專利名稱：治療內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人紅細(xì)胞生成素(EPO)在預(yù)防或治療由于化療、放療、機(jī)械創(chuàng)傷或由于損害內(nèi)皮的疾病(如炎癥、心臟病或癌癥)造成的內(nèi)皮創(chuàng)傷中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及EPO在與化療結(jié)合使用中的用途。
發(fā)明
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種在腎臟中產(chǎn)生的糖蛋白，是起刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生(紅細(xì)胞發(fā)生)作用的主要激素。EPO刺激骨髓中定向紅細(xì)胞先祖的分裂和分化。正常的血漿紅細(xì)胞生成素的水平變化范圍為0.01-0.03單位/mL，在低氧或貧血期間可增加高達(dá)100-1000倍。參見Graber和Krantz，醫(yī)學(xué)年述(Ann.Rev.Med.29:51(1978)；Eschbach和Adamson國際腎臟雜志(Kidney Intl.)28:1(1985)。重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEpo或epoetinα)可以Epogen(Amgen公司，Thousand Oaks,CA)和Procrit@(Ortho生物技術(shù)公司，Raritan,NJ)的形式商購獲得。EPO被用來治療貧血，包括與癌癥化療、慢性衰竭、惡性腫瘤、成年和幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血紅蛋白合成障礙、早熟以及HIM感染的齊多夫定(zidovudine)治療相關(guān)的貧血。
血管內(nèi)皮是一層貼附在內(nèi)層血管壁并與血液直接接觸的細(xì)胞，其在循環(huán)系統(tǒng)與血管外腔隙之間提供了一個有活性的天然屏障。內(nèi)皮在細(xì)胞、組織和器官水平上參與信號和信息的傳遞，在細(xì)胞介導(dǎo)以及體液免疫應(yīng)答中都起作用。內(nèi)皮細(xì)胞具有代謝活性，通常產(chǎn)生許多對血管腔以及血小板產(chǎn)生作用的物質(zhì)。內(nèi)皮血管舒張劑包括前列腺環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮衍生松馳因子(EDRF，它可能是一氧化氮或其較穩(wěn)定的加合物)；這兩種物質(zhì)還發(fā)揮作用以抑制血小板聚集。
由物理創(chuàng)傷或如形成動脈粥樣硬化斑塊的病程導(dǎo)致的內(nèi)皮的創(chuàng)傷或破壞可減少EDRF的生成，從而導(dǎo)致血管收縮。更為擴(kuò)散和銳敏的內(nèi)皮創(chuàng)傷，例如由慢性高血壓或局部缺血后的血液再充滿導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷，也導(dǎo)致變化的EDRF的產(chǎn)生。被定位于管腔內(nèi)皮表面的內(nèi)皮產(chǎn)物包括外ADP酶(ectoADPase)和血栓調(diào)節(jié)蛋白。內(nèi)皮釋放的血管收縮劑包括內(nèi)皮縮血管肽。內(nèi)皮細(xì)胞還分泌增強(qiáng)內(nèi)皮有絲分裂發(fā)生并可誘導(dǎo)新血管形成(血管發(fā)生)的生長因子。已報道粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。白介素-3(IL-3)也增強(qiáng)這些細(xì)胞的增殖。參見Bussolino等自然337:471(1989)；Brizzi等臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)91:2887(1993)。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個方面是一種通過將內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素與化療劑聯(lián)合給藥來減少由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法。內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素可與化療劑同時或在化療劑給藥之前或之后給藥。
本發(fā)明的第二個方面是一種在用化療劑治療的個體中增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抑制的方法，包括將化療劑與內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素聯(lián)合給藥。內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素可與化療劑同時或在化療劑給藥之前或之后給藥。
本發(fā)明的另一個方面是一種治療實體血管瘤的方法，包括將內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素與抗癌化療劑聯(lián)合給藥。內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素可與化療劑同時或在化療劑給藥之前或之后給藥。
