臟中(糖酵解/糖原異生)和脂肪組織(脂肪生成/脂肪分解)見到的、受蛋白質(zhì)磷酸化循環(huán)調(diào)節(jié)的開/關(guān)及生物合成/降解循環(huán)，看來在胎盤功能中并不起主要作用[18-20]。在胎盤代謝的調(diào)節(jié)方面需要進(jìn)一步工作，以更好地解釋合成的調(diào)節(jié)以及肌醇磷酸聚糖的作用。
尿中P型IPG排泄增加，以及在先兆子癇中它來源于胎盤的可能性這些新的研究結(jié)果，為先兆子癇妊娠的合胞滋養(yǎng)層中糖原積累提出了一種機(jī)制。P型IPG的這些改變與先兆子癇綜合征嚴(yán)重度標(biāo)志物的相關(guān)性也提示，至少這種功能異常的一部分可能是由信號傳導(dǎo)系統(tǒng)水平過高引起的。表1．胎盤和肝臟P型IPG和A型IPG的產(chǎn)量取用重量(g) 計算單位(g) 取用重量(g) 計算計算P型IPG單位/g 單位/g(pH2.0) P型IPG A型IPG(pH2.0) (pH1.3)先兆子癇 對照人胎盤胎盤號胎盤號PE1JB 0.18 581 Con 8CA 0.34 266ND0.26 522 0.49 159ND0.47 242 1.05 47 ND1.03 81人肝臟 1.82 1.60(n=2)大鼠肝臟 2.60±0.22 2.6±0.12(n=13)ND-未測表2．先兆子癇或妊娠糖尿病及匹配對照受試者和非妊娠對照組尿中肌醇磷酸聚糖的濃度和每日總排泄量刺激P 型24小時日 刺激 A型IPG 24小時日 肌酸酐10μl尿 IPG 排泄量10μl尿 單位/mmol 排泄量(mmol/L)單位/ (單位) 肌酸酐 (單位)mmol肌酸酐先兆子癇組對照 94.130.5316 81.4 25.9 251 6.94(n=10) ±11.1 ±8.94 ±62 ±8.4 ±3.48 ±42 ±0.90先兆子癇 205 96.4854 102 48.5 407 4.79(n=10) ±43±29.2 ±318 ±8.4 ±6.98 ±+78±0.58** ** ** **妊娠糖尿病組對照 12938.537484.5 29.2 294 6.41(n=10) ±26 ±5.12 ±47 ±+13.5 ±5.5 ±57 ±0.53糖尿病 89.8 37.327582.1 34.6 253 5.94(n=10) ±11.0 ±7.64 ±48 ±+9.4±8.12 ±45 ±0.76非妊娠組(n=10) 68.2 18.818797.8 32.7 346 7.11±12.3 ±1.98 ±25 ±11.8±6.02 ±75 ±0.81結(jié)果用均數(shù)±SEM表示，每組10名受試者。先兆子癇和糖尿病組的對照受試者在妊娠期、產(chǎn)次和年齡上匹配；一個正常非妊娠組予以列出。資料表示為丙酮酸脫氫酶磷酸酶(P型IPG)的刺激百分率或脂肪生成(A型IPG)的刺激百分率(ⅰ)每單位體積的尿(10μl=10ml尿液)；(ⅱ)以IPG活性單位/mmol肌酸酐或(ⅲ)以24小時IPG活性單位總排泄量。1單位被定為在生物測定系統(tǒng)中引起50％增加的IPG量。統(tǒng)計學(xué)意義用Mann-Whitney檢驗(yàn)評價*,P,＜0.05:**,P,＜0.01表3．妊娠婦女包括糖尿病、先兆子癇(PET)及其匹配對照組尿P型IPG數(shù)量中胎盤部分的計算組別 P型IPG妊娠和非妊娠組的差異(單位/mmol肌酸酐)非妊娠組 18.8+1.98-妊娠組糖尿病組對照 38.5±+5.12+19.7±5.12糖尿病患者 37.3±7.64 +18.5±7.64比值D/C 0.970.94先兆子癇組對照 30.5±8.94 +11.7±8.94先兆子癇 96.4±29.2 +77.6±29.2比值PET/C 3.2 6.6據(jù)表2資料計算。每組含10個值；結(jié)果以均數(shù)±SEM表示。表4．正常非懷孕女性受試者和正常男性受試者尿中P型IPG和A型IPG含量P型IPGA型IPG IPGPIPAA單位/mmol肌酐女性(10) 18.8±1.9832.7±6.02 0.57未治療16.1±2.1429.5±6.02(5) 21.5±3.0143.4±10.5男性(27) 19.3±1.8 6.30±0.78 3.06P值，女性與男性比較 NS＜0.001男性的數(shù)值取自另一項(xiàng)對糖尿病和對照男性受試者尿中A型IPG和P型IPG的調(diào)查。表5．先兆子癇和正常妊娠受試者人胎盤和尿中的P型IPG。
先兆子癇對照 PE/C胎盤[1] 單位/g 單位/gP型IPG 81±11(5) 30±6(4)**2.7尿[2]單位/24小時單位/24小時P型IPG 854±318(10) 316±62(10)**2.7表6．胎盤糖原含量及糖原合成酶活性[3]。
