專利名稱：：診斷先兆子癇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記。本發(fā)明還涉及診斷和治療先兆子癇的方法。
背景技術(shù)：
：先兆子癇或稱妊娠誘發(fā)高血壓(PIH)是在產(chǎn)科文獻(xiàn)中報(bào)道幾率約為全部妊娠中7-10%的最常見的醫(yī)學(xué)上的妊娠病癥(Roberts等(1993)In:FetalMedicalReview.Ed.Dunlop,EdwardArnoldPublishers,London)。先兆子癇的定義/診斷包括升高的血壓、尿蛋白和水腫。先兆子癇分為輕度或嚴(yán)重，其中一種或多種的下列標(biāo)準(zhǔn)可以表明嚴(yán)重的先兆子癇，包括1、當(dāng)在間隔六小時(shí)對靜止的病人測量時(shí)兩次或多次160收縮期或110舒張期的血壓、2、蛋白尿?yàn)?g/24h、3、尿產(chǎn)量為400mL/24h、4、大腦/視覺障礙、5、心口痛、6、肺水腫、7、受損的肝功能、禾口8、血小板減少。它還被稱為先兆子癇毒血癥并且其更嚴(yán)重的形式驚厥是和廣泛的抽搐或癲癇發(fā)作相關(guān)。這個(gè)幾率根據(jù)使用的診斷標(biāo)準(zhǔn)和研究的人群在2-35%的范圍內(nèi)(Sibai,(1991),ClinObstetGynecol,34:27-34)。先兆子癇的幾率在未經(jīng)產(chǎn)婦、在有PIH家族史的婦女、在有過PIH的婦女、在糖尿病婦女及在妊娠中有增大的滋養(yǎng)層腫塊的婦女中顯著增加(Zhouetal.,(1992),J.ClinInvest,91:950-960)。PIH是世界上孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一，并且是在美國、英國和威爾士胎兒和新生兒發(fā)病率和死亡率的重要原因(Kaimitz等(1985),ObstetGynecol,65:605-612;DepartmentOfHealth:ReportonconfidentialenquiriesintomaternaldeathsintheUnitedKingdom.1985-1987,HMSO.London;1991)。分析由世界衛(wèi)生組織(WHO)收集的大量、主要以醫(yī)院為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)顯示PIH是多個(gè)發(fā)展中國家如亞洲、非洲、拉丁美洲和加勒比海的10-15%孕產(chǎn)婦死亡的原因。研究表明如果治療在妊娠的早期開始，PIH在一些病例中可以被阻止(Uzan等(1992),JGynecolObstetReprod,21:35-318)。但是介入治療安全的不確定性，如低劑量阿司匹林，仍然對未經(jīng)選擇的人群是使用的障礙(Mass6等(1993),AmJObstetGynecol,169:501-508;Roberts(1994),JNurseMidwifery,39(2):70-90)并且因此直到血壓已經(jīng)開始升高治療通常還沒有開始。早期鑒別有高危性PIH發(fā)生的婦女仍然不可靠。家族和醫(yī)學(xué)史不能鑒別大多數(shù)繼發(fā)PIH的個(gè)體并且直到現(xiàn)在或單獨(dú)使用或組合使用的候選臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測也顯示了不良的予卿』價(jià)值(Robertssupra)。因此Dionne和同事在1994年陳述"用在預(yù)測先兆子癇的篩查測試中具有顯著良好的預(yù)測價(jià)值的新標(biāo)記的研制將在防止這種妊娠并發(fā)癥上具有重要的影響(ClinBiochem,27(2):99-103)。診斷已確定的PIH產(chǎn)科醫(yī)生和婦科醫(yī)生美國學(xué)院(ACOG)所建議的診斷已確定的妊娠誘導(dǎo)的高血壓的臨床標(biāo)準(zhǔn)是收縮壓M40mmHg:舒張壓〉90mmHg;收縮壓的增加〉30mmHg;當(dāng)上述的任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在間隔六小時(shí)或更長至少出現(xiàn)兩次時(shí)，舒張壓的增加"5mmHg。出現(xiàn)外周水腫或蛋白尿(定義為在間隔至少六小時(shí)兩次或更多的隨機(jī)尿樣中>300mg/24h或>lg/L)也需要診斷。在疊加了已有的慢性高血壓、血管和腎病的有PIH的婦女中診斷尤其艱難(Pas6&Christianson(1976),AmJObstetGynecol,125:740-745;Sidal(1988)，AmJObstetGynecol，159:1-5;Sandovaletal.,(1994)，GinecolObstetMex，61:283-289)。浮腫和異常體重增加被用于PIH的診斷。但是浮腫在約80%的妊娠中出現(xiàn)，并且一般的水腫和過度的體重增加在正常的妊娠中常見(Dexter&Weiss(1941),Boston.LittleBrown:22;Fadiganetal.,(1994),AmFamPhysician,49:849-856)。蛋白尿的出現(xiàn)通常用隨機(jī)尿樣的浸漬片檢測。但是在隨機(jī)尿樣中的蛋白濃度有很大變化并且受幾種因素如污染(假陽性結(jié)果)、鍛煉(增加排泄)、低比重(假陰性)和高比重(假陽性)的影響(Gleicleretal.,(1986),AmJObstetGynecol,155:1011-1016;McEwan(1987),Jn:Hypertensioninpregnancy.Sharp&Symonds(eds),PerinatologyPress;63-67)。關(guān)于診斷需要的蛋白排泄程度和尿蛋白浸漬片的可靠性依舊有相當(dāng)大的爭論(Meyeretal"(1994),AmJObstetGynecol,170:137-141)。鑒別具有發(fā)生PIH高危個(gè)體的臨床標(biāo)準(zhǔn)目前沒有可靠的方法預(yù)測哪些婦女將發(fā)生先兆子癇。但是有比發(fā)生此病一般的危險(xiǎn)性更高的妊娠婦女群體。她們包括未經(jīng)產(chǎn)婦(primigravidae)、青少年或超過35歲的婦女、有多胎妊娠的婦女、有妊娠糖尿病的婦女、有慢性高血壓歷史或證據(jù)的婦女和前妊娠有高血壓的婦女。除未經(jīng)產(chǎn)婦，這組婦女有25%的幾率發(fā)生先兆子癇，但是只占10%的病例。未經(jīng)產(chǎn)婦占60%的病例，但是這些婦女只有1/6的幾率發(fā)生先兆子癇。其余的20%病例根本沒有危險(xiǎn)系數(shù)。仰臥加壓測試在十二個(gè)報(bào)告中被研究(Sidalsupra)，預(yù)測先兆子癇的靈敏度在8-93%范圍并且特異性在54-91%范圍。假陽性幾率高達(dá)90%。血管緊張素II灌輸測試(Chesley(1975)，JReprodMed,15:173-178)雖然有高的變化性、有假陽性測試的高發(fā)生率，具有卯-95%的靈敏度。此外該測試復(fù)雜而昂貴，不合適臨床使用。但是該測試在高血壓發(fā)病的數(shù)周前給出異常結(jié)果的事實(shí)表明該狀況的起始病理學(xué)變化在發(fā)生明顯的高血壓前的數(shù)周已經(jīng)出現(xiàn)。因此仍然有研制和建立能預(yù)測哪些婦女將發(fā)生先兆子癇的測試的雲(yún)西而女o
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)和未患有PIH的婦女相比出現(xiàn)妊娠誘導(dǎo)的高血壓(PIH)的妊娠婦女的血清中存在新的26.6Kd的多肽。研究表明有26.6Kd多肽出現(xiàn)的婦女比沒有這個(gè)多肽的婦女具有發(fā)生先兆子癇的更高風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明者進(jìn)一步確證該多肽可以作為發(fā)生先兆子癇的標(biāo)記。進(jìn)一步研究結(jié)果還表明該多肽是先兆子癇的標(biāo)記及對抗先兆子癇發(fā)生的治療試劑的潛在靶子。因此本發(fā)明的第一方面提供了發(fā)生先兆子癇的標(biāo)記，該標(biāo)記由在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的多肽構(gòu)成。在第二方面，本發(fā)明提供了從妊娠人類的孕婦樣品中檢測先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記的方法，該方法包括當(dāng)比較從未患先兆子癇的人類樣品中發(fā)現(xiàn)的約26Kd的多肽時(shí)，在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定孕婦樣品中約26.6Kd多肽的存在。本發(fā)明的第三方面提供了診斷和/或預(yù)測妊娠人類中先兆子癇(PE)的方法，該方法包括與從未患先兆子癇的人類樣品中的約26Kd的多肽相比，在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定在孕婦樣品中約26.6Kd的多肽存在的方法。