專利名稱：結(jié)合人TNFα的人抗體的制作方法
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子α(TNFα)是由許多細(xì)胞類型(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其原始鑒定是基于其誘導(dǎo)某些小鼠腫瘤壞死的能力(參見例如Old,L.(1985)Science230:630-632)。隨后，一個(gè)與惡病質(zhì)相關(guān)的名稱為惡病質(zhì)素的因子表明是與TNFα相同的分子。據(jù)信TNFα參與介導(dǎo)休克(參見例如Beutler,B.和Cerami,A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:505-518;Beutler,B.和Cerami,A(1988)Annu.Rev.Immunol.7:625-655)。另外，據(jù)信TNFα參與各種各樣的其它人類疾病和紊亂的病理生理學(xué)，包括膿毒癥、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(參見例如Moeller,A等(1990)Cytokine2:162-169；Moeller等的美國專利5,231,024號；Moeller,A.等的歐洲專利公開260 610 B1號，Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:411-452;Tracey,K.J.和Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503)。
由于人TNFα(hTNFα)在各種各樣的人體紊亂中的有害作用，已設(shè)計(jì)治療策略以抑制或抵消hTNFα的活性。特別是，已尋找與hTNFα結(jié)合或中和hTNFα的抗體做為抑制hTNFα活性的手段。一些最早的這種抗體是由用hTNFα免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤分泌的小鼠單克隆抗體(mAbs)(參見例如HahnT等，(1985)Proc Natl Acad SciUSA 82:3814-3818；Liang,C-M.等(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137:847-854;Hirai,M.等(1987),Immunol.Methods96:57-62；Fendly,B.M.等(1987)Hybridoma6:359-370;Moeller,A等(1990)Cytokine2:162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024號；Wallach,D.的歐洲專利公開186 833 B1號；Old等的歐洲專利申請公開218868A1號；Moeller,A.等的歐洲專利公開260610B1號)。雖然這些小鼠抗hTNFα抗體經(jīng)常展示與hTNFα的高親和力(例如Kd≤10-9M)并能夠中和hTNFα活性，但它們的體內(nèi)使用受與給與人類小鼠抗體相關(guān)的問題所限制，所述問題例如為血清半衰期短、不能觸發(fā)某些人體效應(yīng)物的功能和引出不想要的人體內(nèi)抗該小鼠抗體的免疫應(yīng)答(“人抗鼠抗體”(HAMA)反應(yīng))。
為試圖克服與在人體內(nèi)使用全鼠抗體相關(guān)的問題，已對鼠抗hTNFα抗體進(jìn)行遺傳工程使其更“人類化”。例如，已制備嵌合抗體，其中抗體鏈的可變區(qū)為鼠源，而抗體鏈的恒定區(qū)為人源(Knight,D.M等(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453;Daddona,PE等的PCT公開WO92/16553號)。另外，也已制備人化抗體，其中所述抗體可變區(qū)的超變域?yàn)槭笤矗隹勺儏^(qū)的其余部分和所述抗體恒定區(qū)為人源(Adair,J.R.等的PCT公開WO92/11383號)。然而，因?yàn)檫@些嵌合抗體和人化抗體仍然保留一些鼠序列，因此它們?nèi)匀豢赡芤霾幌胍拿庖叻磻?yīng)，即人抗嵌合抗體(HACA)反應(yīng)，特別是當(dāng)長期給藥時(shí)，例如用于慢性適應(yīng)癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(參見例如Elliott,M.J.等(1994)Lancet344:1125-1127；Elliot,M.J.等(1994)Lancet344:1105-1110)。
優(yōu)于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗體或人化抗體)的hTNFα抑制劑可以是完全人類抗hTNFα抗體，因?yàn)檫@種藥劑甚至在長期給與時(shí)也不會引起該HAMA反應(yīng)。已使用人類雜交瘤技術(shù)制備了抗hTNFα人單克隆自身抗體(Boyle,P.等(1993)Cell.Immunol.152:556-568；Boyle,P.等(1993)Cell.Immunol.152:569-581;Boyle等的歐洲專利申請公開614984A2號)。然而，據(jù)報(bào)道這些雜交瘤來源的單克隆自身抗體對hTNFα的親和性太低，以致于不能用常規(guī)方法計(jì)算，不能結(jié)合可溶性hTNFα并且不能中和hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(參見Boyle等；見上述)。另外，人雜交瘤技術(shù)的成功取決于產(chǎn)生hTNFα特異性自身抗體的淋巴細(xì)胞在人外周血中的自然存在。某些研究已在人類對象中檢測到抗hTNFα血清自身抗體(Fomsgaard,A.等(1989)Scand.J.Immunol.30:219-223;Bendtzen,K.等(1990)Prog.Leukocyte Biol.10B:447-452)，而其它的研究未檢測到(Leusch,H-G．等(1991)，Immunol.Methods139:145-147)。
除自然發(fā)生的人抗hTNFα抗體之外的另一選擇是重組hTNFα抗體。已描述了以相對低親和性(即Kd～10-7M)和快解離速率(即Koff～10-2秒-1)結(jié)合hTNFα的重組人抗體(Griffiths,A.D．等(1993)EMBOJ.12:725-734)。然而，由于它們的相對快速解離的動力學(xué)，這些抗體可能不適于治療用途。另外，已描述了一種重組人抗hTNFα，它不中和hTNFα活性，卻增強(qiáng)hTNFα與細(xì)胞表面的結(jié)合并增強(qiáng)hTNFα內(nèi)在化(Lidbury,A．等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45;Aston,R．等的PCT公開WO92/03145號)。
因此，仍然需要以高親和性和慢解離動力學(xué)地結(jié)合可溶性hTNFα并具有中和hTNFα活性包括hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(體外和體內(nèi))和hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活的能力的人抗體，諸如重組人抗體。
發(fā)明概要本發(fā)明提供特異性與人TNFα結(jié)合的人抗體，最好是重組人抗體。本發(fā)明抗體的特征為高親和性和慢解離動力學(xué)地與hTNFα結(jié)合和中和hTNFα的活性，包括hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(體外和體內(nèi))和hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活。本發(fā)明抗體的其它特征為與hTNFα而非hTNFβ(淋巴細(xì)胞毒素)結(jié)合并具有與除人TNFα之外的其它靈長類TNFα和非靈長類TNFα結(jié)合的能力。
本發(fā)明的抗體可以是全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結(jié)合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)。本發(fā)明最優(yōu)選的重組抗體D2E7稱為D2E7，有一包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的輕鏈CDR3域和一包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重鏈CDR3域。該D2E7抗體最好具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于1×10-8M的Kd和不高于1×10-3s-1的Koff速率常數(shù)(均由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離，并在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-7M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。該分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分更優(yōu)選地以不高于5×10-4s-1、甚至更優(yōu)選地以不高于1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。更優(yōu)選的是，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-8M、甚至更優(yōu)選地以不高于1×10- 9M、甚至再更優(yōu)選地以不高于5×10-10M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有以下特征的人抗體或其抗原結(jié)合部分:
a)以不高于1×10-3s-1的Koff(由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1-5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID ID NO:3修飾的氨基酸序列；c)具有一重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1-5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。
更優(yōu)選的是，該抗體或其抗原結(jié)合部分以不高于5×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。再更優(yōu)選的是，該抗體或其抗原結(jié)合部分以不高于1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人抗體或其抗原結(jié)合部分，其LCVR具有的CDR3域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列，其HCVR具有的CDR3域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。更優(yōu)選地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2域，并且該HCVR另外具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域。再更優(yōu)選地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1域，并且該HCVR具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的LCVR和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCVR的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。在某些實(shí)施方案中，該抗體具有一IgG1重鏈恒定區(qū)或一IgG4重鏈恒定區(qū)。在其它實(shí)施方案中，該抗體是一Fab片段、一F(ab’)2片段或一單鏈Fv片段。
在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其LCVR具有選自以下氨基酸序列的一個(gè)CDR3域SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或其HCVR具有選自以下氨基酸序列的一個(gè)CDR3域:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供中和人TNFα而非人TNFβ(淋巴細(xì)胞毒素)活性的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。在一最佳實(shí)施方案中，該人抗體或其抗原結(jié)合部分中和人TNFα、黑猩猩TNFα和選自以下的至少一種其它的靈長類TNFα的活性狒狒TNFα、狨TNFα、獼猴TNFα和恒河猴TNFα。最好是，該抗體亦中和至少一種非靈長類TNFα的活性。例如，在一分實(shí)施方案(subembodiment)中，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分亦中和犬TNFα的活性。在另一分實(shí)施方案中，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分亦中和豬TNFα的活性。在再一分實(shí)施方案中，該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分亦中和小鼠TNFα的活性。
本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子編碼D2E7 LCVR，具有圖7和SEQ IDNO:36所示的核苷酸序列。本發(fā)明的另一優(yōu)選核酸分子編碼D2E7HCVR，具有圖8和SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列。本發(fā)明亦包含攜帶本發(fā)明抗體編碼核酸的重組表達(dá)載體、導(dǎo)入這種載體的宿主細(xì)胞，也包括通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的抗體的方法。
本發(fā)明的再一方面涉及使用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分抑制人TNFα活性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分接觸人TNFα，使得抑制人TNFα活性。在另一實(shí)施方案中，該方法包括將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分給與患病(其中TNFα活性是有害的)的人類受治療者，使得抑制該人類受治療者中的人TNFα活性。該疾病可以是例如膿毒癥、自身免疫疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，變態(tài)反應(yīng)，多發(fā)性硬化，自身免疫性糖尿病，自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥)、傳染性疾病、惡性腫瘤、移植物排斥或移植物抗宿主病、肺功能紊亂、骨疾病、腸功能紊亂或心臟功能紊亂。
附圖簡述

圖1A和1B展示了下述的氨基酸序列D2E7的輕鏈可變區(qū)(D2E7VL；亦示于SEQ ID NO:1)、D2E7 VL的丙氨酸掃描突變體(LD2E7*.A1、LD2E7*.A3、LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8)、D2E7相關(guān)抗體2SD4的輕鏈可變區(qū)(2SD4VL；亦示于SEQ ID NO:9)和其它D2E7相關(guān)輕鏈可變區(qū)(EPB12、VL10E4、VL100A9、VL100D2、VL10F4、LOE5、VLLOF9、VLLOF10、VLLOG7、VLLOG9、VLLOH1、VLLOH10、VL1B7、VL1C1、VL1C7、VL0.1F4、VL0.1H8、LOE7、LOE7.A和LOE7.T)。圖1A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。圖1B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述輕鏈CDR1(“CDRL1”)、CDR2(“CDRL2”)和CDR3(“DRL3”)域位于框內(nèi)。
圖2A和2B展示了下述的氨基酸序列:D2E7的重鏈可變區(qū)(D2E7VH；亦示于SEQ ID NO:2)、D2E7 VH的丙氨酸掃描突變體(HD2E7*.A1、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和HD2E7*.A9)、D2E7相關(guān)抗體2SD4的重鏈可變區(qū)(2SD4VH；亦示于SEQ ID NO:10)和其它D2E7相關(guān)重鏈可變區(qū)(VH1B11、VH1D8、VH1A11、VH1B12、VH1-D2、VH1E4、VH1F6、VH1G1、3C-H2、VH1-D2.N和VH1-D2.Y)。圖2A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。圖2B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述重鏈CDR1(“CDR H1”)、CDR2(“CDR H2”)和CDR3(“CDR H3”)域位于框內(nèi)。
圖3是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性的抑制。
圖4是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對rhTNFα與U-937上的hTNFα受體結(jié)合的抑制。
圖5是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上表達(dá)的抑制。
圖6是一柱狀圖表，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK195(空心柱)相比，通過給與人抗hTNFα抗體D2E7(實(shí)心柱)保護(hù)D-半乳糖胺致敏小鼠免受TNFα誘導(dǎo)的致死性。
圖7展示D2E7的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預(yù)期的氨基酸序列。在所述CDRL1、CDRL2和CDRL3區(qū)下劃線。
圖8展示D2E7的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預(yù)期的氨基酸序列。在所述CDRH1、CDRH2和CDRH3區(qū)下劃線。
圖9是一曲線圖，描述D2E7抗體治療對做為多關(guān)節(jié)炎模型的Tg197轉(zhuǎn)基因小鼠平均關(guān)節(jié)尺寸的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及以高親和性、低解離速率和高中和能力地與人TNFα結(jié)合的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的各個(gè)方面涉及抗體和抗體片段以及其藥用組合物、以及制備這種抗體和片段的核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明亦包括用本發(fā)明的抗體檢測人TNFα或在體外或體內(nèi)抑制人TNFα活性。
為更易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。
本文所用的術(shù)語“人TNFα”(本文縮寫為hTNFα或簡單地寫為hTNF)是指以17kD分泌形式和26kD膜結(jié)合形式存在的人細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性形式由非共價(jià)鍵連接的17kD分子的三聚體組成。hTNFα的結(jié)構(gòu)另外描述于例如Pennica,D．等(1984)Nature312:724-729;Davis,J.M．等(1987)Biochemistry26:1322-1326；和Jones,EY．等(1989)Nature338:225-228。術(shù)語人TNFα包括重組人TNFα(rhTNFα)，它可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)方法制備或購買得到(R&D Systems，目錄號210-TA,Minneapolis,MN)。
本文所用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子，它們由四條多肽鏈組成，即由二硫鍵相互連接的二條重鏈(H)和二條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。該重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。該輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域即CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步劃分為超變區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，其間散布著更為保守的稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它從氨基末端至羧基末端的排布順序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本文所用的抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)指保留與抗原(例如hTNFα)特異性結(jié)合能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已發(fā)現(xiàn)可以由全長抗體的片段行使抗體的抗原結(jié)合功能。在抗體的“抗原結(jié)合部分”術(shù)語中包括的結(jié)合片段的例子包括:(ⅰ)一個(gè)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域組成的單價(jià)片段；(ⅱ)一個(gè)F(ab’)2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的二個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(ⅲ)一個(gè)Fd片段，由VH和CH1域組成；(ⅳ)一個(gè)Fv片段，由抗體單臂的VL和VH域組成；(ⅴ)一個(gè)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由一個(gè)VH域組成；和(ⅵ)一個(gè)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。另外，盡管該Fv片段的二個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由獨(dú)立的基因編碼，但可以采用重組方法用能使它們成為單蛋白鏈的合成接頭將它們連接，在該單蛋白鏈中所述VL和VH區(qū)配對形成單價(jià)分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體亦包含于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之中。亦包括其它形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙抗體是二價(jià)的雙特異性抗體，其中VH和VL域表達(dá)于一個(gè)多肽單鏈上，但所用的接頭太短使得同一鏈上的這二個(gè)結(jié)構(gòu)域不能配對，因此迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對而創(chuàng)造出二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如Holliger,P．等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J．等(1994)Sructure2:1121-1123)。
