專利名稱：P2嘌呤受體之激動劑或拮抗劑在預防谷氨酸引起的細胞毒性中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明背景本發(fā)明涉及特定類的化合物在預防谷氨酸引起的細胞毒性中的應用。
現(xiàn)有技術谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)之主要興奮性神經遞質(Hollmann M.，Heinemann S.，Annu.Rev.Neurosci.17，31-108，1994)，而且谷氨酸受體普遍分布于CNS中也證明谷氨酸在廣范圍的生理和病理過程中起著中心的作用(Watkins J.C.，Collingridge G.L.，The NMDA receptor，IRLOxford，1989)。
谷氨酸依賴型神經遞質傳遞在如學習、圖形識別和記憶等功能中的中心作用已為最令人相信的原理和一些實驗發(fā)現(xiàn)所暗示(Bliss T.V.P.Collingridge G.L.，Nature 361，31-39，1993)。
幾十年來一直認為谷氨酸在體內和培養(yǎng)基中對神經元是有毒性的，而且谷氨酸受體的功能在許多腦疾病和損傷中是關鍵性的(AppelS.H.，Trends Neurosci.16，3-5，1993)。許多涉及中風或癲癇的神經性疾病事實上導致由于谷氨酸的過度刺激引起的腦損傷，以及如阿爾茨海默氏病、杭廷頓氏病、帕金森氏病和肌萎縮側索硬化等的變性疾病，這些疾病涉及由谷氨酸受體的過度活化導致的神經元細胞壞死。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供用于調節(jié)谷氨酸引發(fā)的神經遞質傳遞和神經毒性的特定類化合物，該類化合物可治療急性和慢性神經變性疾病。
本發(fā)明的另一個目的是提供可調節(jié)與谷氨酸有關之生理功能的特定類化合物，所述生理功能包括疼痛、激素平衡、血壓、熱調節(jié)、出汗、學習、圖形識別和記憶。
本發(fā)明的再一個目的是提供可用作預防谷氨酸引發(fā)之細胞毒性的藥物工具的特定類化合物。
本發(fā)明的進一步目的是提供有效替換用于治療與谷氨酸有關之急性和慢性神經性疾病的已知藥物如競爭性和非競爭性谷氨酸拮抗劑、神經節(jié)苷脂和生長因子的特定類化合物。本發(fā)明描述通過使用用于預防谷氨酸引發(fā)之細胞毒性的P2嘌呤受體之激動劑或拮抗劑的化合物可實現(xiàn)上述以及其他目的和相關的優(yōu)點，這些目的和優(yōu)點將在以下描述中更明確地闡明。
本發(fā)明的基本新穎性是谷氨酸引發(fā)之生物過程與P2嘌呤受體調節(jié)劑(激動劑或拮抗劑)之間的相關性。谷氨酸受體和P2嘌呤受體都是具有離子移變和代謝移變性質的受體。
例如，我們選擇Basilen Blue E 3G(也稱為Reactive Blue 2)和Cibacron Blue 3GA，它們是P2嘌呤受體的拮抗劑。這些化合物可商購得到，例如購自Sigma，它們的分子結構和主要特征在1995年于意大利發(fā)行的Sigma目錄中都有描述，Basilen Blue E 3G在149頁，Cibacron Blue 3GA在266頁。我們選擇的其他化合物是5-腺苷?；鶃啺被姿狨?AMPPNP)，它是P2嘌呤受體的激動劑。該化合物也可從Sigma購得，其分子結構和主要特征描述于1995年在意大利發(fā)行的Sigma目錄的52頁。
根據本發(fā)明，這些化合物可用來預防谷氨酸引發(fā)的神經系統(tǒng)細胞之細胞毒性，特別是CNS神經元。作為CNS神經元的細胞模型系統(tǒng)，我們采用產后的鼠小腦神經元。這些細胞在由產后的鼠小腦分離時是最特征化的原始神經元培養(yǎng)物(Lasher R.S.，和Zagon I.S.，Brain Res.41，428-438，1972)，它們在體外可發(fā)育成作為中間神經元的成熟顯型。該中間神經元用谷氨酸作為神經遞質，而且可進一步構成用于研究谷氨酸介導之細胞毒性的優(yōu)異模型系統(tǒng)。
