專(zhuān)利名稱(chēng)：用尼美舒利治療神經(jīng)變性疾病的制作方法
1.引言本發(fā)明涉及尼美舒利(nimesulide)及結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物在預(yù)防和/或治療神經(jīng)變性疾病如早老性癡呆(Alzheimer病)上的應(yīng)用。這至少部分基于尼美舒利在有效濃度時(shí)能抑制細(xì)胞死亡的發(fā)現(xiàn)。
2.發(fā)明的背景2.1.早老性癡呆散發(fā)的早老性癡呆是與衰老有關(guān)的主要神經(jīng)變性疾病，在65-85歲之間，發(fā)生此病的危險(xiǎn)呈指數(shù)增長(zhǎng)，每5歲增一倍。組織學(xué)上，早老性癡呆的標(biāo)志是淀粉樣蛋白沉積在老年斑和腦血管壁上；神經(jīng)纖維出現(xiàn)纏繞，及神經(jīng)變性。但是，早老性癡呆的病因?qū)W尚不清楚。有人提出遺傳因素起作用，包括三體性21淀粉樣蛋白β-蛋白前體(“APP”)基因、早老素1(presenilin-1，PS1)和早老素2(presenilin-2，PS2)基因中的突變，及載脂蛋白E 4型等位基因的存在(Younkin，1995，Ann.Neurol.37287-288；Lendon et al.，1997，JAM A 277825)。一些研究表明，β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)了培養(yǎng)的神經(jīng)原細(xì)胞調(diào)亡(Loo et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.907951-7955；Li et al.，1996，Brain Res.738196-204)。這種調(diào)亡的誘導(dǎo)可能涉及立即早期基因蛋白c-jun和fos(Anderson et al.，1995，J.Neurochemistry651487-1498；Anderson et al.，1994，Experimental Neurology 125286-295；Anderson et al.，1996，J.Neurosci.161710-1719)。
有人提出，調(diào)亡可能涉及早老性癡呆的發(fā)病機(jī)理(Smale et al.，1995，Exp.Neurol.133225-230；Anderson et al.，1996，J.Neurosci.161710-1719；Anderson etal.，1994，Exp.Neurol.125286-295)，炎癥機(jī)制也可能牽連其中(Pasinetti，1996，Neurobiol.Ageing 17707-716)，支持這一機(jī)制的是如下觀察早老性癡呆患者的血清中急性期蛋白質(zhì)升高并沉積于淀粉樣蛋白斑中；激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有定位于老年斑附近的傾向，補(bǔ)體成分定位于營(yíng)養(yǎng)障礙的神經(jīng)軸突和神經(jīng)纖維纏繞物周?chē)?Aisen & Davis，1994，Am.J.Psychiatry 1511105-1113)?？寡讋┍煌扑]為潛在的治療劑(Aisen et al.，1996，Dementia 7201-206；McGeer et al.，1996，Neurology47425-432)。環(huán)氧合酶-2的選擇性抑制劑因其不良副作用少現(xiàn)已被開(kāi)發(fā)成這種炎癥的治療劑(International Publication No.WO 94/13635 by Merck Frosst CanadaInc.)。但是，在本發(fā)明之前，無(wú)人相信這些藥物可用于在早老性癡呆病程中抑制神經(jīng)變性的非炎癥性過(guò)程。
2.2.環(huán)氧合酶-2環(huán)氧合酶(“COXs”)是催化花生四烯酸(AA)生成前列腺素(“PG”)-H2的酶。PG-H2被進(jìn)一步代謝為有生理活性的PG(如PG-D2、PG-E2和PG-F2α)、前列環(huán)素(PG-I2)和血栓烷。具體的PG對(duì)不同的組織具有各種效應(yīng)，常常是拮抗效應(yīng)。例如，PG-I2和PG-E2是強(qiáng)血管擴(kuò)張劑，可引起炎癥反應(yīng)，而PG-F2α是血管收縮劑。
已知有兩種COX同功酶COX-1和COX-2，它們?cè)谏韺W(xué)上雖然不同，但氨基酸序列和酶促功能相似。COX-1在不同細(xì)胞類(lèi)型中基本上以不同的水平表達(dá)。但COX-2基本上不表達(dá)，在正常外周組織中一般不能檢出(Kujubu et al.，1991，J.Biol.Chem.26612866-12872；O′Banion et al.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894888-4892)。COX-2的表達(dá)是可誘導(dǎo)的(如用促細(xì)胞分裂劑)，COX-2mRNA水平觀察到對(duì)炎癥刺激劑如白介素1β和脂多糖反應(yīng)中快速升高，而對(duì)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)中降低。受到這些因素作用時(shí)，COX-1 mRNA水平基本上保持不變，表明COX-2是介導(dǎo)炎癥的同功酶(Cao et al.，1995，Brain Res.697187-196；O′Banion et al.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894888-4892)。
最近的證據(jù)表明，COX-2可能在外周細(xì)胞的細(xì)胞存活和細(xì)胞粘附機(jī)制上起作用(Lu et al.1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.927961-7965；Tsujii et al.，1995，Cell 83493-501)。Tsujii等報(bào)告經(jīng)基因工程改造表達(dá)升高水平COX-2的上皮細(xì)胞，對(duì)丁酸引起的細(xì)胞調(diào)亡有耐受性，顯示BCL2蛋白表達(dá)升高，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2受體水平降低(Tsujii et al.，1995，Cell 83493-501)。Lu等指出，非甾類(lèi)抗炎藥物可誘導(dǎo)涉及COX系統(tǒng)的細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制。
COX-1、COX-2和PG合成在正常腦中和在早老性癡呆的病程中的作用至今尚未被完全描繪。PG在腦生理上的重要性可能不依賴(lài)炎癥機(jī)制。在腦中，PG受體見(jiàn)于下丘腦、丘腦和邊緣系統(tǒng)(Watanabe et al.，1989，Brain Res.478143-148)。PG涉及下丘腦-垂體激素分泌(Kinoshita et al.，1982，Endocrinol.1102207-2209)、溫度調(diào)節(jié)和睡眠-清醒周期(Hayaishi，1988，J.Biol.Chem.26314593-14596)。最近有證據(jù)表明通過(guò)突觸活性和糖皮質(zhì)激素在大鼠腦中表達(dá)和調(diào)節(jié)了COX-2 mRNA(Adams et al.，1996，J.Neurochem.666-13；Kaufmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.932317-2321；Yamagata et al.，1993，Neuron 11371-386)。這些研究表明COX-2在腦中作為立即早期基因受調(diào)節(jié)，并提示PG在跨突觸信號(hào)傳遞和長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)上可能是重要的。Chang et al.(1996，Neurobiol.Of Aging17801-808)報(bào)告，早老性癡呆癥COX-2 mRNA表達(dá)減少。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及尼美舒利及結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物在預(yù)防和/或治療神經(jīng)變性疾病上的應(yīng)用。這至少部分基于如下發(fā)現(xiàn)(i)在神經(jīng)變性模型中COX-2的表達(dá)在神經(jīng)原中而非膠質(zhì)細(xì)胞中增加(符合非炎癥性機(jī)制)，和(ii)尼美舒利對(duì)β-淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡顯示神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。由于COX抑制劑能增加非神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡，這后一個(gè)發(fā)現(xiàn)是特別意想不到的。似乎尼美舒利抑制神經(jīng)變性的非炎癥性機(jī)制，而這不受任何特定理論的束縛。
4.