另外，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是一個(gè)較大的免疫粘附分子的一部分，該分子由該抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其它蛋白或肽通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成。這種免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白鏈菌素核心區(qū)制備四聚體scFv分子(Kipriyanov,S.M．等(1995)HumanAntibodies and Hybridomas6:93-101)和使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端多組氨酸標(biāo)記制備二價(jià)生物素化scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)?？梢圆捎贸Ｒ?guī)技術(shù)例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體，從完整抗體制備諸如Fab和F(ab’)2片段的抗體部分。另外，可以按照本文描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。
本文使用的術(shù)語“人抗體”包括具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，本文使用的術(shù)語“人抗體”不包括其中CDR序列得自其它哺乳動物種(例如小鼠)并已被移植至人框架序列的抗體。
本文使用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的所有人抗體，例如用轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在以下第Ⅱ節(jié)進(jìn)一步描述)、從重組、聯(lián)合人抗體文庫中分離的抗體(在以下第Ⅲ節(jié)進(jìn)一步描述)、從用人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor,L.D．等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的抗體。這種重組人抗體具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，對這種重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因動物時(shí)為體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此所述重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是那些雖然得自人種系VH和VL序列并與之相關(guān)、但在體內(nèi)的人抗體種系的所有組成部分中都不天然存在+的序列。
本文使用的“分離抗體”是指大致不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結(jié)合hTNFα的分離抗體大致不含有與hTNFα之外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而，與hTNFα特異性結(jié)合的分離抗體具有對其它抗原(例如來自其它種的hTNFα)的交叉反應(yīng)性(在以下詳細(xì)討論)。另外，分離抗體可以大致不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。
本文使用的“中和抗體”(或“中和hTNFα活性的抗體”)是指與hTNFα結(jié)合導(dǎo)致hTNFα的生物學(xué)活性被抑制的抗體。這種對hTNFα生物學(xué)活性的抑制可以通過測定hTNFα生物學(xué)活性的一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，所述指標(biāo)例如hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(或者體外或者體內(nèi))、hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活和hTNFα與hTNFα受體的結(jié)合。可以通過本領(lǐng)域已知的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)檢測評價(jià)這些hTNFα生物學(xué)活性指標(biāo)(參見實(shí)施例4)。最好是，通過抑制hTNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性評價(jià)抗體中和hTNFα活性的能力。做為另一個(gè)或者二者擇一的hTNFα活性指標(biāo)，可以評價(jià)抗體抑制hTNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上的表達(dá)的能力，做為hTNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活的量度。
本文使用的術(shù)語“表面等離子體激元共振”是指一光學(xué)現(xiàn)象，它允許通過例如使用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden和Piscataway,NJ)檢測在生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的改變進(jìn)行實(shí)時(shí)生物特異性相互作用分析。有關(guān)進(jìn)一步的描述，參見實(shí)施例1和J nsson,U．等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Jnsson,U.等(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson,B.等(1995)J,Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B．等(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
本文使用的術(shù)語“Koff”是指抗體從所述抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。
本文使用的術(shù)語“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。
本文使用的術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA。
本文使用的與編碼結(jié)合hTNFα的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸有關(guān)的術(shù)語“分離核酸分子”是指下述核酸分子，其中編碼該抗體或抗體部分的核苷酸序列不含其它編碼與hTNFα之外的抗原結(jié)合的抗體或抗體部分的核苷酸序列，所述其它序列可能在人基因組DNA中天然位于該核酸的側(cè)翼。因此，例如編碼抗TNFα抗體的VH區(qū)的本發(fā)明的分離核酸分子不含任何其它編碼與TNFα之外的抗原結(jié)合的其它VH區(qū)的序列。
本文使用的術(shù)語“載體”是指有能力運(yùn)送與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是“質(zhì)粒”，是指其中可以連接其它DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一類型是病毒載體，其中在病毒基因組中可以連接其它DNA片段。某些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)可以在導(dǎo)入該宿主細(xì)胞時(shí)被整合入該宿主細(xì)胞的基因組，由此可以與該宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這種載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“表達(dá)載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體的常見形式為質(zhì)粒。在本說明書中，可以將“質(zhì)?！焙汀拜d體”互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括具有相同的功能的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本文使用的術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”是指導(dǎo)入了重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)理解這種術(shù)語不僅指特定的對象細(xì)胞，而且指這種細(xì)胞的后代。因?yàn)樵诤罄m(xù)世代中由于或者突變或者環(huán)境影響可能發(fā)生某些修飾，事實(shí)上這種后代可以與親本細(xì)胞不同，但卻仍然包含于本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍之內(nèi)。
在下面的小節(jié)中更詳細(xì)地描述本發(fā)明的各種方面。Ⅰ．與人TNFα結(jié)合的人抗體本發(fā)明提供以高親和性、低解離速率和高中和能力與人TNFα結(jié)合的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的人抗體優(yōu)選地是重組的、中和人抗TNFα抗體。最優(yōu)選的本發(fā)明重組中和抗體在本文中稱為D2E7并具有圖1A、1B和圖2A、2B分別展示的VL和VH序列(D2E7 VL區(qū)的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO:1;D2E7 VH區(qū)的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO:2)。以下概述了與表現(xiàn)出高親和性和低解離動力學(xué)的鼠抗hTNFαMAK195mAb和另一個(gè)與D2E7、2SD4有關(guān)的人抗hTNFα抗體相比的D2E7的結(jié)合特性
在用幾種體外和體內(nèi)檢測評價(jià)時(shí)，該D2E7抗體及其相關(guān)抗體亦表現(xiàn)出強(qiáng)大的中和hTNFα活性的能力(參見實(shí)施例4)。例如，這些抗體中和hTNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性的IC50值的范圍為約10-7M至約10-10M。當(dāng)D2E7以全長IgG1抗體表達(dá)時(shí)，中和hTNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性的IC50值的范圍為約1.25×10-10M。另外，當(dāng)以Fab、F(ab’)2或scFv片段表達(dá)該抗體時(shí)，保持D2E7的中和能力。D2E7亦抑制通過hTNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上的表達(dá)測定的TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活(IC50=約1.85×10-10M)和hTNFα與U-937細(xì)胞上的hTNFα受體的結(jié)合(IC50=約1.56×10-10M)。關(guān)于后者，D2E7抑制hTNFα與p55和p75 hTNFα受體的結(jié)合。另外，該抗體抑制hTNFα在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的致死性(ED50=1-2.5μg/小鼠)。
關(guān)于D2E7的結(jié)合特異性，該抗體與各種形式的人TNFα結(jié)合，包括可溶性hTNFα、跨膜hTNFα和結(jié)合至細(xì)胞受體的hTNFα。D2E7不特異性地與其它細(xì)胞因子結(jié)合，例如淋巴細(xì)胞毒素(TNFβ)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFNγ和TGFβ。然而，D2E7確實(shí)表現(xiàn)出對來自其它物種的腫瘤壞死因子的交叉反應(yīng)性。例如，該抗體以與中和hTNFα大致相同的IC50值中和至少五種靈長類(黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恒河猴)TNFα的活性(參見實(shí)施例4，E小節(jié))。D2E7亦中和小鼠TNFα的活性，盡管其效果比中和人TNFα低1000倍(參見實(shí)施例4，E小節(jié))。D2E7亦結(jié)合犬和豬TNFα。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及D2E7抗體和抗體部分、D2E7相關(guān)抗體和抗體部分和其它具有與D2E7相同性質(zhì)(例如以低解離動力學(xué)和高中和能力高親和性地與hTNFα結(jié)合)的其它人抗體和抗體部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于1×10-8M的Kd和不高于1×10-3s-1的Koff速率常數(shù)(均由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離，并在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-7M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分更優(yōu)選地以不高于5×10-4s-1、甚至更優(yōu)選地以不高于1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。該分離人抗體或其抗原結(jié)合部分更優(yōu)選地在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-8M、甚至更優(yōu)選地以不高于1×10-9M、再更優(yōu)選地以不高于5×10-10M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，該抗體是分離人重組抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一最佳實(shí)施方案中，如用標(biāo)準(zhǔn)體外檢測進(jìn)行TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上表達(dá)所評價(jià)的，該抗體亦中和TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞激活。
可以按照實(shí)施例1所述，進(jìn)行測定Kd和Koff的表面等離子體激元共振分析。在實(shí)施例4的A小節(jié)中描述了測定IC50值的標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測。在實(shí)施例4的C小節(jié)中描述了TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)體外檢測。符合或預(yù)期符合上述動力學(xué)和中和標(biāo)準(zhǔn)的重組人抗體的例子包括具有下述[VH/VL]對的抗體，其序列示于圖1A、1B、2A和2B(有關(guān)動力學(xué)和中和分析亦可參見實(shí)施例2、3和4):[D2E7VH/D2E7VL]；[HD2E7*.A1/D2E7VL],[HD2E7*.A2/D2E7VL],[HD2E7*.A3/D2E7VL],[HD2E7*.A4/D2E7VL],[HD2E7*.A5/D2E7VL],[HD2E7*.A6/D2E7VL],[HD2E7*.A7/D2E7VL],[HD2E7*.A8/D2E7VL],[HD2E7*.A9/D2E7VL],[D2E7VH/LD2E7*.A1],[D2E7VH/LD2E7*.A4],[D2E7VH/D2E7*.A5],[D2E7VH/D2E7*.A7],[D2E7VH/LD2E7*.A8],[HD2E7*.A9/LD2E7*.A1],[VH1-D2/LOE7],[VH1-D2.N/LOE7.T],[VH1-D2.Y/LOE7.A],[VH1-D2.N/LOE7.A],[VH1-D2/EPB12]和[3C-H2/LOE7]。
本領(lǐng)域眾所周知抗體重鏈和輕鏈CDR3域在抗體與抗原結(jié)合的特異性/親和性方面起重要作用。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及具有與hTNFα結(jié)合的低解離動力學(xué)并具有與D2E7的CDR3域在結(jié)構(gòu)上相同或相關(guān)的輕鏈和重鏈CDR3域的人抗體。正如實(shí)施例3中證明的，D2E7VLCDR3的位置9可以被Ala或Thr占據(jù)而基本上不影響Koff。因此，D2E7VLCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO:3)。另外，D2E7VH CDR3的位置12可以被Tyr或Asn占據(jù)而基本上不影響Koff。D2E7VHCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ ID NO:4)。另外，正如在實(shí)施例2中證明的，D2E7重鏈和輕鏈的CDR3域可以經(jīng)受用一個(gè)單丙氨酸殘基置換(在該VL CDR3內(nèi)的1、4、5、7或8位，或在該VH CDR3內(nèi)的2、3、4、5、6、8、9、10或11位)而基本上不影響該Koff。另外，技術(shù)人員會理解，已知D2E7VL和VH的CDR3域?qū)Ρ彼嶂脫Q的經(jīng)受性，則在仍然保持該抗體的低解離速率常數(shù)時(shí)在所述CDR3域內(nèi)的其它氨基酸置換也是可能的，特別是用保守氨基酸置換。本文使用的“保守氨基酸置換”是指其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有類似側(cè)鏈的氨基酸取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中定義，它們包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。優(yōu)選在D2E7VL和/或VH的CDR3域內(nèi)制造不超過1至5個(gè)保守氨基酸置換。更優(yōu)選在D2E7VL和/或VH CDR3域內(nèi)制造不超過1至3個(gè)保守氨基酸置換。另外，不應(yīng)在對與hTNFα結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位置進(jìn)行保守氨基酸置換。如實(shí)施例3所示，看來該D2E7VL CDR3的位置2和5以及該D2E7VH CDR3的位置1和7對與hTNFα相互作用是關(guān)鍵的，因此最好不在這些位置進(jìn)行保守氨基酸置換(盡管在該D2E7VL CDR3的位置5的丙氨酸置換是可以接受的，如上所述)。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有以下特征的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分a)以不高于1×10-3s-1的Koff速率常數(shù)(由表面等離子體激元共振測定與人TNFα解離；b)具有的輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列。
c)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。
更優(yōu)選地是，該抗體或其抗原結(jié)合部分以不高于5×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。甚至更優(yōu)選地是，該抗體或其抗原結(jié)合部分以不高于1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有的CDR3域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列，其重鏈可變區(qū)(HCVR)具有的CDR3域包含SEQID NO:4的氨基酸序列、或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。優(yōu)選地是，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VL CDR2)，并且該HCVR另外具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VH CDR2)。甚至更優(yōu)選地是，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VLCDR1)，并且該HCVR具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VH CDR1)。VL的框架區(qū)優(yōu)選來自VK1人種系家族，更優(yōu)選來自A20人種系Vk基因，最優(yōu)選來自示于圖1A和1B的該D2E7VL框架序列。VH的框架區(qū)優(yōu)選來自VH3人種系家族，更優(yōu)選來自DP-31人種系VH基因，最優(yōu)選來自示于圖2A和2B的該D2E7VH框架序列。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(即D2E7VL)的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(即D2E7 VH)的重鏈可變區(qū)(HCVR)的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含一重鏈恒定區(qū)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地是，該重鏈恒定區(qū)是IgG1重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)。另外，該抗體可以包含一輕鏈恒定區(qū)，或者κ輕鏈恒定區(qū)或者λ輕鏈恒定區(qū)。最好是，該抗體包含κ輕鏈恒定區(qū)。另一方面，該抗體部分可以是例如一Fab片段或一單鏈Fv片段。