將粒狀神經元暴露在100μM谷氨酸中15-30分鐘，可使全部細胞的80-100％死亡(15-20小時)。我們發(fā)現(xiàn)將100μM的P2嘌呤受體拮抗劑Basilen Blue(也稱為Reactive Bue 2)(蒽醌磺酸衍生物)給藥于粒狀神經元時，如果同時存在谷氨酸，可完全保存細胞存活，由此消除谷氨酸的細胞毒性作用。盡管暴露于谷氨酸中可引發(fā)完全的細胞死亡，但是Basilen Blue對小腦粒細胞形態(tài)學的作用顯示出表觀健康的細胞體，該細胞體攜帶致密的高度分枝法的網狀結構。Basilen Blue還可防止粘連和軸突自發(fā)性收縮。用谷氨酸處理的第一個5分鐘內即可在粒狀神經元中觀察到以細胞體的快速膨脹和失去光澤為特征的急性應答，而添加Basilen Blue則可防止，這表明該化合物在EAA受體相互作用的下游時就可以立即在一連串的過程中非常早地起作用。
需重要強調的是Basilen Blue在最高至300μm的測試濃度時對細胞也沒有毒性，而且在給藥于粒狀神經元0.5-26小時的時候，不會影響血漿膜的通透性(以溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡的攝取來測定)，或者細胞的代謝(以MTT通過線粒體脫氫酶的活性轉化為fomazan來測定)。Basilen Blue可防止谷氨酸引發(fā)的細胞死亡，其IC50在10-20μM，此值通常與報道的P2嘌呤受體拮抗劑之化合物的濃度相一致。其他市售的蒽醌磺酸衍生物(Cibacron Blue)的異構體在此方面也是有效的?？Х纫蚴荘1嘌呤受體拮抗劑，其在100μM時仍不能消除谷氨酸的細胞毒性作用。
Basilen Blue之細胞毒性防護作用與時間呈線性關系，而且取決于化合物的給藥方式。如果在谷氨酸之后10分鐘向細胞中加入BasilenBlue，并與粒狀神經元一起僅溫育15分鐘，其將使神經元總數的60-70％細胞免于死亡。而如果僅在用谷氨酸處理細胞的最后5分鐘內給藥，Basilen Blue只能維持神經元總數的25-40％細胞存活。相反地，如果在粒狀神經元暴露于谷氨酸之后1-2分鐘或30分鐘或2小時添加(然后與細胞再溫育20小時)，Basilen Blue可分別使神經元總數的55-70％、30％和10％細胞免于死亡。在粒狀神經元暴露于谷氨酸之前(不是期間或之后)添加的話，Basilen Blue需要預處理至少20-25小時，以防止谷氨酸細胞毒性作用的70-80％。對天冬氨酸攝取的抑制并不是這些相同處理的后果。與向粒狀神經元給藥的方式不同，對Basilen Blue誘導的細胞毒性的抑制不取決于新蛋白質的合成，這是因為它對如放線菌素D(以10μM使用)或茴香霉素(以100μM使用)的抑制劑是不敏感的。
Basilen Blue抑制[3H]ATP與粒狀神經元膜的結合，其IC50約為10μM，這相應于抑制谷氨酸引發(fā)之細胞毒性的IC50。與[3H]ATP結合的研究也是直接在完整細胞上進行的，而且顯示Basilen Blue是有效的。
我們已在連續(xù)存在(在體外從1天至不遲于2天)100μM已知的P2嘌呤受體激動劑5-腺苷?；鶃啺被姿狨?AMPPNP)時培養(yǎng)細胞。該處理的結果是谷氨酸誘導的細胞毒性被抑制約50-60％。在此方面，將細胞急性暴露于100μM AMPPNP(與谷氨酸同時)是無效的。在連續(xù)存在AMPPNP時培養(yǎng)神經元產生與急性暴露于BasilenBlue相同的作用，這一事實支持如下假設嘌呤受體直接參與了谷氨酸依賴型的神經毒性；而且這還提示嘌呤受體的脫敏現(xiàn)象主要發(fā)生在小腦粒狀細胞中。
因為通常使用D-[3H]天冬氨酸的釋放作為體外培養(yǎng)之小腦粒狀神經元功能狀態(tài)的一個量度，而去極化或谷氨酸引發(fā)之天冬氨酸釋放是這些細胞與神經元成熟所獲得的漸進特征，所以我們決定測試該參數，以進一步研究使用Basilen Blue防止細胞死亡的生物作用及可能的機理。我們發(fā)現(xiàn)Basilen Blue抑制谷氨酸誘導的[3H]天冬氨酸釋放，其IC50約為10μM。該抑制作用幾乎是完全的，但不影響基礎釋放，而且在測定釋放1分鐘、更長的時間(3、10和25分鐘)或者甚至在Mg2+存在時，該抑制作用才發(fā)生。粒狀神經元長期暴露于100μM AMPPNP 8天可抑制70-80％的谷氨酸引發(fā)的[3H]天冬氨酸釋放。