本發(fā)明的另一個方面是一種治療由機(jī)械創(chuàng)傷、暴露于放射線下、炎癥、心臟病或癌癥導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法，包括將內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素對需要這種治療的個體給藥。
本發(fā)明前面以及其它的目的將在下面提供的說明書中詳細(xì)解釋。
附圖簡要說明

圖1是顯示置于順鉑后內(nèi)皮細(xì)胞存活率的劑量反應(yīng)曲線。
圖2顯示與僅置于順鉑的對照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較，同時置于鉑順和不同劑量的EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)。
圖3顯示首先置于順鉑，兩小時后再置于不同劑量的EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)(與僅置于順鉑的對照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較)。
圖4顯示首先置于不同劑量的EPO，兩小時后再置于順鉑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)(與僅置于順鉑的對照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較)。
發(fā)明詳述本發(fā)明人以前已證實重組人紅細(xì)胞生成素(EPO)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有促有絲分裂和化學(xué)引誘劑作用(遷移)。參見Anagnostou等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5978(1990)。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖是生成血管過程中的關(guān)鍵步驟。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)EPO可有效地防止和/或修復(fù)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與化療劑聯(lián)合給藥EPO產(chǎn)生雙相應(yīng)答一定劑量的EPO保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于化療劑的有害影響，同時劑量的增加增強(qiáng)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮生長抑制。
EPO在化療期間增強(qiáng)內(nèi)皮生長抑制中的用途可用于治療生血管腫瘤，這是希望阻止或減慢支持腫瘤生長的新血管的形成。腫瘤需要充足的血液供應(yīng)，腫瘤組織分泌的生血管因子刺激了新血管在腫瘤實體中的生長。在動物模型中，已表明抑制腫瘤組織中的血管生成觸導(dǎo)致腫瘤退化。高度血管化的實體腫瘤包括小腦成血管細(xì)胞瘤、乳腺管癌和喉鱗狀上皮細(xì)胞癌。異常的血管生成與其它病理疾病有關(guān)，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、新血管性青光眼、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及牛皮癬。EPO降低或防止異常血管生成的能力在防止或降低與這些病情相關(guān)的血管生成中將是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的一種方法是EPO作為致瘤性疾病化療中的輔助劑的用途。當(dāng)希望保護(hù)內(nèi)皮免于化療劑的不利影響時，EPO以內(nèi)皮保護(hù)量提供。根據(jù)本發(fā)明的第二種方法是EPO作為致瘤性疾病化療中的輔助劑的用途，其中希望增強(qiáng)化療劑對內(nèi)皮的不利影響(例如增強(qiáng)內(nèi)皮生長的抑制)。在這種情況下，EPO以內(nèi)皮抑制量提供。
如本文所采用的，EPO的內(nèi)皮保護(hù)量指能降低或防止本來是由于暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或已知創(chuàng)傷內(nèi)皮的病情而另外產(chǎn)生的內(nèi)皮生長的抑制的劑量。另一方面，EPO的內(nèi)皮保護(hù)量可定義為在暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知創(chuàng)傷內(nèi)皮的疾病后能增加可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的那些劑量；可存活細(xì)胞數(shù)目的增加是指與沒有EPO時所預(yù)期的數(shù)目進(jìn)行比較而有所增加。EPO最有效的內(nèi)皮保護(hù)量可隨給藥的時間以及內(nèi)皮創(chuàng)傷的病因，不同而發(fā)生變化。