本發(fā)明的第四方面提供了在妊娠人類中檢測先兆子癇(PE)的診斷試劑盒，該試劑盒含有在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的作為陽性對照的多肽，該多肽已經(jīng)從患先兆子癇的妊娠人類中分離出來。在第五方面，本發(fā)明提供了可以選擇性結(jié)合到在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的多肽的抗體，該多肽己經(jīng)從患先兆子癇的妊娠人類中分離出來。在第六方面，本發(fā)明提供了在妊娠人類中先兆子癇的發(fā)生(development)和發(fā)展(progression)的抑制劑，其中所述抑制劑可以減少或去除來源于患先兆子癇或有發(fā)生先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的妊娠人類血清中存在的在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的多肽。優(yōu)選地，該抑制劑能減少26.6Kd多肽的表達(dá)水平。在第七方面，本發(fā)明提供了對在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的從患先兆子癇的妊娠人類血清中分離的多肽特異的抗體。在第八方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中檢測先兆子癇的方法，包括歩驟1)從哺乳動(dòng)物受試者獲得孕婦樣品；2)以從患先兆子癇的婦女血清中發(fā)現(xiàn)的26.6Kd的多肽標(biāo)記的抗體接觸樣品，形成抗體和26.6Kd的多肽標(biāo)記的復(fù)合物；并且3)檢測抗體-標(biāo)記復(fù)合物。在第九方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測治療先兆子癇有效性的方法，包括步驟1)對患先兆子癇的哺乳動(dòng)物受試者提供治療；2)從受試者獲得至少一個(gè)治療后孕婦樣品；并3)檢測治療后樣品中先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記的出現(xiàn)或缺失。在第十方面，本發(fā)明提供了檢測從受試者獲得的孕婦樣品中的先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記出現(xiàn)的試劑盒，包括1)獲得一定量的孕婦樣品的方法；2)可以附著能和先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記形成復(fù)合物的捕獲性抗體的介質(zhì)；并3)檢測先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記和捕獲性抗體的復(fù)合物的分析方法。在第十一方面，本發(fā)明提供了檢測哺乳動(dòng)物受試者的先兆子癇狀況的競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，包括用于檢測受試者的孕婦樣品中先兆子癇的26.6Kd多肽的出現(xiàn)，對該多肽標(biāo)記特異的第一抗體。圖1顯示用十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分辨和用銀染觀看的半純化的PIH(P)和正常妊娠(N)血清蛋白。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從已知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)計(jì)算得來，它們是(A)磷酸化酶B110kD;牛血清白蛋白，84kD;(C)卵白蛋白，47kD;(D)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)，33kD;(E)大豆胰蛋白酶抑制劑，24kD;(F)溶菌酶，16kD(從上到下)。圖2顯示用SDS-PAGE分辨的和用考馬斯染色觀看的半純化PIH(P)和正常孕婦(N)血清蛋白。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從已知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)[Biorad]計(jì)算得來，它們是(A)磷酸化酶B110kD;牛血清白蛋白，84kD;(C)卵白蛋白，47kD;(D)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)，33kD;(E)大豆胰蛋白酶抑制劑,24kD;(F)溶菌酶，16kD(從上到下)。圖3顯示用SDS-PAGE分辨的和用銀染觀看的半純化PIH(P)和正常孕婦(N)血清蛋白。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從已知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)[Biorad]計(jì)算得來，它們是(A)磷酸化酶B110kD;牛血清白蛋白，84kD;(C)卵白蛋白，47kD;(D)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)，33kD;(E)大豆胰蛋白酶抑制劑,24kD;(F)溶菌酶，16kD(從上到下)。圖4顯示用SDS-PAGE分辨的和用考馬斯藍(lán)染色觀看的半純化PIH(P)和正常孕婦(N)和妊娠誘導(dǎo)的高血壓婦女(H)的血清蛋白。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從己知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)[Biorad]計(jì)算得來，它們是(A)磷酸化酶B110kD;牛血清白蛋白，84kD;(C)卵白蛋白，47kD;(D)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)，33kD;(E)大豆胰蛋白酶抑制劑，24kD;(F)溶菌酶，16kD(從上到下)。圖5顯示在圖3中放大的膠，用于強(qiáng)調(diào)含有感興趣的分析物的膠上區(qū)域。樣品是用SDS-PAGE分辨的和用考馬斯藍(lán)染色觀看的半純化PIH(P)和正常孕婦(N)和妊娠誘導(dǎo)的高血壓婦女(H)的血清蛋白。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從已知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)[Biorad]計(jì)算得來，它們是(E)大豆胰蛋白酶抑制劑,24kD;(F)溶菌酶，16kD(從上到下)。圖6顯示用SDS-PAGE分辨的和用考馬斯藍(lán)染色觀看的半純化PIH(P)和正常孕婦(N)和妊娠誘導(dǎo)的高血壓婦女的血清蛋白(H)。對PIH特異的分析物被顯示(箭頭)。分子量從已知大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(S)[Biorad]計(jì)算得來，它們是(A)磷酸化酶B106kD;牛血清白蛋白，80kD;(C)卵白蛋白，49.5kD;(D)碳酸酐酶(牛紅細(xì)胞)，32.5kD;(E)大豆胰蛋白酶抑制劑，27.5kD;(F)溶菌酶，18.5kD(從上到下)。發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，需要知道的是本發(fā)明并非僅限于特定的實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、血清、培養(yǎng)基或方法，它們是可以變化的。還要知道本文使用的術(shù)語目的在于只是描述本發(fā)明的特定具體實(shí)施方式，而非是用于對權(quán)利要求限制。本文引用的所有公開案、專利案和專利申請案，無論是上文或下文的，都據(jù)此一并作為參考。但是本文上述公開案引用的目的在于描述和披露公開案中報(bào)道的規(guī)程和試劑，所述的規(guī)程和試劑可能用于本發(fā)明。這里也并非欲將本發(fā)明視為在先發(fā)明而早于這些公開。除另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)，它們在已有技術(shù)范圍內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述。見，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，由Sambrool(、Fritsch禾口Maniatis編車葺(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);DNA克隆，I和II冊(D.N.Glovered.,1985);寡核苷酸合成(M.J.Gaited.,1984);Mullis等U.S.Pat.No.4,683,195;核酸雜交(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);轉(zhuǎn)錄和翻譯(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);酶學(xué)方法(AcademicPress,Inc.,N.Y.);酶學(xué)方法，第154禾n155巻(Wuetal.eds.)