谷氨酸依賴型的神經毒性在小腦粒狀神經元中通常伴隨著細胞間Ca2+通過多步驟的增加。Basilen Blue與咖啡因不同，幾乎完全消除谷氨酸引發(fā)的Ca2+攝取，但不消除基礎的Ca2+攝取，其IC50約為10μM。而且該值與抑制ATP結合、細胞毒性和天冬氨酸釋放時的IC50一致。在短時間(1分鐘)或長時間(3、10和25分鐘)測量Ca2+攝取時，Basilen Blue依賴型的抑制作用都發(fā)生。粒狀神經元長期暴露于100μMAMPPNP 8天，可抑制50-70％的谷氨酸引發(fā)的Ca2+流入，這類似于對細胞毒性和天冬氨酸釋放的抑制。


第1-2頁在小腦粒狀原始培養(yǎng)物中，Basilen Blue抑制谷氨酸誘導的細胞毒性劑量-應答的作用和添加方式。將8 DIV之復制的小腦粒狀培養(yǎng)物暴露于100μM谷氨酸25分鐘，其中同時存在不同濃度的Basilen Blue(圖1)。20小時后，通過直接計數完整的有生命的細胞核來估測培養(yǎng)物中細胞的存活率。星號代表在向細胞中同時添加100μM谷氨酸和100μM咖啡因后得到的細胞核百分數。在圖2中，將8 DIV之復制的小腦粒狀培養(yǎng)物暴露于100μM谷氨酸25分鐘。在撤出谷氨酸后的不同時間向介質中添加Basilen Blue(100μM)，直到20小時后通過直接計數完整的有生命的細胞核來估測培養(yǎng)物中細胞的存活率。星號代表在向細胞中同時添加100μM谷氨酸和100μM Basilen Blue后得到的細胞核百分數。在圖3中，在添加100μM谷氨酸之前25分鐘，在100μM Basilen Blue存在下對復制培養(yǎng)物進行預處理不同的時間。20小時后估測培養(yǎng)物的細胞存活率。
星號代表在向細胞中同時添加100μM谷氨酸和100μM BasilenBlue后得到的細胞核百分數。計數代表平均值±SEM(n＝4)，100％的細胞存活率代表1.75-2×106的總細胞量。
方法在將粒狀細胞暴露于谷氨酸約20小時后，除去培養(yǎng)基，并用1ml含有洗滌劑的溶解溶液(0.5％乙基十六烷基二甲基溴化銨、0.28％乙酸、0.5％Triton X-100、3mM NaCl、2mM MgCl2，在PBS pH7.4中稀釋1/10)。
在1-2分鐘后，研磨幾次細胞，產生單一的、完整的、有生命的細胞核的均勻懸浮液。通過血球計數計對后者進行定量。破裂或者損壞的細胞核不包括在計數內。第3-4頁Basilen Blue抑制ATP與小腦粒狀細胞膜的結合，但不抑制天冬氨酸的攝取。由8 DIV小腦粒狀細胞中制備膜，然后在不同濃度的BasilenBlue存在下將20μg蛋白質與[3H]ATP(0.5μCi/ml，最終濃度為14nM)(圖4)一起在4℃下溫育1小時。顯示出專一性的結合，計數代表平均值±SEM(n＝3)。星號代表在100μM咖啡因存在時進行的結合。在圖5中，將8 DIV之復制的小腦粒狀培養(yǎng)物洗滌二次，然后在不同濃度的Basilen Blue存在時與含有[3H]D-2，3天冬氨酸的Locke氏溶液(0.5μCi/ml，最終濃度為40nM)溫育不同的時間。二次洗滌后，將細胞溶解在0.1M氫氧化鈉中，然后通過液體閃爍計數摻入的放射性。所得值以cpm/μg表示，并代表平均值±SEM(n＝3)。蛋白質濃度通過Bradford法用牛血清白蛋白作標準進行測定。
方法將8DIV之復制的小腦粒狀細胞收集在冰冷的緩沖液A(50mM Tris、1mM EGTA，用HCl將pH調節(jié)至7.4，還包含2mM苯基甲基磺酰氯、200 KIU/ml抑肽酶和1μg/ml的亮肽素)中，然后于4℃、35,000×g下離心20分鐘。重新將沉淀物懸浮于緩沖液A中，以使蛋白質的濃度為5-6mg/ml，并立即用于結合研究中。在與[3H]ATP結合后，通過Whatman GF/B玻璃纖維過濾器真空過濾樣品(1ml)，然后立即用5ml的50mM Tris-HCl(pH7.4)洗滌過濾器，空氣干燥，并通過液體閃爍計數估測專一性結合的放射活性。第5-6頁在AMPPNP存在下培養(yǎng)小腦粒狀細胞調節(jié)谷氨酸依賴型的細胞死亡、Ca2+攝取和天冬氨酸釋放。制備原始小腦粒狀培養(yǎng)物，然后由1DIV開始，將它們中的一些每日補充100μM AMPPNP(圖6)。在8DIV時，在洗滌二次后，將培養(yǎng)物中的一些在20℃下與100μM谷氨酸一起溫育。在下一天如上所述對它們進行細胞存活率的估測。
