專利名稱：Hsp70家族的鏈球菌熱休克蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的新熱休克蛋白和免疫相關(guān)多肽，提供了在治療、預(yù)防和診斷疾病中有用的免疫治療、預(yù)防和診斷劑的基礎(chǔ)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的熱休克蛋白，它們是HSP70家族的成員，表觀分子量為7072kDa，本發(fā)明還涉及相應(yīng)的核苷酸和衍生的氨基酸序列、生產(chǎn)HSP70/HSP72和免疫相關(guān)多肽的重組DNA方法、與這些HSP結(jié)合的抗體以及診斷、預(yù)防和治療因肺炎鏈球菌和有關(guān)細(xì)菌如化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌引起的疾病的方法和組合物。發(fā)明背景肺炎鏈球菌是人，特別是嬰幼兒和老年人以及免疫受損者的重要致病因素。從世界范圍內(nèi)來(lái)看，是患有侵襲性疾病菌血癥/敗血癥、肺炎、腦膜炎的患者和高發(fā)病率和死亡率的患者中經(jīng)常分離出來(lái)的一種細(xì)菌。盡管抗微生物藥物的發(fā)現(xiàn)降低了肺炎球菌疾病的死亡率，但抗性肺炎球菌生物是目前世界上的主要問(wèn)題。有效地肺炎球菌疫苗對(duì)于與肺炎鏈球菌疾病有關(guān)的發(fā)病率和死亡率有很大的影響。所述疫苗還可有效地用于預(yù)防嬰幼兒中的中耳炎。
顯然，許多肺炎球菌因素在致病機(jī)制中都是很重要的[G.J.Boulnois，遺傳微生物學(xué)雜志，138，pp249-259(1992)；C.J.Lee等，Crit.Rev.Microbiol.，18，pp89-114(1991)]。肺炎球菌的莢膜盡管沒(méi)有毒性，但認(rèn)為是使肺炎球菌具有毒性的必要條件。以抗原差異為基礎(chǔ)，鑒定了80多種肺炎球菌莢膜血清型?？贵w是保護(hù)機(jī)制，而且已經(jīng)明確了抗莢膜抗體對(duì)于宿主抵御肺炎鏈球菌是非常重要的[R.Austrian，美國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，67，pp547-549(1979)]。然而，目前可得到的肺炎球菌疫苗含有最經(jīng)常引起疾病的23種莢膜多糖，但這些疫苗有明顯的缺陷如莢膜多糖的致免疫性差，血清型多種多樣，而且在時(shí)間、地理區(qū)域和年齡組中，血清型的分布不同。具體地說(shuō)，現(xiàn)有疫苗不能保護(hù)幼童抵御多種血清型的缺陷促使人們?cè)u(píng)估其他肺炎鏈球菌組分。不斷有跡象表明，特定的肺炎球菌蛋白質(zhì)可能在保護(hù)和致病性方面均很重要[J.C.Paton，微生物研究年報(bào)，47，pp89-115(1993)]。但到目前為止，只研究了很少的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)。這可能是由于缺少蛋白質(zhì)特異性抗體而造成的，缺少抗體就很難研究蛋白質(zhì)抗原在保護(hù)和致病性方面的作用。認(rèn)為肺炎球菌蛋白質(zhì)抗原沒(méi)有很強(qiáng)的致免疫性，而大多數(shù)抗體應(yīng)答是針對(duì)磷酸膽堿和莢膜多糖[L.S.McDaniel等，J.Exp.Med.，160，pp386-397(1984)；R.M.Krause，Adv.Immunol.，12，pp1-56(1970)；D.G.Braun等，J.Exp.Med.，129，pp809-830(1969)]。在使用X連鎖免疫缺陷性小鼠(這種小鼠對(duì)碳水化合物抗原和磷酸膽堿的反應(yīng)差，但對(duì)蛋白質(zhì)抗原的反應(yīng)相對(duì)正常)所進(jìn)行的研究中，得到與肺炎球菌蛋白質(zhì)抗原有反應(yīng)性的單克隆抗體的頻率不到10％，因此表明肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)不是好的免疫原[McDaniel等，同上文]。