在內(nèi)皮創(chuàng)傷是由于置于化療劑時，根據(jù)EPO是否與化療劑同時，或在其之前或之后給藥，EPO最有效的內(nèi)皮保護(hù)量將發(fā)生變化，并可能隨所用的具體化療劑的不同而發(fā)生變化。
如本文所采用的，EPO的內(nèi)皮抑制量指能增強(qiáng)或增加本來是由于暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知創(chuàng)傷內(nèi)皮的疾病而產(chǎn)生的內(nèi)皮生長的抑制的劑量。另一方面，EPO的內(nèi)皮抑制量可定義為在暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知創(chuàng)傷內(nèi)皮的病情后減少可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的那些劑量；可存活細(xì)胞數(shù)目的減少是指與沒有EPO時所預(yù)期的數(shù)目進(jìn)行比較而有所減少。EPO最有效的內(nèi)皮抑制量可隨給藥的時間以及內(nèi)皮創(chuàng)傷的病因，不同而發(fā)生變化。
在內(nèi)皮創(chuàng)傷是由于置于化療劑時，根據(jù)EPO是否與化療劑同時，或在其之前或之后給藥，EPO最有效的內(nèi)皮抑制量將發(fā)生變化，并可隨所用的具體化療劑的不同而發(fā)生變化。
可通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖的減少和/或可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的減少來評價導(dǎo)致可存活內(nèi)皮細(xì)胞總的數(shù)目減少的內(nèi)皮創(chuàng)傷。這種可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的減少也可稱為內(nèi)皮生長抑制或內(nèi)皮細(xì)胞抑制或抑制作用。
如本文所采用的，一種減少由于對個體給藥化療劑而造成的個體內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法指減少或防止本來由于給藥化療劑而造成的可存活內(nèi)皮細(xì)胞減少的方法。如本文所采用的，一種增強(qiáng)由于對個體給藥化療劑造成的個體中的內(nèi)皮抑制的方法指增加或增強(qiáng)本來是由于給藥化療劑而造成的可存活內(nèi)皮細(xì)胞減少的方法。
內(nèi)皮細(xì)胞的創(chuàng)傷也可由放療、機(jī)械創(chuàng)傷以及由如炎癥、心臟病(如動脈粥樣硬化)和癌癥的疾病造成。例如在動脈粥樣硬化中，內(nèi)皮創(chuàng)傷或功能異常導(dǎo)致血管舒張反應(yīng)減弱以及增加血小板在動脈壁上的沉積。從沉積的血小板中釋放的血清緊張素和血栓烷A2引起動脈收縮和痙攣，增加血小板的黏附和聚集，并促進(jìn)動脈粥樣硬化。通過生血管刺激而形成新的冠狀血管經(jīng)常使冠狀動脈阻塞的后果得以改善。EPO在增強(qiáng)內(nèi)皮生長和/或修復(fù)或防止內(nèi)皮創(chuàng)傷中的使用將使其成為一個有效的治療由于機(jī)械創(chuàng)傷、放療或由于對內(nèi)皮產(chǎn)生不利影響的疾病而造成的內(nèi)皮創(chuàng)傷劑。
如本文所采用的，人紅細(xì)胞生成素(EPO)指天然產(chǎn)生的人紅細(xì)胞生成素糖蛋白以及重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEpo或epoetinα，可以Epogen(Amgen公司，Thousand Oaks,CA)和Procrit(Ortho生物技術(shù)公司，Raritan,NJ)的形式商購獲得)。EPO的肽類似物也可用于本發(fā)明的方法中。如本文所采用的，肽類似物為雖然不具有與EPO相同的氨基酸序列，但具有類似的三維結(jié)構(gòu)的那些化合物。在與受體相互作用的蛋白分子中，相互作用發(fā)生在穩(wěn)定的三維分子的表面可達(dá)位點(diǎn)?？筛鶕?jù)已知方法，通過以適宜構(gòu)象排列關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)殘基，設(shè)計和合成模擬EPO結(jié)合區(qū)的必需的表面特征的肽。具有與EPO結(jié)合表面基本相同的分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面區(qū)域的分子將能夠模擬EPO與EPO受體的相互作用。業(yè)已知確定肽三維結(jié)構(gòu)以及其類似物的方法，有時被稱為‘合理的藥物設(shè)計技術(shù)’。參見例如Geysen的美國專利號4，833，092；Nestor的美國專利號4，859，765；Pantoliano的美國專利號4,853,871；B1alock的美國專利號4,863,857(申請人特別說明本文所引用的全部美國專利公開被全文引作參考)。
