專利名稱：一種預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用血管和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)通路上的重要酶基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)體外預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重、妊娠高血壓綜合癥以及先兆子癇和子癇等妊娠不良結(jié)局，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生殖生育健康是涉及母嬰健康、家庭幸福和人口社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的世界性問題。妊娠期間發(fā)生先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)(Preterm)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(Uterus GrowthRetardation，UGR)和出生低體重(Low Birth Weight，LBW)、以及妊娠高血壓綜合癥(pregnancy induced hypertension syndrome，PIHs)和其重度臨床表現(xiàn)的先兆子癇和子癇等三大妊娠不良結(jié)局，是損害圍產(chǎn)期母子健康、影響孕產(chǎn)婦和新生兒、嬰兒死亡和相關(guān)疾患地的最常見和最主要的原因。在孕前、孕中早期預(yù)防最常見和主要的生殖健康問題，對(duì)提供圍產(chǎn)期母嬰健康水平意義十分重要。
早產(chǎn)(Preterm delivery)指在妊娠28-37足周(196-258日)之間終止而分娩者。先兆早產(chǎn)指在妊娠28-37周之間出現(xiàn)臨產(chǎn)前兆，伴有宮頸管展平和宮口擴(kuò)張。伴有見紅和胎膜早破的早產(chǎn)一般較難控制，而一旦出現(xiàn)宮口擴(kuò)張，頸管展平，則往往發(fā)展至早產(chǎn)分娩。全國2002～2003年早產(chǎn)兒回顧調(diào)查表明，77所城市醫(yī)院一年6179名新生兒中，產(chǎn)科出生的早產(chǎn)發(fā)生率7.8％，住院病人中早產(chǎn)兒占19.7％，性比1.67∶1。胎齡32-36周占63.5％。出生低體重(＜1500g)占32.3％。早產(chǎn)的高危因素依次為母親流產(chǎn)史(36.8％)、多胎(20.1％)、胎膜早破(19.8％)和妊高癥(12.6％)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組，中國城市早產(chǎn)兒流行病學(xué)初步調(diào)查報(bào)告，中國當(dāng)代兒科雜志，2005，7(1)25-28其他引發(fā)早產(chǎn)的臨床常見因素還有母親的急性感染性疾病、生殖器異常和胎兒本身的疾病。約30％的早產(chǎn)無明顯原因。
低出生體重指足月出生的新生兒體重低于2500克。極低出生體重兒＜1500克。早產(chǎn)和低出生體重兒是圍產(chǎn)兒死亡和疾病的主要原因。低出生體重兒發(fā)病率為4.52％(476/10522)，各年間沒有明顯變化，其中早產(chǎn)發(fā)生率達(dá)到一半(53.57％)，足月產(chǎn)和過期產(chǎn)分別為36.13％和10.29％。王剛琴，袁蜀豫，出生體重兒發(fā)生的相關(guān)因素分析與結(jié)局，中華現(xiàn)代婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2006，3(1)14臨床觀察發(fā)現(xiàn)，低出生體重的發(fā)病因素與早產(chǎn)、胎膜早破、妊娠高血壓綜合征、多胎妊娠等有關(guān)。既往早產(chǎn)次數(shù)越多，本次妊娠發(fā)生早產(chǎn)的可能越大。第一次妊娠分娩新生兒體重≤1.5kg的產(chǎn)婦，第二次妊娠發(fā)生早產(chǎn)的機(jī)會(huì)為50％。
妊娠期女性人群高血壓最常見的是妊娠期高血壓綜合癥(簡(jiǎn)稱妊高癥)。孕前有原發(fā)性高血壓者，定義為慢性高血壓合并妊娠。孕前血壓正常，孕中期才開始血壓升高，定義為妊娠高血壓綜合癥。妊高癥多發(fā)生在妊娠20周后至產(chǎn)后2周，發(fā)展為重度妊高癥，則為先兆子癇(Preeclampsia)和子癇(Eclampsia)。我國參照WHO的建議分類標(biāo)準(zhǔn)，1983年制定了現(xiàn)行分類法(見表1)余振球等主編，《實(shí)用高血壓學(xué)》科學(xué)出版社，1998年第二版，609-23頁表1.妊娠高血壓綜合癥分類

注血壓如不符合以上標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，則以其收縮壓或舒張壓之高者為標(biāo)準(zhǔn)，例如血壓為150/110或170/100均按重度妊高癥計(jì)之。
妊高癥是孕產(chǎn)婦人群特有的一種全身性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為水腫、高血壓、蛋白尿三大癥候群?；颊甙橛蓄^痛、眼花、甚至抽搐、昏迷。妊高癥總體發(fā)病率為5-15％，我國的發(fā)病率為9-10％。我國妊高癥科研協(xié)作組90年代370萬人群調(diào)查顯示，妊高癥平均發(fā)病率9.2％，輕中重度先兆子癇和子癇的發(fā)病率分別為4.7％、2.6％、1.7％和0.2％，慢性高血壓合并妊娠僅為0.2％全國妊高癥科研協(xié)作組，全國妊高癥流行病學(xué)調(diào)查，中華婦產(chǎn)科雜志，1991，2667-70。妊娠婦女患有妊娠高血壓綜合征、特別是伴有慢性，使胎兒子宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩、低氧血癥、酸中毒、早產(chǎn)、新生兒低出生體重；還可使母親出現(xiàn)子癇、腦出血、胎盤早剝、彌漫性血管內(nèi)凝血、肝出血、腎衰、肺水腫、中風(fēng)，甚至危及生命。調(diào)查表明，輕度先兆子癇隨診病人，早產(chǎn)率顯著高于普通人群，達(dá)13-54％。驚厥和胎盤早剝發(fā)生率分別為0.2％和1％，胎兒或新生兒死亡率約1％，胎兒生長(zhǎng)遲緩出現(xiàn)率5-13％。
妊娠不良結(jié)局的病因深層機(jī)制尚不清楚。既往研究已知，妊娠婦女患有妊娠高血壓綜合征、特別是伴有慢性，是引起早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的重要因素之一。目前認(rèn)為，妊高癥最具特征性的病理改變是子宮-胎盤單位缺血缺氧和全身廣泛小血管內(nèi)皮損傷。子宮-胎盤缺血可能是妊高癥及發(fā)生先兆子癇的起始環(huán)節(jié)，胎盤血灌注不足導(dǎo)致其代謝改變，釋放某種因子進(jìn)入外周血循環(huán)，引起廣泛血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼而導(dǎo)致血管收縮痙攣、凝血系統(tǒng)功能變化、體液重新分流；可能是妊高癥臨床表現(xiàn)及其多器官功能障礙，以及由妊高癥進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局的早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重相關(guān)病理機(jī)制的基礎(chǔ)。有報(bào)道，先兆子癇病人的HELLP綜合癥(溶血、肝酶升高、血小板計(jì)數(shù)下降)和妊娠34周前母嬰病死率明顯增加。另有研究提示，妊娠期濫用中樞神經(jīng)興奮劑可卡因，造成局部的麻醉和縮血管作用，可致離體胎盤強(qiáng)烈收縮，加強(qiáng)一種緩激酞誘導(dǎo)的縮血管物的作用，可明顯降低胎兒血供，而致缺氧，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩。妊娠期間生活過度緊張或有嚴(yán)重生活事件打擊，可導(dǎo)致早產(chǎn)。由此提示了，子宮-胎盤缺血和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可能多組妊娠不良結(jié)局的共有的重要深層病因機(jī)制線索。