在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有D2E7相關(guān)VL和VH的CDR3域的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，例如，其輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有包含選自以下氨基酸序列的CDR3域的抗體或其抗原結(jié)合部分SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26或其重鏈可變區(qū)(HCVR)具有包含選自以下氨基酸序列的CDR3域SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供中和人TNFα而非人TNFβ活性的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分。最好是抗體或其抗原結(jié)合部分亦中和黑猩猩TNFα和選自以下的至少一種其它靈長類TNFα的活性狒狒TNFα、狨TNFα、獼猴TNFα和恒河猴TNFα。該抗體或其抗原結(jié)合部分在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中中和人、黑猩猩和/或另一靈長類TNFα?xí)r的IC50優(yōu)選為不高于1×10-8M，更優(yōu)選為不高于1×10-9M，甚至更優(yōu)選為不高于5×10-10M。在一個(gè)分實(shí)施方案中，該抗體亦中和犬TNFα的活性，它在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中的IC50優(yōu)選為不高于1×10-7M，更優(yōu)選為不高于1×10-8M，甚至更優(yōu)選為不高于5×10-9M。在另一分實(shí)施方案中，該抗體亦中和豬TNFα的活性，其IC50優(yōu)選為不高于1×10-5M，更優(yōu)選為不高于1×10-6M，甚至更優(yōu)選為不高于5×10-7M。在再一分實(shí)施方案中，該抗體亦中和小鼠TNFα的活性，其IC50優(yōu)選為不高于1×10-4M，更優(yōu)選為不高于1×10-5M，甚至更優(yōu)選為不高于5×10-6M。
可以將本發(fā)明的抗體或抗體部分衍生為或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白)。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分包括本文描述的人抗hTNFα抗體的衍生的和其它修飾的形式，包括免疫粘附分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以功能性地連接(通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)結(jié)合或其它)至一個(gè)或多個(gè)其它分子實(shí)體，例如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、可檢測藥劑、細(xì)胞毒藥劑、藥用藥劑和/或可以介導(dǎo)該抗體或抗體部分與另一分子結(jié)合的蛋白或肽(例如抗生蛋白鏈菌素核心區(qū)或多組氨酸標(biāo)記)。
一種類型的衍生抗體是通過交聯(lián)二個(gè)或多個(gè)抗體(同一類型或不同類型，例如創(chuàng)造雙特異性抗體)制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑包括那些雜雙官能的、具有二個(gè)由適當(dāng)隔離物分隔的獨(dú)特反應(yīng)基團(tuán)(例如鄰馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙官能的(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)?？梢詮腜ierce Chemical Company,Rockford,IL得到這些接頭。
可以用于衍生本發(fā)明抗體或抗體部分的可檢測劑包括熒光化合物。典型的熒光可檢測劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白等等。亦可以用可檢測酶衍生抗體，所述酶為例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶等等。當(dāng)用可檢測酶衍生抗體時(shí)，通過加入該酶用于產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的另外的試劑檢測該抗體。例如，當(dāng)有可檢測劑辣根過氧化物酶時(shí)，加入過氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺產(chǎn)生可檢測的有色反應(yīng)產(chǎn)物。亦可以用生物素衍生抗體，并通過間接測定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結(jié)合檢測。Ⅱ．抗體表達(dá)可以通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和重鏈制備本發(fā)明的抗體或抗體部分。為重組表達(dá)抗體，用攜帶編碼該抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使所述輕鏈和重鏈在該宿主細(xì)胞中表達(dá)并最好分泌至培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，可以從該培養(yǎng)基回收所述抗體。使用了諸如Sambrook,Fritsch和Maniatis(編輯)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港，紐約，(1989),Ausubel,F.M．等(編輯)分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，Greene Publishing Associates,(1989)和Boss等的美國專利4,816,397號描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法，以獲得抗體重鏈和輕鏈基因、將這些基因加入重組表達(dá)載體并將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
為表達(dá)D2E7或D2E7相關(guān)抗體，首先獲得編碼所述輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA片段。可以通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和修飾種系輕鏈和重鏈可變序列制備這些DNA。本領(lǐng)域已知道人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列(參見例如“Vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫；亦可參見Kabat,EA．等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242;Tomlinson,IM．等(1992)“人種系VH序列的所有組成部分揭示約50組具有不同超變環(huán)的VH區(qū)段”J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等(1994)“人種系VK區(qū)段的目錄揭示在其使用中的強(qiáng)偏差”Eur.J.Immunol.24:827-836；其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。為獲得編碼該D2E7或D2E7相關(guān)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增人種系VH基因的VH3家族的一員。最優(yōu)選地是，擴(kuò)增DP-31VH種系序列。為獲得編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增人種系VL基因的VKI家族的一員。最優(yōu)選地，擴(kuò)增A20 VL種系序列?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法、根據(jù)上述引用參考文獻(xiàn)中公開的核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增DP-31種系VH和A20種系VL序列的適當(dāng)PCR引物。
一旦得到所述種系VH和VL片段后，可以使這些序列突變以編碼本文公開的所述D2E7或D2E7相關(guān)氨基酸序列。首先將由種系VH和VL DNA序列編碼的氨基酸序列與所述D2E7或D2E7相關(guān)VH和VL氨基酸序列比較，以鑒別在所述D2E7或D2E7相關(guān)序列中與種系不同的氨基酸殘基。然后，使用遺傳密碼確定應(yīng)改變的核苷酸，將所述種系DNA序列的適當(dāng)核苷酸突變，使得該突變種系序列編碼該D2E7或D2E7相關(guān)氨基酸序列。通過標(biāo)準(zhǔn)方法例如PCR介導(dǎo)的誘變(其中將所述突變核苷酸加入所述PCR引物，使得所述PCR產(chǎn)物含有所述突變)或定點(diǎn)誘變進(jìn)行所述種系序列的誘變。
另外，應(yīng)注意如果該通過PCR擴(kuò)增得到的“種系”序列在框架區(qū)編碼的氨基酸與真正的種系構(gòu)型不同(即例如由于體細(xì)胞突變，與真正的種系序列相比擴(kuò)增序列中有差異)，可能最好將這些氨基酸差異變回真正的種系序列(即框架殘基“回復(fù)突變”至該種系構(gòu)型)。
一旦得到編碼D2E7或D2E7相關(guān)VH和VL片段的DNA片段(按上述，通過擴(kuò)增和誘變種系VH和VL基因)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如，將所述可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，將VL或VH編碼DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白(例如抗體恒定區(qū)或撓性接頭)的另一DNA片段。本文使用的術(shù)語“可操作地連接”是指連接這二個(gè)DNA片段使3得由這二個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持在框架中。
通過可操作地將該VH編碼DNA連接至另一編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的DNA分子，可以將編碼該VH區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)變?yōu)槿L重鏈基因。本領(lǐng)域已知道人重鏈恒定區(qū)基因序列(參見例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNO.91-3242),并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得包含這些區(qū)的DNA片段。該重鏈恒定區(qū)可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最好是IgG1或IgG4恒定區(qū)。關(guān)于Fab片段重鏈基因，可以將該VH編碼DNA可操作地連接至僅編碼該重鏈CH1恒定區(qū)的另一DNA分子。
通過可操作地將該VL編碼DNA連接至另一編碼該輕鏈恒定區(qū)CL的DNA分子，可以將編碼該VL區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)變?yōu)槿L輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。本領(lǐng)域已知道人輕鏈恒定區(qū)基因序列(參見例如Kabat,EA.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNO.91-3242)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得包含這些區(qū)的DNA片段。該輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但最好是κ恒定區(qū)。
為制備scFv基因，將所述VH和VL編碼DNA片段可操作地連接至編碼撓性接頭(例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得該VH和VL序列做為相連單鏈蛋白表達(dá)，由該撓性接頭連接所述VL和VH區(qū)(參見例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883;McCafferty等，Nature(1990)348:552-554)。
為表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分，將上述得到的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體，使得所述基因可操作地連接至轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯控制序列。在本文中，術(shù)語“可操作地連接”是指抗體基因連接至載體中，使得該載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的既定功能。選擇該表達(dá)載體和表達(dá)控制序列使之與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？梢詫⒃摽贵w輕鏈和該抗體重鏈插入單獨(dú)的載體中，或更常用的是將這兩個(gè)基因插入同一載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如連接該抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制位點(diǎn)、或如果沒有限制位點(diǎn)就進(jìn)行平端連接)將所述抗體基因插入該表達(dá)載體。在插入該D2E7或D2E7相關(guān)輕鏈或重鏈序列之前，該表達(dá)載體可以已經(jīng)攜帶抗體恒定區(qū)序列。例如，將該D2E7或D2E7相關(guān)序列轉(zhuǎn)變?yōu)槿L抗體基因的一個(gè)方法是，將它們分別插入已經(jīng)編碼重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體，使得該VH區(qū)段可操作地連接至該載體內(nèi)的CH區(qū)段并使該VL區(qū)段可操作地連接至該載體內(nèi)的CL區(qū)段。另外或二者擇一地，該重組表達(dá)載體可以編碼便于該抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？梢詫⒃摽贵w鏈基因克隆入該載體，使得該信號肽在框架內(nèi)連接至該抗體鏈基因的氨基末端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。
除所述抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶控制所述抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強(qiáng)子和控制所述抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯的其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序列例如描述于Goeddel;GeneExpression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,SanDiego,CA(1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解該表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包括選擇調(diào)節(jié)序列)可以取決于種種因素，例如選擇欲轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需蛋白的表達(dá)水平等。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)在哺乳動物細(xì)胞中高水平蛋白表達(dá)的病毒元件，例如來自巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)和多形瘤的啟動子和/或增強(qiáng)子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述，參見例如Stinski的美國專利5,168,062號、Bell等的美國專利4,510,245號和Schaffner等的美國專利4,968,615號。
除所述抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶其它序列，例如在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)該載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。該選擇標(biāo)記基因便于選擇已導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞(參見例如Axel等的美國專利4,399,216、4,634,665和5,179,017號)。例如，一般該選擇標(biāo)記基因賦予已導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞對藥物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因用于G418選擇)。
為表達(dá)所述輕鏈和重鏈，將編碼所述重鏈和輕鏈的表達(dá)載體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式涵蓋了眾多的各種用于將外源基因?qū)朐嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞的常用技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。盡管理論上可以在或者原核宿主細(xì)胞或者真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但最優(yōu)選在真核細(xì)胞中、最優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)抗體，因?yàn)檫@種真核細(xì)胞、特別是哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更有可能裝配和分泌正確折疊和具免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道抗體基因原核表達(dá)在活性抗體的高產(chǎn)率生產(chǎn)方面是低效的(Boss,M.A．和Wood,C.R.(1985)Immunology Today6:12-13)。
優(yōu)選的表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠子宮(CHO)細(xì)胞(包括dhfr-CHO細(xì)胞，描述于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad Sci.USA77:4216-4220,與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，例如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞時(shí)，通過培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞足夠時(shí)間以在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，或更優(yōu)選地將該抗體分泌到所述宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中生產(chǎn)所述抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法可以從該培養(yǎng)基中回收抗體。
亦可以用宿主細(xì)胞生產(chǎn)完整抗體的部分，例如Fab片段或scFv分子。應(yīng)理解上述方法的變化亦屬于本發(fā)明的范圍。例如，可能最好用編碼本發(fā)明抗體的或者輕鏈或者重鏈(但不是兩者)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。亦可以用重組DNA技術(shù)除去編碼對與hTNFα結(jié)合非必需的或者輕鏈或者重鏈或者這二者的一些或全部DNA。本發(fā)明的抗體亦包括從這種截短的DNA分子表達(dá)的分子。另外，通過用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)交聯(lián)方法交聯(lián)本發(fā)明的抗體和第二抗體，可以生產(chǎn)雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，另一條重鏈和另一條輕鏈對非hTNFα的抗原具特異性。
在一重組表達(dá)本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的推薦系統(tǒng)中，通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將既編碼該抗體重鏈又編碼該抗體輕鏈的重組表達(dá)載體導(dǎo)入dhfr-CHO細(xì)胞。在該重組表達(dá)載體中，所述抗體重鏈和輕鏈基因都可操作地連接至增強(qiáng)子/啟動子調(diào)節(jié)元件(例如來自SV40、CMV、腺病毒等等的，例如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件)以驅(qū)動所述基因的高水平轉(zhuǎn)錄。該重組表達(dá)載體亦攜帶DHFR基因，它使得可以用氨甲蝶呤選/擴(kuò)增選擇已用該載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)該選出的轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞以表達(dá)所述抗體重鏈和輕鏈，并從該培養(yǎng)基中回收完整抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備該重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞、選擇轉(zhuǎn)化體、培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從該培養(yǎng)基中回收該抗體。