在本發(fā)明的方法中，模擬紅細(xì)胞生成素生物活性的肽(EPO受體肽配體)可替代EPO。這些肽的序列可代表全長EPO蛋白序列的片段，其中該片段能與EPO受體結(jié)合以及活化它。此外，在這些肽模擬EPO生物活性時，具有不類似于EPO的序列的肽可用于本發(fā)明的方法中。Wrighton等報道了結(jié)合并活化靶細(xì)胞表面上的紅細(xì)胞生成素受體的小分子肽的鑒定和表征，雖然這些肽序列不類似于EPO的一級結(jié)構(gòu)(Wrighton等科學(xué)273:458(1996,7,26))。(用二硫鍵結(jié)合的14氨基酸環(huán)肽代表這些肽激動劑，其中環(huán)肽具有已鑒定的最小共有序列。Livnah等，科學(xué)273:464(1996,7,26)描述了一種這樣的肽模擬物與紅細(xì)胞生成素受體的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
如本文所采用的，術(shù)語化療劑指細(xì)胞毒性抗腫瘤劑，即治療上用來阻止或降低腫瘤細(xì)胞的生長，優(yōu)先殺死腫瘤細(xì)胞或打斷迅速增殖細(xì)胞的細(xì)胞周期的化學(xué)物質(zhì)?；焺┮卜Q為抗腫瘤藥物或細(xì)胞毒性劑并為本領(lǐng)域所熟知。如本文所采用的，化療包括用一種化療劑或用化療劑的組合物進(jìn)行治療。在需要治療的個體中，化療可與外科治療或放療或與其它抗腫瘤治療方法結(jié)合。
作為實例的化療劑為長春花生物堿、表鬼臼毒素、蒽環(huán)霉素抗生素、放線菌素D、普卡霉素、(嘌呤霉素、短桿菌肽D、paclitaxel(Taxol@,Bristol Myers Squibb)、秋水仙堿、細(xì)胞松弛素B、依米啶、美登素以及安吖啶(或“mAMSA”)。長春花生物堿類描述在Goodman和Gilman的治療的藥物學(xué)基礎(chǔ)，1227-1280(第7版，1985)(下文為“Goodman和Gilman”)。長春花生物堿的實例為長春花新堿、長春堿和長春地辛。表鬼臼毒素類描述在Goodman和Gilman，見上文1280-1281。表鬼臼毒素的實例為依托泊甙、依托泊甙正醌和替尼泊甙。蒽環(huán)霉素抗生素類描述在Goodman和Gilman，見上文1283-1285。蒽環(huán)霉素抗生素的實例為柔紅霉素、阿霉素、米托蒽醌和比生群。放線菌素D，也稱為更生菌素描述在Goodman和Gilman，見上文1281-1283。普卡霉素，也稱為光神霉素，描述在Goodman和Gilman，見上文1287-1288。其它的化療劑包括順鉑(Platinol,Bristol Myers Squibb)；卡鉑(Paraplatin,Bristol Myers Squibb)；絲裂霉素(Mutamycin,Bristol MyersSquibb)；六甲蜜胺(Hexalen,U.S.Bioscience,Inc.)；環(huán)磷酰胺(Cytoxan,Bristol Myers Squibb)；洛莫司叮[CCNU](CeeNU,Bristol Myers Squibb)；卡莫司叮[BCNU](BiCNU,Bristol Myers Squibb)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，化療藥物的給藥方法根據(jù)所使用的具體的化療劑而發(fā)生變化。根據(jù)所使用的化療劑，例如可通過注射(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、胸膜內(nèi))或口服給藥化療劑。
如本文所采用的，一種化合物與另一種化合物“聯(lián)合”給藥指以足夠接近的時間給藥兩種化合物，這樣一種化合物的存在改變另一種的生物作用。兩種化合物可同步(同時)或依次給藥。可通過在給藥前混合化合物，或通過在相同時間點(diǎn)但在不同的組織位點(diǎn)給藥化合物或使用不同的給藥途徑來完成同時給藥。
如本文所采用的短語“同時的給藥”、“同步的給藥”或“同時給藥”指化合物在相同的時間點(diǎn)或彼此緊接著給藥。在后一種情況下，兩種化合物在足夠接近的時間內(nèi)給藥，以致觀察到的結(jié)果與化合物在相同時間點(diǎn)給藥時獲得的結(jié)果難以區(qū)別。
用本發(fā)明方法治療的個體包括人和動物(例如狗、貓、牛、馬)個體，優(yōu)選為哺乳動物個體。
許多化療劑在細(xì)胞周期的特定時期起作用，并僅對處于分裂過程中的細(xì)胞具有活性。對化療最敏感的腫瘤為具有高百分比處于細(xì)胞分裂過程的細(xì)胞的腫瘤，包括但不局限于乳腺、肝、腦、肺以及卵巢癌。高度血管化的實體瘤適宜于用內(nèi)皮抑制量的EPO結(jié)合化療劑治療，因為這些腫瘤依賴于血管生成以為生長的腫瘤組織提供足夠的血液供應(yīng)。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何適宜的方式給藥根據(jù)本發(fā)明所使用的EPO?？扇?例如靜脈內(nèi))或局部(例如注射至腫瘤、緊圍繞腫瘤的組織中或注射至包含腫瘤的解剖學(xué)腔隙中)給藥EPO。例如，在內(nèi)皮抑制量的EPO作為化療的輔助劑使用時，可將EPO局部給藥至希望防止血管生成的腫瘤(或緊圍繞腫瘤的組織)中。例如在全身性地遞送化療劑時，可通過靜脈注射全身性地給藥內(nèi)皮保護(hù)量的EPO。
與化療劑結(jié)合使用的EPO的給藥劑量和給藥時間將類似地取決于所希望達(dá)到的效果。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)EPO的給藥時間(同時、在化療劑給藥之前或之后)以及給藥劑量的不同，EPO既能起保護(hù)內(nèi)皮免受化療劑的生長抑制作用，又能起增強(qiáng)使用化療劑所見到的內(nèi)皮生長抑制的作用。如何通過常規(guī)實驗確定與特定的化療劑結(jié)合使用以獲得所需效果的EPO的給藥劑量和時間對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是顯而易見的。