無(wú)乳鏈球菌也稱為B型鏈球菌(GBS)，是膿毒癥(血液感染)和新生兒腦膜炎的最常見(jiàn)的病因。GBS也是新生兒肺炎的常見(jiàn)病因。在美國(guó)每年約有8000個(gè)嬰兒患GBS病，5％-15％的患兒死亡。存活下來(lái)的嬰兒，特別是患腦膜炎的那些，會(huì)遺留下長(zhǎng)期問(wèn)題，如喪失聽(tīng)覺(jué)或視覺(jué)或失去學(xué)習(xí)能力。在懷孕的婦女中，GBS會(huì)引起尿道感染、子宮感染(羊膜炎，子宮內(nèi)膜炎)和死產(chǎn)。在未懷孕的婦女和男性中，GBS引起的最常見(jiàn)的疾病是血液感染、皮膚和軟組織感染以及肺炎。約20％患GBS疾病的未懷孕婦女和男性死于這種疾病。在新生兒和成年人中的GBS感染通常通過(guò)靜脈內(nèi)施用抗生素(如青霉素或氨芐青霉素)來(lái)治療。大部分新生兒中的GBS病可通過(guò)在分娩時(shí)給孕婦靜脈內(nèi)施用抗生素而得到預(yù)防。正在研制預(yù)防GBS病的疫苗。在將來(lái)，期望接種了的婦女都能產(chǎn)生可通過(guò)胎盤的抗體，從而在出生和嬰兒早期能夠保護(hù)嬰兒。
自1980年以來(lái)，也稱為A組鏈球菌(GAS)的化膿鏈球菌作為嚴(yán)重疾病的病因再次出現(xiàn)，這可能是由于生物體的毒性增加而引起的。GAS可引起咽炎，通常稱為strep throat，和皮膚感染(膿皰病、丹毒/蜂窩組織炎)。strep throat和膿皰病導(dǎo)致腎小球腎炎(腎損傷)。約3％的strep throat感染導(dǎo)致風(fēng)濕性發(fā)燒(游走性關(guān)節(jié)炎)，其并發(fā)癥包括舞蹈病(神經(jīng)癥狀)，50％的情況下，有心內(nèi)膜炎的風(fēng)濕性心臟病(心臟瓣膜損傷)可能是長(zhǎng)期結(jié)果。重要的是用抗生素治療膿皰病和“strep throat”以預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)展。由產(chǎn)生毒素的菌株而引起的感染會(huì)導(dǎo)致猩紅熱(diffuse rash和發(fā)熱)或極嚴(yán)重的鏈球菌中毒性休克征(TSS；GAS也稱為“吃肉細(xì)菌”)，其特征在于會(huì)迅速發(fā)生休克和多器官系統(tǒng)衰竭。盡管有包括除去細(xì)菌感染病灶的攻擊性治療和抗生素治療，但TSS仍有30-70％的死亡率。TSS的發(fā)病率為每100,000有10到20個(gè)。目前還沒(méi)有抗GAS的疫苗。
熱休克或應(yīng)激蛋白(“HSP”)是自然界中最高度保守的，而且豐富的蛋白質(zhì)[F.C.Neidhardt等，遺傳學(xué)研究年鑒，18，pp.295-329(1984)；S.Lindquist生物化學(xué)研究，55，pp.1151-1191(1986)]。它們是由應(yīng)答各種生理和非生理刺激的所有細(xì)胞生產(chǎn)的。其中突然增加溫度會(huì)誘導(dǎo)合成HSP的熱休克反應(yīng)是研究最多的應(yīng)激反應(yīng)。其他環(huán)境條件如低pH、鐵缺乏或過(guò)氧化氫也會(huì)誘導(dǎo)HSP。通過(guò)其大小限定HSP，hsp90、hsp70和hsp60家族中的成員是在所有原核和真核細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的主要HSP。這些蛋白質(zhì)通過(guò)幫助蛋白質(zhì)折疊和組裝以及輔助跨膜轉(zhuǎn)位來(lái)完成侶伴蛋白功能[C.Georgopoulos and W.J.Welch，細(xì)胞生物學(xué)研究年鑒，9，pp.601-634(1993)；D.Ang.等，生物化學(xué)雜志，266，pp.24233-24236(1991)]。HSP可能作為分子侶伴蛋白或通過(guò)其它機(jī)制參與保護(hù)細(xì)胞免于應(yīng)激的不利影響。通過(guò)環(huán)境條件調(diào)節(jié)多種毒性因素的事實(shí)表明了HSP在微生物致病性中的作用[J.J.Mekalanos，細(xì)菌學(xué)雜志，174，pp.1-7(1992)；P.J.Murray and R.A Young，細(xì)菌學(xué)，174，pp.4193-4196(1992)]。在那方面，最近對(duì)沙門氏菌種的研究表明應(yīng)激反應(yīng)可能是與引發(fā)和保持感染細(xì)胞內(nèi)病原體的能力非常相關(guān)的[N.A.Buchmeir and F.Heffron，科學(xué)，248，pp.730-732(1990)；K.Z.Abshire andF.C.Neidhardt，細(xì)菌學(xué)雜志，175，pp.3734-3743(1993)；B.B.Finlay等，科學(xué)，243，pp.940-943(1989)]。其他人表明在熱休克條件下，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌中的必需的毒性因子lysteriolysin[Z.Sokolovic andW.Goebel，Infect.Immun.57，pp.295-298(1989)]。