要發(fā)現(xiàn)并早期預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)、以及宮內(nèi)發(fā)育遲緩或低出生體重等妊娠不良結(jié)局，早期發(fā)現(xiàn)高危婦女人群給予預(yù)防和治療，目前在內(nèi)在病因尚不完全清楚情況下，早期識(shí)別高危人群，目前仍依賴于臨床流行病的一些危險(xiǎn)因素。如年輕初孕婦、高齡初產(chǎn)婦、有妊高癥或先兆子癇病、或先兆早產(chǎn)、或低出生體重史、高體重指數(shù)者，家族高血壓、腎炎、或糖尿病病史者，多胎妊娠、羊水過多、葡萄胎患者，經(jīng)濟(jì)條件差，營養(yǎng)不良，重度貧血者；妊娠期心理社會(huì)壓力大，對(duì)妊娠恐懼、精神過分緊張或受刺激者，生活衛(wèi)生狀況差，伴有急性或慢性生殖系統(tǒng)炎癥；母親本人為低出生體重兒、早產(chǎn)兒，或有慢性高血壓病史、糖尿病、凝血異常和脂代謝異常者。但這些指標(biāo)還不夠敏感和特異。寒冷季節(jié)、氣壓升高時(shí)妊娠不良結(jié)局的發(fā)病也會(huì)增多。
既往研究提示，妊高癥、早產(chǎn)和低出生體重等妊娠不良結(jié)局都稱為復(fù)雜遺傳疾病，是環(huán)境與遺傳共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病特征，都有家族遺傳傾向。有妊高癥家族史的孕婦要比無家族史者發(fā)病率高8倍，表明孕婦對(duì)妊高癥的易感性具有遺傳特性王志堅(jiān)，余艷紅。妊娠高血壓綜合癥合并胎兒生長(zhǎng)受限胎盤組織血管細(xì)胞粘附因子1的表達(dá)。中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2003；675-7。
妊娠不良結(jié)局都傾向于多基因遺傳，確切的遺傳基礎(chǔ)尚不十分清楚。目前研究較多發(fā)病相關(guān)基因有1、調(diào)節(jié)血壓和體液量的易感基因血管緊張素原基因(angiotensinogen，AGT)、Ag-II 1型受體基因(angiotensin I receptor，AT-1)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因(angiotensin-converting enzyme，ACE)；2、血栓形成的易感基因凝血因子V leiden突變、亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate，MTHFR)、凝血酶原基因、凝血酶原調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)；3、與內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)的基因一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide sythase gene，eNOS)；4、參與脂質(zhì)代謝的易感基因脂蛋白脂肪酶基因(lipoprotein lipase gene，LPL)、載脂蛋白E基因(apolipoprotein E，apo E)；5、與免疫相關(guān)的基因人類白細(xì)胞抗原(HLA)易感基因、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因和啟動(dòng)子；6、與線粒體相關(guān)的易感基因細(xì)胞色素C氧化酶和長(zhǎng)鏈-3-羥乙酰-輔酶A脫氫酶。7、印跡基因。
疾病相關(guān)的候選基因多態(tài)性是疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體差異性的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。功能基因組學(xué)是基于的DNA檢測(cè)疾病發(fā)生相關(guān)候選基因多態(tài)性手段。妊高癥易感基因的遺傳特征，還表現(xiàn)為單核苷酸點(diǎn)變異形成人群中在基因多態(tài)性，即不同個(gè)體間在基因水平上的單核苷酸變異特征。生物學(xué)通路上重要酶基因上SNP突變，可以是無意義的、隱性的，也可能會(huì)造成重要酶活性和整個(gè)生物學(xué)功能改變，甚至影響整個(gè)生物學(xué)通路功能，直接與臨床個(gè)體發(fā)病差異有關(guān)。據(jù)估算，平均每1000對(duì)基因堿基會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP，而兩個(gè)無關(guān)個(gè)體間大約有300萬個(gè)SNP。這種個(gè)體間遺傳學(xué)上的差別造成的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)差異可以達(dá)上百倍之多。如對(duì)一些疾病相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)在患病人群中進(jìn)行SNP檢測(cè)，能夠預(yù)測(cè)患者發(fā)生某一特定疾病特征的可能程度，從而為疾病診斷提供新的輔助依據(jù)。另外，還可幫助認(rèn)識(shí)疾病或其某癥狀的發(fā)生和控制機(jī)制。
妊高癥易感基因的遺傳特征，還可以幫助推測(cè)與妊高癥相關(guān)的染色體片段。目前已發(fā)現(xiàn)與妊高癥相關(guān)的染色體片段包括6號(hào)染色體；17號(hào)染色體(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)；21號(hào)染色體(超氧化物歧化酶基因)；3號(hào)染色體(血管緊張素I型受體)Brought PF.What is the place of genetics in the pathogenesis of preeclampia.BiolNeonate，1999，76325-330。
2004年6月30日授權(quán)公告的專利(授權(quán)公開號(hào)CN 1155722C；發(fā)明名稱孕前基因報(bào)警診斷試劑盒及其檢測(cè)方法)中所謂的報(bào)警基因包括了N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因，可用于在孕前診斷子代是否會(huì)發(fā)生神經(jīng)管畸形。
為了克服臨床預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局依賴臨床經(jīng)驗(yàn)、靈敏和特異指標(biāo)低下之不足，需要利用生物樣本的遺傳標(biāo)記特征信息，建立一種預(yù)測(cè)妊娠不良的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，幫助提高預(yù)測(cè)效率。這將有助于更早期有效保護(hù)妊娠不良結(jié)局的高危人群，減少臨床不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，降低醫(yī)療治療的盲目性和高成本，提高圍產(chǎn)期母嬰生活質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種早期、安全、方便、快速且靈敏的、通過測(cè)定生物樣本與體外預(yù)測(cè)與妊娠不良結(jié)局，包括先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重、以及妊娠高血壓綜合癥和子癇等，共同相關(guān)的脯氨酸羧肽酶基因上的多態(tài)性位點(diǎn)基因型，可在孕前預(yù)測(cè)母親妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，降低臨床預(yù)防和控制妊娠不良結(jié)局上的盲目性和滯后性，改善公共衛(wèi)生和臨床輔助診斷水平，早期發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異和高危人群，減少孕產(chǎn)期間的妊娠不良結(jié)局發(fā)病率、并發(fā)癥和病死率。該方法還可用于研制預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，采取以下技術(shù)方案本發(fā)明的預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，通過測(cè)定來自受試者的生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)的多態(tài)性位點(diǎn)E112D的基因型來預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)當(dāng)基因型為112EE純合野生型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較低；當(dāng)基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較高。