未確定可以單次量或多次量給藥的EPO的最大量。在三至四周中已給藥高達(dá)1,500單位/kg的劑量而沒有由于EPO本身引起的毒性作用。參見Eschbach等，慢性尿毒癥的預(yù)防(Prevention of ChronicUremia)(Friedman等編)，F(xiàn)ield and Wood Inc.,Philadelphia,pp 148-155(1989)。在本方法中，在希望保護(hù)內(nèi)皮免受由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷和/或內(nèi)皮生長抑制時，以內(nèi)皮保護(hù)量給藥EPO。適宜的內(nèi)皮保護(hù)劑量為約100U/kg-約200U/kg。在本方法中，在希望增強(qiáng)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷和/或內(nèi)皮生長抑制時，EPO以內(nèi)皮抑制量給藥，其可為約750U/kg-約2000U/kg。如上所述，與化療劑結(jié)合使用的EPO的給藥劑量和時間將取決于所需效果以及使用的化療劑。
提供下面的實施例以說明本發(fā)明，不應(yīng)被認(rèn)為是對它們的限定。實施例1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是從來源于剖腹產(chǎn)術(shù)的臍帶中得到的(HUVECs)。用標(biāo)準(zhǔn)方法在覆蓋有0.5％豬皮明膠(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)的25cm2T-燒瓶中培養(yǎng)HUVECs。補(bǔ)充有20％規(guī)定的胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT),16U/ml肝素(Sigma),50ug/ml來源于牛下丘腦的內(nèi)皮促細(xì)胞分裂劑(Biomedical Technologies,Stoughton,MA),100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的培養(yǎng)基199被用于HUVECs的生長(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。如本領(lǐng)域所知，內(nèi)皮細(xì)胞的特征為馮維勒布蘭德氏因子抗原陽性、相似及典型的鵝卵石(cobblestone)形態(tài)以及存在Weillebrand-Palade氏體。保護(hù)/抑制分析使用比色法確定在將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物置于試驗物后的代謝活性細(xì)胞的數(shù)目。本項分析使用四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓](MTS)和電子偶合劑吩嗪甲硫酸鹽(PMS；可從Promega公司購得，Madison,Wisconsin)的溶液。參見Denizot和Lang，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)89:271(1986)；Promega CorporationTechnical Bulletins 112,152和169。MTS被在代謝活性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的脫氫酶生物還原為甲。以490nm處的吸光率測定甲的量，它與培養(yǎng)物中的活細(xì)胞的數(shù)目成正比。
收集在完全(補(bǔ)充)M199培養(yǎng)基中生長的對數(shù)期內(nèi)皮細(xì)胞。在80-90％完全鋪滿時，將EC培養(yǎng)物單細(xì)胞層用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，用0.25％胰蛋白酶的1mM EDTA溶液處理1-2分鐘，接著將細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中。分別使用血細(xì)胞計數(shù)器和錐蟲藍(lán)染色確定細(xì)胞的數(shù)目和存活率。制備7.22×104細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，將90ul(6.5×103細(xì)胞)分散在96井平板的各井中。在37℃,5％CO2，增濕空氣下培養(yǎng)過夜后，以在下面描述的實施例中說明的濃度和順序加入EPO和/或化療劑。接著再將平板保溫24小時。如制造商所推薦，在保溫末期，將20ul新制備的混合MTS/PMS(20∶1比例)溶液加入到各井中，將平板再保溫1-4小時。使用ELIAS平板計數(shù)器記錄在490nm處各井的吸光率。通過將490nm處的校正的吸光率對加入物(EPO、化療劑或其混合物)的濃度作圖確定LD50以及各種處理對細(xì)胞存活率以及化學(xué)敏感性的影響。統(tǒng)計學(xué)研究對于保護(hù)/抑制分析，將實驗重復(fù)三次。所有其它實驗進(jìn)行至少5次。將結(jié)果取平均值并以平均值±SD表示。所有實驗的對照組包括用下面一種處理的1-2個重復(fù)三次的井1)1ug/ml順鉑；2)50ug/ml順鉑；3)10或20U/ml EPO；4)0.6或1.2U/ml EPO。