圖1.對(duì)照組未受損雄性大鼠腦中COX-2 mRNA的區(qū)域表達(dá)用原位雜交評(píng)估和用X-射線放射自顯影顯示COX-2 mRNA表達(dá)。縮寫(xiě)DG，齒狀回；海馬結(jié)構(gòu)的神經(jīng)原錐體層的CA1、CA2和CA3亞區(qū)；PAC，頂部皮層(parietal cortex)；PYC，梨狀區(qū)皮層；AC，杏仁樣復(fù)合體(amygdaloid)；THAL，丘腦腹后側(cè)核。改編自Paxinos & Watson圖版24，1986(The Rat Brain inSteriotaxic，Coordinates，Academic Press，NY)。
圖2.大鼠腦中COX-2 mRNA表達(dá)的成熟調(diào)節(jié)從放射自顯影圖象進(jìn)行光密度定量?？s寫(xiě)如上及如下所述PYC/AC，梨狀區(qū)和杏仁樣復(fù)合體作為單個(gè)腦區(qū)作COX-2 mRNA表達(dá)的定量。N＝5-8/時(shí)間點(diǎn)。
圖3.對(duì)KA引起的驚厥產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)對(duì)COX-2 mRNA表達(dá)的成熟影響從放射自顯影圖象制備的顯微攝影。變化的解剖分布參見(jiàn)圖1。對(duì)照組，注射賦形劑的未受損大鼠；處死前8小時(shí)用KA 8H，KA處理的大鼠；出生后天數(shù)，P-7、P-14和P-21。
圖4A-D.對(duì)KA處理產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)大鼠腦中COX-2 mRNA變化的時(shí)間過(guò)程變化的成熟影響和區(qū)域分布從放射自顯影圖象進(jìn)行光密度定量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，N＝4-6/組。p＜0.01(與0H組(注射鹽水組)相比)；4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、30小時(shí)、120小時(shí)，KA引起的驚厥發(fā)作后時(shí)間，以小時(shí)計(jì)。
圖5A-D.對(duì)大鼠海馬中COX-2 mRNA表達(dá)和誘導(dǎo)的分布的成熟影響通過(guò)在位雜交試驗(yàn)評(píng)估和采用暗視野照明的乳液放射自顯影顯示P21(A，B)和成鼠(C，D)海馬結(jié)構(gòu)中的COX-2 mRNA。A和C，在對(duì)照組大鼠(注射賦形劑)中的COX-2 mRNA表達(dá)；B和D，KA引起的驚厥發(fā)作8小時(shí)后的COX-2mRNA。箭頭指向DG(粒層)的淺表層。標(biāo)尺＝200μm。
圖6.用凝集印跡雜交試驗(yàn)評(píng)價(jià)對(duì)KA引起的驚厥產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，海馬COX-2而非COX-1 mRNA的選擇性誘導(dǎo)CTL，注射鹽水的對(duì)照組大鼠；KA，KA處理的大鼠，毀損12小時(shí)后。
圖7A-I.在成年大鼠腦中KA引起的COX-2和細(xì)胞調(diào)亡(A，B)，分別在對(duì)照組和KA處理大鼠的CA3海馬錐體神經(jīng)原中COX-2mRNA的表達(dá)；(C)，顯示有凋亡特征(箭頭)神經(jīng)原的KA毀損大鼠海馬結(jié)構(gòu)的CA3亞區(qū)。(D，E)，分別為對(duì)照組和KA處理大鼠的梨狀區(qū)皮層的COX-2mRNA表達(dá)。(F)，箭頭指向KA毀損大鼠的梨狀區(qū)皮層凋亡細(xì)胞。(G「H)，分別為對(duì)照組和KA處理大鼠的杏仁樣復(fù)合體細(xì)胞中的COX-2mRNA表達(dá)。(I)，箭頭指向KA毀損大鼠的杏仁樣復(fù)合體調(diào)亡細(xì)胞。通過(guò)原位雜交試驗(yàn)評(píng)估和采用暗視野照明的乳液放射自顯影測(cè)定COX-2 mRNA。用原位3′端標(biāo)記評(píng)價(jià)KA處理后的細(xì)胞調(diào)亡特征。標(biāo)尺在A、B、D、E、G和H中＝200μm；在C、F和I中＝40μm。
圖8A-D.體外試驗(yàn)中對(duì)谷氨酸鹽產(chǎn)生反應(yīng)的神經(jīng)原COX-2表達(dá)/調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)接觸谷氨酸鹽后(12小時(shí))(A)對(duì)照組和(B)大鼠原代海馬神經(jīng)原的單型培養(yǎng)物中的COX-2樣免疫反應(yīng)性。(C，D)，分別為對(duì)照和谷氨酸鹽處理的培養(yǎng)物與免疫吸附COX-2抗體的免疫反應(yīng)。標(biāo)尺＝50μm。
圖9A-C.尼美舒利對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)中內(nèi)毒素介導(dǎo)的細(xì)胞因子和亞硝酸鹽合成/分泌的作用在BV2小鼠無(wú)限增殖化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中評(píng)估10-9M尼美舒利對(duì)(A)TNF、(B)NO中間產(chǎn)物(Griess reaction)和(C)PGE2的合成/分泌的作用。平均值±SEM，n＝8-10/組。脂多糖(″LPS″)＝5μg/ml。LPS和尼美舒利聯(lián)合加入培養(yǎng)物中；培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。統(tǒng)計(jì)采用ANOVA，p＜0.05。
圖10A-E.對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡的情況產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，在P19細(xì)胞中COX-2 mRNA變化的時(shí)間過(guò)程
(A)，P19細(xì)胞中COX-2誘導(dǎo)的定量分析，n＝4-6/組，p＜0.05(與t＝0相比)；(B)，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)對(duì)變化進(jìn)行Western分析評(píng)價(jià)；(C，D)除去血清(用N2培養(yǎng)基取代)24小時(shí)后用Hoechst H33258評(píng)價(jià)P19細(xì)胞中調(diào)亡細(xì)胞核的形態(tài)外觀；(E)，除去血清14小時(shí)后評(píng)估顯示DNA階梯狀降解的DNA電泳圖譜(第1泳道，t＝0時(shí)的對(duì)照細(xì)胞；第2泳道，去除血清14小時(shí)后的DNA階梯；第3泳道，DNA標(biāo)志)。這些研究中所用的COX-2多克隆抗體在第6部分有描述。COX-2特異性抗體識(shí)別小鼠、大鼠和人腦的總勻漿中估計(jì)分子量約為70和65kDa的兩個(gè)主要區(qū)帶。