越來(lái)越多的證據(jù)表明HSP是許多病原體的主要抗原。hsp60家族的成員因其與大腸桿菌GroEL蛋白質(zhì)的相似性也稱為GroEL蛋白，是各種細(xì)菌病原體的主要抗原[D.Young等，Proc.Acad.Sci.USA，85，pp.4267-4270(1988)]，所述病原體包括麻風(fēng)分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌[D.Young等，Proc.Acad.Sci.USA，85，pp.4267-4270(1988)]、嗜肺軍團(tuán)桿菌[B.B.Plikaytis等，J.Clin.Microbiol.，25，pp.2080-2084(1984)]、布氏疏螺旋體[B.J.Luft等，J.Immunol.，146，pp.2776-2786(1991)]和砂眼衣原體[E.A.Wager等，J.Infect.Dis.，162，pp.922-927(1990)]。該抗原是遍在“共同抗原”的同系物，而且認(rèn)為其存在于各個(gè)細(xì)菌中[J.E.Thole等，Microb.Pathogen，4，pp71-83(1988)]。還已就多種細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染描述了抗hsp70家族成員或DnaK-相關(guān)蛋白的抗體[Young等，同上文；Luft等，同上文；S.M.Engman等，J.Immunol.，144，pp.3987-3991(1990)；N.M.Rothstein等，Molec.Biochem.Parasitol.，33，pp.229-235(1989)；V.Nussenzweig andR.S.Nussenzweig，Adv.Immunol.，45，pp.283-334(1989)]。HSP還會(huì)引發(fā)強(qiáng)B和T細(xì)胞反應(yīng)，而且表明用結(jié)核分枝桿菌接種之小鼠的20％的CD4+T淋巴細(xì)胞只與hsp60蛋白質(zhì)反應(yīng)[S.H.E.Kaufman等，Eur.J.Immunol，17，pp.351-357(1987)]。相似的，總共24個(gè)抗麻風(fēng)分枝桿菌蛋白的單克隆抗體中的7個(gè)識(shí)別hsp60上的決定基[H.D.Engers等，Infect.Immun.，48，pp.603-605(1985)]。看起來(lái)對(duì)應(yīng)激蛋白的免疫應(yīng)答在抵御感染方面起重要作用。這與微生物HSP有反應(yīng)性的抗體和T細(xì)胞可以表現(xiàn)出中和和保護(hù)活性的結(jié)果一致[A.Noll等，Infect.Immun.，62，pp.2784-2791(1994)；和S.L.Danilition等，Infect.Immun.，58，pp.189-196(1990)]。應(yīng)激蛋白的免疫特性使它們可作為疫苗組分，而且目前認(rèn)為數(shù)種HSP可用于預(yù)防微生物感染并治療癌癥。但是，到目前為止，研究集中于細(xì)胞內(nèi)病原體入分枝桿菌、沙門氏菌、衣原體和數(shù)種寄生蟲(chóng)。有關(guān)細(xì)胞外革蘭氏陽(yáng)性菌中熱休克蛋白抗原的報(bào)道很少。在肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌中，既未鑒定熱休克蛋白，也未鑒定其基因結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明通過(guò)提供來(lái)自肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的新熱休克蛋白和免疫相關(guān)多肽而述及了上述問(wèn)題。還提供了編碼前述多肽的DNA序列，含所述多肽的載體、用那些載體轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主以及制備基本純的重組多肽的方法。還提供了前述多肽特異性的抗體。本發(fā)明的多肽、DNA序列和抗體為用于檢測(cè)、預(yù)防和治療疾病的新方法和組合物提供了基礎(chǔ)。特別是，本發(fā)明提供了以對(duì)鏈球菌菌株有特異性的這些多肽片段為基礎(chǔ)的新疫苗。