鑒于前述，本發(fā)明的另一方面涉及可以用于重組表達(dá)本發(fā)明抗體和抗體部分的核酸、載體和宿主細(xì)胞組合。編碼該D2E7輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列示于圖7和SEQ ID NO:36。該LCVR的CDR1域包括核苷酸70-102，該CDR2域包括核苷酸148-168，而該CDR3域包括核苷酸265-291。編碼該D2E7重鏈可變區(qū)的核苷酸序列示于圖8和SEQ ID NO:37。該HCVR的CDR1域包括核苷酸91-105，該CDR2域包括核苷酸148-198，而該CDR3域包括核苷酸295-330。技術(shù)人員會理解，使用遺傳密碼和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以從編碼該D2E7LCVR和HCVR的核苷酸序列衍生編碼D2E7相關(guān)抗體或其部分(例如諸如CDR3域的CDR域)的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼輕鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列(即D2E7VL CDR3)、或包含通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的一至五個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列。該核酸可以僅編碼該CDR3區(qū)，或更優(yōu)選編碼整個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)(LCVR)。例如，該核酸可以編碼一個(gè)具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VL CDR2)和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VL CDR1)的LCVR。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼重鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(即D2E7VH CDR3)、或包含通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的一至五個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。該核酸可以僅編碼該CDR3區(qū)，或更優(yōu)選編碼整個(gè)抗體重鏈可變區(qū)(HCVR)。例如，該核酸可以編碼一個(gè)具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域(即D2E7VH CDR2)和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域(即D2E7VH CDR1)的HCVR。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼D2E7相關(guān)CDR3域的分離核酸，該CDR3域例如包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)(即D2E7LCVR)的分離核酸。該核酸最好包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列，盡管技術(shù)人員會理解由于遺傳密碼的簡并性，其它核苷酸序列可以編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列。該核酸可以僅編碼該LCVR或亦可以編碼可操作地連接至該LCVR的抗體輕鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸存在于一個(gè)重組表達(dá)載體中。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)(即D2E7HCVR)的分離核酸。該核酸最好包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列，盡管技術(shù)人員會理解由于遺傳密碼的簡并性，其它核苷酸序列可以編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列。該核酸可以僅編碼該HCVR或亦編碼可操作地連接至該HCVR的重鏈恒定區(qū)。例如，該核酸可以包含IgG1或IgG4恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸存在于一個(gè)重組表達(dá)載體中。
本發(fā)明亦提供既編碼抗體重鏈又編碼抗體輕鏈的重組表達(dá)載體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼以下的重組表達(dá)載體
(a)具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體輕鏈(即D2E7 LCVR)；和(b)具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體重鏈(即D2E7HCVR)。
本發(fā)明亦提供已導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞更優(yōu)選是CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞或COS細(xì)胞。
另外本發(fā)明提供合成本發(fā)明重組人抗體的方法，即通過在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞直至合成本發(fā)明的重組人抗體。該方法還包括從該培養(yǎng)基中分離該重組人抗體。Ⅲ．選擇重組人抗體可以通過篩選重組聯(lián)合抗體文庫、最好是從得自人淋巴細(xì)胞的mRNA制備的人VL和VH cDNA制備的scFv噬菌體呈現(xiàn)文庫分離除本文公開的該D2E7或D2E7相關(guān)抗體之外的本發(fā)明重組人抗體。本領(lǐng)域已知道制備和篩選這種文庫的方法學(xué)。除市售制備噬菌體呈現(xiàn)文庫的藥盒(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現(xiàn)藥盒，目錄號240612)之外，可以在以下文獻(xiàn)中找到特別適用于制備和篩選抗體呈現(xiàn)文庫的方法和試劑例如Ladner等的美國專利5,223,409號；Kang等的PCT說明書WO92/18619號；Dower等的PCT說明書WO91/17271號；Winter等的PCT說明書WO92/20791號；Markland等的PCT說明書WO92/15679號；Breitling等的PCT說明書WO93/01288號；McCafferty等的PCT說明書WO92/01047號；Garrard等的PCT說明書WO92/09690號；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等(1992)Hum AntibodHybridomas3:81-85;Huse等(1989)Science246:1275-1281;McCafferty等，Nature(1990)348:552-554;Griffiths等(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等(1992)J Mol Biol226:889-896;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Gram等(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137；和Barbas等(1991)PNAS88:7978-7982。
在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，為分離對hTNFα具有高親和性和低解離速率常數(shù)的人抗體，首先用對hTNFα具有高親和性和低解離速率常數(shù)的鼠抗hTNFα抗體(例如MAK195，保藏號為ECACC87050801的雜交瘤)、采用描述于Hoogenboom等的PCT說明書WO93/06213號的表位印記或?qū)蜻x擇方法，選擇具有對hTNFα類似的結(jié)合活性的人重鏈和輕鏈序列。在該方法中使用的抗體文庫最好是按照McCafferty等的PCT說明書WO92/01047號，McCafferty等，Nature(1990)348:552-554；和Griffiths等，(1993)EMBOJ12:725-734所述制備和篩選的scFv文庫。最好用重組人TNFα做為抗原篩選所述scFv抗體文庫。
一旦選擇出最初的人VL和VH區(qū)段，就進(jìn)行“混合和配對”實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中對最初選擇的VL和VH區(qū)段的不同配對進(jìn)行hTNFα結(jié)合篩選，以選擇優(yōu)選的VL/VH對組合。另外，為進(jìn)一步提高對hTNFα結(jié)合的親和性和/或降低hTNFα結(jié)合的解離速率常數(shù)，可以對優(yōu)選的VL/VH對的VL和VH區(qū)段進(jìn)行隨機(jī)突變，該突變最好在VH和/或VL的CDR3區(qū)進(jìn)行，突變過程與造成在自然免疫應(yīng)答中抗體親和性成熟的體內(nèi)體細(xì)胞突變過程相似?？梢允褂门cVH CDR3或VL CDR3分別互補(bǔ)的PCR引物，通過擴(kuò)增VH和VL區(qū)完成這種體外親和性成熟，所述引物已用四種核苷酸堿基的隨機(jī)混合物于某些位置“釘入”，使得該得到的PCR產(chǎn)物編碼已在VH和/或VL CDR3區(qū)中導(dǎo)入隨機(jī)突變的VH和VL區(qū)段?？梢栽俅魏Y選這些隨機(jī)突變VH和VL區(qū)段的hTNFα結(jié)合性，可以選擇出展示對hTNFα結(jié)合有高親和性和低解離速率的序列。
可以將選擇的抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列與種系重鏈和輕鏈氨基酸序列比較。在該選擇的VL和/或VH鏈的某些框架殘基不同于種系構(gòu)型時(shí)(例如由于用于制備該噬菌體文庫的免疫球蛋白基因的體細(xì)胞突變的結(jié)果)，可能需要將所述選定抗體的改變的框架殘基“回復(fù)突變”為該種系構(gòu)型(即改變該選定抗體的框架氨基酸序列，使它們與所述種系框架氨基酸序列相同)。框架殘基的這種“回復(fù)突變”(或“種系化”)可以通過用于導(dǎo)入特異性突變的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(例如定點(diǎn)誘變；PCR介導(dǎo)的誘變等等)完成。
在從重組免疫球蛋白呈現(xiàn)文庫篩選和分離本發(fā)明的抗hTNFα抗體之后，可以從該呈現(xiàn)包裝物(例如從該噬菌體基因組)回收編碼該選擇抗體的核酸并通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將其亞克隆入其它表達(dá)載體。如果需要，可以進(jìn)一步操作該核酸以創(chuàng)造本發(fā)明的其它抗體形式(例如連接至編碼另外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的核酸，例如其它恒定區(qū))。為表達(dá)通過聯(lián)合文庫篩選分離的重組人抗體，如上述Ⅱ節(jié)詳述，將編碼該抗體的DNA克隆入重組表達(dá)載體并導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞。Ⅳ．藥用組合物和給藥可以將本發(fā)明的抗體和抗體部分加入適于給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發(fā)明的抗體或抗體部分和藥學(xué)上可接受的載體。本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其組合物。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、或氯化鈉。藥學(xué)上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，它們增強(qiáng)了該抗體或抗體部分的有效期或效力。
本發(fā)明的組合物可以有各種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑量形式，例如液體溶液(例如注射液和輸注液)、分散液或懸液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。推薦的形式取決于給藥方式和治療用途。典型的推薦組合物是注射液或輸注液的形式，例如與用其它抗體對人進(jìn)行被動免疫所用的組合物類似的組合物。推薦的給藥方式是非腸道的(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，通過靜脈內(nèi)輸液或注射給與該抗體。在另一最佳實(shí)施方案中，通過肌內(nèi)注射或皮下注射給與該抗體。
治療組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒃摻M合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的該活性化合物(即抗體或抗體部分)與所需上述成分的一種或組合一起加入適當(dāng)?shù)娜軇┲胁⒔又M(jìn)行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將該活性化合物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥產(chǎn)生該活性成分與任何其它來自先前除菌過濾溶液的所需成分的粉劑。例如通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當(dāng)流動性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)可以達(dá)到注射組合物的延長吸收。
本發(fā)明的抗體和抗體部分可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥，盡管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是靜脈內(nèi)注射或輸液。技術(shù)人員會理解給藥途徑和/或給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些實(shí)施方案中，該活性化合物可以與保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體一同制備，例如控釋制劑，包括移植物、透皮貼和微囊傳遞系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯和聚乳酸。制備這種制劑的許多方法均已申請專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,紐約，1978。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。該化合物(和其它成分，如果需要)亦可以包于硬或軟殼明膠膠囊、壓制成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關(guān)于口服治療給藥，可以將所述化合物與賦形劑一起加入并以可食片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、糯米紙囊劑等等形式使用。為了以非腸道給藥之外給與本發(fā)明的化合物，可能需要用防止其失活的材料對該化合物包衣或與該化合物一同給與。
亦可以將補(bǔ)充的活性化合物加入該組合物中。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種可以用于治療hTNFα活性為有害的疾病的其它治療藥物共配制和/或共給與。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以與一種或多種結(jié)合其它靶的抗體(例如結(jié)合其它細(xì)胞因子的抗體或結(jié)合細(xì)胞表面分子的抗體)、一種或多種細(xì)胞因子、可溶性TNFα受體(參見例如PCT說明書WO94/06476號)和/或一種或多種抑制hTNFα產(chǎn)生或活性的化學(xué)藥劑(例如PCT說明書WO93/19751號中描述的亞環(huán)己烷基衍生物)共配制和/或共給與。另外，可以將一種或多種本發(fā)明的抗體與二種或多種前述治療藥物聯(lián)用。這種聯(lián)合治療可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給與的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。
可以與本發(fā)明的抗體或抗體部分聯(lián)用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療藥物的非限制性例子包括以下非類固醇抗炎藥(NSAID)；細(xì)胞因子抑制抗炎藥(CSAID);CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A);55kdTNFR-IgG(5kDTNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IDEC-CE9.1/SB210396(無缺失靈長類化抗CD4抗體；IDEC/SmithKline；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1995)Vol.38,S185);DAB486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1993)Vol.36,1223)；抗Tac(人化抗IL-2Rα;Protein Design Labs/Roche);IL-4(抗炎細(xì)胞因子；DNAX/Schering);IL-10(SCH52000；重組IL-10，抗炎細(xì)胞因子；DNAX/Schering);IL-4;IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；Synergen/Amgen);TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結(jié)合蛋白；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39、第9期(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)Vol.268，第37-42頁)；R973401(磷酸二酯酶Ⅳ型抑制劑；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282);MK-966(COX-2抑制劑；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S81);Iloprost(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；酞胺哌啶酮(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)和酞胺哌啶酮相關(guān)藥物(例如Celgen);leflunomide(抗炎和細(xì)胞因子抑制劑；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S131;Inflammation Research(1996)Vol.45，第103-107頁)；凝血酸(血纖維蛋白溶酶原激活抑制劑；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S284);T-614(細(xì)胞因子抑制劑；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)；前列腺素E1(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)；Tenidap(非類固醇抗炎藥；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S280)；萘普生(非類固醇抗炎藥；參見例如NeuroReport(1996)Vol.7，第1209-1213頁)；Meloxicam(非類固醇抗炎藥)；布洛芬(非類固醇抗炎藥)；吡羅昔康(非類固醇抗炎藥)；雙氯芬酸(非類固醇抗炎藥)；消炎痛(非類固醇抗炎藥)；柳氮磺胺吡啶(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S281)；ICE抑制劑(白介素-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑)；zap-70和/或1ck抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或1ck抑制劑)；VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體抑制劑；血管發(fā)生抑制劑)；皮質(zhì)類固醇抗炎藥(例如SB203580)；TNF-轉(zhuǎn)化酶抑制劑；抗IL-12抗體；白介素-11(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S296)；白介素-13(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S308)；白介素-17抑制劑(參見例如Arthritis＆Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素；全淋巴照射；抗胸腺細(xì)胞球蛋白；抗CD4抗體；CD-5毒素；口服肽和膠原蛋白；lobenzarit disodium；細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals,Inc.);ICAM-1反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(ISIS 2302;Isis Pharmaceuticals,Inc.)；可溶性補(bǔ)體受體1(TP10;T Cell Sciences,Inc.)；強(qiáng)的松；肝蛋白；葡糖胺聚糖多硫酸鹽；二甲胺四環(huán)素；抗IL2R抗體；海洋和植物脂質(zhì)(魚類和植物種子脂肪酸；參見例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21:759-777)；金諾芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；靜注免疫球蛋白；zileuton；霉酚酸(RS-61443);tacrolimus(FK-506);sirolimus(雷帕霉素)；amiprilose(therafectin);cladribine(2-氯脫氧腺苷)；和阿扎立平。