，細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(MayerandWalker,eds.,AcademicPress,London,1987);實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊，I-IV巻(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986)。當(dāng)用在這里和在附加權(quán)利要求書中使用時(shí)必須要注明的是單數(shù)形式"a，""an，"和"the"包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文明確表示不是這樣。因此，例如，"一個(gè)診斷樣品"的參考包括這樣的樣品的復(fù)數(shù)，并且"一個(gè)抗體"的參考是一個(gè)或多個(gè)抗體的參考等等。除非另外定義，所有用在這里的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有通常被本發(fā)明所屬于的己知技術(shù)方法所理解的同樣意思。雖然任何相似或等同于這里描述的材料和方法可以用于實(shí)踐和檢測本發(fā)明，首選的材料和方法在現(xiàn)在被描述。本發(fā)明包含以下方面制備發(fā)生先兆子癇的標(biāo)記的本發(fā)明的26.6Kd多肽；制備編碼上述多肽或帶有和表達(dá)上述多核苷酸的重組載體；帶有上述載體的轉(zhuǎn)化體；產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)化體的方法；對抗本發(fā)明26.6Kd多肽的抗體；檢測多肽的方法；檢測編碼上述26.6Kd多肽的mRNA或多核苷酸；檢測先兆子癇的方法；檢測先兆子癇的診斷試劑盒；鑒別能從妊娠婦女血清中減少或去除本發(fā)明的26.6Kd多肽出現(xiàn)的治療劑的方法及在下文解釋的治療先兆子癇的方法。在后面的描述中，如果沒有說明，將理解為如基因重組技術(shù)、在動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中產(chǎn)生重組多肽、分子生物學(xué)方法、分離和純化表達(dá)的多肽的方法，分析和免疫學(xué)方法的技術(shù)在這個(gè)領(lǐng)域中熟知并且任何這樣的技術(shù)都可能被采用。在其廣泛的方面，本發(fā)明提供了先兆子癇的標(biāo)記。用在這里的術(shù)語"標(biāo)記"是指發(fā)生先兆子癇的標(biāo)記(也作為先兆子癇標(biāo)記提到)。標(biāo)記可以是任何標(biāo)記，如這里描述的出現(xiàn)在妊娠哺乳動(dòng)物血清中，優(yōu)選人類和傾向于發(fā)生先兆子癇的哺乳動(dòng)物的26.6Kd多肽。有效的先兆子癇標(biāo)記是典型的這里描述的26.6Kd多肽；但是標(biāo)記也可以是編碼26.6Kd多肽的mRNA或編碼同樣多肽的基因組DNA分子。像其他地方討論的，26.6Kd多肽可以從孕婦樣品中分離，其中多肽是在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd。在具體實(shí)施例中，先兆子癇標(biāo)記必要的包括在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的26.6Kd多肽。用在這里的術(shù)語"孕婦樣品"是指從妊娠的雌性哺乳動(dòng)物中提取的任何樣品。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物是妊娠的人類女性。可以用本發(fā)明的方法分析的孕婦的樣品可以經(jīng)藥簽，分流器等獲得或分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解這里公開的技術(shù)可以用在任何種類的孕婦樣品上。首選的孕婦樣品是骨髓、血漿、脊髓液、淋巴液、呼吸、腸和生殖泌尿道的皮膚的表面切片，眼淚、唾液、奶、血、全血、血清、血細(xì)胞、腫瘤和器官。更優(yōu)選的孕婦樣品是血清。一旦被提取，孕婦樣品可以直接分析或可以在測試前用例如濃縮或調(diào)節(jié)pH來處理。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，孕婦樣品是從懷疑患有先兆子癇或有發(fā)生先兆子癇高風(fēng)險(xiǎn)的病人血中獲得的血清。血清開始是用親和藍(lán)膠處理以去除主要的干擾化合物(例如白蛋白)。然后進(jìn)行孕婦樣品中先兆子癇標(biāo)記的檢測或定量。本發(fā)明的標(biāo)記的"檢測或定量"通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ò庖叻治龌蚍肿由飳W(xué)分析來完成。當(dāng)標(biāo)記是先兆子癇多肽時(shí)，上面的方法包括，例如，免疫分析如酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，螢光抗體技術(shù)，SDS-PAGE，Western印記法或免疫結(jié)構(gòu)染色法。當(dāng)先兆子癇標(biāo)記是多核苷酸如mRNA時(shí)，分析包括分子生物學(xué)分析，例如，Northern印記法，點(diǎn)印記法或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。mRNA可以用先兆子癇的標(biāo)記的多核苷酸或其片段作為探針或引物來檢測或定量。在具體實(shí)施方案中，"檢測或定量"是根據(jù)Laemmli,Nature,227:680-685,1970用5到20%的聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE完成。首選的是，梯度膠是有4%積層膠的15-23%或15-25%的聚丙烯酰胺梯度膠。一旦SDS-PAGE膠跑到了所需時(shí)間，它們用商品化的染料如溶于50%甲醇-10%乙酸的0.25%考馬斯亮藍(lán)R250(CBB)染色而顯示多肽條帶。本發(fā)明的26.6Kd多肽的出現(xiàn)或缺失可以容易地用對比已知的標(biāo)準(zhǔn)評估它的大小來實(shí)現(xiàn)。另外，在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的26.6Kd多肽的"檢測或定量"是通過Western印記法或EL1SA。像已有技術(shù)所理解的，這些技術(shù)都需要使用本發(fā)明的26.6Kd先兆子癇多肽的抗體。通過針對先兆子癇多肽或其片段的抗體，先兆子癇可以檢測或定量。結(jié)合本發(fā)明的26.6Kd多肽標(biāo)記的單克隆和多克隆抗體都在本發(fā)明的方法和試劑盒中有用。抗體可以用已知技術(shù)方法制備。為制備多克隆抗體，典型的全長26.6Kd多肽或其一部分或包含26.6Kd多肽一部分的多肽作為哺乳動(dòng)物的抗原。多肽本身和載體，例如，結(jié)合了牛血清白蛋白(BSA)的載體、匙孔威血藍(lán)素(KLH)或牛甲狀腺球蛋白(BTG)可以作為抗原。為了增加對抗原的免疫反應(yīng)，例如，可以給與完全弗羅因德佐劑(CFA)和不完全弗羅因德佐劑(IFA)。小鼠、兔子、山羊或倉鼠可以作為免疫的哺乳動(dòng)物。產(chǎn)生多克隆抗體的已知技術(shù)方法可以在Lane等Antibodies:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)(ColdSpringHarberLaboratoryPress)中找到。簡短的，在第一次免疫后，哺乳動(dòng)物在間隔1到2周用3至1.0次合適的抗原免疫。首選的抗原劑量是每個(gè)動(dòng)物每次50-100嗎。當(dāng)肽被使用時(shí)，共價(jià)結(jié)合到合適的載體上的肽首選作為抗原。作為抗原的肽可以通過遺傳工程或肽合成儀合成。免疫的三到七天后，收集血液并且，對抗原的血清反應(yīng)可以通過ELISA測量，見例如，Igaku-ShoinLtd.(1976),Antibodies:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress)。然后從被免疫的哺乳動(dòng)物定期收集血液直到被免疫的哺乳動(dòng)物顯示足夠的抗體滴度，然后從血清中制備多克隆多克隆抗體的分離和純化可以通過色譜法如離心分離、硫酸銨鹽|斤、caplyric酸^n^定(見仿lj勿]，Antibodies:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress)、DEAE-瓊脂糖柱、陰離子交換柱、蛋白A柱或G-柱或膠過濾柱。一旦用于產(chǎn)生多克隆抗體的哺乳動(dòng)物達(dá)到了合適的滴度，它們也可以被用作制備針對本發(fā)明的26.6Kd多肽的單克隆抗體。在這個(gè)過程中，脾和淋巴結(jié)從哺乳動(dòng)物中提取出來并通過來源于脾和淋巴結(jié)的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而產(chǎn)生雜交瘤。至于骨髓瘤細(xì)胞，可以用從小鼠和大鼠中建立的細(xì)胞。