圖11A-E.在SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)Aβ1-40介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)COX-2的調(diào)節(jié)(A)顯示相對(duì)于對(duì)照組(CTL)的COX-2免疫反應(yīng)量的條形圖，免疫反應(yīng)性的衡量來(lái)自(B)中顯示的數(shù)據(jù)；(B)從對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞或接觸Aβ肽48或72小時(shí)的細(xì)胞制備的蛋白與COX-2抗血清反應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡；(C)對(duì)照組或Aβ處理SH-SY5Y細(xì)胞的MTT試驗(yàn)結(jié)果；(D)剝脫的(stripped)和與肌動(dòng)蛋白抗血清免疫反應(yīng)的(B)中顯示的免疫印跡；(E)檢查SH-SY5Y培養(yǎng)物的調(diào)機(jī)制。
圖12.用SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)MTT試驗(yàn)評(píng)估尼美舒利對(duì)Aβ1-40介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用。
縮寫(xiě)CTL對(duì)照；NIM尼美舒利；AB-β-淀粉樣蛋白(1-40)。*p＜0.01(與CTL相比)；**p＜0.05(與CTL相比)。
圖13.AD和年齡配對(duì)的神經(jīng)學(xué)對(duì)照組的顳部皮層中COX-2免疫反應(yīng)性誘導(dǎo)的顯微攝影此顯微攝影顯示在富含神經(jīng)原的灰質(zhì)(″gm″)中而非富含膠質(zhì)細(xì)胞的白質(zhì)(″wm″)區(qū)域中COX-2免疫染色的選擇性誘導(dǎo)。
圖14A-D.AD腦額部皮層神經(jīng)原的COX-2免疫染色及COX-2免疫染色與AD腦額部皮層AD斑的共定位(A，B)，顯示AD神經(jīng)原的COX-2免疫染色(A，低功率；B，高功率放大)；(C)，擴(kuò)散斑的免疫染色；(D)用毗鄰組織切片Aβ免疫染色評(píng)估神經(jīng)原斑中的COX-2。
圖15A-D.AD腦額部皮層的COX-2表達(dá)(A)AD額部皮層相對(duì)于對(duì)照組的COX-2和COX-1mRNA的Northern印跡，數(shù)據(jù)的定量分析在(B)；(C)AD額部皮層和對(duì)照組COX-2蛋白的Western印跡，數(shù)據(jù)的定量分析在(D)。
圖16.ALS脊髓的前角和后角及神經(jīng)學(xué)對(duì)照組的神經(jīng)原中的COX-2mRNA調(diào)節(jié)。
用X線底片顯示放射自顯影圖象。指向前角的箭頭顯示ALS病例COX-2mRNA信號(hào)的強(qiáng)誘導(dǎo)。
圖17A-D.用原位雜交試驗(yàn)評(píng)估人皮層癲癇灶活組織檢查中COX-2mRNA的升高用X線底片顯示放射自顯影圖象。指向皮層的箭頭顯示癲癇腦(A)相對(duì)于對(duì)照組(B)中的COX-2mRNA強(qiáng)信號(hào)；(C)和(D)部分顯示關(guān)于COX-2和COX-1mRNA水平匯編數(shù)據(jù)的分析。
圖18.聚集的Aβ肽對(duì)環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物酶活性的增強(qiáng)圖19A-B.神經(jīng)細(xì)胞中COX-2的短暫表達(dá)增強(qiáng)Aβ介導(dǎo)的氧化還原活性的損害將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染人COX-2(A)或COX-1(B)基因，并用Aβ25-35處理，然后用MTT試驗(yàn)評(píng)估氧化還原活性。
圖20A-B.表達(dá)COX-2轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生(A)原位雜交證明COX-2mRNA在TgNHC32小鼠而不在野生型小鼠(一月齡小鼠)中表達(dá)；(B)hCOX-2mRNA在NHC32和NHC5上相對(duì)于野生型上的區(qū)域表達(dá)，用Bioquant圖象分析進(jìn)行定量。
圖21.在原代小鼠神經(jīng)原培養(yǎng)物中hCOX-2超量表達(dá)增強(qiáng)了Aβ介導(dǎo)的氧化損害。
圖22.尼美舒利保護(hù)B12神經(jīng)原細(xì)胞抗御谷氨酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
圖23.圖22的對(duì)照研究用LDH試驗(yàn)測(cè)定與谷氨酸介導(dǎo)的氧化損害有關(guān)的劑量(A)和時(shí)間過(guò)程(B)。(C)表明尼美舒利對(duì)B12培養(yǎng)物無(wú)毒性。
5.發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及環(huán)氧合酶-2(″COX-2″)選擇性抑制劑尼美舒利及結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物在預(yù)防和/或治療神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用。這至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即COX-2表達(dá)的增加與紅藻氨酸產(chǎn)生的神經(jīng)原損害增加以及與體外系統(tǒng)中建立的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)的增加相平行(見(jiàn)下面的第6和8節(jié))?，F(xiàn)有技術(shù)報(bào)告說(shuō)COX-2在炎癥中起主要作用，并可能涉及神經(jīng)變性(例如在早老性癡呆的病程中)的炎癥成分，但與此相反，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在人腦中COX-2的表達(dá)似乎限于神經(jīng)原而非膠質(zhì)細(xì)胞(而如果炎癥機(jī)制起作用的話(huà)則預(yù)料會(huì)在到膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，見(jiàn)下面的第9節(jié))。已觀察到COX-2表達(dá)和早老性癡呆、淀粉樣蛋白斑所伴有的特征性病理變化之間的相關(guān)性(見(jiàn)第9節(jié))。而且，證明在神經(jīng)原培養(yǎng)物中尼美舒利發(fā)揮了抵御β-淀粉樣蛋白引起細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明，尼美舒利及相關(guān)的化合物可用來(lái)干預(yù)早老性癡呆和其它神經(jīng)變性疾病所伴有的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程。尼美舒利及相關(guān)化合物的作用(不受任何特定理論的束縛)可能通過(guò)降低氧化應(yīng)激的調(diào)亡效應(yīng)而起作用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“尼美舒利”指具有如下式I所述結(jié)構(gòu)的化合物4-硝基-2-苯氧基-N-甲磺酰苯胺。