可以與本發(fā)明的抗體或抗體部分聯(lián)用的炎癥性腸病治療藥物的非限制性例子包括以下budenoside；表皮生長因子；皮質(zhì)類固醇；環(huán)孢菌素；柳氮磺胺吡啶；氨基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制劑；氨水楊酸；奧沙拉秦；balsalazide；抗氧化劑；凝血噁烷抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A);55kdTNFR-IgG(55kDTNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；白介素-10(SCH52000;Schering Plough);IL-4;IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)；白介素-11；強(qiáng)的松龍、地塞米松或budesonide的葡糖苷酸或葡聚糖結(jié)合前體藥物；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸(ISIS 2302;Isis Pharmaceuticals,Inc.)；可溶性補(bǔ)體受體1(TP10;T CellSciences,Inc.)；緩釋氨水楊酸；氨甲蝶呤；血小板激活因子(PAF)拮抗劑；環(huán)丙沙星；和利多卡因。
可以與本發(fā)明的抗體或抗體部分聯(lián)用的多發(fā)性硬化治療藥物的非限制性例子包括以下皮質(zhì)類固醇；強(qiáng)的松龍；甲基強(qiáng)的松龍；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；tizanidine；干擾素-β1a(AvonexTM;Biogen)；干擾素-β1b(BetaseronTM;Chiron/Berlex);Copolymer1(Cop-1;CopaxoneTM;Teva PharmaceuticalIndustries,Inc.)；高壓氧；靜注免疫球蛋白；clabribine;CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A);55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche);IL-10；IL-4；和IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)。
可以與本發(fā)明的抗體或抗體部分聯(lián)用的膿毒癥治療藥物的非限制性例子包括以下高滲鹽溶液；抗生素；靜注γ球蛋白；連續(xù)性濾血；carbapenems(例如meropenem)；諸如TNFα、IL-1β、IL-6和/或IL-8的細(xì)胞因子的拮抗劑；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer);cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kDTNF受體-IgG融合蛋白；Immuunex；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1994)Vol.37,S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A);55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche；細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals,Inc.);SK&F107647(低分子肽；SmithKlineBeechem)；四價(jià)脒基腙CNI-1493(Picower Institute)；組織因子通道抑制劑(TFPI；Chiron)；PHP(化學(xué)修飾血紅蛋白；APEX Bioscience)；鐵螯合劑和螯合物，包括五乙酸二乙三胺-鐵(Ⅲ)絡(luò)合物(DPTA鐵(Ⅲ)；Molichem Medicines);lisofylline(合成小分子甲基黃嘌呤；CellTherapeutics,Inc.);PGG-葡聚糖(水溶性β1,3葡聚糖；Alpha-BetaTechnology)；用脂類重建的載脂蛋白A-1；手性異羥肟酸(抑制脂A生物合成的合成抗菌劑)；抗內(nèi)毒素抗體；E5531(合成脂A拮抗劑；EisaiAmerica,Inc.);rBPl21(人殺菌劑/透過性增強(qiáng)蛋白的重組N末端片段)；和合成抗內(nèi)毒素肽(SAEP；Bios Ynth Research Laboratories)；可以與本發(fā)明的抗體或抗體部分聯(lián)用的成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)治療藥物的非限制性例子包括以下抗IL-8抗體；表面活性劑置換療法；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Baye);cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor);75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis＆Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A;和55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)。
在Ⅳ小節(jié)中進(jìn)一步討論將本發(fā)明的抗體或抗體部分與其它治療藥物聯(lián)用的用途。
本發(fā)明的藥用組合物可以包括“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明抗體或抗體部分。“治療有效量”是指在必要的劑量和時(shí)間下有效達(dá)到所需治療效果的量。抗體或抗體部分的治療有效量可以根據(jù)諸如個(gè)體的病況、年齡、性別和體重以及該抗體和抗體部分在該個(gè)體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指該抗體或抗體部分的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量?！邦A(yù)防有效量”是指在必要劑量和時(shí)間下有效達(dá)到所需預(yù)防效果的量。因?yàn)轭A(yù)防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預(yù)防有效量通常小于治療有效量。
可以調(diào)整劑量制度以提供最佳所需反映(例如治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可以單次大團(tuán)給藥，可以在一段時(shí)間內(nèi)給與幾個(gè)均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式指適于欲治療的哺乳動物受治療者的單元劑量的物理分離單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的計(jì)算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由以下確定并直接取決于以下(a)該活性化合物的獨(dú)特特征和欲達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)在混合這種用于治療個(gè)體敏感性活性化合物的技術(shù)中的內(nèi)在限制。
本發(fā)明的抗體或抗體部分的治療或預(yù)防有效量的典型的非限制性范圍是0.1-20mg/kg，更優(yōu)選為1-10mg/kg。應(yīng)注意劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴(yán)重性變化。另外應(yīng)理解對于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會限制要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。Ⅳ．本發(fā)明抗體的用途已知本發(fā)明的抗hTNFα抗體或其部分結(jié)合hTNFα的能力，可以將其用于在諸如酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)、放射免疫檢測(RIA)或組織免疫組織化學(xué)的常規(guī)免疫檢測中檢測hTNFα(例如在諸如血清或血漿的生物樣品中)。本發(fā)明提供在生物樣品中檢測hTNFα的方法，該方法包括用本發(fā)明的抗體或抗體部分接觸生物樣品并檢測或者結(jié)合至hTNFα的抗體(或抗體部分)或者未結(jié)合抗體(或抗體部分)，由此檢測該生物樣品中的hTNFα。用便于檢測結(jié)合或未結(jié)合抗體，用可檢測物質(zhì)直接或間接標(biāo)記該抗體。合適的可檢測物質(zhì)包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合體例子包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；而合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
與標(biāo)記該抗體二者擇一地，利用用可檢測物質(zhì)標(biāo)記的rhTNFα標(biāo)準(zhǔn)和未標(biāo)記抗hTNFα抗體，通過競爭免疫檢測可以在生物流體中檢測hTNFα。在該檢測中，將該生物樣品、該標(biāo)記rhTNFα標(biāo)準(zhǔn)和該抗hTNFα抗體混合并測定與該未標(biāo)記抗體結(jié)合的標(biāo)記rhTNFα標(biāo)準(zhǔn)的量。該生物樣品中的hTNFα量與結(jié)合至該抗hTNFα抗體的標(biāo)記rhTNFα標(biāo)準(zhǔn)的量成反比。
亦可以用本發(fā)明的D2E7抗體檢測來自除人類之外的其它物種的TNFα，特別是來自靈長類(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恒河猴)、豬和小鼠的TNFα，因?yàn)镈2E7可以與這些TNFα的每一種結(jié)合(在實(shí)施方案4的E小節(jié)中進(jìn)一步討論)。
本發(fā)明的抗體和抗體部分能夠在體外和體內(nèi)中和hTNFα活性(參見實(shí)施方案4)。另外，至少一些本發(fā)明抗體(例如D2E7)可以中和來自其它物種的TNFα。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分可以用于例如在含有hTNFα的細(xì)胞培養(yǎng)物、在人類受治療者或在其它具有本發(fā)明的抗體可以交叉反應(yīng)的TNFα的哺乳動物受治療者(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恒河猴、豬或小鼠)中抑制TNFα活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制TNFα活性的方法，該方法包括用本發(fā)明的抗體或抗體部分接觸TNFα使得TNFα活性被抑制。該TNFα最好是人TNFα。例如，可以在含有或懷疑含有hTNFα的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中加入本發(fā)明的抗體或抗體部分，以抑制該培養(yǎng)物中的hTNFα活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在患病的受治療者中抑制TNFα的方法，在該病中TNFα活性是有害的。已提出TNFα參與許多的各種紊亂的病理生理學(xué)(參見例如Moeller,A等(1990)Cytokine2:162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024;Moeller,A.等的歐洲專利公開260610B1號)。本發(fā)明提供在患這種紊亂的受治療者中有關(guān)TNFα活性的方法，該方法包括給與該受治療者本發(fā)明的抗體或抗體部分，使得該受治療者中的TNFα活性被抑制。最好是，該TNFα是人TNFα并且該受治療者是人。二者擇一地，該受治療者可以是表達(dá)本發(fā)明抗體交叉反應(yīng)的TNFα的哺乳動物。另外的該受治療者可以是已經(jīng)導(dǎo)入hTNFα的哺乳動物(例如通過給與hTNFα或通過表達(dá)hTNFα轉(zhuǎn)基因)?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體以治療目的給與人受治療者(以下進(jìn)一步討論)。另外，可以將本發(fā)明的抗體給與表達(dá)該抗體交叉反應(yīng)的TNFα的非人類哺乳動物(例如靈長類、豬或小鼠)，以達(dá)到獸醫(yī)目的或做為人類疾病的動物模型。有關(guān)后者，這種動物模型可以用于評價(jià)本發(fā)明抗體的治療效力(例如測試給藥的劑量和時(shí)間過程)。
本文使用的術(shù)語“其中TNFα活性是有害的紊亂”包括疾病和其它紊亂，其中在患該紊亂的受治療者中TNFα的存在已顯示出或被懷疑或者對該病的病理生理學(xué)負(fù)責(zé)或是造成該病加重的因子。因此，其中TNFα是有害的紊亂是這樣一種紊亂，其中TNFα活性的抑制預(yù)期將減輕該紊亂的癥狀和/或進(jìn)程。這種紊亂可以通過例如患該病的受治療者的生物流體中TNFα濃度的增加(例如在該受治療者的血清、血漿、滑液等中TNFα濃度增加)而證實(shí)，這可以用上述抗TNFα抗體檢測。有許多其中TNFα是有害的紊亂的例子。以下進(jìn)一步討論本發(fā)明的抗體和抗體部分在治療具體紊亂中的用途A膿毒癥腫瘤壞死因子在膿毒癥病理生理學(xué)中已有確定地位，其生物學(xué)效應(yīng)包括低血壓、心肌抑制、血管漏出綜合癥、器官壞死、刺激釋放毒性次級介質(zhì)和激活凝血級聯(lián)(參見例如Moeller,A等(1990)Cytokine2:162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024號；Moeller,A．等的歐洲專利公告260610B1號；Tracery,K.J.和Cerami,A(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503；Russell,D和Thompson,R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:714-721)。因此，本發(fā)明的人抗體和抗體部分可以用于治療任何臨床背景中的膿毒癥，包括膿毒癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥和毒性休克綜合癥。
另外，為治療膿毒癥，可以將本發(fā)明的抗hTNFα抗體或抗體部分與一種或多種可以另外減輕膿毒癥的其它治療藥物共給藥，所述其他治療藥物為例如白介素-1抑制劑(諸如在PCT說明書WO92/16221和WO92/17583號中描述的)、細(xì)胞因子白介素-6(參見例如PCT說明書WO93/11793號)或血小板激活因子的拮抗劑(參見例如歐洲專利申請公告EP374510號)。在小節(jié)Ⅲ中進(jìn)一步討論治療膿毒癥的其它組合療法。
另外，在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗hTNFα抗體或抗體部分給與一膿毒癥病人小組的人受治療者，這些病人的治療時(shí)的血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml，更優(yōu)選地超過1000pg/ml(參見Daum L.等的PCT說明書WO95/20978號)。
B．自身免疫疾病已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在各種自身免疫疾病的病理生理學(xué)中起作用。例如，已發(fā)現(xiàn)TNFα參與激活組織炎癥并引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)破壞(參見例如Moeller,A.等(1990)Cytokine2:162-169；授予Moeller等的美國專利5,23l,024號；Moeller,A.等的歐洲專利公開260610 B1號；Tracery,K.J.和Cerami，見上述；Arend,W.P.和Dayer,J-M.(1 995)Arth.Rheum.38:151-160;Fava,R.A.等(1993)Clin.Exp.Immunol.94:261-266)。亦發(fā)現(xiàn)TNFα在糖尿病中參與促進(jìn)胰島細(xì)胞死亡和介導(dǎo)胰島素抗性(參見例如Tracery,K.J.和Cerami，見上述；PCT說明書WO94/08609號)。亦發(fā)現(xiàn)TNFα在多發(fā)性硬化中參與介導(dǎo)對少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒和誘導(dǎo)炎癥斑(參見例如Tracey和Cerami，見上述)。已經(jīng)進(jìn)行了嵌合和人化鼠抗hTNFα抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)(參見例如Elliott,M.J.等(1994)Lancet344:1125-1127;Elliot,M.J.等(1994)Lancet344:1105-1110;Rankin,E.C.等(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342)。
本發(fā)明的人抗體和抗體部分可以用于治療自身免疫疾病，特別是那些與炎癥有關(guān)的自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥。典型地，系統(tǒng)性給與該抗體或抗體部分，盡管對某些紊亂而言在炎癥位點(diǎn)局部給與該抗體或抗體部分是有益的(例如單獨(dú)或與PCT說明書WO93/19751號描述的環(huán)己烷-ylidene衍生物聯(lián)用，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)處局部給與或在糖尿病性潰瘍表面涂藥)。本發(fā)明的抗體或抗體部分亦可以與在Ⅲ小節(jié)中進(jìn)一步討論的用于治療自身免疫疾病的一或多種治療藥物一同給與。
C．傳染病已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子參與介導(dǎo)在各種傳染病中觀察到的生物學(xué)效應(yīng)。例如，已發(fā)現(xiàn)TNFα介導(dǎo)瘧疾中的大腦炎癥和毛細(xì)管血栓形成和梗塞。亦發(fā)現(xiàn)TNFα參與介導(dǎo)大腦炎癥，誘導(dǎo)腦膜炎中的血腦屏障崩潰、觸發(fā)膿毒癥性休克綜合癥和激活靜脈梗塞。亦發(fā)現(xiàn)TNFα在獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)中參與誘導(dǎo)惡病質(zhì)、刺激病毒增殖和介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。因此，可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療傳染病，包括細(xì)菌性腦膜炎(參見例如歐洲專利申請公告EP585705號)、腦型瘧、AIDS和AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)(參見例如歐洲專利申請公告EP230574號)、以及移植繼發(fā)的巨細(xì)胞病毒感染(參見例如Fietze,E．等(1994)Transplantation58:675-680)。本發(fā)明的抗體和抗體部分亦可以用于減輕與傳染病有關(guān)的癥狀，包括因感染(例如流感)引起的發(fā)燒和肌痛和感染繼發(fā)的惡病質(zhì)(例如AIDS或ARC繼發(fā)的)。
D．移植已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子可能是同種移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)鍵介質(zhì)并參與介導(dǎo)在用導(dǎo)向T細(xì)胞受體CD3復(fù)合物的大鼠抗體OKT3抑制腎移植排斥時(shí)觀察到的負(fù)反應(yīng)(參見例如Eason,J.D.等(1995)Transplantation59:300-305;Suthanthiran,M.和Strom,T.B.(1994)New Engl.J.Med.331:365-375)。因此，可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分抑制移植排斥，包括同種移植和異種移植排斥和抑制GVHD。盡管可以單獨(dú)使用該抗體或抗體部分，但更優(yōu)選地將其與一種或多種抑制抗同種移植的免疫應(yīng)答或抑制GVHD的其它藥劑聯(lián)用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或抗體部分與OKT3聯(lián)用，以抑制OKT3誘導(dǎo)的反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一或多種導(dǎo)向參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的其它靶的抗體聯(lián)用，這些靶例如為細(xì)胞表面分子CD25(白介素-2受體-α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在再一實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或抗體部分與諸如環(huán)孢菌素A或FK506的一或多種一般性免疫抑制劑聯(lián)用。
E．惡性腫瘤已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在惡性腫瘤中參與誘導(dǎo)惡病質(zhì)、刺激腫瘤生長、增強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛力和介導(dǎo)細(xì)胞毒性。因此，可以使用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長或轉(zhuǎn)移和/或減輕惡性腫瘤繼發(fā)的惡病質(zhì)?？梢詫⒃摽贵w或抗體部分系統(tǒng)性給藥或局部給與該腫瘤部位。
F．肺功能紊亂已知腫瘤壞死因子參與成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的病理生理學(xué)，包括刺激白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞激活、細(xì)胞毒性導(dǎo)向肺細(xì)胞和誘導(dǎo)血管漏出綜合癥。因此，可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療肺功能紊亂，包括成人呼吸窘迫綜合癥(參見例如PCT說明書WO91/04054號)、休克肺、慢性肺炎、肺結(jié)節(jié)病、肺纖維化和硅肺?？梢詫⒃摽贵w或抗體部分系統(tǒng)性給藥或局部地給與肺表面，例如做為氣溶膠。亦可以將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種用于治療肺功能紊亂的其它治療藥物(在Ⅲ小節(jié)中進(jìn)一步討論)一同給與。