細(xì)胞融合可以根據(jù)已知方法，如，見KohlerandMilstein(1975)(Nature,256,495-497)來完成。26.6Kd多肽，其部分或包括26.6Kd多肽或其部分的多肽被注射到大鼠中。三到七天后大鼠顯示出足夠的抗體滴度，大鼠用抗原最后一次免疫，它的脾作為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞被提取出來。將脾在MEM培養(yǎng)基(NissuiPharmaceuticalCo.Ltd.)中切成片，離解的細(xì)胞1,200rpm離心5分鐘沉淀。脾細(xì)胞通過用Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65)處理沉淀1到2分鐘去除紅細(xì)胞而被分離。脾細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基洗3次并用作產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。為了建立細(xì)胞系，骨髓瘤細(xì)胞從小鼠或大鼠中被分離出來。合適的骨髓瘤細(xì)胞可以從以下品系中分離BALB/c(8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠)、P3-X63Ag8-Ul(稱為P3-U1)(CurrentTopicsMicrobiologicalImmunology,81,1(1978)、SP2/0-Agl4(稱為SP-2)(Nature,276，269(1978))、P3-X63-Ag8653(稱為653)(JournalofImmunology,123,1548(1979))或P3-X63-Ag8(稱為X63)(Nature,256,495(1975))。這些品系的細(xì)胞在8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基中次代培養(yǎng)(正常培養(yǎng)基包括15pg/ml8-氮雜鳥嘌呤(RPMI]640培養(yǎng)基包括1.5mM抗體。谷氨酰胺，5xl0—5M2-巰基乙醇，10(ig/ml慶大霉素和CSL生產(chǎn)的10%FCS)并在正常培養(yǎng)基上在細(xì)胞融合前培養(yǎng)3到4天。2x107或更多的細(xì)胞為細(xì)胞融合而制造出來。雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞然后混合并用MEM培養(yǎng)基或PBS洗(每升1.83g磷酸氫二鈉，0.21g磷酸二氫鉀，7.65gNaCl，pH7.2)，并以產(chǎn)生抗體的細(xì)胞數(shù)量比骨髓瘤細(xì)胞大5到10倍混合。在1,200rpm離心分離5分鐘后，獲得沉淀。沉淀的細(xì)胞在0.2到1ml聚乙烯乙二醇溶液中懸浮(2g聚乙烯乙二醇-1000(PEG-1000)、2mlMEM培養(yǎng)基、0.7ml二甲基亞砜(DMSO))，每1()S抗體產(chǎn)生細(xì)胞在37。C攪拌加到上述細(xì)胞中。然后每1到2分鐘加入數(shù)次1到2ml的MEM培養(yǎng)基。溶液和MEM培養(yǎng)基總共為50ml。在900rpm離心分離5分鐘后，獲得沉淀。100m的HAT培養(yǎng)基(含10—4M次黃嘌呤，1.5x10—5M胸苷和4x10—M氨基喋呤的正常培養(yǎng)基)加入沉淀并且緩慢重懸沉淀。懸浮物每孔100(il倒入96孔培養(yǎng)板并在37°C，5%C02存在下培養(yǎng)7到14天。通過在Antibodies:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress)中描述的方法，挑選出X寸26.6Kd多肽特異反應(yīng)的抗體產(chǎn)生雜交瘤。上述用抗體檢測先兆子癇多肽或其部分的方法可以包括直接或非直接結(jié)合的酶、熒光底物、放射性同位素或乳膠。該分析方法，例如，可以是檢測酶活性，如賴根過氧化物酶或堿性磷酸酶的ELISA或化學(xué)發(fā)光方法、檢測熒光標(biāo)簽如發(fā)光或GFP(綠色熒光蛋白)的FITC方法，檢測放射性同位素標(biāo)簽如125I的RIA方法或檢測結(jié)合乳膠的乳膠凝集方法。分析還可以是，例如，Western印記法或免疫結(jié)構(gòu)染色。此外，26.6Kd多肽或其部分多肽可以用上述分析來定量。在免疫分析中的抗體可以固定到固相載體上，并且被捕獲的多肽可以用有報(bào)告基團(tuán)的第二抗體或用試劑檢測。抗體可以附著的和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何物質(zhì)可以用作固相載體。這些物質(zhì)包括，例如，微滴度板、膜如硝酸纖維素膜、小珠、盤、玻璃玻璃纖維、塑料材料如橡膠、聚苯乙烯或聚氯乙烯。也可以使用磁珠或光纖傳感器(U.S.Pat.No.5,359,681)。在描述中，"固相"表示用物理方法如吸附或通過抗體和載體上功能基團(tuán)的共價(jià)鍵的化學(xué)結(jié)合而固定?？贵w和載體上的功能基團(tuán)可以直接或通過交聯(lián)劑結(jié)合。物理方法的固定可以用適當(dāng)稀釋的抗體和載體，首選的是微滴度板或膜，在適當(dāng)?shù)木彌_液和適當(dāng)?shù)膮奸g內(nèi)接觸而實(shí)現(xiàn)。接觸的時(shí)間根據(jù)溫度不同，但通常是在1小時(shí)和1天之間。大約10ng到1(ig，更好的是加入約100到200ng抗體并固定在塑料如聚苯乙烯和聚氯乙烯制成的微滴度板的每個(gè)孔中?；瘜W(xué)方法的固定可以用載體和抗體的功能基團(tuán)的反應(yīng)，例如，載體與和羧基和氨基兩者以及載體反應(yīng)的兩個(gè)功能試劑的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。例如，抗體可以通過使用苯醌或載體上的醛基和結(jié)合伙伴上的氨或活性氫間的縮合，用共價(jià)鍵固定在有合適的聚合物層的載體上。載體固定的抗體用適當(dāng)?shù)姆忾]試劑例如牛血清白蛋白或Tween20(Sigma-Aldrich)處理，通過本專業(yè)技術(shù)人員熟知的方法，以抑制其他多肽的物理吸附。載體固定的抗體同樣品和本發(fā)明的多肽反應(yīng)，并且抗體被合并。孕婦樣品可以用適當(dāng)?shù)南♂寗├1磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)適當(dāng)稀釋。孕婦樣品和抗體的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該足夠檢測從懷疑有先兆子癇的個(gè)體獲得的孕婦樣品中本發(fā)明的多肽的出現(xiàn)，最好的是，與結(jié)合和非結(jié)合多肽為平衡的水平相比，至少獲得95%結(jié)合水平的時(shí)間。達(dá)到平衡的時(shí)間可以容易地用測量結(jié)合水平的時(shí)間來決定。非結(jié)合多肽的物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_液，例如PBS(含0.1。/。Tween20)，清洗固相載體而去除。標(biāo)記的第二抗體和固體載體反應(yīng)。這些標(biāo)記最好是酶，如賴根過氧化物酶、基質(zhì)、補(bǔ)充元素、抑制劑、色素、放射性同位素、顯色物質(zhì)或熒光物質(zhì)?？贵w和標(biāo)記間的結(jié)合可以用己知方法來完成。第二抗體反應(yīng)足夠的時(shí)間而結(jié)合包括固定的抗體和本發(fā)明的多肽的復(fù)合物。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間可以容易地用測量結(jié)合水平的時(shí)間來決定。非結(jié)合第二抗體可以用適當(dāng)?shù)木彌_液，例如PBS(含0.1。/。Tween20)清洗固體載體而去除。檢測第二抗體標(biāo)記的方法根據(jù)所用標(biāo)記的種類。例如，當(dāng)所用標(biāo)記是放射性同位素時(shí)，可以用閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影檢測。當(dāng)所用標(biāo)記是色素，顯色物質(zhì)或熒光物質(zhì)時(shí)，可以用分光光度計(jì)檢測。當(dāng)酶用作標(biāo)記時(shí)，加入酶的底物，反應(yīng)固定的時(shí)間，產(chǎn)物可以用分光光度計(jì)檢測。標(biāo)記和第二抗體通過卵白素-生物素方法直接或非直接結(jié)合。當(dāng)它們非直接結(jié)合時(shí)，卵白素-生物素的一部分結(jié)合到第二抗體上，另一個(gè)結(jié)合到標(biāo)記上。26.6Kd多肽可以用流動(dòng)式試驗(yàn)或試驗(yàn)紙?jiān)噥頇z須(1。在流動(dòng)式試驗(yàn)中，孕婦樣品加到固定了抗體的硝酸纖維素膜上，當(dāng)樣品經(jīng)過膜時(shí)，多肽結(jié)合到固定的抗體上而形成免疫復(fù)合物。當(dāng)含第二抗體的溶液經(jīng)過膜時(shí)，多肽結(jié)合到免疫復(fù)合物上。