被認(rèn)為結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物是具有類(lèi)似雙環(huán)結(jié)構(gòu)和選擇性、用作COX-2的化合物。例如，尼美舒利的取代化合物、類(lèi)似物和對(duì)映體被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物。作為另一個(gè)例子，如結(jié)晶體圖所測(cè)定，結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物可與尼美舒利競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合COX-2，或可結(jié)合COX-2的基本上同一部位。此外，按本文定義與其它化合物交聯(lián)的尼美舒利也被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物。
可給予患者尼美舒利或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物在受治療者的神經(jīng)系統(tǒng)提供有效濃度。本文中，有效濃度定義為至少能抑制20％神經(jīng)細(xì)胞死亡的濃度。在本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案中，在需要治療的神經(jīng)細(xì)胞部位，尼美舒利的濃度至少為1納摩爾，較佳為至少1微摩爾。理想的是，在神經(jīng)細(xì)胞部位的濃度低于10-3摩爾以避免毒性。在一個(gè)這樣的實(shí)施例中，其中待治療的神經(jīng)變性疾病是早老性癡呆，受治療者海馬結(jié)構(gòu)中尼美舒利的濃度至少為1皮摩爾，較佳為至少1納摩爾，更佳為至少1微摩爾。相應(yīng)的血清濃度可能是至少10皮摩爾，較佳為至少10納摩爾，更佳為至少10微摩爾。也可使用相等量的結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物(因強(qiáng)度差異調(diào)整到補(bǔ)償量)。
尼美舒利或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物可以達(dá)到所需有效濃度的方式給藥。例如，合適的給藥途徑包括口服、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給藥和鞘內(nèi)注射。
尼美舒利或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物可包含在合適的藥物載體中。此類(lèi)制劑可供緩釋用。
例如(但不是限制)，尼美舒利可以2-800mg/天的劑量口服給藥，較佳為50-400mg/天，最佳為200mg/天。
可按照本發(fā)明進(jìn)行治療的神經(jīng)變性疾病包括(但不限于)早老性癡呆、帕金森氏病、伴有驚厥的神經(jīng)變性、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓損傷以及病情常規(guī)上不認(rèn)為是炎癥介導(dǎo)的或自身免疫性的其它疾病。
6.實(shí)施例大鼠腦中COX-2的成熟調(diào)節(jié)和區(qū)域誘導(dǎo)6.1.材料和方法動(dòng)物和興奮毒性損傷將不同年齡的雄性成年Sprague/Dawley大鼠維持在控制光和溫度的環(huán)境中，自由攝食、攝水。成年大鼠(250-300g)通過(guò)皮下注射紅藻氨酸(″KA″，10mg/kg，Sigma)引起海馬興奮毒性損傷。由于KA的攝取年輕大鼠高于成年大鼠(Berger et al.，1986，in Schwartz and Ben-Ari，Advances in ExperimentalMedicine and Biology，Plenum，NY，pp.199-209)，因此調(diào)節(jié)KA劑量以產(chǎn)生最大興奮毒性而不達(dá)到致死劑量(出生后第7天2mg/kg至出生后第25天6mg/kg)。注射鹽水的大鼠作為對(duì)照組(0小時(shí)時(shí)間點(diǎn))。
COX-1和COX-2cDNA探針通過(guò)ClaI消化將含有大鼠COX-1 cDNA全長(zhǎng)(2.7kb)的Bluescript質(zhì)粒(stratagene公司產(chǎn)品)線性化；通過(guò)pfMI消化將含有大鼠COX-2編碼序列的PCRII質(zhì)粒(Invitrogen公司產(chǎn)品)線性化(Feng et al.，1993，Arch.Biochem.Biophys.307361-368)。在瓊脂糖凝膠電泳后，用Elu-Quick(Schleicher &Schuell)純化線性化的質(zhì)粒。
原位雜交在KA引起的驚厥發(fā)作后不同間隔時(shí)間，將大鼠處死，迅速取腦，在冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，10mM，pH7.4)中淋洗，并在-25℃的甲基丁烷中浸三分鐘。將腦切成10微米的切片，冷凍，將所得的冷凍切片安放在涂覆了聚賴(lài)氨酸的載玻片上，儲(chǔ)存于-70℃。為了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(″ICC″)或原位雜交(″ISH″)，將冷凍切片在含4％多聚甲醛的PBS中作后固定(室溫30分鐘)，然后用PBS淋洗。為了進(jìn)行ISH，將組織切片用0.1M三乙醇胺(″TEA″)(pH8.0)淋洗，在乙酸酐中培育(″AAH″，0.25％v/v TEA溶液，10分鐘)，以TEA和PBS淋洗。在AAH處理后，組織切片用從COX-2線性化的cDNA轉(zhuǎn)錄載體制得的〔35S〕-cRNA探針(0.3μg/ml，2×109dpmμg-1)進(jìn)行雜交(Feng et al.，1993，Arch.Biochem.Biophys.307361-368)。用有義鏈雜交作為對(duì)照，得出陰性結(jié)果。在50℃雜交3小時(shí)后，嚴(yán)格洗滌(0.1×SSC，60℃)和脫水，將載玻片暴光X線底片七天，用于定量。然后將載玻片暴露于NTB-2乳劑(Kodak，Rochester，NY)，作COX-2mRNA分布的顯微鏡分析。顯影后，用甲酚紫對(duì)組織切片復(fù)染。用裝有Drexel大學(xué)軟件的圖象分析系統(tǒng)定量分析放射自顯影膠片(Tocco et al.，1992，Eur.J.Neurosci.41093-1103)。用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，再作posthoc分析。
原位末端標(biāo)記在平行研究中，將多聚甲醛固定的腦組織切片脫水、空氣干燥，用dATP、dCTP、dGTP(0.2mM)、dTTP(13μM)、毛地黃毒苷-11-dUTP和DNA聚合酶I(Boehringer Mannheim)10單位/100μl，于37℃培育2小時(shí)。加入20mM EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)。將切片與堿性磷酸酶交聯(lián)的毛地黃毒苷抗體(Genius System，BoehringerMannheim)室溫培育過(guò)夜，所述毛地黃毒苷抗體以150mM Nacl、100mM TRIS-HCl(pH7.5)液(含5％綿羊血清)稀釋成1∶200。按制造商的方案，用Genius系統(tǒng)以氮藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽進(jìn)行比色測(cè)定(Sakhi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.917525-7529)。