G．腸功能紊亂已發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子參與炎癥性腸功能紊亂的病理生理學(xué)(參見例如Tracy,K.J．等(1986)Science234:470-474；Sun,X-M.等(1988)J.Clin.Invest.81:1328-1331;MacDonald,T.T.等(1990)Clin.Exp.Immunol.81:301-305)。已進(jìn)行嵌合鼠抗hTNFα抗體治療局限性回腸炎的臨床試驗(yàn)(van Dullemen,H.M等(1995)Gastroenterology109:129-135)。亦可以使用本發(fā)明的人抗體和抗體部分治療腸功能紊亂，例如特發(fā)性炎癥性腸病，該病包括二種綜合癥，即局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。亦可以將本發(fā)明的抗體或抗體部分與一或多種用于治療腸功能紊亂的治療藥物(在Ⅲ小節(jié)中進(jìn)一步討論)一同使用。
H．心臟功能紊亂亦可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療各種心臟功能紊亂，包括心臟局部缺血(參見例如歐洲專利申請公告EP453898號)和心臟功能不全(心肌虛弱)(參見例如PCT說明書WO94/20139號)。
Ⅰ．其它亦可以用本發(fā)明的抗體和抗體部分治療各種其中TNFα活性是有害的其它紊亂。已發(fā)現(xiàn)TNFα活性參與其病理生理學(xué)并因此可以用本發(fā)明抗體或抗體部分治療的其它疾病和紊亂的例子包括炎癥性骨病和骨吸收(參見例如Bertolini,DR.等(1986)Nature319:516-518;Konig,A．等(1988)J.Bone Miner.Res.3:621-627;Lerner,U.H.和Ohlin,A.(1993)J.Bone Miner.Res.8:147-155；和Shankar,G.和Stern,P.H(1993)Bone14:871-876)、肝炎,包括酒精性肝炎(參見例如McClain,C.J.和Cohen,D.A.(1989)Hepatology9:349-35l;Felver,M.E．等(1990)Alcohol.Clin.Exp.Res.14:255-259；和Hansen,J.等(1994)Hepatology20:461-474)、病毒性肝炎(Sheron,N.等(1991),Hepatol.12:241-245；和Hussain,M.J.等(1994)J.Clin.Pathol.47:1112-1115)和爆發(fā)性肝炎；凝結(jié)紊亂(參見例如van der Poll,T.等(1990)N.Engl.J.Med.322:1622-1627；和van der Poll,T．等(1991)Prog Clin.Biol.Res.367:55-60),燒傷(參見例如Giror,B.P.等(1994)Am.J.Physiol.267:H118-124；和Liu,X.S.等(1994)Burns20:40-44)，再灌注損傷(參見例如Scales,W.E.等(1994)Am.J.Physiol.267:G1122-1127;Serrick,C．等(1994)Transplantation58:1158-1162；和Yao,YM.,等(1995)Resuscitation29:157-168)，瘢痕疙瘩形成(參見例如McCauley,R.L.等(1992)J.Clin.Immunol.12:300-308)，瘢痕組織形成；發(fā)熱；牙周??；肥胖和放射毒性。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明。本申請引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請通過引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例1人抗體與hTNFα結(jié)合的動力學(xué)分析使用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)通過表面等離子體激元共振(SPR)檢測配體(生物素化的重組人TNFα(rhTNFα)，固定于生物傳感器基質(zhì)上)與分析物(溶液中的抗體)之間的實(shí)時(shí)結(jié)合反應(yīng)。該系統(tǒng)利用SPR的光學(xué)特性檢測葡聚糖生物傳感器基質(zhì)中蛋白濃度的改變。以已知濃度將蛋白共價(jià)結(jié)合至該葡聚糖基質(zhì)。將抗體注射通過該葡聚糖基質(zhì)，注射抗體和固定化配體之間的特異性結(jié)合導(dǎo)致基質(zhì)蛋白濃度增加并導(dǎo)致SPR信號變化。SPR信號的變化以共振單位(RU)記錄并沿著傳感圖的y軸隨時(shí)間顯示。
為便于將生物素化rhTNFα固定于生物傳感器基質(zhì)上，通過首先用100mM N-羥基檸檬酰亞胺(NHS)和400mM鹽酸N-乙基-N’-(3-二乙基氨丙基)碳二亞胺(EDC)激活基質(zhì)上的羧基，將抗生蛋白鏈菌素通過游離氨基共價(jià)連接至該葡聚糖基質(zhì)。下一步，將抗生蛋白鏈菌素通過該活化基質(zhì)注射。將稀釋于乙酸鈉pH 4.5的35微升抗生蛋白鏈菌素(25μg/ml)注射通過該活化的生物傳感器，該蛋白上的游離胺直接結(jié)合至該活化的羧基。通過注射1M的乙醇胺失活未反應(yīng)的基質(zhì)EDC-酯?？股鞍祖溇嘏悸?lián)的生物傳感器芯片亦有市售(Pharmacia BR-1000-16,Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)。
通過首先溶解5.0mg生物素(D-生物素-ε-氨基己酸N-羥基檸檬酰亞胺酯；Boehringer Mannheim目錄號1008960)于500μl二甲基亞砜以制備10mg/ml溶液，制備生物素化rhTNFα。每毫升rhTNFα(2.65mg/ml)加入10微升生物素以使生物素與rhTNFα摩爾比為2∶1。溫和攪拌反應(yīng)物并于黑暗處于室溫保溫2小時(shí)。用25ml冷PBS平衡裝有SephadexG-25M(Pharmacia目錄號17-0851-01)的PD-10柱，并以每根柱2ml rhTNFα-生物素上柱。用10×1ml冷PBS洗脫該柱。收集分部收集液并于OD280讀數(shù)(1.0OD=1.25mg/ml)。合并適當(dāng)?shù)姆植坎Υ嬗?80℃直至使用。生物素化rhTNFα亦有市售(R&D Systems目錄號FTA00,Minneapolis,MN)。
將欲通過抗生蛋白鏈菌素固定化于該基質(zhì)上的生物素化rhTNFα稀釋于PBS流動緩沖液(Gibco目錄號14190-144,Gibco BRL,GrandIsland,NY),該緩沖液添加了0.05％(BIAcore)表面活性劑P20(Pharmacia BR-1000-54,Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)。為測定rhTNFα特異性抗體結(jié)合固定化rhTNFα的能力，按下述進(jìn)行結(jié)合檢測。以5μl/min的流速將數(shù)等份的生物素化rhTNFα(25nM;10μl等份)注射通過該偶聯(lián)了抗生蛋白鏈菌素的葡聚糖基質(zhì)。在注射該蛋白之前和剛注射完時(shí)，僅使PBS緩沖液流過每個(gè)流動池?；€和生物素化rhTNFα注射完成后約30秒鐘的信號的凈差值做為結(jié)合值(約500RU)。測定了rhTNFα特異性抗體與固定化生物素化rhTNFα的直接結(jié)合。在PBS流動緩沖液中稀釋抗體(20μg/ml)，并將25μl的等份以5μl/min的流速注射通過所述固定化蛋白基質(zhì)。在注射抗體之前和剛注射完時(shí)，僅使PBS緩沖液流過每個(gè)流動池?；€信號和抗體注射完成后的信號的凈差值做為該特定樣品的結(jié)合值。在注射下一個(gè)樣品之前用100mM HCl再生生物傳感器基質(zhì)。為確定解離速率(Koff)、結(jié)合速率(Kon)、結(jié)合速率(Ka)和解離速率(Kd)常數(shù)，使用了BIAcore動力學(xué)評價(jià)軟件(2.1版)。
D2E7(IgG4全長抗體)與生物素化rhTNFα結(jié)合的代表性結(jié)果以及與之比較的鼠mAbMAK195(F(ab')2片段)，均示于以下表1中。表1:D2E7IgG4或MAK195與生物素化rhTNFα的結(jié)合
在第二系列試驗(yàn)中,按照上述用BIAcore技術(shù)定量分析了D2E7的IgG1全長形式與生物素化rhTNF之間的分子動力學(xué)相互作用，并得出了動力學(xué)速率常數(shù)，概括于以下表2、3和4中。
表2D2E7和生物素化rhTNF相互作用的表觀解離速率常數(shù)<
表3:D2E7和生物素化rhTNF之間相互作用的表觀結(jié)合速率常數(shù)
表4:D2E7和生物素化rhTNF的表觀動力學(xué)速率常數(shù)和親和性常數(shù)
用BIA分析軟件通過分析該傳感圖的解離區(qū)和結(jié)合區(qū)計(jì)算解離和結(jié)合速率常數(shù)。以常規(guī)化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)假設(shè)D2E7與生物素化rhTNF分子之間的相互作用零階解離和一階結(jié)合動力學(xué)。為了分析的原因，在選擇分析該動力學(xué)數(shù)據(jù)的分子模型時(shí)僅考慮該二價(jià)D2E7抗體的一個(gè)臂與該三聚體生物素化rhTNF的一個(gè)單位之間的相互作用。進(jìn)行了三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)并分別分析其結(jié)果。D2E7與生物素化rhTNF之間相互作用的平均表觀解離速率常數(shù)(Kd)是8.81±1.06×10-5s-1，平均表觀結(jié)合速率常數(shù)Ka是1.91±1.26×105M-1s-1。然后用公式Kd=Kd/Ka計(jì)算表觀內(nèi)在解離常數(shù)(Kd)。因此，得自動力學(xué)參數(shù)的D2E7抗體對rhTNF的平均Kd是6.09±3.42×10-10M。未將D2E7的IgG1形式的動力學(xué)值(示于表2、3和4中)和D2E7的IgG4形式的動力學(xué)值(示于表1和實(shí)施例2和3中)的較小的差別認(rèn)為是由或者IgG1恒定區(qū)或IgG4恒定區(qū)的存在產(chǎn)生的真正差別，而認(rèn)為是由于將更精確的抗體濃度測定用于IgG1動力學(xué)分析而造成。因此，認(rèn)為本文提出的D2E7的IgG1形式的動力學(xué)值是該D2E7抗體最精確的動力學(xué)參數(shù)。實(shí)施例2:D2E7 CDR3域的丙氨酸掃描誘變通過標(biāo)準(zhǔn)方法沿著D2E7 VL區(qū)和D2E7 VH區(qū)的CDR3域?qū)胍幌盗袉伪彼嵬蛔儭Ｋ鲚p鏈突變示于圖1B(LD2E7*.A1、LD2E7*.A3，LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8，分別于該D2E7VLCDR3的位置1、3、4、5、7或8具有一個(gè)丙氨酸突變)。所述重鏈突變示于圖2B(HD2E7*.A1、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和HD2E7*.A9，分別于該D2E7VH CDR3域的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11具有一個(gè)丙氨酸突變)。將rhTNFα與由野生型D2E7VL和D2E7VH組成的抗體相互作用的動力學(xué)與下述組成的抗體的動力學(xué)比較1)野生型D2E7VL與丙氨酸置換的D2E7VH配對；2)野生型D2E7 VH與丙氨酸置換的D2E7VL配對；或3)丙氨酸置換的D2E7VL與丙氨酸置換的D2E7VH配對。所有的抗體都做為全長IgG4分子進(jìn)行試驗(yàn)。
按照實(shí)施例1所述通過表面等離子體激元共振測定抗體與rhTNFα相互作用的動力學(xué)。不同VH/VL配對的Koff速率概括于以下表5中表5:D2E7丙氨酸掃描突變體與生物素化rhTNFα的結(jié)合
這些結(jié)果證明該D2E7VL區(qū)和VH區(qū)的CDR3域的大多數(shù)位置可以經(jīng)受用單丙氨酸殘基置換。與野生型親本D2E7抗體相比，于該D2E7VL CDR3域的1、4、5或7位或于該D2E7VH CDR3域的2、5、6、8、9或10位的單丙氨酸置換未顯著影響hTNFα結(jié)合的解離速率。于該D2E7VL CDR3的位置8或于該D2E7VH CDR3的位置3的丙氨酸置換給出了快四倍的Koff，于D2E7VH CDR3的4或11位的丙氨酸置換給出了快八倍的Koff，表明這些位點(diǎn)對與hTNFα結(jié)合更為關(guān)鍵。然而，于該D2E7VLCDR3域的1、4、5、7或8位或于該D2E7VH CDR3域的2、3、4、5、6、8、9、10或11位的單丙氨酸置換仍然產(chǎn)生一個(gè)具有不高于1×10-3的Koff的抗hTNFα抗體。實(shí)施例3:D2E7相關(guān)抗體的結(jié)合分析按照實(shí)施例1所述通過表面等離子體激元共振，分析與D2E7相比的其序列與D2E7相關(guān)的一系列抗體。測試的VL區(qū)的氨基酸系列示于圖1A和1B中。測試的VH區(qū)的氨基酸序列示于圖2A和2B中。各種VH/VL配對(在所示的形式中，或者做為全長IgG1或IgG4抗體或做為scFv)的Koff速率概括于以下表6中表6:D2E7相關(guān)抗體與生物素化rhTNFα的結(jié)合
具有選自D2E7、LOE7、LOE7.T和LOE7.A的VL(它們在位置9或者有一個(gè)蘇氨酸或有丙氨酸)的全長抗體(即IgG形式)的慢解離速率(即Koff≤1×10-4sec-1)，表明該D2E7VL CDR3的位置9可以由這二種殘基之一占據(jù)而大致不影響Koff。因此，該D2E7VL CDR3的共有基序包含氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO:3)。另外，具有選自D2E7、VH1-D2.N和VH1-D2.Y的VH(它們在位置12或者有酪氨酸或有天冬酰胺)的抗體的慢解離速率(即Koff≤1×10-4sec-1)，表明該D2E7VH CDR3的位置12可以由這二種殘基之一占據(jù)而大致不影響Koff。因此，該D2E7VH CDR3的共有基序包含氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D(Y/N)(SEQ ID NO:4)。
示于表6中的結(jié)果證明，在scFv形式下，與含有該D2E7VL或VHCDR3區(qū)的抗體相比，含有2SD4 VL或VH CDR3區(qū)的抗體表現(xiàn)出更快的Koff(即Koff≥1×10-3sec-1)。在該VL CDR3內(nèi)，2SD4在2、5和9位與D2E7不同。然而，如上述討論，9位可以由Ala(如在2SD4中)或Thr(如在D2E7中)占據(jù)而基本不影響Koff。因此，通過比較2SD4和D2E7，可以鑒定出該D2E7VL CDR3的2和5位(都是精氨酸)對該抗體與hTNFα結(jié)合是關(guān)鍵的。這些殘基可以做為該抗體結(jié)合位點(diǎn)的接觸殘基直接參與或可以對保持在該區(qū)抗體分子的支架結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用。關(guān)于位置2的重要性，用Lys(在EPB12中)取代Arg(在LOE7中，它與D2E7具有相同的VL CDR3)以2倍系數(shù)加速解離速率。關(guān)于位置5的重要性，如實(shí)施例2所述，用Ala(在LD2E7*.A5)取代Arg(在D2E7中)亦加速解離速率2倍。另外，在2和5位均無Arg時(shí)(在2SD4中)，解離速率快5倍。然而，應(yīng)注意盡管位置5對增強(qiáng)與hTNFα結(jié)合是重要的，但此位置的變化可以由其它位置的變化抵消，如在VLLOE4、VLLOH1或VL0.1H8中觀察到的。
在該VH CDR3中，2SD4在1、7和12位與D2E7不同。然而，如上述討論，12位可以由Asn(如在2SD4中)或Tyr(如在D2E7中)占據(jù)而基本不影響Koff。因此，通過比較2SD4和D2E7，可以鑒定出該D2E7VHCDR3的1和7位對與hTNFα結(jié)合是關(guān)鍵的。如上述討論，這些殘基可以做為該抗體結(jié)合位點(diǎn)的接觸殘基直接參與或可以對保持在該區(qū)抗體分子的支架結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用。這二個(gè)位置對與hTNFα結(jié)合都是重要的，因?yàn)槭褂?C-H2VH CDR3(它相對于D2E7VH CDR3而言，在位置1有一個(gè)纈氨酸變?yōu)楸彼岬淖兓?時(shí)，該scFv的解離速率比用D2E7VHCDR3時(shí)快3倍，但該解離速率仍然比使用2SD4VH CDR3時(shí)慢4倍(它相對于D2E7VH CDR3而言在位置1和7都有變化)。實(shí)施例4:D2E7的功能活性為檢查D2E7的功能活性，將該抗體用于幾個(gè)或者體外或者體內(nèi)測定該抗體抑制hTNFα活性的能力的檢測之中。A.在L929細(xì)胞中中和TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性在培育18-24小時(shí)后，人重組TNFα(rhTNFα)引起對鼠L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如下述通過共溫育抗體與rhTNFα和所述細(xì)胞，在L929檢測中評價(jià)人抗hTNFα抗體。將含有100μ1抗hTNFαAbs的96孔微滴定板用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培養(yǎng)基沿著該板雙份進(jìn)行1/3連續(xù)稀釋。加入50μlrhTNFα使每個(gè)樣品孔的最終濃度為500 pg/ml。然后將所述板于室溫溫育30分鐘。接著，加入含有1μg/ml放線菌素D的50μlTNFα敏感型L929小鼠成纖維細(xì)胞，使最終濃度為每孔5×104細(xì)胞。對照包括培養(yǎng)基加細(xì)胞和rhTNFα加細(xì)胞。這些對照和范圍為2ng/ml至8.2pg/ml的一個(gè)TNFα標(biāo)準(zhǔn)曲線用于測定該檢測的質(zhì)量并提供一個(gè)中和窗口。然后將這些板于37℃在5％CO2中培育過夜(18-24小時(shí))。
從每個(gè)孔中取出100μl培養(yǎng)基，并加入50μlPBS中的5mg/ml溴化3,(4,4-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基-四唑鎓(MTT；可從Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO購得)。然后將這些板于37℃培育4小時(shí)。然后加入50μl的20％十二烷基硫酸鈉(SDS)至每個(gè)孔中，并將這些板于37℃培育過夜。測定570/630nm的光密度，為每個(gè)樣品繪制曲線并通過標(biāo)準(zhǔn)方法確定IC50。
與鼠MAK195mAb的相比，具有各種VL和VH配對的人抗體的代表性的結(jié)果示于圖3和下表7中。表7中和TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性
圖3和表7中的結(jié)果證明，該D2E7人抗hTNFα抗體和各種D2E7相關(guān)抗體以與鼠抗hTNFαmAbMAK195基本相等的能力中和TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，按照上述檢查了D2E7的IgG1形式中和TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性的能力。在以下表8中概括了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及其平均值表8:D2E7IgG1中和TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性
該系列實(shí)驗(yàn)證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.25±0.01×10-10中和TNFα誘導(dǎo)的L929細(xì)胞毒性。B.抑制TNFα與U-937細(xì)胞上的TNFα受體結(jié)合使用表達(dá)hTNFα受體的人組織細(xì)胞系U-937細(xì)胞系(ATCC No.CRL1593)檢測人抗hTNFα抗體抑制hTNFα與細(xì)胞表面hTNFα受體結(jié)合的能力。將U-937生長于RPMI1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加了10％胎牛血清(Hyclone A-1111,Hyclone Laboratories,Logan,UT)、L-谷氨酰胺(4nM)、HEPES緩沖液(10mM)、青霉素(100μg/ml)和鏈霉素(100μl/ml)。為檢測全長IgG抗體的活性，用添加了1mg/ml人IgG(Sigma I-4506,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的PBS在冰上預(yù)培養(yǎng)U-937細(xì)胞45分鐘，然后用結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞三次。為進(jìn)行受體結(jié)合檢測，將U-937細(xì)胞(5×106細(xì)胞/孔)在96孔微滴定板(Costar3799,Costar Corp.,Cambridge,MA)中的結(jié)合緩沖液(PBS,添加了0.2％牛血清白蛋白)與125I標(biāo)記的rhTNFα(3×10-10M;25μCi/ml；得自NEN Research Products,Wilmington,DE)、加或不加抗hTNFα抗體、總體積為0.2ml中溫育。將該板在冰上培養(yǎng)1.5小時(shí)。然后,將各75μl的樣品轉(zhuǎn)移至含有鄰苯二甲酸二丁酯(Sigma D-2270,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)和鄰苯二甲酸二癸酯(ICN210733,ICN,Irvine,CA)的1.0ml試管(Sarstedt72.700,Sarstedt Corp.,Princeton,NJ)。所述試管分別含有體積比為2∶1的鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二癸酯的300μl混合物。通過微量離心5分鐘除去游離的(即未結(jié)合的)125I標(biāo)記的rhTNFα。然后,借助微試管剪刀(Bel-Art 210180001,Bel-Art Products,Pequannock,NJ)剪下每個(gè)含有細(xì)胞沉淀的試管末端。該細(xì)胞沉淀含有與p60或p80TNFα受體結(jié)合的125I標(biāo)記的rhTNFα,而油混合物上的水相則含有多余的游離125I標(biāo)記的rhTNFα。將所有的細(xì)胞沉淀收集于計(jì)數(shù)管(Falcon2052,BectonDickinson Labware,Lincoln Park,NJ)并于閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