因此，對于每個實驗，3-6個井獲得了上面四種對照組處理(總共12-24個對照組井)。還對由重復(fù)三次的未處理細(xì)胞井構(gòu)成的其它對照組進(jìn)行了實驗。實施例2順鉑LD50的測定如實施例1描述地制備含有內(nèi)皮細(xì)胞的96井平板，在37℃,5％CO2，增濕空氣下培養(yǎng)過夜。制備160ug/ml順鉑溶液，將系列稀釋物加入到各井中(5ul/井；濃度從0.03125ug/ml變化至4.0ug/ml。接著將平板保溫兩天(48小時))，使用實施例1描述的MTS/PMS方法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。使用ELISA平板計數(shù)器記錄490nm處各井的吸光率。將校正的490nm處的吸光率對順鉑的濃度(ug/ml)作圖(圖1)以提供劑量-反應(yīng)曲線。產(chǎn)生50％最大反應(yīng)所需順鉑的濃度(順鉑的LD50)被確定為0.45ug/ml。
根據(jù)上面的發(fā)現(xiàn)，如下面實施例所提供的，用1ug/ml劑量的順鉑來測定EPO對內(nèi)皮細(xì)胞的影響。實施例3順鉑和EPO同時給藥對內(nèi)皮細(xì)胞的影響為了確定EPO和順鉑結(jié)合使用對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，將EPO的系列稀釋物與順鉑一起同時加入到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。
如實施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物。將順鉑(最終濃度為1ug/ml)與5ul各種濃度的EPO制備物(最終EPO濃度從0.15變化至20U/ml)同時加入到各試驗井中。使用實施例1描述的MTS/PMS比色分析法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對照組井比較(僅用1ug/ml順鉑處理的內(nèi)皮細(xì)胞，其被當(dāng)作基線并在圖2中以0％代表)。結(jié)果提供在圖2中；“對照組的百分?jǐn)?shù)”為相對于對照組，490nm處的光密度變化的百分?jǐn)?shù)，這樣“0％”說明試驗井具有與對照組類似數(shù)目的代謝活性細(xì)胞，而“50％”說明多50％,“-50％”說明少50％的代謝活性細(xì)胞。
如圖2所示，當(dāng)EPO與順鉑同時加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中時，觀察到雙相反應(yīng)。當(dāng)EPO與順鉑同時加入時，用0.15-1.25U/mlEPO處理的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物被保護(hù)免于順鉑的創(chuàng)傷作用。當(dāng)EPO與順鉑同時加入時，0.3U/ml的EPO濃度提供內(nèi)皮細(xì)胞的最大保護(hù)；存活細(xì)胞的數(shù)目比在僅用順鉑處理的對照組培養(yǎng)物中觀察到的高約30％。
還如圖2所示，與單獨(dú)用順鉑處理的培養(yǎng)物比較，當(dāng)EPO與順鉑同時加入時，在用5-20U/ml EPO處理的培養(yǎng)物中的內(nèi)皮細(xì)胞生長被抑制。與僅暴露于順鉑的對照組細(xì)胞相比，用5U/ml EPO和1ug/ml順鉑處理的培養(yǎng)物顯示存活細(xì)胞的數(shù)目減少了33％。實施例4在暴露于順鉑后給藥的EPO對內(nèi)皮細(xì)胞的影響在本實驗中，在培養(yǎng)物暴露于順鉑2小時后，將EP0的系列稀釋物加入到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。
如實施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。將順鉑加入到各試驗井中(順鉑的最終濃度為1ug/ml)；2小時后，加入最終濃度變化范圍為0.15-20U/ml的EPO制備物。使用如實施例描述的MTS/PMS比色法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對照組井(僅用1ug/ml順鉑處理的內(nèi)皮細(xì)胞)比較。
結(jié)果提供在圖3中，表明當(dāng)在加入順鉑后將EPO加入到細(xì)胞培養(yǎng)物時觀察到了雙相反應(yīng)。當(dāng)在暴露于順鉑2小時后加入EPO時，用0.15-5U/ml EPO處理的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物被保護(hù)免于順鉑的創(chuàng)傷作用。在暴露于順鉑之后用1.25U/mlEPO處理過的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中，存活細(xì)胞的數(shù)目比對照組高34％。相反，在暴露于順鉑2小時后給藥10-20U/ml EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中，細(xì)胞的存活率比在對照組(僅暴露于順鉑中)中所觀察到的要低。實施例5在暴露于順鉑之前給藥的EPO對內(nèi)皮細(xì)胞的影響在本實驗中，在將培養(yǎng)物暴露于順鉑之前2小時，將EPO的系列稀釋物加入到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。