Northern印跡雜交試驗(yàn)RNA提取按如下進(jìn)行。大鼠處死后、取腦，儲(chǔ)存于-75℃直至試驗(yàn)。從合并的海馬組織提取總的RNA(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400)。簡(jiǎn)言之，將組織在4M硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉(pH7.5)、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1M β-巰基乙醇(終體積0.5ml)中制成勻漿。用酸性苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀后，將RNA沉淀用70％和100％乙醇相繼淋洗。然后將純化的RNA溶于0.5％十二烷基硫酸鈉(″SDS″)中，儲(chǔ)存于-75℃。在UV分光光度計(jì)中對(duì)總RNA進(jìn)行定量。將從組織中得到的總RNA(5μg)在變性(0.2M甲醛)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。并以2×SSC轉(zhuǎn)到尼龍膜(Nylon 66+；Hoeffer，Sanfrancisco CA)上。用以50％甲酰胺、1.5×SSPE、1％SDS、0.5％奶粉、100μg/ml酵母總RNA和500mg/ml鮭精子RNA配制的106cpm/ml反義COX-1或COX-2〔32P〕-cRNA探針，53℃進(jìn)行印跡雜交15小時(shí)。將印跡于72℃沖洗到0.2×SSC、0.2％SDS的最終嚴(yán)謹(jǐn)度。于-70℃用增感屏將印跡曝光于柯達(dá)X線底片(XAR-5)上。
細(xì)胞培養(yǎng)從大鼠胚胎鼠腦中得到海馬神經(jīng)原培養(yǎng)物。將E16-E18胚胎在Hank′s平衡鹽溶液中分割和培養(yǎng)(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400；Peterson et al.，1989，Dev.Brain Res.48187-195)。每3天更換培養(yǎng)基。對(duì)于谷氨酸神經(jīng)毒性研究，用谷氨酸(250μM，Sigma)在2.4mM鈣離子和0.8mM鎂離子存在下處理8日齡的培養(yǎng)物。接觸谷氨酸6小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮的培養(yǎng)基；12小時(shí)后，在神經(jīng)原中評(píng)估COX-2樣免疫反應(yīng)性。
在原代大鼠神經(jīng)原的單型培養(yǎng)物中進(jìn)行COX-2的免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定將對(duì)照組和谷氨酸處理的培養(yǎng)物在含4％多聚甲醛的PBS中作后固定(30分鐘，室溫)，以PBS漂洗，用正常血清處理并與第一抗體4℃培養(yǎng)過(guò)夜。產(chǎn)生了針對(duì)包含小鼠COX-2 C-末端區(qū)域的合成肽(CNASASHSRLDDINPT；SEQ ID NO1)的COX-2抗血清(家兔IgG)。經(jīng)Western印跡分析評(píng)估，該抗血清與人和大鼠COX-2起反應(yīng)而不與COX-1反應(yīng)。在后面的步驟中使用Vectastain ABC藥盒(Vector，Burlingame，CA)完成二氨基苯染色(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400)。用合成COX-2肽免疫吸附COX-2抗血清，以控制特異性；用合成COX-2肽30μg/ml于4℃吸附過(guò)夜。
6.2.結(jié)果成年大鼠腦中的COX-2表達(dá)圖1用ISH顯示，COX-2 mRNA的區(qū)域分布以邊緣結(jié)構(gòu)中最顯著，但新皮層中也存在(與Kaufmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.932317-2321和Yamagata et al.，1993，Neuron 11371-386所報(bào)告的相符)。在海馬結(jié)構(gòu)中，COX-2 mRNA選擇性地表達(dá)在顆粒層和錐體神經(jīng)原層的細(xì)胞中。COX-2 mRNA表達(dá)也見(jiàn)于頂部皮層的外層、梨狀區(qū)皮層和杏仁樣復(fù)合體細(xì)胞。
海馬COX-2 mRNA的成熟調(diào)節(jié)表達(dá)ISH結(jié)果表明，在成熟過(guò)程中，海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)原層的細(xì)胞亞組中，COX-2 mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)有差別(圖2，圖3頂部)。出生后P7-P14天，齒狀回的顆粒細(xì)胞層和錐體細(xì)胞層的CA3亞區(qū)中COX-2 mRNA增加2倍以上(p＜0.001，圖2)。雖然在所檢查的其它腦區(qū)中COX-2 mRNA的表達(dá)較低，但成熟表達(dá)的方式是相似的(圖2)。出生后P21天，COX-2 mRNA表達(dá)在所檢查的所有亞區(qū)都接近成年水平(圖2，圖3頂部)。
對(duì)KA引起的驚厥的反應(yīng)為了進(jìn)一步揭示腦中COX-2的成熟調(diào)節(jié)，出生后檢查了在對(duì)KA引起的驚厥產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)COX-2 mRNA的表達(dá)。盡管KA處理后有強(qiáng)驚厥活動(dòng)，但在P7天所檢查的所有腦區(qū)中均未發(fā)現(xiàn)可檢出的COX-2 mRNA改變(圖3，圖4A)。P7組KA處理后120小時(shí)COX-2 mRNA表達(dá)的變化表明發(fā)育成熟而非對(duì)KA毒性的應(yīng)答(圖4A)。與P7組相反，P14和P21天時(shí)，在KA引起的驚厥發(fā)作后4-8小時(shí)內(nèi)所檢查的所有海馬亞區(qū)中COX-2 mRNA均增加(圖4B和4C)。處理后120小時(shí)內(nèi)P14、P21和成年大鼠腦中COX-2 mRNA表達(dá)水平回復(fù)到對(duì)照水平。
在齒狀回內(nèi)，P14和P21天大鼠對(duì)照組COX-2的表達(dá)是不對(duì)稱(chēng)的、選擇性地定位于粒層的較淺層神經(jīng)原而不是齒狀回葉片的較深層顆粒細(xì)胞(圖5A)。對(duì)KA處理的應(yīng)答中，COX-2 mRNA誘導(dǎo)顯示類(lèi)似的表達(dá)不對(duì)稱(chēng)性(圖5B)。相反，在對(duì)照組動(dòng)物和成年組KA誘導(dǎo)后，齒狀回內(nèi)的不對(duì)稱(chēng)性不太顯著(圖5C和5D)。
在平行試驗(yàn)中，成年大鼠KA引起驚厥后12小時(shí)，從海馬得到的總RNA的Northern印跡雜交確證了COX-2 mRNA的誘導(dǎo)(圖6)。在同一大鼠腦中未檢出COX-1 mRNA的誘導(dǎo)。
成年大鼠KA誘導(dǎo)的COX-2和程序性細(xì)胞死亡KA誘導(dǎo)的驚厥發(fā)作后8小時(shí)，成年大鼠腦的海馬結(jié)構(gòu)CA3區(qū)(圖7B)、梨狀區(qū)皮層(圖7E)和杏仁樣復(fù)合體(圖7H)的細(xì)胞中，COX-2 mRNA的誘導(dǎo)短時(shí)平行于并在解剖學(xué)上覆蓋于同一腦區(qū)中發(fā)生的細(xì)胞調(diào)亡(用原位末端標(biāo)記評(píng)估)(圖7C，海馬的CA3區(qū)；圖7F，梨狀區(qū)皮層；圖7I，杏仁樣復(fù)合體)。通過(guò)乳液放射自顯影用ISH試驗(yàn)鑒定成年鼠、對(duì)照鼠(圖7A、7D和7G)和KA處理(圖7B、7E和7H)大鼠的細(xì)胞內(nèi)COX-2 mRNA表達(dá)。