在試紙?jiān)囼?yàn)中，一旦孕婦樣品加入，孕婦樣品經(jīng)過含標(biāo)記的抗體的區(qū)域，多肽結(jié)合到標(biāo)記的抗體上而形成免疫復(fù)合物。當(dāng)孕婦樣品經(jīng)過含固相抗體的區(qū)域，多肽結(jié)合到免疫復(fù)合物上。有固定的抗體的區(qū)域中被檢測到的第二抗體的量顯示了先兆子癇的出現(xiàn)或缺失。本發(fā)明多肽的"檢測或定量"的另一種是編碼先兆子癇多肽的多核苷酸的"檢測或定量"。編碼本發(fā)明的先兆子癇標(biāo)記的多核苷酸可以被用作先兆子癇的標(biāo)記。編碼本發(fā)明26.6Kd多肽的多核苷酸序列可以用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)檢測和測量。檢測編碼26.6Kd多肽的多核苷酸出現(xiàn)的方法是用探針或引物，包括和多肽的編碼序列具有相同序列的核苷酸或和具有和多肽或其衍生物的編碼序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。其衍生物包括，例如，其中寡核苷酸中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成磷硫酰鍵或N3'-P5'phosphoamidite鍵的寡核苷酸、其中核糖和磷酸二酯鍵被轉(zhuǎn)化成肽鍵的寡核苷酸、其中寡核苷酸中的尿嘧啶用C-5丙酰尿嘧啶或C-5噻唑尿嘧啶替換的寡核苷酸、其中寡核苷酸中的胞嘧啶用C-5丙酰胞嘧啶或用吩惡嗪修飾的胞嘧啶替換的寡核苷酸或其中DNA中的核糖用2'-0-丙基核糖、2，-甲氧乙氧核糖替換的寡核苷酸等。所有上述多核苷酸可以作為，例如，基因標(biāo)記，PCR引物或雜交探針而有用。本發(fā)明涉及部分或全部編碼本發(fā)明先兆子癇標(biāo)記的多核苷酸?？赡艿氖?6.6Kd多肽的編碼序列可以被分離，測序和/或在體外表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)這一目的，包括編碼本發(fā)明的26.6Kd多肽的多核苷酸的cDNA文庫，從人類腦、心、骨骼肌、脾、腎、肝、小腸、胎盤、來自這些組織的人類正常細(xì)胞或人類臍靜脈上皮細(xì)胞中制備。制作cDNA的有用方法在MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress),CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994)(Wiley-Interscience)中有牛苗述。還有可從商家獲得的試劑盒，例如cDNA合成和質(zhì)?？寺∮肧uperscript質(zhì)粒系統(tǒng)(Invitrogen)或ZAP-cDNA合成試劑盒(STRATAGENE)。一旦獲得含編碼本發(fā)明的26.6Kd多肽的DNA的cDNA，它可被插入合適的表達(dá)載體。表達(dá)載體然后可以被引入適當(dāng)?shù)乃拗鞑⑶业玫睫D(zhuǎn)化體。表達(dá)載體是任何其中cDNA被插入并在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體。適合的載體包括，例如pcDNAl.l、pcDNAl.l/Amp、pCDM8、pREP(Invitrogen)、p醒6、pHB6(RocheDiagnostics)、pKK223-3、pGEX(AmershamPharmaciaBioteque)、pET-3、pET-11、pBluescriptllSK(+)、pBluescriptllSK(-)(STRATAGENE)、pUC]9、pTrxFus(Invitrogen)、pUC118、pSTV28(TaKaRa)、pMAL-c2X(NewEnglandBioLabs)、pAGE107(Cytotechnology,3(2),133-140(1990).;JP1991-22979)、pAGE103(TheJournalofBiochemistry,101(5)，1307-1310(1987))、pAMo、pAMoA(TheJournalofBiologicalChemistry,268(30)、22782-22787(1993))、pAMoPRSA(JP1993-336963)或pAS3-3(JP1990-227075)。含編碼26.6Kd多肽的cDNA的表達(dá)載體，通過任何已知技術(shù)方法被引入任選的動(dòng)物細(xì)胞。當(dāng)宿主是動(dòng)物細(xì)胞，以下非限制性方法可以被使用電穿孔法(Cytotechnology,(1990),3，133-140,calciumphosphatemethodorlipofection(PNAS，USA,(1987),84,7413))。適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括Namalwa(伯基特淋巴瘤，ATCC:CRL-1432)，HCT-15(人類大腸癌細(xì)胞，ATCC:CCL-225)，COS-1(非洲綠猴腎原細(xì)胞，ATCC:CRL-1650)，COS-7(非洲綠猴腎原細(xì)胞，ATCC:CRL-1651)和CHO-Kl(中國倉鼠卵巢細(xì)胞,ATCC:CCL-61)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體用熟知和常用的方法培養(yǎng)。它可以用適合轉(zhuǎn)化宿主的培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基完成。有用培養(yǎng)基的例子是MEM培養(yǎng)基(Science,130,432(1959))、D-MEM培養(yǎng)基(Virology,8,396(1959))、PRMI1640i咅養(yǎng)基(TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,199:519(1967))，YT培養(yǎng)基或BEM培養(yǎng)基可以使用。當(dāng)轉(zhuǎn)化體用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主制備時(shí)，培養(yǎng)基通常添加胎牛血清(FCS)。培養(yǎng)基也可以選擇性的包括促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)而增強(qiáng)表達(dá)載體的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。例如isopropyl-l-thio-[beta]-D-galactopyranosin(IPTG)可以孚皮使用。培養(yǎng)基也可以包括其他營養(yǎng)素如葡萄糖、氨基酸、蛋白胨、維生素、激素或血清，更好的是FCS、氯化鈣或氯化鎂。本發(fā)明獲得編碼多肽cDNA的其他種方法包括化學(xué)合成多肽序列或從抽提的mRNA產(chǎn)生cDNA。例如，根據(jù)本發(fā)明的26.6Kd多月太的氨基酸序列可以確定多核苷酸序列。化學(xué)合成DNA然后用DNA合成儀通過硫代亞磷酸酯法(ShimazuCorporation)或用392型DNA合成儀通過phosphoamidite》去(PerkinElmer,Inc.)來完成。cDNA百丁以通過表達(dá)以26.6Kd多肽的DNA為模板的互補(bǔ)mRNA的細(xì)胞中的mRNA來制備。當(dāng)編碼26.6Kd多肽的cDNA被分離出來，DNA可以在體外表達(dá)。例如編碼26.6Kd多肽的多核苷酸可以通過在合適的表達(dá)載體中亞克隆DNA片段或啟動(dòng)子下游的全長DNA而在宿主細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)載體然后轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞，酵母，動(dòng)物細(xì)胞，植物或昆蟲細(xì)胞中。適合的表達(dá)載體包括pBTrp2、pBTacl、pBTac2(RocheDiagnostics)、BluescriptIISK(+)、pBluescriptllSK(-)(STRATAGENE)、pSTV28、pUC118、pUC19(TaKaRa)、pKK233-2(Pharmacia)、pSE280、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、pGEX(Pha腿cia)、pETsystem(Novagen)、pMAL-c2(NewEnglandBioLabs)、pKYP10(JP1982-110600)、pKYP200(AgriculturalBiologicalChemistry,48,669(1984).)、pLSAl(AgriculturalBiologicalChemistry,53，277(1989).)、pGELl(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA,82,4306(1985).)、pEG400(JournalofBacteriology,172,2392(1990).)、pTrs30(FERMBP-5407)、pTrs32(FERMBP-5408)、pGHA2(FERMBP-400)、pGKA2(FERMBP-6798)、pPAl(JP1987-233798)或pTerm2(JP1990-22979,U.S.Pat.No.4,686,191，U.S.Pat.No.4,939,094,U.S.Pat.No.5,160,735)?？