脯氨酸羧肽酶是血管和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)通路上的關(guān)鍵酶，PRCP E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)和妊娠不良結(jié)局的發(fā)生有關(guān)，具有顯著預(yù)測(cè)效果。具體的，當(dāng)(1)所述PRCP位點(diǎn)基因型為112EE純合野生型時(shí)，預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較低；(2)所述的PRCP位點(diǎn)基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較高；
(3)當(dāng)妊娠婦女合并慢性高血壓且PRCP基因型為112EE雜合型時(shí)，上述預(yù)測(cè)效果更加明顯，即預(yù)測(cè)PRCP EE純合野生型基因型的無高血壓的妊娠婦女發(fā)生妊娠不良結(jié)局概率，低于伴有慢性高血壓的妊娠婦女。
(4)預(yù)測(cè)PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型的妊娠婦女，若合并慢性高血壓時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率極高于其他PRCP基因型的妊娠婦女。
在本發(fā)明的上述方法中，所述預(yù)測(cè)的妊娠不良結(jié)局包括先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重、妊娠高血壓綜合癥以及先兆子癇和子癇等妊娠不良結(jié)局，這些不同階段的妊娠不良結(jié)局，可能在子宮-胎盤缺血和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷上具有共同的發(fā)病發(fā)展的病理機(jī)制。
上述PRCP的多態(tài)性位點(diǎn)E112D(rs2298668)的基因型除了直接進(jìn)行測(cè)定外，還可以通過測(cè)定該位點(diǎn)附件與之存在連鎖不平衡的其它多態(tài)性位點(diǎn)基因型來確定，這樣的多態(tài)性位點(diǎn)包括無義突變位點(diǎn)、錯(cuò)義突變位點(diǎn)以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點(diǎn)。
在本發(fā)明中，可利用多態(tài)性分型寡核苷酸來檢測(cè)上述多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。優(yōu)選地，所述多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，用于擴(kuò)增含有所述多態(tài)性位點(diǎn)的脯氨酸羧肽酶基因片斷，它能夠檢測(cè)血管和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵酶基因PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型，和/或(2)用于檢測(cè)血管和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵酶基因PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型的寡核苷酸探針，其能特異地與血管和內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)通路的關(guān)鍵酶基因PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交。優(yōu)選地，所述寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為17-50個(gè)核苷酸。
由此，本發(fā)明預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，具體可包括以下步驟1)利用上述多態(tài)性分型寡核苷酸檢測(cè)來自個(gè)體的樣品中所述關(guān)鍵酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型；2)建立含有檢測(cè)樣品PRCP多態(tài)性位點(diǎn)基因型的預(yù)測(cè)模型；3)根據(jù)所述多態(tài)性位點(diǎn)基因型預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，以及合并伴隨慢性高血壓者發(fā)生妊娠不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。
在本發(fā)明所述的方法中，可用于預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的的多態(tài)性位點(diǎn)至少包含上述PRCP的E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)，還可以進(jìn)一步包含其它的與與之存在連鎖不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)，包括無義突變位點(diǎn)、錯(cuò)義突變位點(diǎn)以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點(diǎn)。
在本發(fā)明所述的方法中，測(cè)定所述多態(tài)性位點(diǎn)的基因型可以使用選自以下的差異核酸分析技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR-序列特異寡核苷酸法、測(cè)序法、PCR-序列特異性引物法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、寡核苷酸連接分析、熒光能量共振轉(zhuǎn)移的檢測(cè)法、生物芯片、核酸芯片、質(zhì)譜技術(shù)、基因掃描、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、酶或化學(xué)錯(cuò)配切割法、Taqman生物檢測(cè)方法。其中優(yōu)選的檢測(cè)方法為PCR、PCR-RFLP、Taqman技術(shù)、生物芯片、核酸芯片或者試劑盒。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、測(cè)序法、Teqman基因掃描技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的方法。Taqman技術(shù)是一種運(yùn)用熒光技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的方法。生物芯片是指采用廣島原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影相機(jī)(CCD)對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量或質(zhì)量。
本發(fā)明對(duì)于位點(diǎn)基因型的檢測(cè)方法的說明并非是對(duì)于檢測(cè)方法的限定，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測(cè)本發(fā)明的多態(tài)性位點(diǎn)基因型來預(yù)測(cè)以妊娠不良結(jié)局發(fā)生率為核心的其他風(fēng)險(xiǎn)均屬于本發(fā)明內(nèi)容，還可以進(jìn)一步包括采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測(cè)本發(fā)明的多態(tài)性位點(diǎn)功能型基因型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或者表達(dá)產(chǎn)物的差異間接反映相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點(diǎn)來預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率的事例。