代表性的結(jié)果示于圖4。在這些實(shí)驗(yàn)中,D2E7對hTNFα與U-937細(xì)胞上的hTNFα受體結(jié)合的抑制的IC50值為約3×10-10M。這些結(jié)果證明該D2E7人抗hTNFα抗體以與鼠抗hTNFαmAbMAK195基本相同的濃度抑制rhTNFα與U-937細(xì)胞上的hTNFα受體結(jié)合。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，按照上述檢測了D2E7的IgG1形式抑制rhTNFα與U-937細(xì)胞上的hTNFα受體結(jié)合的能力。在以下表9中概括了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及其平均值表9:D2E7IgG1抑制U-937細(xì)胞上TNF受體結(jié)合
該系列實(shí)驗(yàn)證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.56±0.12×10-10抑制U-937細(xì)胞上TNF受體結(jié)合。
為研究D2E7對125I-rhTNF與單個(gè)p55和p75受體結(jié)合抑制的能力，進(jìn)行固相放射免疫檢測。為測定D2E7對獨(dú)立TNF受體的IC50值，將各種濃度的該抗體與3×10-10濃度的125I-hTNF一同培育。然后以劑量依賴性方式在含有或者p55TNF受體或者p75 TNF受體的獨(dú)立平板上檢測該混合物。結(jié)果概括于下表10表10:D2E7IgG1對TNF受體與p55和p75TNFR結(jié)合的抑制
由D2E7對125I-rhTNF與U937細(xì)胞上的p55和p75 TNF受體的結(jié)合抑制遵循簡單的S形曲線，表明每個(gè)受體的IC50值相似。在用重組TNF受體的固相放射免疫檢測(RIA)實(shí)驗(yàn)中，D2E7對125I-rhTNF與所述p55和p75受體結(jié)合抑制的IC50值分別計(jì)算為1.47×10-9和1.26×10-9M。在固相中IC50值的降低可能是因?yàn)樵谠揜IA形式中受體密度較高，而未標(biāo)記rhTNFα亦以類似IC50值進(jìn)行抑制。未標(biāo)記rhTNF對125I-rhTNF與p55和p75受體結(jié)合抑制的IC50值分別為2.31×10-9和2.70×10-9。C．抑制ELAM-1在HUVEC上表達(dá)通過用rhTNFα處理，可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在其表面表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞粘附分子(ELAM-1)，通過用鼠抗人ELAM-1抗體與rhTNFα處理的HUVEC反應(yīng)可以檢測到該分子。如下述檢測人抗hTNFα抗體抑制該TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上表達(dá)的能力將HUVEC(ATCC No.CRL1730)平板接種于96孔平板(5×104細(xì)胞/孔)并于37℃培養(yǎng)過夜。第二天，以20-100μg/ml抗體為起點(diǎn)，在微滴定板中進(jìn)行人抗hTNFα抗體的連續(xù)稀釋(1:10)。制備4.5ng/ml的rhTNFα貯液，將等份的rhTNFα加入每個(gè)含有抗體的孔中，并徹底混合內(nèi)容物。對照包括培養(yǎng)基自身、培養(yǎng)基加抗hTNFα抗體和培養(yǎng)基加rhTNFα。將HUVEC平板從其37℃過夜培養(yǎng)中移出，并溫和地從每個(gè)孔中吸出培養(yǎng)基。向所述HUVEC平板的每個(gè)孔中轉(zhuǎn)移200μl的該抗體-rhTNFα混合物。然后將所述HUVEC平板在37℃再培育4小時(shí)。接著，將鼠抗ELAM-1抗體貯液在RPMI中稀釋1:1000。從該HUVEC平板的每個(gè)孔中溫和地吸出培養(yǎng)基，加入50μl/孔的該抗ELAM-1抗體溶液并于室溫將所述HUVEC平板培育60分鐘。在RPMI中制備125I標(biāo)記的抗鼠Ig抗體溶液(約50,000cpm/50μl)。將所述HUVEC平板的每個(gè)孔中的培養(yǎng)基溫和地吸出，用RPMI清洗這些孔二次，然后向每個(gè)孔中力加A50μl的125I標(biāo)記的抗鼠Ig溶液。將所述平板于室溫培育1小時(shí)，然后用RPMI清洗每個(gè)孔三次。向每個(gè)孔中加入180μl的5％SDS以裂解所述細(xì)胞。將每個(gè)孔中的溶胞物轉(zhuǎn)移至試管中并于閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
代表性結(jié)果示于圖5中。在這些實(shí)驗(yàn)中，D2E7對hTNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上表達(dá)的抑制的IC50值為約6×10-11M。這些結(jié)果證明該D2E7A人抗hTNFα抗體以與鼠抗hTNFα mAb MAK195基本相同的濃度抑制hTNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上的表達(dá)。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，按照上述檢測了D2E7的IgG1形式抑制hTNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上的表達(dá)的能力。在以下表11中概括了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及其平均值表11:D2E7IgG1受體抑制TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1表達(dá)
該系列實(shí)驗(yàn)證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.85±0.14×10-10抑制TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在HUVEC上的表達(dá)。
亦檢測了D2E7 IgG1對rhTNF誘導(dǎo)的其它二種粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)的中和能力。因?yàn)橛?6小時(shí)的ICAM-1表達(dá)的rhTNF效價(jià)曲線與ELAM-1表達(dá)的曲線非常相似，因此在該抗體中和實(shí)驗(yàn)中使用了同樣濃度的rhTNF。在各種濃度的D2E7存在下，將HUVEC與rhTNF于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)，通過鼠抗ICAM-1抗體后加125I標(biāo)記的羊抗鼠抗體測定ICAM-1的表達(dá)。進(jìn)行二次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)并計(jì)算IC50值。一種不相關(guān)人IgG1抗體沒有抑制該ICAM-1表達(dá)。
測試VCAM-1表達(dá)抑制的實(shí)驗(yàn)程序與用于ELAM-1表達(dá)的程序相同，但是使用了抗VCAM-1 MAb代替抗ELAM-1 MAb。進(jìn)行了三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)并計(jì)算IC50值。一種不相關(guān)人IgG1抗體沒有抑制該VCAM-1表達(dá)。
結(jié)果概括于下表12中表12D2E7IgG1抑制ICAM-1和VCAM-1表達(dá)
這些實(shí)驗(yàn)證明用rhTNF處理原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致粘附分子的最佳表達(dá)ELAM-1H和VCAM-1在第4小時(shí)，ICAM-1的最大向上調(diào)節(jié)表達(dá)在第16小時(shí)。D2E7能夠以劑量依賴性方式抑制這三種粘附分子的表達(dá)。抑制ELAM-1、ICAM-1和VCAM-1的IC50值分別是1.85×10-10、2.17×10-10和1.01×10-10M。這些值非常相似，表明誘導(dǎo)ELAM-1、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)對rhTNF激活信號劑量的要求相似。有意義的是，D2E7在該ICAM-1表達(dá)的較長久的抑制檢測中有相似效力。該ICAM-1抑制檢測需要將rhTNF和D2E7與HUVEC共培育16小時(shí)，與之相反，ELAM-1和VCAM-1抑制檢測需要4小時(shí)。因?yàn)镈2E7對rhTNF有慢解離速率，可以相信在該16小時(shí)共培育期間在HUVEC上的TNF受體沒有顯著競爭。D.體內(nèi)中和hTNFα使用了三種不同的體內(nèi)系統(tǒng)以證明D2E7有效地在體內(nèi)抑制hTNFα活性。
I．在D-半乳糖胺致敏的小鼠中抑制TFN誘導(dǎo)的致死性給D-半乳糖胺致敏的小鼠注射重組人TNFα(rhTNFα)導(dǎo)致在24小時(shí)內(nèi)的致死性。已表明TNFα中和劑可以在此模型中防止致死性。為檢測人抗hTNFα抗體在此模型中體內(nèi)中和hTNFα的能力，用PBS中的各種濃度的D2E7-IgG1或?qū)φ盏鞍赘鼓?nèi)注射C57B1/6小鼠。30分鐘后，用PBS中的1μgrhTNFα和20mgD-半乳糖胺腹膜內(nèi)注射攻擊小鼠，并于24小時(shí)后觀察。已預(yù)先確定這些量的rhTNFα和D-半乳糖胺在這些小鼠中達(dá)到80-90％的致死性。
代表性結(jié)果以存活百分比對抗體濃度做成柱狀圖表示于圖6中。實(shí)心柱代表D2E7，而空心柱代表MAK195。每只小鼠注射2.5-25μgD2E7抗體保護(hù)這些動物不受TNFα誘導(dǎo)的致死性影響。ED50值約為1-2.5μg/小鼠。陽性對照抗體MAK195在保護(hù)能力方面相似。在沒有rhTNFα的情況下注射D2E7對小鼠沒有任何有害影響。注射非特異性人IgG1抗體沒有提供任何免于TNFα誘導(dǎo)的致死性的保護(hù)。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將49只小鼠分成7個(gè)相等的組。每組在接受LD80劑量的rhTNF/D-半乳糖胺混合物(1.0μgrhTNF和20mgD-半乳糖胺/小鼠)的30分鐘之前接受了各種劑量的D2E7。對照組7接受了25μg/小鼠劑量的正常人IgG1κ抗體。24小時(shí)后檢查小鼠。各組的存活率概括于下表13中。
表13用D2E7處理24小時(shí)后的存活率
抑制TNF誘導(dǎo)的兔發(fā)熱檢測了D2E7抑制rhTNF誘導(dǎo)的兔發(fā)熱反應(yīng)的效力。用D2E7、rhTNF和D2E7與rhTNF的免疫復(fù)合物靜脈注射三只一組重約2.5kg的每一只NZW雌兔。用Kaye熱記錄儀的熱敏電阻探頭測定每分鐘的直腸溫度約4小時(shí)。在注射后約45分鐘，鹽水中的以5μg/kg注射的重組人TNF導(dǎo)致溫度上升超過0.4℃。直至注射后140分鐘，溶于鹽水并以138μg/kg劑量單獨(dú)的抗體制劑沒有導(dǎo)致兔子溫度上升。在所有的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，將D2E7或?qū)φ赵噭?人IgG1或鹽水載體)靜脈注射給兔子。并于15分鐘后靜脈注射鹽水中5μg/kg的rgTNF。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果概括于下表14
表14用D2E7在兔子中抑制rh-TNF誘導(dǎo)的發(fā)熱
峰值溫度**=抑制百分比=(1-{使用rhTNF和D2E7時(shí)的溫度上升/僅使用rhTNF時(shí)的溫度上升})×100與僅用鹽水預(yù)治療的兔子相比，用14μg/kg的劑量的D2E7靜脈預(yù)治療部分地抑制該熱原反應(yīng)。以137μg/kg給與的D2E7在同一實(shí)驗(yàn)中完全抑制了rhTNF的熱原反應(yīng)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與僅用鹽水預(yù)治療的兔子相比，以24μg/kg給與的D2E7亦部分地抑制該熱原反應(yīng)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，D2E7與rhTNF的摩爾比是1/6:1。在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與鹽水中的30μg/kg的對照人IgG1預(yù)治療的兔子相比，以48μg/kg(摩爾比D2E7:rhTNF=3.3:1)靜脈注射的D2E7完全抑制了該熱原反應(yīng)。在最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用很高D2E7:rhTNF(55:1)摩爾比的D2E7(792μg/kg預(yù)治療的兔子在直至觀察的4個(gè)小時(shí)內(nèi)的任何時(shí)刻體溫都升高。用將D2E7和rhTNF的混合物(摩爾比55:1)于37℃培育1小時(shí)制備的免疫復(fù)合物治療兔子亦未引起在同一實(shí)驗(yàn)中的任何溫度上升。
Ⅲ．在Tg197轉(zhuǎn)基因小鼠中預(yù)防多關(guān)節(jié)炎在轉(zhuǎn)基因鼠關(guān)節(jié)炎模型中研究D2E7對疾病發(fā)展的影響。已制備表達(dá)人野生型TNF(在所述編碼序列的3’區(qū)內(nèi)修飾)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg197)，并且這些小鼠在4-7周齡時(shí)100％發(fā)生慢性多關(guān)節(jié)炎(參見EMBO J.(1991)10:4025-4031有關(guān)多關(guān)節(jié)炎Tg197模型的進(jìn)一步描述)。
通過PCR在年齡為三天時(shí)識別轉(zhuǎn)基因動物。將一窩轉(zhuǎn)基因小鼠分成六組。在年齡為15天時(shí)通過槽印跡雜交分析確認(rèn)轉(zhuǎn)基因小鼠。按下述程序治療這六個(gè)組1組=未治療；2組=鹽水(載體)；3組=1.5μg/g的D2E7；4組=15μg/g的D2E7；5組=30μg/g的D2E7；和6組=30μg/g的IgG1同種型對照。將一窩非轉(zhuǎn)基因小鼠亦包括于本研究中做為對照(7組-非轉(zhuǎn)基因；未治療)。每組每周接受指明的治療的三次腹膜內(nèi)注射。注射持續(xù)10周。每周，記錄每個(gè)動物的關(guān)節(jié)形態(tài)的宏觀變化。第10周時(shí)，處死所有的小鼠并將小鼠組織收集于福爾馬林中。對該組織進(jìn)行顯微鏡檢查。
在每周開始時(shí)記錄每只小鼠的動物重量克數(shù)。同時(shí)記錄測定的關(guān)節(jié)尺寸(mm)以做為疾病嚴(yán)重性的尺度。用測微儀三次測定后右踝的平均值做為關(guān)節(jié)尺寸。每周按照下述記錄關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)0=無關(guān)節(jié)炎，(正常外觀和彎曲)；+=輕微關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)變形)；++=中等關(guān)節(jié)炎(腫脹，關(guān)節(jié)變形)和+++=嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎(在屈曲檢測到關(guān)節(jié)強(qiáng)硬和嚴(yán)重運(yùn)動受損)。根據(jù)關(guān)節(jié)切片的蘇木精/曙紅染色的組織病理學(xué)計(jì)分按下述進(jìn)行0=未檢測到疾??；1=滑膜增生；2=嚴(yán)重滑液加厚；3=軟骨破壞和骨侵蝕。
D2E7治療對該Tg197轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠的平均關(guān)節(jié)尺寸的影響示于圖9的曲線圖中。11周齡時(shí)該Tg197轉(zhuǎn)基因小鼠的組織病理學(xué)和關(guān)節(jié)炎計(jì)分概括于下表15中
表15D2E7對Tg197小鼠組織病理學(xué)和關(guān)節(jié)炎計(jì)分的影響
該實(shí)驗(yàn)證明D2E7抗體對表達(dá)野生型人TNF的轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg197)具有明確有益效果，在本研究時(shí)期后沒有可證實(shí)的關(guān)節(jié)炎。E.D2E7中和來自其它物種的TNFα利用L929細(xì)胞毒性檢測(如上述實(shí)施例4A小節(jié)所述)，通過檢測D2E7中和來自各種靈長類物種和來自小鼠的腫瘤壞死因子檢測其結(jié)合特異性。結(jié)果概括于下表16中
表16D2E7在L929檢測中中和來自不同物種TNF的能力
表16中的結(jié)果證明，D2E7可以以約等于人TNFα的情況中和五種靈長類TNFα的活性，而且可以中和犬TNFα(約比人TNFα差10倍)、豬和鼠TNFα(約比人TNFα差～1000倍)。另外，D2E7與溶液相rhTNFα的結(jié)合未受其它細(xì)胞因子(例如淋巴細(xì)胞毒素(TNFβ)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFNγ和TGFβ)抑制，表明D2E7對其配體TNFα具有非常的特異性。F．用D2E7培育的人全血缺乏細(xì)胞因子釋放在該實(shí)施例中，檢測了D2E7本身誘導(dǎo)正常人血液細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或排出細(xì)胞表面分子的能力。將D2E7與來自三個(gè)不同正常獻(xiàn)血者的稀釋全血于不同濃度培育24小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行LPS陽性對照，其濃度已預(yù)先確定可以刺激免疫活性血細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。收集上清液并在有10種可溶性細(xì)胞因子、受體和粘附分子(IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗劑、IL-6、IL-8、TNFα、可溶性TNFα受體Ⅰ、可溶性TNFα受體Ⅱ、可溶性ICAM-1和可溶性E-selectin)的ELISA藥盒嵌板中檢測。直至濃度為343μg/ml，由于D2E7抗體共培育的結(jié)果，沒有檢測到顯著數(shù)量的細(xì)胞因子或排出細(xì)胞表面分子。未加入該抗體的對照培養(yǎng)物亦未產(chǎn)生可檢測量的細(xì)胞因子，而LPS共培養(yǎng)對照產(chǎn)生了pg至ng范圍的較高的值。這些結(jié)果表明D2E7沒有誘導(dǎo)全血細(xì)胞離體培養(yǎng)中分泌高出正常水平的細(xì)胞因子或排出細(xì)胞表面蛋白。
所附的順序表構(gòu)成了本說明書的一部分，該表的內(nèi)容概括于下表中
等價(jià)物僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會識別或能夠確定許多與本文描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的等價(jià)物。這種等價(jià)物包括于下列權(quán)利要求之內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)收信人BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl-Bosch Str.38(C)城市67056Ludwigshafen(D)州Rheinland-Pfalz(E)國家德意志聯(lián)邦共和國(ⅱ)發(fā)明名稱結(jié)合人TNFα的人抗體(ⅲ)序列數(shù)37(ⅳ)通信地址(A)收信人LAHIVE&amp;COCKFIELD(B)街道60State Street,suite510(C)城市波士頓(D)州麻省(E)國家美國(F)郵政編碼02109-1875(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，版本#1.25(ⅳ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S08/599,226
(B)提交日期1996年2月9日(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S60/031,476(B)提交日期1996年11月25日(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名DeConti,Giulio A.,Jr.
(B)注冊號31,503(C)參考/檔案號BBI-043CPPC(ⅸ)電訊資料(A)電話(617)227-7400(B)傳真(617)227-5941(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu ASp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Ash Arg Ala Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100105(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長度121個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro GIy Arg1 510 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Ala Met His Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Sar Val50 55 60Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注釋=“Xaa為Thr或Ala”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3:
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala pro Tyr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注釋=“Xaa為Tyr或Asn”