梢允褂萌魏慰梢栽谌绱竽c桿菌的宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。例如它可以是從大腸桿菌或噬菌體來源的啟動(dòng)子，如trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子(Plac)、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子或PSE啟動(dòng)子、SP01啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子或penP啟動(dòng)子。宿主細(xì)胞包括大腸桿菌屬、靈桿菌屬、芽胞桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬或假單胞菌屬的原核細(xì)胞。例如可以使用大腸桿菌品系XL1-Blue、XL2-Blue、DH1、MC1000、KY3276、W1485、JM109、HB101、No.49、W3110、NY49、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)或HMS174(DE3)pLysS?？梢杂米魉拗鞯慕湍讣?xì)胞包括酵母菌屬的啤酒酵母、裂殖酵母屬的非洲酒酵母、克魯維酵母屬的乳酵母、毛孢子菌屬的芽霉菌糖酵母、許旺酵母屬的S.alluviusspecies或畢赤酵母屬的巴斯德畢赤酵母。任何引導(dǎo)表達(dá)載體進(jìn)入宿主的方法都可以使用。例如電穿孔法、原生質(zhì)球或醋酸鋰法。當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞被用作宿主時(shí)，可以使用以下表達(dá)載體pcDNAl/Amp、pcDNAl、pCDM8、pREP4(Invitrogen)、pAGE107(Cytotechnology,3,133(1990).)、pAGE103(TheJournalofBiochemistry,101,1307(1987).)、pAMo、pAMoA(pAMoPRSA)(TheJournalofBiologicalChemistry,268，22782-22787(1993).)或pAS3-3(JP19卯-22705)。任何可以在宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子可以作為啟動(dòng)子。例如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)IE(即刻早期)基因的啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、莫羅尼鼠白血病病毒的長末端重復(fù)啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、HSP啟動(dòng)子、SR[alpha]啟動(dòng)子或金屬硫蛋白啟動(dòng)子。人類CMVIE基因的增強(qiáng)子可以和啟動(dòng)子一起使用。作為宿主的動(dòng)物細(xì)胞是，例如，HEK293(人胎兒腎原細(xì)胞ATCC:CRL-1573)、淋巴瘤細(xì)胞(伯基特淋巴瘤細(xì)胞ATCC:CRL-1432)、海拉癌細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞ATCC:CCL-2)、HBT5637(白血病細(xì)胞JP1987-299)、BALL-I(白血病細(xì)胞)或已建立的人源細(xì)胞HCT-15(大腸癌細(xì)胞)、Sp2/0-Agl4(小鼠骨髓瘤細(xì)胞ATCC:CRL-1581)或已建立的鼠源細(xì)胞NSO(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、COS-1(非洲綠猴腎原細(xì)胞(SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞)、ATCC:CRL-1650)或已建立的猴源細(xì)胞COS-7(非洲綠猴腎原細(xì)胞(SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞)ATCC:CRL-1651)、CHO-K1(中國倉鼠卵巢細(xì)胞ATCC:CCL-61)或已建立的倉鼠來源的細(xì)胞BHK-21(C-13)(西西里島倉鼠腎細(xì)胞ATCC:CCL-IO)、PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤ATCC:CRL-1721)或己建立的大鼠來源的細(xì)胞YB2/0(大鼠骨髓瘤細(xì)胞ATCC:CRL-1662)。昆蟲細(xì)胞也可以作為宿主。當(dāng)昆蟲細(xì)胞用作宿主時(shí)，表達(dá)載體是，例如，pVL1392、pVL1393或pBlueBacIII(Invitrogen)并且用于感染的病毒是，例如，感染甘藍(lán)夜蛾家族昆蟲的Vaculovirus、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)載體質(zhì)粒與桿狀病毒DNA(Bac-N-Blue)。轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的方法是，例如，在桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(1992)(W.H.FreemanandCompany)、分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊第二片反(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress)、分子生物學(xué)中的當(dāng)前規(guī)程(1994)(Wiley-InterScience)或生物技術(shù)6,47(1988)中有描述。含有用于感染昆蟲細(xì)胞的耙基因和桿狀病毒DNA的轉(zhuǎn)移載體被加到培養(yǎng)物中，表達(dá)由重組體產(chǎn)生的靶基因的病毒感染要表達(dá)多肽的昆蟲細(xì)胞。作為宿主的昆蟲是，例如，草地夜蛾(甘藍(lán)夜蛾)或粉紋夜蛾來源的已建立細(xì)胞。例如，草地夜蛾來源的細(xì)胞包括Sf9(ATCC:CRL-1711,卵巢細(xì)胞)或Sf21(卵巢細(xì)胞)和粉紋夜蛾來源的細(xì)胞系，例如，HighFive或BTI-TN-5B1-4(卵細(xì)胞，Invitrogen)。一旦產(chǎn)生和培養(yǎng)了轉(zhuǎn)化體，本發(fā)明的26.6Kd多肽可以被分離和純化。分離/純化26.6Kd多肽的有用方法是由Sandler(MethodsinEnzymology,83,458)描述的方法。當(dāng)26.6Kd多肽作為可溶的多肽產(chǎn)生和積累，培養(yǎng)液可以從細(xì)胞中通過例如，離心分離出來。如果26.6Kd多肽存在于宿主細(xì)胞中，細(xì)胞被提取并用適合的緩沖液如STE溶液清洗并用超聲波、弗氏細(xì)胞壓碎器、MantonGaulin勻漿器或Dynomill破成碎片。獲得的物質(zhì)然后用離心或過濾分離。從原始材料中分離和純化靶蛋白的方法可以用各種已有的分離/純化方法完成。已知方法包括，例如溶劑提取法、硫酸銨鹽析法、透析法、有機(jī)溶劑沉淀法、超濾法、凝膠過濾法、各種色譜如二乙胺乙基(DEAE)瓊脂糖色譜、陰離子色譜或用賴氨酸的離子交換色譜如DIAIONHPA-75(MitsubishiChemicalCorporation)，用賴氨酸的陽離子色譜如S-SepharoseFF(Pharmacia)、疏水色譜或親和色譜如丁基瓊脂糖凝膠或各種電泳如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳或電聚焦電泳。親和色譜可以用抗26.6Kd多肽抗體來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)26.6Kd多肽以不溶多肽形式產(chǎn)生和積累時(shí)，細(xì)胞用上述方法分離并用適合的方法破成碎片。然后含有多肽的部分被收集。收集的樣品用增溶劑，如表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)或SodiumN-Dodecanoylsalcosinate(salcosiyl)溶解。在溶劑溶液被稀釋或透析到增溶劑沒有或幾乎沒有的濃度后，多肽構(gòu)建到正常的立體結(jié)構(gòu)，純化樣品用上述分離/純化方法獲得。本發(fā)明還提供了對分析從懷疑患有先兆子癇的哺乳動(dòng)物受試者中取得的在孕婦樣品中出現(xiàn)的先兆子癇標(biāo)記存在的方法和試劑盒。早期檢測先兆子癇可以減少治療時(shí)間和減少發(fā)生臨床顯著合并癥的風(fēng)險(xiǎn)。用和廣泛使用的尿妊娠試驗(yàn)試劑盒有相似原理，用于快速檢測先兆子癇標(biāo)記的簡單的定點(diǎn)護(hù)理試劑盒可以讓臨床醫(yī)生快速檢測先兆子癇，并快速制定證實(shí)的和有效的治療和預(yù)防方法。