在本發(fā)明所述的方法，其中所述來自個(gè)體的生物樣品選自如外周全血、外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清等的血液樣品，尿液、唾液等體液樣品，口腔粘膜試子、毛發(fā)、皮膚、活檢組織等組織樣品，組織樣分泌物、排泄物樣本，培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選的，所述樣品為血液樣品，任選的，所述樣品可以預(yù)先進(jìn)行純化，例如分離總核酸。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一種重要的血管緊張素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先發(fā)現(xiàn)。PRCP在pH等于5時(shí)，具有最佳的酶活性，當(dāng)pH升高到7時(shí)酶活性只剩下最大時(shí)的20-50％。PRCP屬于絲氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在內(nèi)皮細(xì)胞的外膜表達(dá)。PRCP是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)和激肽-緩激肽系統(tǒng)(KKS)之間的調(diào)節(jié)劑，是血管和內(nèi)皮功能的另一種重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。PRCP降解血管緊張素II，使得具有強(qiáng)烈縮血管活性的血管緊張素II轉(zhuǎn)變成具有舒血管活性的血管緊張素1-7，參與RAAS系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。此外，PRCP還是一種獨(dú)立于XIIa之外的血漿激肽酶原激活物，能夠使得激肽酶原激活生成緩激肽。由于PRCP既能降解血管緊張素II，增加血管緊張素1-7的生成又能促進(jìn)緩激肽的釋放，兩種作用都能使得NO的生成增多，進(jìn)而舒張血管，起到降低血壓的作用。
脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人類11號(hào)常染色體的長(zhǎng)臂上(11q14)，編碼一種溶酶體酶，作用是酶切如血管緊張素II、血管緊張素III和緩激肽等肽類與脯氨酸連接的C末端氨基酸。位于其外顯子上的一個(gè)A-C的堿基突變，導(dǎo)致了第112位氨基酸(Glu)由谷氨酸變成天門冬氨酸(Asp)。我們研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性位點(diǎn)與PRCP的mRNA的表達(dá)及活性等有關(guān)。鑒于PRCP對(duì)RAAS系統(tǒng)和血壓的重要調(diào)節(jié)作用，該功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)很有可能會(huì)影響到ACEI類藥物的藥物作用。但利用該位點(diǎn)預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的方法和試劑盒尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
常見的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)可以位于基因的外顯子部位、內(nèi)含子部位和非編碼區(qū)部位，優(yōu)選為外顯子部位，尤其是能改變編碼的氨基酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)。
本發(fā)明涉及的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)并早期預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)、以及宮內(nèi)發(fā)育遲緩或低出生體重等妊娠不良結(jié)局，早期發(fā)現(xiàn)高危婦女人群給予預(yù)防和治療，在內(nèi)在病因尚不完全清楚情況下，早期識(shí)別高危人群，目前仍依賴于臨床流行病的一些危險(xiǎn)因素。但這些指標(biāo)還不夠敏感和特異。既往研究提示，妊高癥、早產(chǎn)和低出生體重等妊娠不良結(jié)局都稱為復(fù)雜遺傳疾病，是環(huán)境與遺傳共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病特征，都孕婦對(duì)妊娠不良結(jié)局的易感性具有遺傳特性家族遺傳傾向。
妊娠不良結(jié)局的病因深層機(jī)制尚不清楚。既往研究已知，妊娠婦女患有妊娠高血壓綜合征、特別是伴有慢性高血壓，是引起早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的重要因素之一。目前認(rèn)為，妊高癥最具特征性的病理改變是子宮-胎盤單位缺血缺氧和全身廣泛小血管內(nèi)皮損傷。子宮-胎盤缺血可能是妊高癥及發(fā)生先兆子癇的起始環(huán)節(jié)，胎盤血灌注不足導(dǎo)致其代謝改變，釋放某種因子進(jìn)入外周血循環(huán)，引起廣泛血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼而導(dǎo)致血管收縮痙攣、凝血系統(tǒng)功能變化、體液重新分流；可能是妊高癥臨床表現(xiàn)及其多器官功能障礙，以及由妊高癥進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局的早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重相關(guān)病理機(jī)制的基礎(chǔ)。有報(bào)道，先兆子癇病人的HELLP綜合癥(溶血、肝酶升高、血小板計(jì)數(shù)下降)和妊娠34周前母嬰病死率明顯增加。另有研究提示，妊娠期濫用中樞神經(jīng)興奮劑可卡因，造成局部的麻醉和縮血管作用，可致離體胎盤強(qiáng)烈收縮，加強(qiáng)一種緩激酞誘導(dǎo)的縮血管物的作用，可明顯降低胎兒血供，而致缺氧，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩。妊娠期間生活過度緊張或有嚴(yán)重生活事件打擊，可導(dǎo)致早產(chǎn)。由此提示了，子宮-胎盤缺血和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可能多組妊娠不良結(jié)局的共有的重要深層病因機(jī)制線索。
流行病學(xué)資料提示，妊娠不良結(jié)局有家族遺傳傾向，有妊高癥家族史的孕婦要比無家族史者發(fā)病率高8倍，表明孕婦對(duì)妊高癥的易感性具有遺傳特性，但目前該病確切的遺傳基礎(chǔ)還不十分清楚，能調(diào)節(jié)血壓、體液量、胎盤生長(zhǎng)、血栓形成、血管重鑄、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的基因都可能是妊高癥的易感基因。因此，建立能預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生相關(guān)遺傳特征的試劑盒，可能使識(shí)別妊娠不良結(jié)局的高危婦女的更早更準(zhǔn)確，使從進(jìn)入育齡妊娠到生產(chǎn)各期能夠盡早采取預(yù)防措施和處理措施，能最大限度減少發(fā)病率、并發(fā)癥和病死率，是挽救和治療妊娠不良結(jié)局的關(guān)鍵。
妊娠不良結(jié)局是一組多基因疾病。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotension system，RAAS)基因可能在妊娠不良結(jié)局的發(fā)病機(jī)制上是主要深層次的病因候選基因。RAAS是一種激素內(nèi)分泌系統(tǒng)，循環(huán)RAAS即腎臟來源的腎素，在外周血中使肝臟合成的血管緊張素原，轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素I，再在肺臟經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用，轉(zhuǎn)變成血管緊張素II(Ang II)；Ang II分泌到血液中，隨血流至遠(yuǎn)端靶器官(血管、心臟、腦、腎臟、腎上腺等)，與靶器官上的特異性受體結(jié)合，調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)和水電解質(zhì)平衡。很多外周靶器官(如血管、心臟、腦、腎臟、腎上腺、胎盤、子宮、卵巢、睪丸等)存在局部RAAS的成分。RAAS的主要成分包括腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素酶原、血管緊張素I、血管緊張素II和它們的受體，都存在于胎盤。