體外對(duì)谷氨酸應(yīng)答的神經(jīng)原COX-2表達(dá)/調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)在體外試驗(yàn)中，將大鼠海馬神經(jīng)原的原代培養(yǎng)物接觸谷氨酸。用免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)組成性COX-2表達(dá)在基線上(圖8B)。接觸谷氨酸12小時(shí)后，觀察到COX-2免疫反應(yīng)性的增加，這與神經(jīng)原數(shù)目的顯著減少正好相符(圖8D)。
人癲癇中COX-2的表達(dá)人腦活檢中在癲癇病灶經(jīng)ISH檢出COX-2 mRNA表達(dá)增加(圖17A-D)。發(fā)現(xiàn)在癲癇患者皮層中COX-2 mRNA而非COX-1 mRNA明顯升高。P＜0-05。
7.實(shí)施例尼美舒利抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞因子和亞硝酸鹽的產(chǎn)生在體外進(jìn)行的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低濃度尼美舒利(1納摩爾)有效地抑制腦衍生的無(wú)限增殖小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2)和星形細(xì)胞中內(nèi)毒素介導(dǎo)腫瘤壞死因子(″TNF″)產(chǎn)生的誘導(dǎo)(圖9A)。與此相似，尼美舒利在阻斷亞硝酸鹽的產(chǎn)生上也同樣有效(Griess反應(yīng)；圖9B)。后一觀察特別相關(guān)，因?yàn)樽C據(jù)表明阻斷神經(jīng)原一氧化氮(″NO″)合成酶能抗御谷氨酸的神經(jīng)毒性。還發(fā)現(xiàn)尼美舒利有效地阻斷了腦衍生小膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)毒素介導(dǎo)的前列腺素PGE2的誘導(dǎo)(圖9C)。
8.實(shí)施例程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞中COX-2的表達(dá)用已確立的細(xì)胞凋亡體外模型研究了COX-2表達(dá)的調(diào)節(jié)。具體地講，研究了在P19胚胎性癌細(xì)胞對(duì)血清除去反應(yīng)中的COX-2調(diào)節(jié)。在這樣的條件下，P19細(xì)胞經(jīng)歷了程序性細(xì)胞死亡，顯示特征性DNA片段和核形態(tài)變化。如圖10所示，用此系統(tǒng)，觀察到調(diào)亡和COX-2表達(dá)同時(shí)發(fā)生。
將這些研究延伸到人神經(jīng)原細(xì)胞系SH-SY5Y?，F(xiàn)已證明，β-淀粉樣蛋白在誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)原變性上起作用(Oda et al.，Alzheimers Res.129-34)。用合成的凝集Aβ1-40肽以20μM濃度處理SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間。用COX-2抗血清或肌動(dòng)蛋白抗血清作對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞提取物的Western印跡分析(分別見(jiàn)圖11B和D)。在圖11A中，從圖11B顯示的免疫印跡定量分析對(duì)照或Aβ處理的SH-SY5Y的COX-2蛋白(在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)；僅對(duì)70kDa mw的種類(lèi)作定量)。通過(guò)用純化的人重組COX-2(″hrCOX-2″)肽免疫吸附COX-2抗血清取消了COX-2信號(hào)。圖11顯示，如平行培養(yǎng)物MTT試驗(yàn)所評(píng)估的那樣，用凝集的Aβ1-40(20μm)處理72小時(shí)后觀察到細(xì)胞氧化還原活性減弱。條形圖表示平均值±SEM，n＝4-5/組，p＜0.05(t檢驗(yàn))。用Bioquant圖象分析(Biometric，Nashville，TN)從數(shù)字化圖象中分析COX-2集成光密度。還發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了與DNA梯級(jí)相同的COX-2表達(dá)(圖11E)，這是調(diào)亡的標(biāo)志。圖12顯示，用MTT試驗(yàn)評(píng)估尼美舒利在10-6和10-9摩爾時(shí)能阻斷Aβ1-40的毒性。
有趣的是，凝集的合成Aβ1-40肽(150μm)與純化的hr-holoCOX-2(COX-2+血紅素輔因子，50nM)在37℃、1×PBS中共同培育16小時(shí)，測(cè)定環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物酶活性(Murphy et al.，1989，Neuron 21547-1558)，環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物酶活性增加(相對(duì)于無(wú)Aβ時(shí)的酶活性水平；圖18)。在無(wú)血紅素時(shí)環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物酶水平得到陰性結(jié)果。
9.實(shí)施例早老性癡呆疾病中COX-2的表達(dá)對(duì)正常人腦和早老性癡呆(″AD″)患者腦中COX-2的表達(dá)進(jìn)行了研究。免疫細(xì)胞化學(xué)數(shù)據(jù)表明，COX-2表達(dá)主要定位于人腦中有神經(jīng)原形態(tài)的細(xì)胞；在所有受檢查腦區(qū)均發(fā)現(xiàn)有膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞中COX-2免疫染色定位最少。這些結(jié)果傾向于提示COX-2的作用是在非炎癥功能上。在神經(jīng)學(xué)對(duì)照病例的顳部皮層中，COX-2免疫細(xì)胞化學(xué)信號(hào)僅在檢出界限上，但AD腦中COX-2顯示升高(圖13A、13B)。灰質(zhì)中這種COX-2免疫活性的選擇性誘導(dǎo)與下述發(fā)現(xiàn)，即大鼠腦中對(duì)導(dǎo)致神經(jīng)原死亡的損傷產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)顯示有COX-2的神經(jīng)原誘導(dǎo)，相一致(見(jiàn)第6節(jié))。
同時(shí)檢查了AD腦中COX-2的細(xì)胞免疫分布。觀察到神經(jīng)原COX-2不僅分布于核周體(perikarya)(圖14A)而且也見(jiàn)于神經(jīng)原突起(圖14B)。此外，對(duì)海馬結(jié)構(gòu)毗鄰組織切片進(jìn)行Aβ免疫染色鑒定的擴(kuò)散斑(圖14C)和AD神經(jīng)炎斑中，也發(fā)現(xiàn)稠密的免疫染色。這些發(fā)現(xiàn)提示在神經(jīng)原死亡或存活機(jī)制中COX-2的作用。