試劑盒的使用表明對有發(fā)生先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的所有病人的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。本發(fā)明的方法和試劑盒還提供了檢測或監(jiān)測包括狀況改變的先兆子癇的方法。因此本發(fā)明還提供給臨床醫(yī)生監(jiān)測先兆子癇在治療后進(jìn)展(惡化、改善或無改變)的方法。通常，臨床醫(yī)生會(huì)建立在選擇的間隔內(nèi)收集和分析病人一定量的孕婦樣品的規(guī)程。通常樣品在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)間歇獲得。間歇采樣之間的一段時(shí)間可以根據(jù)受試者的狀況而定，可以從每24小時(shí)一個(gè)樣品到持續(xù)采樣，更通常的是每4小時(shí)到30分鐘一個(gè)樣品。用這里描述的方法和技術(shù)，本發(fā)明孕婦樣品中的26.6Kd多肽標(biāo)記的定性水平可以分析和估計(jì)，樣品中出現(xiàn)的26.6Kd多肽標(biāo)記的定量水平可以分析和測量。臨床醫(yī)生會(huì)根據(jù)病人的狀況選擇定性方法，定量方法，或這兩種方法。通常，收集的樣品量小于1毫升，更常見的是小于10pl。通常的樣品可以從約1^到約lml。一旦先兆子癇的指征被檢測到，該狀況的介入和治療己經(jīng)開始，臨床醫(yī)生可以用本發(fā)明的方法和試劑盒監(jiān)測治療或介入的進(jìn)展。通常會(huì)提取治療后一個(gè)或更多的后續(xù)孕婦樣品并分析在治療先兆子癇繼續(xù)時(shí)26.6Kd多肽標(biāo)記的出現(xiàn)。治療繼續(xù)直到檢測不到治療后后續(xù)孕婦樣品中26.6Kd多肽標(biāo)記的出現(xiàn)。因?yàn)橹委熀徒槿敫纳屏瞬r，26.6Kd多肽標(biāo)記的表達(dá)和它在樣品中的存在，將相應(yīng)的減少。改善的程度用樣品中檢測到的26.6Kd多肽標(biāo)記的相應(yīng)減少的水平來表示。本方法中使用的試劑盒通常包括附著俘獲性抗體的基質(zhì)，因而孕婦樣品和基質(zhì)接觸而向樣品中26.6Kd的多肽標(biāo)記暴露俘獲性抗體。試劑盒包括具有包含基質(zhì)的表面的工具，如藥鏟或樣品棒的獲取方法。獲取方法還包括接受孕婦樣品的容器，其中容器有含有基質(zhì)的血清接觸表面。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測26.6Kd多肽標(biāo)記和抗體復(fù)合物的分析包括ELISA，可以用作孕婦樣品中的26.6Kd多肽量的定量。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，獲取方法可以包括容納基質(zhì)的盒子的器具。用于檢測26.6Kd多肽標(biāo)記的本發(fā)明的方法和試劑盒可以通過改造已知技術(shù)方法和試劑盒用于快速檢測生物學(xué)樣品中的其他蛋白和配基。適合本發(fā)明的方法和試劑盒的例子在1997年8月12日May等人的美國專利5,656,503、O'Conner等人2002年12月31日的美國專利6,500,627、Smith-Lewis1989年9月26日美國專利4,870,007、Ahlem等人1993年12月28日美國專利5,273,743和Valkers等人1986年12月30日美國專利4,632,901中有描述，所有這樣的文獻(xiàn)在這里并入本文。檢測本發(fā)明的多肽標(biāo)記的快速一步法可以減少檢測發(fā)生先兆子癇的時(shí)間。通常的方法可以包括以下步驟懷疑易發(fā)生先兆子癇的人類孕婦樣品的獲得；混合部分樣品和特異結(jié)合26.6Kd多肽標(biāo)記的檢測抗體，以用于起始檢測抗體和樣品中26.6Kd多肽標(biāo)記的結(jié)合；將樣品和檢測抗體的混合物與固定的特異結(jié)合26.6Kd多肽標(biāo)記的俘獲性抗體接觸，該俘獲性抗體不與檢測抗體交叉反應(yīng)，以用于結(jié)合檢測抗體到26.6Kd多肽標(biāo)記上，結(jié)合26.6Kd多肽標(biāo)記到俘獲性抗體上，而形成可檢測的復(fù)合物；從復(fù)合物中去除非結(jié)合檢測抗體和任何非結(jié)合樣品；并檢測復(fù)合物的檢測抗體。檢測抗體可以用已知技術(shù)方法標(biāo)記檢測標(biāo)記，如放射性標(biāo)記、酶、生物染料、磁珠或生物素。在實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)鑒定可以抑制妊娠人類中先兆子癇的發(fā)生或發(fā)展的化合物。僅通過參考下列非限制的具體實(shí)施例，本發(fā)明現(xiàn)在將被進(jìn)一步描述。但應(yīng)該理解的是，以下的具體實(shí)施例是用作說明的，不應(yīng)以任何方式作為這里描述的本發(fā)明的普遍性的限制。特別是當(dāng)本發(fā)明具體涉及用血清作為孕婦樣品時(shí)，不應(yīng)該排除使用其他樣品如尿。具體實(shí)施例1最初發(fā)現(xiàn)最初發(fā)現(xiàn)是在有妊娠誘導(dǎo)的高血壓或PIH的妊娠婦女的血液(血漿或血清)含有在不發(fā)生PIH的正常妊娠婦女，正常非妊娠婦女和男性的血液中缺失的新的分析物。以下過程被使用。從PIH病人或其他對照組(正常妊娠和非妊娠婦女和男性)獲得的血開始，用親和藍(lán)膠處理去除主要的干擾化合物(如白蛋白)。用SDS-PAGE電泳鑒別這個(gè)獨(dú)特的分析物。膠在窄的線性梯度范圍中制備，因?yàn)榉荘IH病人的和PIH病人的多肽條帶的結(jié)構(gòu)差別是4-6個(gè)氨基酸。通過凝膠滲透色譜法，分析物顯示可能是含有四個(gè)亞基的四聚體，和在非PIH病人血中的約26Kd亞基分子量相比，每個(gè)是約為26.6Kd的分子量。具體實(shí)施例2臨床研究有臨床妊娠誘導(dǎo)高血壓史的病人中獲得的血液樣品從常規(guī)實(shí)驗(yàn)室獲得并保存在-20。C。接著胎盤送組織學(xué)檢查。我們選擇進(jìn)一步研究，被診斷為PIH的病人的血漿樣品后來用胎盤的組織學(xué)檢查確定。證實(shí)PIH的臨床診斷的陽性組織學(xué)發(fā)現(xiàn)是，在所述的妊娠期胎盤的加速成熟，大量絨毛狀梗死的出現(xiàn)和絨毛間、絨毛膜下或邊緣出血，底蛻膜壞死和/或出血和妊娠血脈管系統(tǒng)的變薄或缺少。在每個(gè)病例中，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和PIH的臨床印象是一致的。分析物在65個(gè)被研究的有PIH的婦女血清中發(fā)現(xiàn)。它在160個(gè)正常妊娠的婦女的血中缺失。對30個(gè)不同的PIH、37個(gè)正常妊娠、7個(gè)正常非妊娠婦女和6個(gè)男性的研究結(jié)果在圖1-6中顯示。興趣分析物在有PIH的婦女血漿或血清中出現(xiàn)并在所有其他正常非PIH組的血漿或血清中缺失。這顯示分析物不是激活涉及凝血或相關(guān)級聯(lián)蛋白的結(jié)果。在常規(guī)試驗(yàn)完成后病人的血在第二次就診時(shí)(29-34周妊娠)獲得并用梯度SDS-PAGE檢查他們的蛋白式樣用于臨床試驗(yàn)。其中未顯示高或增加的血壓和在當(dāng)時(shí)沒有異常血化學(xué)物的四個(gè)病人顯示了在電泳研究中患有PIH的病人的明顯條帶。后面檢查這四個(gè)病人的歷史顯示所有四個(gè)人都在36-39周發(fā)生了高血壓。在三個(gè)作了胎盤組織學(xué)檢查的病人中，發(fā)現(xiàn)和PIH—致。具體實(shí)施例3鑒定的分析物性質(zhì)在有PIH的婦女的血中發(fā)現(xiàn)的分析物的亞基分子量用梯度SDS-PAGE測定為約26.6Kd。術(shù)語約是指SDS-PAGE伴隨的不準(zhǔn)確性；但是26.6Kd多肽的大小是和非PIH受試者的血清中發(fā)現(xiàn)的26Kd多肽相比。其它分析物中氨基酸組成的內(nèi)在結(jié)構(gòu)差別可以從圖2和4、5中看到；用考馬斯藍(lán)染色，和當(dāng)使用銀染同等的染色相比，分析物有相對于非PIH的條帶低水平的染色(圖l、3和5)。具體實(shí)施例4半純化源自正常妊娠婦女和患有PIH的妊娠婦女的血液的電泳比較有妊娠誘導(dǎo)高血壓臨床史的病人的肝素鋰血樣從常規(guī)實(shí)驗(yàn)室獲得并且血漿在-20。C儲(chǔ)存。隨后胎盤送組織學(xué)檢查。我們選擇進(jìn)一步研究，被診斷為PIH的病人的血漿樣品后來用胎盤的組織學(xué)檢查確定。證實(shí)PIH的臨床診斷的陽性組織學(xué)發(fā)現(xiàn)是在所述的妊娠期胎盤的加速成熟，有/無絨毛間、絨毛膜下和/或邊緣出血的大量絨毛狀梗死的出現(xiàn)，有妊娠血脈管系統(tǒng)的變薄或缺少的底蛻膜壞死和/或出血。在每個(gè)病例中，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和PIH的臨床印象是一致的。在使用前，親和藍(lán)膠(AGB[BIORAD])在20mM磷酸鹽緩沖液pH7.1中用1.4MNaCl清洗。然后膠在PBS中洗三遍(NaCl:8.0g/L[BDH];Na2HP04:l,15g/L[BDH];KC1:0,2g/L[BDH];KH2P04-2H20:OJg/L[BDH])。