新熱休克蛋白是肺炎鏈球菌的約72kDa熱休克蛋白(“HSP72”)(SEQ ID NO5)、化膿鏈球菌的約70kDa的熱休克蛋白(“HSP70”)(SEQ ID NO20)和無(wú)乳鏈球菌的約70kDa的熱休克蛋白(“HSP70”)(SEQ ID NO22)，包括其類似物、同系物和衍生物和含有至少一個(gè)致免疫表位之前述多肽的片段。優(yōu)選的HSP70/72片段包括HSP70/72多肽的C-末端部分。更具體地說(shuō)，包括C末端169個(gè)殘基的片段(“C-169”)(殘基439-607，SEQ ID NO5)C末端151個(gè)殘基的片段(“C-151”)(殘基457-607，SEQ ID NO5)，以及由C-169區(qū)中的肽表位組成的小片段。HSP72之C-169區(qū)內(nèi)的特別優(yōu)選片段包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO5的殘基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO5的殘基586-600)，這是肺炎鏈球菌的HSP72所專有的。更優(yōu)選的是在人宿主中引發(fā)抗肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的免疫反應(yīng)，但不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)的片段。所述片段可以選自下列肽CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880、CS882、MAP1、MAP2、MAP3和MAP4(見(jiàn)表5，同上文)。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體是F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4單克隆抗體(“MAb”)，它們都是HSP72特異性的。
更優(yōu)選的抗體是具有HSP70和HSP72特異性的F2-Pn3.2和F2-Pn3.4單克隆抗體。更優(yōu)選的是肺炎鏈球菌特異性的F1-Pn3.1。
本發(fā)明的優(yōu)選多肽和抗體為用于檢測(cè)、預(yù)防和治療肺炎球菌病的新方法和組合物提供了基礎(chǔ)。
附圖描述

圖1是熒光圖譜，描述了熱休克蛋白對(duì)肺炎鏈球菌蛋白合成的影響。在A中的細(xì)胞提取物是肺炎鏈球菌6型菌株64。在B中的細(xì)胞提取物是肺炎鏈球菌4型菌株53。將奇數(shù)道的細(xì)胞提取物在37℃保溫。將偶數(shù)道的細(xì)胞提取物在45℃保溫5分鐘。然后用[35S]甲硫氨酸將細(xì)胞提取物標(biāo)記10分鐘(道1、2和7、8)，30分鐘(道3、4和9、10)或60分鐘(道5、6)。在左邊列出了以kDa計(jì)的分子量標(biāo)記。在各組的右手用箭頭表示HSP80、HSP72和HSP62的位置。
圖2圖示比較說(shuō)明在與熱休克蛋白接觸(----)或不接觸(----)的條件下，肺炎鏈球菌中的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)的電泳圖。通過(guò)測(cè)量相對(duì)光密度(Y軸)對(duì)標(biāo)記蛋白帶的遷移率(X軸)來(lái)確定光密度示蹤(densitometric tracing)。在圖1的道1和2中列出了SDS-PAGE的光密度掃描。
圖3是一熒光圖譜，它表示用來(lái)自經(jīng)去垢劑可溶的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)提取物免疫之小鼠的血清免疫沉淀的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)抗原。來(lái)自在37℃生長(zhǎng)并在37℃溫育(道3、5、7和9)或45℃熱休克(道4、6、8和10)的肺炎鏈球菌的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)用來(lái)自小鼠1(道3到6)或小鼠2(道7-10)的血清免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和熒光照相術(shù)分析。在第一(道3、4和7、8)與第二(道5、6和9、10)次免疫后，檢測(cè)血清。在道1和2中分別說(shuō)明來(lái)自[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的非熱休克和熱休克肺炎鏈球菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在熒光圖譜的左側(cè)用箭頭標(biāo)明了HSP的位置。