進(jìn)行了研究，以對(duì)AD和年齡匹配對(duì)照者腦中COX-2的表達(dá)進(jìn)行定量。使用定量斑點(diǎn)印跡分析和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。用Western分析作定量評(píng)估。發(fā)現(xiàn)在AD腦的海馬勻漿中COX-2含量的升高大于神經(jīng)學(xué)年齡匹配對(duì)照組的2倍。
由于免疫細(xì)胞化學(xué)證據(jù)表明COX-2免疫反應(yīng)性在AD斑，因此比較了AD病例中的COX-2水平和總Aβ，發(fā)現(xiàn)直接相關(guān)。
在AD腦額葉皮層中發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA和蛋白質(zhì)增加。圖15A顯示雜交于〔32P〕COX-2 mRNA和COX-1 mRNA的神經(jīng)學(xué)對(duì)照(C)和AD額葉皮層總RNA的Northern印跡。用COX-2 cRNA和COX-1 cRNA探針檢出的這些mRNA種類(lèi)代表了在外周組織中發(fā)現(xiàn)的同樣大小的RNA。圖15B顯示Northern研究的定量結(jié)果。具體地說(shuō)，AD額葉皮層中相對(duì)于對(duì)照組而言COX-2 mRNA的優(yōu)勢(shì)(prevalence)增加，而通過(guò)在雜交膜上歸一化為28S rRNA確證了兩泳道中存在等量的RNA，在凝膠后轉(zhuǎn)移中無(wú)28S rRNA和18S rRNA，證明了RNA完全轉(zhuǎn)移到膜上。用Biquant圖象分析從數(shù)字化圖象分析集成光密度。條形圖表示n＝9/組，結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，表明有顯著意義(p＜0.05)。
同樣，進(jìn)行AD額葉皮層與對(duì)照組的Western印跡分析，發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白的量增加。圖15C顯示該Western印跡的結(jié)果。第1泳道和第2泳道表示用于Nortern分析的同樣組織的COX-2蛋白含量。第3-4泳道表示用hrCOX-2肽對(duì)COX-2抗血清作免疫吸附時(shí)，無(wú)COX-2結(jié)合，證明了此信號(hào)的特異性。
用hrCOX-2肽預(yù)先吸附抗血清時(shí)，也無(wú)預(yù)期的70kDa hrCOX-2新種類(lèi)出現(xiàn)(第5泳道)。圖15D對(duì)這些結(jié)果作了定量(關(guān)于70kDa種類(lèi))。剝下免疫斑點(diǎn)，與肌動(dòng)蛋白抗血清進(jìn)行免疫反應(yīng)來(lái)證實(shí)變化的特異性(肌動(dòng)蛋白值對(duì)照組100±8；AD對(duì)照條形圖的94±7％；n＝9/組；t檢驗(yàn)值為p＜0.05)。圖15D的插圖顯示COX-2含量和斑點(diǎn)數(shù)/mm2的相關(guān)性，n＝8，r＝0.72，p＜0.03。用Biquant圖象分析從數(shù)字化圖象，分析了COX-2和肌動(dòng)蛋白集成光密度。
10.實(shí)施例在肌萎縮側(cè)索硬化癥中的COX-2表達(dá)原位雜交證明在罹患肌萎縮側(cè)索硬化癥(″ACS″)患者的脊髓前角細(xì)胞中COX-2 mRNA增加(圖16)。
11.實(shí)施例神經(jīng)原細(xì)胞中COX-2的瞬時(shí)表達(dá)增強(qiáng)A β介導(dǎo)的氧化還原活性損傷在培養(yǎng)的人SH-SY5Y神經(jīng)原細(xì)胞中研究了COX-2在神經(jīng)原死亡和/或存活中的作用。用含全長(zhǎng)人(h)COX-2 cDNA(pRc/CMV/hCOX-2)或細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因(pRc/CMV2/CAT)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pRc/CMV/hCOX，Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用Aβ25-35處理后，用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)試驗(yàn)評(píng)估氧化還原活性的損傷(圖19)。用前面描述的抗COX-2抗體在相同的組織培養(yǎng)槽載玻片上進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，證實(shí)了用pRc/CMV/hCOX-2轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中有hCOX-2的過(guò)量表達(dá)。在用pRc/CMV2/CAT轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中，同樣的抗COX抗體引起最小的免疫細(xì)胞化學(xué)信號(hào)。我們發(fā)現(xiàn)，與用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y培養(yǎng)物相比，SH-SY5Y神經(jīng)原細(xì)胞中hCOX-2的瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了Aβ25-35(25μM，48小時(shí)處理)介導(dǎo)的氧化還原活性的損傷(與Aβ/對(duì)照載體相比，±±p＜0.01；與CTL相比，*p＜0.001)。這些數(shù)據(jù)與顯示SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中氧化還原活性損傷與COX-2mRNA誘導(dǎo)并存的證據(jù)相符(圖11)。
12.實(shí)施例用COX-2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)基于神經(jīng)原細(xì)胞中COX-2的過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)Aβ介導(dǎo)的氧化還原損傷這一證據(jù)，及AD腦中和試驗(yàn)性神經(jīng)變性中，神經(jīng)原COX-2升高的事實(shí)，我們生產(chǎn)了一種具有人(h)COX-2神經(jīng)原過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。為了獲得神經(jīng)原中COX-2的過(guò)量表達(dá)，制備了一種雜交基因，其中含全部hCOX-2編碼區(qū)的cDNA序列的表達(dá)由大鼠神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
我們獲得了具有hCOX-2 mRNA高度表達(dá)的4個(gè)種系小鼠。在其中之一(NHC32)，用原位雜交分析評(píng)估了COX-2 mRNA(圖20A)。我們發(fā)現(xiàn)在NHC32小鼠系的海馬結(jié)構(gòu)、大腦皮層和其它神經(jīng)原層有高水平的hCOX-2 mRNA(圖20B)。在同樣的組織切片上作原位雜交使用針對(duì)NSE和hCOX-2的聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)分析，未發(fā)現(xiàn)白質(zhì)hCOX-2 mRNA水平，從而確認(rèn)了hCOX-2轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)神經(jīng)原細(xì)胞的選擇性。
用轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)原培養(yǎng)物，還進(jìn)一步顯示hCOX-2過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了Aβ介導(dǎo)的反應(yīng)。如圖21所示，研究表明，與經(jīng)同樣處理的野生型/同窩對(duì)照小鼠(n＝4)的神經(jīng)原培養(yǎng)物相比，具有神經(jīng)原COX-2過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠(NHC32，n＝3)的原代神經(jīng)原培養(yǎng)物，對(duì)凝集的Aβ25-35肽介導(dǎo)的氧化還原活性損傷(MTT試驗(yàn)，Aβ25-35μM，48小時(shí))最敏感。此外，作形態(tài)學(xué)檢查時(shí)，與野生型對(duì)照Aβ25-35處理的神經(jīng)原培養(yǎng)物(A，插圖)相比，轉(zhuǎn)基因hCOX-2小鼠的Aβ25-35處理的神經(jīng)原顯示神經(jīng)原突起的加劇退化(B，插圖)。
13.實(shí)施例尼美舒利保護(hù)B12神經(jīng)原細(xì)胞抗御谷氨酸毒性我們測(cè)試了尼美舒利、吲哚美辛和NS398(另一個(gè)優(yōu)選的COX-2抑制劑)對(duì)谷氨酸介導(dǎo)的毒性的作用。在這一試驗(yàn)中，我們使用B12神經(jīng)原細(xì)胞，用處理后條件培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶LDH水平的增加量來(lái)評(píng)估毒性。LDH是細(xì)胞毒性的一個(gè)指標(biāo)，其升高一般認(rèn)為是神經(jīng)毒性的標(biāo)志。如圖22-23所示，我們發(fā)現(xiàn)，尼美舒利以10-6、10-9和10-12M量預(yù)處理(24小時(shí)前)和共處理(與谷氨酸共處理24小時(shí))，具有抗御谷氨酸毒性的保護(hù)作用。吲哚美辛在10-6M有保護(hù)作用，而在10-9和10-12M時(shí)失去其保護(hù)效應(yīng)。吲哚美辛在10-9M(預(yù)處理24小時(shí))時(shí)觀察到對(duì)谷氨酸介導(dǎo)的毒性有臨界保護(hù)作用。NS398預(yù)處理未見(jiàn)保護(hù)作用。在預(yù)處理的情況下，當(dāng)谷氨酸處理時(shí)，藥物保留在介質(zhì)中。
本文引用了各種出版物，其內(nèi)容全部收編于此。
序列表(1) 一般信息(i)申請(qǐng)人Pasinetti，Giulio M.和Aisen，Paul S.(ii)發(fā)明名稱(chēng)用尼美舒利治療神經(jīng)變性疾病(iii)序列數(shù)1(iv)通訊地址(A) 收信人Baker & Botts，L.L.P.
(B)街30 Rockefeler Plaza(C)城市New York(D)州NY(E)國(guó)家USA(F)ZIP10112-0228(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型磁盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容型(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Fast SEQ第1.5版本(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/831,402(B)申請(qǐng)日1997年4月1日(viii)代理人信息(A)姓名Clark，Richard S.
(B)登記號(hào)26，154(C)參照/申請(qǐng)?zhí)?ix)電信信息(A)電話(huà)212-705-5000(B)傳真212-765-2519(C)電傳(2)SEQ ID NO1信息(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬NO(iv)反義NO(v)片段類(lèi)型(vi)來(lái)源(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Asn Ala Ser Ala Ser His Ser Arg Leu Asp Asp Ile Asn Phe Thr 165 10 1權(quán)利要求
1.一種組合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保護(hù)罹患神經(jīng)變性疾病的患者預(yù)防非炎癥性神經(jīng)原細(xì)胞死亡的方法中。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中神經(jīng)變性疾病為早老性癡呆。
3.一種組合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保護(hù)罹患肌萎縮側(cè)索硬化癥的患者預(yù)防神經(jīng)原細(xì)胞死亡的方法中。
4.一種組合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保護(hù)罹患慢性癲癇所致神經(jīng)變性的患者預(yù)防神經(jīng)原細(xì)胞死亡的方法中。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中神經(jīng)變性疾病受累神經(jīng)原接觸于至少1微摩爾濃度的尼美舒利。
6.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中神經(jīng)變性疾病受累神經(jīng)原接觸于至少1微摩爾濃度的尼美舒利。
7.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中神經(jīng)變性疾病受累神經(jīng)原接觸于至少1微摩爾濃度的尼美舒利。
8.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中神經(jīng)變性疾病受累神經(jīng)原接觸于至少1微摩爾濃度的尼美舒利。
9.攜帶編碼人環(huán)氧合酶-2基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
10.從權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制得的神經(jīng)原細(xì)胞培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及尼美舒利及結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物在預(yù)防和/或治療神經(jīng)變性疾病上的應(yīng)用。這至少部分基于尼美舒利對(duì)β－淀粉樣蛋白引起的細(xì)胞死亡顯示出神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)現(xiàn)。不受任何特定理論的束縛,尼美舒利看來(lái)抑制神經(jīng)變性的非炎癥性機(jī)制。
文檔編號(hào)A61K31/18GK1241941SQ97180988
公開(kāi)日2000年1月19日 申請(qǐng)日期1997年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月19日
發(fā)明者G·M·帕西內(nèi)特, P·S·艾森 申請(qǐng)人:紐約市大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院