每次清洗后，膠在MOOrpm離心10min,棄去上清。在第三次離心后，膠在PBS中重懸到其原始體積(50ml)。病人血清(從疾病特異和陰性(對照)組來的所有血清；每組12-20病人)(50-250pL)用準(zhǔn)確的1:5比例分別用AGB處理并徹底混合30min去除血中常見的白蛋白和其他蛋白。然后在10，000rpm離心10min保留上清。所有上清置于用concavalin-A作親和配體的親和基質(zhì)上(1ml);基質(zhì)用含有以下物質(zhì)0.5MNaCl，0.1mMCaCl2和0.1mMMnCl2的pH7.4的0.02MTris緩沖液平衡。所有樣品用0.5mL/min的流速并且收集洗的部分用于進(jìn)一步處理。結(jié)合的部分用50mM甲基-D-糖苷作為單一峰洗脫并用作進(jìn)一步研究。上清(50和0.2ml的電泳樣品緩沖液混合(20%甘油(v/v)、2%(w/v)SDS、5%(v/v)2-巰基乙醇、0.00125%(w/v)溴酚藍(lán)和12.5%(v/v)0.5MTris-HCl,pH6.8)，在100。C煮10min，加10)iL到梯度膠中；使用有4%積層膠的15-23%和15-25%聚丙烯酰胺梯度膠。內(nèi)部自制的分子量標(biāo)準(zhǔn)也在相同的膠上跑。膠用電泳緩沖液(125mMTris,0.96M甘氨酸，pH8.0，含0.5%(w/v)SDS)平衡。電泳在BIORADProteanII系統(tǒng)上完成。蛋白在40ma恒流電泳約5h或直到染料前沿接近膠的底部。蛋白用銀染[BIORAD]或考馬斯藍(lán)[SIGMA]觀看。圖l-5顯示有妊娠誘導(dǎo)的高血壓(n=25)，正常妊娠婦女(n=28)正常非妊娠婦女(n=7)，正常男性(n=6)血清得到的電泳蛋白式樣。PIH中的興趣蛋白條帶對正常樣品中發(fā)現(xiàn)的條帶有不同的遷移，PIH條帶的更細(xì)分離顯示這條帶可以分成兩條帶。這些造成一致性的和有PIH的婦女中獲得的血的特征性的分步結(jié)合式樣。從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的亞基分子量約分別是對PIH的26.6kd和對對照遷移條帶的25.8-26Kd;這可以從圖1-5中看到。這一差別可以是由于在正常妊娠婦女中缺失4-6個(gè)氨基酸或由于蛋白質(zhì)的碳水化合物組成的變化。有PIH的病人還顯示比正常血清更擴(kuò)散的遷移式樣，很難確定PIH條帶是否是一、二或多條蛋白條帶的結(jié)果，接著也是一或多蛋白的結(jié)果。當(dāng)電泳比較正常病人的血清和血漿時(shí)，相似的條帶式樣的變化還在PIH病人的血清和血漿樣品中觀察到。這揭示PIH式樣的遷移變化不是涉及凝血或相關(guān)級聯(lián)的蛋白激活的結(jié)果。在常規(guī)試驗(yàn)完成后病人的血在第二次就診時(shí)(29-34周妊娠)獲得并用梯度SDS-PAGE檢査他們的蛋白式樣用于臨床試驗(yàn)。其中未顯示高或增加的血壓和在當(dāng)時(shí)沒有異常血化學(xué)物的四個(gè)病人顯示了在電泳研究中患有PIH的病人的明顯條帶。后面檢査這四個(gè)病人的歷史顯示所有四個(gè)人都在36-39周發(fā)生了高血壓。在三個(gè)作了胎盤組織學(xué)檢查的病人中，發(fā)現(xiàn)結(jié)果和PIH—致。表l從不同妊娠時(shí)間收集的PIH(P)和正常婦女(N)血清在P-巰基乙醇存在時(shí)用SDS-PAGE檢測分析物的存在。蛋白式樣用銀染(圖])和考馬斯藍(lán)染色(圖2)觀看。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2從不同妊娠時(shí)間進(jìn)一歩收集的PIH(P)和正常婦女(N)血清在P-巰基乙醇存在時(shí)用SDS-PAGE檢測分析物的存在。蛋白式樣如圖3顯示用銀染觀看。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表3從不同妊娠時(shí)間進(jìn)一步收集的PIH(P)、正常婦女(N)和有妊娠誘導(dǎo)的高血壓(H)婦女的血清在卩-巰基乙醇存在時(shí)用SDS-PAGE檢測分析物的存在。蛋白式樣如圖4顯示，用考馬斯染藍(lán)染色觀看。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表3注釋a-50號病人有高血壓，沒有蛋白尿。cp:51號病人有高血壓，沒有蛋白尿。S:52號病人有高血壓和蛋白尿。表4進(jìn)一步收集的PIH(P)、正常非妊娠婦女(W)和正常男性(M)的血清在(3-巰基乙醇存在時(shí)用SDS-PAGE檢測分析物的存在。蛋白式樣如圖6顯示，用考馬斯染藍(lán)染色觀看。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>權(quán)利要求1、一個(gè)先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記，該標(biāo)記由在還原條件下用15-30％梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd的多肽構(gòu)成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記，其中所述標(biāo)記在妊娠人類來源的孕婦樣品中存在。3、一種檢測來源于妊娠人類的孕婦樣品的先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記的方法，該方法包括，與來源于未患先兆子癇的人類樣品中的約26Kd多肽比較時(shí)，在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定孕婦樣品中約26.6Kd多肽的存在。4、一種在妊娠人類中診斷和/或預(yù)測先兆子癇(PE)的方法，該方法包括，與來源于未患先兆子癇的人類樣品中的約26Kd多肽比較時(shí)，在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定孕婦樣品中約26.6Kd多肽的存在。5、一種檢測妊娠人類中先兆子癇的診斷試劑盒，包括作為陽性對照的在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd多肽，該多肽己從患有先兆子癇的妊娠人類中分離出來。6、一種可以選擇性結(jié)合在還原條件下用15-30%梯度SDS-PAGE測定的約26.6Kd多肽的抗體，該多肽已從患有先兆子癇的妊娠人類中分離出來。7、一種妊娠人類中的先兆子癇的發(fā)生或進(jìn)一步發(fā)展的抑制劑，其中所述抑制劑可以從患有先兆子癇或有發(fā)生先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的妊娠人類的血清中減少或去除存在的，在還原條件下用15-30。/。梯度SDS-PAGE測得的約26.6Kd多肽。8、一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的抑制劑，其中所述抑制劑可以降低`26.6Kd多肽的表達(dá)水平。9、一種在哺乳動(dòng)物中先兆子癇的檢測方法，包括歩驟1)獲得自哺乳動(dòng)物受試者來源的孕婦樣品；2)用患有先兆子癇婦女的血清中發(fā)現(xiàn)的26.6Kd多肽標(biāo)記的抗體和樣品接觸，形成抗體和26.6Kd多肽標(biāo)記的復(fù)合物；3)檢測抗體-標(biāo)記復(fù)合物。10、一種監(jiān)測先兆子癇的治療效果的方法，包括歩驟1)對患有先兆子癇的哺乳動(dòng)物受試者提供治療；2)從受試者獲得至少一個(gè)治療后孕婦樣品；并且3)在治療后樣品中檢測先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記的存在或缺失。11、一種檢測來源于受試者的孕婦樣品中先兆子癇26.6Kd多肽標(biāo)記存在的試劑盒，包括1)獲得一定量的孕婦樣品的裝置；2)可附著到能夠和先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記形成復(fù)合物的俘獲性抗體的基質(zhì)；并且3)檢測先兆子癇的26.6Kd多肽標(biāo)記和俘獲性抗體的復(fù)合物的分析法。12、一種檢測哺乳動(dòng)物受試者的先兆子癇狀況的競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的試劑盒，其包含用于檢測受試者孕婦樣品中多肽標(biāo)記存在的先兆子癇`26.6Kd多肽標(biāo)記的特異的第一抗體。全文摘要本發(fā)明涉及先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記。特別的是本發(fā)明提供了先兆子癇發(fā)生的標(biāo)記，該標(biāo)記由在還原條件下用15-30％的梯度SDS-PAGE測定的一個(gè)約26.6Kd的多肽構(gòu)成。文檔編號C07K2/00GK101616927SQ200680056330公開日2009年12月30日申請日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日發(fā)明者V·沃羅泰利亞克申請人:迪愛麥有限公司