如實施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。每個試驗井加入5ul濃度為0.15-20U/ml的EPO制備物；2小時后，將順鉑加入到各試驗井中(5ul 1ug/ml的順鉑)。使用如實施例描述的MTS/PMS比色法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對照組井(僅用1ug/ml順鉑處理的細(xì)胞)比較。
結(jié)果提供在圖4中，表明了在暴露于順鉑之前2小時暴露于EPO后的存活內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目的降低(與僅暴露于順鉑的對照組細(xì)胞比較)。與對照組比較，細(xì)胞增殖和存活率降低了81％。抑制為劑量依賴性的；與對照組比較，低如5和2.5U/ml的EPO濃度分別降低細(xì)胞生長58％和48％。
前面是對本發(fā)明的說明，不應(yīng)認(rèn)為是對它們的限定。本發(fā)明用下面的權(quán)利要求來定義，權(quán)利要求的等效物應(yīng)被包括在其中。
權(quán)利要求
1．一種減少由對個體給藥化療劑導(dǎo)致的個體內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法，包括將化療劑與內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素聯(lián)合給藥。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素與所述化療劑同時給藥。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之前給藥。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之后給藥。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化療劑為順鉑。
6．一種增強(qiáng)用化療劑治療的個體的內(nèi)皮細(xì)胞抑制的方法，包括將化療劑與內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素對個體聯(lián)合給藥。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中將所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素與所述化療劑同時給藥。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之前給藥。
9．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之后給藥。
10．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化療劑為順鉑。
11．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述個體患有選自小腦成血管細(xì)胞瘤、乳腺管癌以及喉鱗狀上皮細(xì)胞癌的腫瘤生長。
12．一種在需要這種治療的個體中治療實體血管瘤的方法，包括將內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素與抗癌化療劑聯(lián)合給藥。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中將所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素與化療劑同時給藥。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之前給藥。
15．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之后給藥。
16．一種治療需要這種治療的個體中的由機(jī)械創(chuàng)傷、暴露于放射線下、炎癥、心臟病或癌癥導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法，包括對所述個體給藥內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素。
全文摘要
描述了人紅細(xì)胞生成素(EPO)在預(yù)防或治療由于化療、放療、機(jī)械創(chuàng)傷或由于損害內(nèi)皮的疾病(如炎癥、心臟病或癌癥)造成的內(nèi)皮創(chuàng)傷中的用途。描述了EPO在與化療劑聯(lián)合給藥中的用途。
文檔編號A61K45/00GK1235512SQ97199338
公開日1999年11月17日 申請日期1997年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月11日
發(fā)明者阿塔納修斯A·阿納諾斯托, 喬治·西高納斯 申請人:東卡羅萊娜大學(xué)