脯氨酸羧肽酶(PRCP)是一種重要的血管緊張素II降解酶。由Yang HYT等于1968年首先發(fā)現(xiàn)。PRCP在pH等于5時(shí)，具有最佳的酶活性，當(dāng)pH升高到7時(shí)酶活性只剩下最大時(shí)的20-50％。PRCP屬于絲氨酸蛋白酶家族，活性能被苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。大量研究表明，PRCP能在內(nèi)皮細(xì)胞的外膜表達(dá)。PRCP是RAAS和激肽-緩激肽系統(tǒng)(KKS)之間的調(diào)節(jié)劑，是血管和內(nèi)皮功能的另一種重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。PRCP降解血管緊張素II，使得具有強(qiáng)烈縮血管活性的血管緊張素II轉(zhuǎn)變成具有舒血管活性的血管緊張素1-7，參與RAAS系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。此外，PRCP還是一種獨(dú)立于XIIa之外的血漿激肽酶原激活物，能夠使得激肽酶原激活生成緩激肽。由于PRCP既能降解血管緊張素II，增加血管緊張素1-7的生成又能促進(jìn)緩激肽的釋放，兩種作用都能使得NO的生成增多，進(jìn)而舒張血管，起到降低血壓和減低血管內(nèi)皮細(xì)胞損害的作用，此外，在妊娠過程中可能細(xì)胞對(duì)胎盤局部和母親全身的供血和血壓調(diào)節(jié)或內(nèi)皮保護(hù)上。
脯氨酸羧肽酶(Prolylcarboxypeptidase，PRCP)基因于1993年被克隆，定位于人類11號(hào)常染色體的長(zhǎng)臂上(11q14)，編碼一種溶酶體酶，作用是酶切如血管緊張素II、血管緊張素III和緩激肽等肽類與脯氨酸連接的C末端氨基酸。位于其外顯子上的一個(gè)A-C的堿基突變，導(dǎo)致了第112位氨基酸由谷氨酸(Glu)變成天門冬氨酸(Asp)。我們研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性位點(diǎn)與PRCP的mRNA的表達(dá)及活性等有關(guān)。鑒于PRCP對(duì)RAAS系統(tǒng)和血壓的重要調(diào)節(jié)作用，該功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)很有可能會(huì)影響到ACEI類藥物的藥物作用。但與妊高癥、早產(chǎn)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的關(guān)系及其預(yù)測(cè)試劑方法尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
本發(fā)明依次發(fā)現(xiàn)并證明在綜合分析妊娠不良結(jié)局層面上，觀察妊娠分娩婦女中，PRCP 112DD純合突變型的比例(3％)在妊娠不良結(jié)局患者中比無妊娠不良結(jié)局的妊娠婦女比例明顯增高(21％)。經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP 112DD純合突變型基因型與PRCP 112EE純合野生型基因型的妊娠不良結(jié)局發(fā)生率的OR值為4(95％ CI1-12，p＝0.031)。結(jié)果提示PRCP基因可以預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的發(fā)生，PRCP E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的發(fā)生。
本發(fā)明依次發(fā)現(xiàn)并證明在各案分析先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)層面上，在妊娠婦女中，PRCP 112DD純合突變型的比例(3％)在先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)患者中比無先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)的妊娠婦女比例明顯增高(21％)。經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP 112DD純合突變型基因型與PRCP 112EE純合野生型基因型的先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)發(fā)生率的OR值為4(95％ CI1-12，p＝0.031)。結(jié)果提示PRCP基因可以預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)的發(fā)生，PRCP E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)的發(fā)生。
本發(fā)明依次發(fā)現(xiàn)并證明在各案分析胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重層面上，在妊娠婦女中，PRCP 112DD純合突變型的比例(3％)在胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重患者中比無先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)的胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重比例明顯增高(21％)。經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP 112DD純合突變型基因型與PRCP 112EE純合野生型基因型的胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重發(fā)生率的OR值為4(95％ CI1-12，p＝0.031)。結(jié)果提示PRCP基因可以預(yù)測(cè)胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的發(fā)生，PRCP E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以預(yù)測(cè)胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的發(fā)生。
本發(fā)明依次發(fā)現(xiàn)并證明在各案分析妊高癥和子癇層面上，在妊娠婦女中，PRCP 112DD純合突變型的比例(3％)在妊高癥和子癇患者中比無妊高癥和子癇的妊娠婦女比例明顯增高(21％)。經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP 112DD純合突變型基因型與PRCP 112EE純合野生型基因型的妊高癥發(fā)生率的OR值為4(95％ CI1-12，p＝0.031)。結(jié)果提示PRCP基因可以預(yù)測(cè)妊高癥的發(fā)生，PRCP E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以預(yù)測(cè)妊高癥的發(fā)生。
本發(fā)明以慢性高血壓進(jìn)行分層后進(jìn)一步相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與未合并慢性高血壓的PRCP 112EE純合野生型基因型的妊娠婦女相比較，慢性高血壓?jiǎn)为?dú)增加了11倍患妊高癥的風(fēng)險(xiǎn)，而PRCP E112D雜合型基因型妊娠婦女合并慢性高血壓增加了120倍患妊高癥的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果提示PRCP E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型可以預(yù)測(cè)妊娠婦女妊高癥的發(fā)生(見表2)，尤其對(duì)于合并慢性高血壓的妊娠婦女預(yù)測(cè)作用更加明顯。
應(yīng)用本發(fā)明成果，選擇PRCP作為妊娠不良結(jié)局的預(yù)測(cè)基因，增強(qiáng)了目前傳統(tǒng)開展的育齡婦女、孕產(chǎn)婦針對(duì)妊娠不良結(jié)局的預(yù)防水平和控制能力。便于社區(qū)婦女保健咨詢時(shí)和/或臨床醫(yī)生對(duì)初診孕婦通過測(cè)定PRCP基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型，為就診者更科學(xué)地提供預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局和高血壓防治的咨詢服務(wù)，發(fā)現(xiàn)和保護(hù)高危人群。


圖1是使用PCR-RFLP方法檢測(cè)PRCP基因的E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型的凝膠電泳圖。
圖2是使用Taqman方法檢測(cè)PRCP基因的E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型的熒光圖譜。