先兆子癇 對照 PE/C絨毛膜絨毛-糖原含量(μg/g組織)1300 570 2.3STB微泡-糖原含量(μg/mg蛋白質(zhì))223 25 9.7STB微泡-糖原合成酶(單位/mg蛋白質(zhì))1323 83 16[1]非匹配胎盤樣本[2]妊娠齡和產(chǎn)次匹配的尿樣本[3]資料取自Arkwright,Rademacher,Dwek,Reaman＇(1993)臨床研究雜志，(J.Clin.Invest.)91:2744-2753P型IPG活化丙酮酸脫氫酶磷酸酶和糖原合成酶磷酸酶。1單位P型IPG活性被定義為引起PDH磷酸酶50％刺激的量。值為均數(shù)±SEM；Fisher氏P值以**P＜0.01表示。表7先兆子癇尿中IPG含量產(chǎn)前與產(chǎn)后的比較狀態(tài) 肌酸酐 尿 肌酸酐 總排泄量(mmol/L 單位/L 單位/mmolP型IPG產(chǎn)前 6.58±0.86 632±112 98.9±12.1850±105產(chǎn)后 5.78±0.64 406±5170.8±12.2747±127配對tNS NS ****A型IPG產(chǎn)前 149±23.2 26.2±5.6 234±60產(chǎn)后 148±19.2 30.4±6.5 286±66配對t NS NSNSn=9參考文獻(xiàn)在此提到的參考文獻(xiàn)特全部引入作為參考。
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權(quán)利要求
1．一種P型IPG拮抗劑在用于先兆子癇治療藥物的制備中的用途。
2．權(quán)利要求1的用途，其中P型IPG拮抗劑具有以下生物學(xué)特性(a)抑制P型IPG從胎盤中釋放；(b)降低胎盤源性P型IPG的水平；和/或，(c)減弱胎盤源性P型IPG的效應(yīng)。
3．權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的用途，其中P型IPG拮抗劑是一種抗P型IPG抗體或結(jié)合蛋白質(zhì)。
4．權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的用途，其中藥物被施用于與對照受試者相比P型IPG水平升高的病人。
5．前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的用途，其中P型IPG升高的水平比對照受試者中的水平約高2倍以上。
6．一種藥物組合物，其包括與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合使用的P型拮抗劑。
7．一種診斷病人先兆子癇的方法，該方法包括測定取自病人的生物樣本中的P型IPG水平。
8．權(quán)利要求7的方法，其中P型IPG的水平是應(yīng)用一種測試P型IPG生物學(xué)活性的試驗(yàn)來測定的。
9．權(quán)利要求8的方法，其中P型IPG的水平是在一種測量由P型IPG活化丙酮酸脫氫酶磷酸酶的試驗(yàn)中測定的。
10．權(quán)利要求7的方法，其中P型IPG的水平是應(yīng)用一種能特異性結(jié)合P型IPG的結(jié)合劑來測定的。
11．權(quán)利要求10的方法，該方法包括以下步驟(a)將一種取自病人的生物樣本與一種其上固定了結(jié)合劑的固體支持物接觸，該結(jié)合劑具有對一種或多種P型IPG特異的結(jié)合位點(diǎn)；(b)將固體支持物與一種標(biāo)記的顯影劑接觸，這種顯影劑能夠與未被占用的結(jié)合位點(diǎn)、已結(jié)合的P型IPG或被占用的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；以及。(c)檢測在步驟(b)中特異性結(jié)合的顯影劑標(biāo)記，以獲得一個代表樣本中P型IPG水平的值。
12．權(quán)利要求11的方法，該方法還包括以下步驟(d)將在步驟(c)中得出的值與對照受試者的P型IPG水平相關(guān)聯(lián)，以確定是否病人具有升高的P型IPG水平。
13．權(quán)利要求10至12中任何一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合劑是一種抗P型IPG抗體。
14．權(quán)利要求7至13中任何一項(xiàng)的方法，其中P型IPG升高的水平比對照受試者中的水平約高2倍以上。
15．權(quán)利要求7至14中任何一項(xiàng)的方法，其中樣本是血液、血清、組織或尿樣本。
16．一種篩選P型IPG拮抗劑的方法，該方法包括(a)在一種測定P型IPG生物學(xué)特性的試驗(yàn)中，在使這種P型IPG能與候選拮抗劑競爭的條件下，使一種侯選拮抗劑與一種P型IPG接觸；(b)測定這種P型IPG的生物學(xué)特性；以及，(c)選擇降低P型IPG生物學(xué)活性的侯選拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于先兆子癇診斷與治療的材料和方法,尤其涉及P型肌醇磷酸聚糖(IPG)在先兆子癇發(fā)生中的作用。公開的內(nèi)容包括:通過測定P型IPG水平來診斷先兆子癇的方法,以及P型IPG拮抗劑在治療先兆子癇中的應(yīng)用,此外還包括一種篩選P型IPG拮抗劑的方法。
文檔編號A61K45/00GK1235556SQ97199318
公開日1999年11月17日 申請日期1997年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月11日
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