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4:Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa1 S 10(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:5:Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6:Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7:Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特征(A)長度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8:Asp Tyr Ala Met His1 5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)順序特征(A)長度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:9:Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Se Ile Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Sar Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr85 90 95Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)順序特征(A)長度121個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:10:Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:11:
Gln Lys Tyr Asn Ser Ala pro Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:12:
Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅱ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅳ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:13:
Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:14:
Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1 5:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:16:
Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)順序特征
(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:17:
Gln Lys Tyr Asn Ser Ala pro Tyr Tyr1 5(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:18:
Gln Lys Tyr Asn Ser Ala pro Tyr Asn1 5(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:19:Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:20:Gln Lys Tyr Asn Arg Ala pro Tyr Asn1 5(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:21:Gln Lys Tyr Ash Ser Ala Ala Tyr Ser1 5(2)SEQ ID NO:22的信息
(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:22:Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr1 5(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:23:Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:24Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:25:Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:26:Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:27:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:28:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:29:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:30:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:32:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:33:Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)順序特征
(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:34:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:35:Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)順序特征(A)長度321個(gè)核苷酸(B)類型核酸(C)類型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31:GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGGGA CAGAGTCACC60ATCACTTGTC GGGCAAGTCA GGGCATCAGA AATTACTTAG CCTGGTATCA GCAAAAACCA 120GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCACTT TGCAATCAGG GGTCCCATCT 180CGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTACAGCCT 240GAAGATGTTG CAACTTATTA CTGTCAAAGG TATAACCGTG CACCGTATAC TTTTGGCCAG 300GGGACCAAGG TGGAAATCAA A 321(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)順序特征(A)長度363個(gè)核苷酸(B)類型核酸(C)類型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31:GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CCGGCAGGTC CCTGAGACTC 60TCCTGTGCGG CCTCTGGATT CACCTTTGAT GATTATGCCA TGCACTGGGT CCGGCAAGCT 120CCAGGGAAGG GCCTGGAATG GGTCTCAGCT ATCACTTGGA ATAGTGGTCA CATAGACTAT 180GCGGACTCTG TGGAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAT 240CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCTGAGGAT ACGGCCGTAT ATTACTGTGC GAAAGTCTCG 300TACCTTAGCA CCGCGTCCTC CCTTGACTAT TGGGGCCAAG GTACCCTGGT CACCGTCTCG 360AGT 36權(quán)利要求
1．分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，同以不高于12×10-8M的Kd和不高于1×10-3s-1的Koff速率常數(shù)(均由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離、并在一標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-7M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。
2權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于5×10-4s-1的Koff速率常數(shù)與人TNFα解離。
3．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于1×10-4s-1的Koff速率常數(shù)與人TNFα解離。
4．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-8M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。
5．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于1×10-9M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。
6．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測中以不高于5×10-10M的IC50中和人TNFα細(xì)胞毒性。
7．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它是重組抗體或其抗原結(jié)合部分。
8．權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它抑制人TNFα誘導(dǎo)的ELAM-1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)。
9．具有以下特征的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分a)以不高于1×10-3s-1的Koff速率常數(shù)(由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離b)具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列。c)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。
10．權(quán)利要求9的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于5×10-4s-1的koff速率常數(shù)與人TNFα解離。
11．權(quán)利要求9的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它以不高于1×10-4s-1的Koff速率常數(shù)與人TNFα解離。
12．分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列的CDR3域，其重鏈可變區(qū)(HCVR)具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列的CDR3域。
13．權(quán)利要求12的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR2域，并且該HCVR還具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2域。
14．權(quán)利要求13的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該LCVR另外具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1域，并且該HCVR具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1域。
15．分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)。
16．權(quán)利要求15的分離人抗體，該抗體具有一IgG1重鏈恒定區(qū)。
17．權(quán)利要求15的分離人抗體，該抗體具有一IgG4重鏈恒定區(qū)。
18．權(quán)利要求15的分離人抗體，該抗體是一Fab片段。
19．權(quán)利要求15的分離人抗體，該抗體是一單鏈Fv片段。
20．分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有包含選自以下的氨基酸序列的CDR3域:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或其重鏈可變區(qū)(HCVR)具有包含選自以下的氨基酸序列的CDR3域:SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQID NO:34。
21．中和人TNFα而非人TNFβ活性的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分。
22．權(quán)利要求21的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分，它亦中和黑猩猩TMFα和選自以下的至少一種其它靈長類TNFα的活性狒狒TNFα、狨TNFα、獼猴TNFα和恒河猴TNFα。
23．權(quán)利要求22的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分，它亦中和犬TNFα的活性。
24．權(quán)利要求22的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分，它亦中和豬TNFα的活性。
25．編碼輕鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或包含通過于位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過于位置1、3、4、6、7、8和/或9的一至五個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列。
26．權(quán)利要求25的分離核酸，它編碼抗體輕鏈可變區(qū)(LCVR)。
27．權(quán)利要求26的分離核酸，其中該抗體LCVR的CDR2域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
28．權(quán)利要求27的分離核酸，其中該抗體LCVR的CDR1域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
29．編碼重鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或包含通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的一至五個(gè)保守氨基酸置換從SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。
30．權(quán)利要求29的分離核酸，它編碼抗體重鏈可變區(qū)(HCVR)。
31．權(quán)利要求30的分離核酸，其中該抗體HCVR的CDR2域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
32．權(quán)利要求31的分離核酸，其中該抗體HCVR的CDR1域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
33．編碼CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
34．編碼包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的分離核酸。
35．權(quán)利要求34的分離核酸，它編碼該抗體輕鏈可變區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū)。
36．權(quán)利要求35的分離核酸，它存在于一個(gè)重組表達(dá)載體中。
37．編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)的分離核酸。
38．權(quán)利要求37的分離核酸，它編碼該抗體重鏈可變區(qū)和抗體重鏈恒定區(qū)。
39．權(quán)利要求38的分離核酸，其中該抗體重鏈恒定區(qū)是IgG1恒定區(qū)。
40．權(quán)利要求38的分離核酸，其中該抗體重鏈恒定區(qū)是IgG4恒定區(qū)。
41．權(quán)利要求38的分離核酸，它存在于一個(gè)重組表達(dá)載體中。
42．編碼以下的重組表達(dá)載體:a)具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體輕鏈；和b)具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體重鏈。
43．導(dǎo)入了權(quán)利要求42的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
44．合成結(jié)合人TNFα的人抗體的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求43的宿主細(xì)胞，直至該細(xì)胞合成結(jié)合人TNFα的人抗體。
45．包含權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合部分和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。
46．權(quán)利要求45的藥用組合物，它還包含至少一種用于治療hTNFα活性為有害的紊亂的其它治療劑。
47．抑制人TNFα活性的方法，該方法包括用權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合部分接觸人TNFα使得人TNFα活性被抑制。
48．在患紊亂的人類受治療者中抑制人TNFα的方法，在該紊亂中TNFα活性是有害的，該方法包括給與該人類受治療者權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得該人類受治療者中的人TNFα活性被抑制。
49．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是膿毒癥。
50．權(quán)利要求49的方法，其中將該抗體與細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)一同給予該人類受治療者，或者將該抗體給與血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml的人受治療者。
51．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是自身免疫疾病。
52．權(quán)利要求51的方法，其中該自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。
53．權(quán)利要求51的方法，其中該自身免疫疾病選自變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥。
54．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是傳染病。
55．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是移植排斥或移植物抗宿主病。
56．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是惡性腫瘤。
57．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是肺功能紊亂。
58．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是腸功能紊亂。
59．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂是心臟功能紊亂。
60．權(quán)利要求48的方法，其中該紊亂選自炎癥性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、爆發(fā)性肝炎、凝結(jié)紊亂、燒傷、再灌注損傷、瘢痕疙瘩形成、瘢痕組織形成、發(fā)熱、牙周炎、肥胖和放射毒性。
61．權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分用于制造治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物的用途。
62．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是膿毒癥。
63．權(quán)利要求62的用途，其中可以將該抗體與細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)一同向該人類受治療者給藥，或者將該抗體給與血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml的人受治療者。
64．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是自身免疫疾病。
65．權(quán)利要求64的用途，其中該自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。
66．權(quán)利要求64的用途，其中該自身免疫疾病選自變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合癥。
67．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是傳染病。
68．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是移植排斥或移植物抗宿主病。
69．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是惡性腫瘤。
70．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是肺功能紊亂。
71．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是腸功能紊亂。
72．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂是心臟功能紊亂。
73．權(quán)利要求61的用途，其中該紊亂選自炎癥性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、爆發(fā)性肝炎、凝結(jié)紊亂、燒傷、再灌注損傷、瘢痕疙瘩形成、瘢痕組織形成、發(fā)熱、牙周炎、肥胖和放射毒性。
全文摘要
公開了特異性與人腫瘤壞死因子α(hTNFα)結(jié)合的人抗體,最好為重組人抗體。這些抗體對hTNFα具有高親和性(例如,K
文檔編號A61P33/06GK1215407SQ97193635
公開日1999年4月28日 申請日期1997年2月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月9日
發(fā)明者J·G·薩菲爾德, D·J·阿倫, Z·凱馬克卡蘭, B·拉布科夫斯基, J·A·曼克維, B·T·麥圭內(nèi)斯, A·J·羅伯茨, P·薩克拉法斯, H·R·J·M·霍根布姆, D·舍恩豪特, T·J·沃漢, M·懷特, A·J·維爾頓 申請人:Basf公司