其中1——167bp片斷；2——101bp片斷； 3——66bp片斷；4——發(fā)出FAM熒光區(qū)域； 5——發(fā)出兩種熒光區(qū)域；6——發(fā)出VIC熒光區(qū)域。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1測(cè)定PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型并預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的發(fā)生(一)測(cè)定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法操作。
(a)在全血中加入30ml紅細(xì)胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置10分鐘，期間，搖動(dòng)數(shù)次，徹底裂解紅細(xì)胞；(b)于4℃、2000轉(zhuǎn)離心/分，10分鐘，去上清，將沉淀之白細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)震蕩器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，搖勻，加白細(xì)胞裂解液置15ml，混勻37℃水浴20分鐘后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在-20℃冰箱5分鐘，取出于4℃、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液倒入已加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動(dòng)數(shù)次，至DNA絮狀物析出；(d)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml已裝入75％乙醇的濾紙上，使液體揮發(fā)干；(e)加DNA水化液1.5ml，置搖床，搖動(dòng)過夜，備用；(f)DNA濃度的測(cè)定采用紫外分光光度法，分別測(cè)定260nm及280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下的OD值，以O(shè)D260nm×50所得值為DNA濃度。并以O(shè)D260nm/OD280nm比值估計(jì)DNA純度。
(2)使用Taqman方法檢測(cè)PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(a)用PCR儀擴(kuò)增PRCP功能基因多態(tài)位點(diǎn)及其側(cè)翼序列，在5μl PCR反應(yīng)體系中含有基因組DNA 10ng，2.5μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG(組成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，以優(yōu)化的緩沖液)，及0.90μM的正向引物，0.90μM的反向引物及兩段帶熒光報(bào)告集團(tuán)的等位基因特異性探針各0.25μM.
引物序列為正向引物5’GTTTGCCAAAAGGTTCAGTGACTT 3’(SEQ ID No.1)反向引物5’TCTCCATAGTATCGATGTTCAGCAAAC 3’(SEQ ID No.2)等位基因特異性探針的序列為VIC-5’CATAGCTTTCAGTTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.3)對(duì)應(yīng)于“T(或Glu)”等位基因，攜帶VIC熒光報(bào)告集團(tuán)。
FAM-5’ATAGCTTTCAGGTCCTCA 3’-NFQ(SEQ ID No.4)
對(duì)應(yīng)于“G(或Asp)”等位基因，攜帶FAM熒光報(bào)告集團(tuán)。
PCR反應(yīng)條件95℃10min，1個(gè)循環(huán)；92℃15s，60℃1min，50個(gè)循環(huán)。
(b)在ABI Primer 7900型熒光定量PCR儀上檢測(cè)熒光信息進(jìn)行基因型的鑒定將完成PCR反應(yīng)的PCR板放入7900型熒光定量PCR儀上，選用SDS 2.1軟件中“Allelic Discrimination”程序，進(jìn)行掃描與結(jié)果的判斷發(fā)出FAM熒光者的基因型為Asp/Asp純合子；發(fā)出VIC熒光者的基因型為Glu/Glu純合子；發(fā)出兩種熒光者的基因型為Asp/Glu雜合子。
(3)使用PCR和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測(cè)PRCPE112D多態(tài)性位點(diǎn)根據(jù)PRCP E112D基因序列設(shè)計(jì)PCR特異性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下條件進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。
引物序列正向引物5’ATGGTTTGCCAAAAGGTTCA 3’(SEQ ID No.5)反向引物5’TGTCACCAAAGGGGAGAGAC 3’(SEQ ID No.6)PCR反應(yīng)體系基因組DNA 15ng/μl，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 1.25mmol/L，10×buffer 1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，dH2O補(bǔ)足總體積至6.55μl。
PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性3min后；94℃變性45sec，62℃退火45sec，72℃延伸1sec，38個(gè)循環(huán)周期；最后72℃延伸7min。；得到167bp的擴(kuò)增片段。
酶切條件及體系(15μl)PRCP E112D位點(diǎn)PCR產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為167bp，總的酶切體系為15μl，其中PCR產(chǎn)物10ul，10×NEBuffer#2 1.5μl，AVaII內(nèi)切酶(其識(shí)別片斷為G/GWCC，其中W為A或T)4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃過夜。
基因型結(jié)果判定將DNA酶切后的產(chǎn)物點(diǎn)樣在2.5％瓊脂糖膠上，37℃酶切過夜后，在紫外燈下讀取膠圖并進(jìn)行基因型分析。個(gè)體基因型鑒定如下酶切片段為167bp，PRCP基因型為112EE(野生型)；酶切片段為167+101+66bp，PRCP基因型為112ED(雜合子)；酶切片段為101+66bp，PRCP基因型為112DD(純合子)。
(二)發(fā)生妊娠不良結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較高；基因型為112EE純合型時(shí)，預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較低。
當(dāng)妊娠婦女合并慢性高血壓時(shí)，上述預(yù)測(cè)效果更加明顯。即慢性高血壓的妊娠婦女的PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生率更高。
以上方法通過臨床驗(yàn)證，先將妊娠不良結(jié)局病人分為三組純合野生型組、雜合型組、純合突變型組。采用臨床流行病學(xué)病例對(duì)照方法，對(duì)三組人群進(jìn)行PRCP多態(tài)性位點(diǎn)基因型和妊娠不良結(jié)局總危險(xiǎn)性的相關(guān)分析。按是否伴隨慢性高血壓分層分析孕產(chǎn)婦發(fā)生妊高癥情況，結(jié)果表明(表2)在妊娠前無慢性高血壓、攜帶PRCP基因DD純合突變基因型的妊娠婦女中，妊娠不良結(jié)局發(fā)生比例較高(52.6％)，經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP DD純合突變型基因型，相對(duì)EE純合野生型基因型，OR值為2.7，95％CI為1.1-11.6，p＝0.035。
表2.PRCP基因E112D多態(tài)性基因型與妊娠不良結(jié)局危險(xiǎn)性的相關(guān)分析

*p＜0.05，**p＜0.0001；#對(duì)照組；§調(diào)整了性別、妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型(95％ CI95％可信區(qū)間)。