(圖7)在有或沒有谷氨酸的情況下，在45 Ca2+(1μCi/ml)存在時在Locke氏溶液中溫育8 DIV之復制的小腦粒狀細胞培養(yǎng)物1分鐘，然后估測Ca2+的流入(圖8)。在[3H]D-2，3天冬氨酸(1μCi/ml，最終濃度為40nM)存在時，在Locke氏溶液中溫育8 DIV之復制的小腦粒狀細胞培養(yǎng)物5分鐘，然后在有或沒有100μM谷氨酸時估測天冬氨酸的釋放。數據用平均值±SEM(n＝3)來表示。第7-8頁Basilen Blue在小腦粒狀細胞中抑制由谷氨酸誘導的天冬氨酸釋放和Ca2+攝取(圖9)。在[3H]D-2，3天冬氨酸(1μCi/ml，最終濃度為40nM)存在時，在Locke氏溶液中溫育8 DIV之復制的小腦粒狀細胞5分鐘。洗滌二次后，在Locke氏溶液中在不同濃度的Basilen Blue存在時，將培養(yǎng)物與或不與100μM谷氨酸一起溫育1分鐘。將在該釋放階段中由培養(yǎng)基中除去的緩沖液收集在小玻璃瓶中，然后計數放射性。星號代表在100μM谷氨酸和100μM咖啡因同時存在時得到的天冬氨酸釋放。將細胞溶解在0.1M氫氧化鈉中，蛋白質濃度通過Bradford法用牛血清白蛋白作標準進行測定(圖10)。在含有45 Ca2+(1μCi/ml)的Locke氏溶液中將8 DW之復制的小腦粒狀細胞培養(yǎng)物與或不與100μM谷氨酸一起溫育1分鐘，其中同時存在不同濃度的Basilen Blue。在用冰冷154mM氯化膽堿、2mM EDTA洗滌二次后，將細胞溶解在0.1M氫氧化鈉中，取幾等份用于測量Ca2+流入(通過放射性計數)和蛋白質濃度。星號代表同時存在100μM谷氨酸和100μM咖啡因時得到的Ca2+流入。數據用平均值±SEM(n＝3)來表示。
權利要求
1.用于預防谷氨酸引發(fā)之細胞毒性的P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑化合物。
2.P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑化合物在制備用于治療急性和慢性神經變性疾病之藥物中的應用。
3.藥物組合物，其包括作為活性成分的P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑化合物以及常用的添加劑。
4.如權利要求3的藥物組合物，其特征在于，除常用的添加劑外，其還包括在藥物學上可接受之載體中的作為活性成分的P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑化合物。
5.如權利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑是5-腺苷?；鶃啺被姿狨?AMPPNP)。
6.如權利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述化合物選自Basilen Blue E-3G(Reactive Blue 2)和Cibacron Blue 3GA。
7.如權利要求3、5和6的藥物組合物，其是用于急性和慢性神經變性疾病。
8.如權利要求3、5和6的藥物組合物，其是用于調節(jié)谷氨酸引發(fā)之生理功能。
9.如權利要求8的藥物組合物，其特征在于，所述谷氨酸引發(fā)之生理功能是疼痛、激素平衡、血壓、熱調節(jié)、出汗、學習、圖形識別和記憶。
10.如權利要求3、5和6的藥物組合物，其是用于預防谷氨酸引發(fā)之神經毒性。
全文摘要
P2嘌呤受體激動劑或拮抗劑的化合物在預防谷氨酸引起的細胞毒性中的應用,特別是使用Basilen Blue E－3G(Reactive Blue2)、Cibacron Blue 3GA和5－腺苷?；鶃啺被姿狨?AMPPNP)。存在細胞毒性濃度的谷氨酸時,這些化合物可維持中樞神經系統(tǒng)(CNS)神經元如產后鼠小腦粒狀神經元之細胞存活率。
文檔編號A61K31/00GK1192139SQ96195903
公開日1998年9月2日 申請日期1996年7月24日 優(yōu)先權日1995年7月28日
發(fā)明者欽齊亞·沃隆特, 達尼埃拉·梅洛 申請人:國家研究委員會