實(shí)施例2測(cè)定PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型并預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)的發(fā)生(一)測(cè)定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法操作。(同實(shí)施例1)(2)使用Taqman方法檢測(cè)PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(同實(shí)施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測(cè)PRCPE112D多態(tài)性位點(diǎn)(同實(shí)施例1)(二)發(fā)生先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)發(fā)生率較高；基因型為112EE純合型時(shí)，預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)發(fā)生率較低。
當(dāng)妊娠婦女合并慢性高血壓時(shí)，上述預(yù)測(cè)效果更加明顯。即慢性高血壓的妊娠婦女的PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)發(fā)生率更高。
以上方法通過臨床驗(yàn)證，先將先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)病人分為三組純合野生型組、雜合型組、純合突變型組。采用臨床流行病學(xué)病例對(duì)照方法，對(duì)三組人群進(jìn)行PRCP多態(tài)性位點(diǎn)基因型和先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)總危險(xiǎn)性的相關(guān)分析。按是否伴隨慢性高血壓分層分析孕產(chǎn)婦發(fā)生妊高癥情況，結(jié)果表明(表3)在妊娠前無慢性高血壓、攜帶PRCP基因DD純合突變基因型的妊娠婦女中，先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)發(fā)生比例較高(36.1％)，經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP DD純合突變型基因型，相對(duì)EE純合野生型基因型，OR值為1.6，95％CI為1.1-10.6，p＝0.041。
表3.PRCP基因E112D多態(tài)性基因型與先兆早產(chǎn)和早產(chǎn)危險(xiǎn)性相關(guān)分析

*p＜0.05，**p＜0.0001；#對(duì)照組；§調(diào)整了性別、妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型(95％ CI95％可信區(qū)間)。
實(shí)施例3測(cè)定PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型并預(yù)測(cè)宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重的發(fā)生(一)測(cè)定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法操作。(同實(shí)施例1)(2)使用Taqman方法檢測(cè)PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(同實(shí)施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測(cè)PRCPE112D多態(tài)性位點(diǎn)(同實(shí)施例1)(二)發(fā)生宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重發(fā)生率較高；基因型為112EE純合型時(shí)，預(yù)測(cè)宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重發(fā)生率較低。
當(dāng)妊娠婦女合并慢性高血壓時(shí)，上述預(yù)測(cè)效果更加明顯。即慢性高血壓的妊娠婦女的PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重發(fā)生率更高。
以上方法通過臨床驗(yàn)證，先將宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重病人分為三組純合野生型組、雜合型組、純合突變型組。采用臨床流行病學(xué)病例對(duì)照方法，對(duì)三組人群進(jìn)行PRCP多態(tài)性位點(diǎn)基因型和宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重總危險(xiǎn)性的相關(guān)分析。按是否伴隨慢性高血壓分層分析孕產(chǎn)婦發(fā)生妊高癥情況，結(jié)果表明(表4)在妊娠前無慢性高血壓、攜帶PRCP基因DD純合突變基因型的妊娠婦女中，宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重發(fā)生比例較高(47.4％)，經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP DD純合突變型基因型，相對(duì)EE純合野生型基因型，OR值為1.7，95％CI為1.2-11.2，p＝0.036。
表4.PRCP基因E112D多態(tài)性基因型與宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重危險(xiǎn)性相關(guān)分析

*p＜0.05，**p＜0.0001；#對(duì)照組；§調(diào)整了性別、妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型(95％CI95％可信區(qū)間)。
實(shí)施例4測(cè)定PRCP基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型并預(yù)測(cè)妊高癥和子癇的發(fā)生(一)測(cè)定PRCP基因的E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(1)提取宿主細(xì)胞的基因組DNA按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法操作。(同實(shí)施例1)(2)使用Taqman方法檢測(cè)PRCP基因的Glu112Asp(E112D)多態(tài)性位點(diǎn)基因型(同實(shí)施例1)(3)使用PCR和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測(cè)PRCPE112D多態(tài)性位點(diǎn)(同實(shí)施例1)(二)發(fā)生妊高癥和子癇風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)妊高癥和子癇發(fā)生率較高；基因型為112EE純合型時(shí)，預(yù)測(cè)妊高癥和子癇發(fā)生率較低。
當(dāng)妊娠婦女合并慢性高血壓時(shí)，上述預(yù)測(cè)效果更加明顯。即慢性高血壓的妊娠婦女的PRCP基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，預(yù)測(cè)妊高癥和子癇發(fā)生率更高。
以上方法通過臨床驗(yàn)證，先將妊高癥和子癇病人分為三組純合野生型組、雜合型組、純合突變型組。采用臨床流行病學(xué)病例對(duì)照方法，對(duì)三組人群進(jìn)行PRCP多態(tài)性位點(diǎn)基因型和妊高癥和子癇總危險(xiǎn)性的相關(guān)分析。按是否伴隨慢性高血壓分層分析孕產(chǎn)婦發(fā)生妊高癥情況，結(jié)果表明(表5)在妊娠前無慢性高血壓、攜帶PRCP基因DD純合突變基因型的妊娠婦女中，妊高癥和子癇發(fā)生比例較高(15.8％)，經(jīng)過矯正調(diào)整了妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、BMI等因素后，發(fā)現(xiàn)PRCP DD純合突變型基因型，相對(duì)EE純合野生型基因型，OR值為2.9，95％CI為1.2-10.1，p＝0.035。
攜帶PRCP基因EE基因型的孕婦，妊娠前伴有慢性高血壓者與不伴有慢性高血壓者相比，患妊高癥和子癇的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，OR值為8.8，95％CI為3.6-12.7；而妊娠前伴有慢性高血壓同時(shí)具有PRCP ED雜合基因型的孕產(chǎn)婦，患妊高癥和子癇的風(fēng)險(xiǎn)較EE基因型且不伴有慢性高血壓者更為顯著，OR值為138.。以上結(jié)果提示，PRCP E112D(rs2298668)多態(tài)性位點(diǎn)基因型和妊高癥和子癇發(fā)生有很顯著的預(yù)測(cè)關(guān)聯(lián)關(guān)系。
表5.PRCP基因E112D多態(tài)性基因型和慢性高血壓與妊高癥和子癇危險(xiǎn)性相關(guān)分析

*p＜0.05，**p＜0.0001；#對(duì)照組；§調(diào)整了性別、妊娠年齡、孕齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、吸煙、糖尿病、BMI、教育程度等因素。EE代表純合野生型；ED代表雜合型；DD代表純合突變型(95％CI95％可信區(qū)間)。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110> 安徽省生物醫(yī)學(xué)研究所<120> 一種預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法<130> JSP060090<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1
<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<400> 1gtttgccaaa aggttcagtg actt 24<210> 2<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<400> 2tctccatagt atcgatgttc agcaaac27<210> 3<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 3catagctttc agttcctca 19<210> 4<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 4atagctttca ggtcctca 18<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工序列
<400> 5atggtttgcc aaaaggttca20<210> 6<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 6tgtcaccaaa ggggagagac20
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，通過測(cè)定來自受試者的生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)E112D的基因型來預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)當(dāng)基因型為112EE純合野生型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較低；當(dāng)基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較高。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述受試者為慢性高血壓合并妊娠婦女，當(dāng)其基因型為112EE純合野生型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率高于無高血壓的妊娠婦女；當(dāng)其基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率明顯高于無高血壓的妊娠婦女。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品、組織樣分泌物、排泄物樣本、培養(yǎng)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述血液樣品選自外周全血、外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清；所述體液樣品選自尿樣、唾液；所述組織樣品選自口腔粘膜試子、毛發(fā)、皮膚、活檢組織。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的妊娠不良結(jié)局包括先兆早產(chǎn)、早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、低出生體重、妊娠高血壓綜合癥以及先兆子癇和子癇。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中測(cè)定脯氨酸羧肽酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)E112D的基因型的方法選自以下的差異核酸分析技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR-序列特異寡核苷酸法、序列測(cè)定、PCR-序列特異性引物法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、寡核苷酸連接分析、熒光能量共振轉(zhuǎn)移的檢測(cè)法、生物芯片、核酸芯片、質(zhì)譜技術(shù)、基因掃描、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、酶或化學(xué)錯(cuò)配切割法、以及Taqman生物檢測(cè)方法。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過利用多態(tài)性分型寡核苷酸檢測(cè)生物樣品中脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型，其中，所述的多態(tài)性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，用于擴(kuò)增含有所述多態(tài)性位點(diǎn)的脯氨酸羧肽酶基因片斷，和/或(2)用于檢測(cè)所述脯氨酸羧肽酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)基因型的寡核苷酸探針，其能特異地與含有所述脯氨酸羧肽酶基因多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為15-50個(gè)核苷酸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸羧肽酶基因的多態(tài)性位點(diǎn)E112D的基因型是通過該多態(tài)性位點(diǎn)附件與之存在連鎖不平衡的其它多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來確定的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的其它多態(tài)性位點(diǎn)包括無義突變位點(diǎn)、錯(cuò)義突變位點(diǎn)以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過測(cè)定個(gè)體脯氨酸羧肽酶基因的E112D多態(tài)性位點(diǎn)基因型來預(yù)測(cè)妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法當(dāng)基因型為112EE純合野生型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較低；當(dāng)基因型為112ED雜合型或者112DD純合突變型時(shí)，妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較高。本發(fā)明可在孕前預(yù)測(cè)母親妊娠不良結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，可幫助醫(yī)生早期識(shí)別妊娠不良結(jié)局的高危婦女，從進(jìn)入育齡、妊娠到分娩各期盡早采取預(yù)防措施、醫(yī)療隨診和適時(shí)分娩，減低臨床預(yù)防和控制妊娠不良結(jié)局上的盲目性和滯后性，盡可能降低妊娠不良結(jié)局引起的孕產(chǎn)期間的發(fā)病率、并發(fā)癥和病死率。
文檔編號(hào)A61B10/00GK101063678SQ200610011838
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者邢厚恂, 張巖, 王濱燕, 李志平, 吳滌, 王曉斌, 臧桐華, 徐希平 申請(qǐng)人:安徽省生物醫(yī)學(xué)研究所