圖4是熒光圖譜，它表示用來(lái)自經(jīng)熱殺死的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)提取物免疫之小鼠的血清免疫沉淀的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)抗原。來(lái)自在37℃生長(zhǎng)并在37℃溫育(道3、5和7)或45℃熱休克(道4、6和8)的肺炎鏈球菌的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)用來(lái)自小鼠1(道3、4)或小鼠2(道5、6)或小鼠3(道7、8)的血清免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和熒光照相術(shù)分析。只在第二次免疫后，檢測(cè)血清。在道1和2中分別說(shuō)明來(lái)自[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的非熱休克和熱休克肺炎鏈球菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在熒光圖譜的左側(cè)用箭頭標(biāo)明了HSP的位置。
圖5是照片，表示用Western印跡分析檢測(cè)的肺炎鏈球菌抗原。用來(lái)自經(jīng)熱殺死的肺炎鏈球菌免疫之15只小鼠的血清(道1-15)檢測(cè)全細(xì)胞提取物。道16表示用MAbF1-Pn3.1檢測(cè)的HSP72蛋白質(zhì)。A組中，在第二次免疫后檢測(cè)血清。B組中表明了第一次免疫后，檢測(cè)15個(gè)血清中的4個(gè)血清的反應(yīng)。在左側(cè)用短劃標(biāo)出了53.5kDa和47kDa蛋白質(zhì)帶的位置。在各組的右側(cè)，用箭頭標(biāo)出了HSP72的位置。
圖6是說(shuō)明MAb F1-Pn3.1對(duì)HSP72之特異性的熒光圖譜。在不進(jìn)行(道1、3和5)或進(jìn)行(道2、4和6)熱休克的條件下，肺炎鏈球菌的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)用IgG2a-對(duì)照MAb(道3、4)或F1-Pn3.1(道5、6)進(jìn)行免疫沉淀，然后用SDS-PAGE和熒光照相術(shù)分析。在道1和2中分別為來(lái)自[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記非熱休克和熱休克肺炎鏈球菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在熒光圖譜的左側(cè)用箭頭標(biāo)明了HSP(所有3種)的位置。
圖7，A組是一免疫印跡，說(shuō)明熱休克和非熱休克[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的肺炎鏈球菌細(xì)胞提取物與MAb F1-Pn3.1的反應(yīng)。道1含有熱休克的細(xì)胞溶解產(chǎn)物(45℃)。道2含有非熱休克細(xì)胞溶解產(chǎn)物(37℃)。B組是A組免疫印跡的熒光圖譜。
圖8是一Western印跡，說(shuō)明肺炎鏈球菌HSP72的亞細(xì)胞定位。在SDS-PAGE上電泳含15ug膜組分蛋白(道1)和胞質(zhì)組分蛋白(道2)的樣品，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，用MAb F1-Pn3.1檢測(cè)。
圖9是免疫印跡的照片，說(shuō)明含肺炎鏈球菌HSP72的C-169區(qū)的重組融合蛋白與MAb F1-Pn3.1的反應(yīng)性。道1含來(lái)自肺炎鏈球菌菌株64的全細(xì)胞提取物，用HSP72特異性MAb F1-Pn3.1檢測(cè)。道2和3含有存在(+)或不存在(-)IPTG條件下培養(yǎng)的來(lái)自λJBDl7感染之大腸桿菌的噬菌體溶解產(chǎn)物，然后用HSP72特異性MAb F1-Pn3.1檢測(cè)。道4和5含有存在(+)或不存在(-)IPTG條件下培養(yǎng)的來(lái)自λJBD7感染之大腸桿菌的噬菌體溶解產(chǎn)物，然后用HSP72特異性MAb F1-Pn3.1檢測(cè)。在左側(cè)是分子量標(biāo)記。在左、右側(cè)分別標(biāo)出了74kDa和160kDa反應(yīng)性蛋白質(zhì)的位置。
圖10圖示說(shuō)明HSP72(DnaK)和Fuc座位和重組克隆插入片段的限制圖譜。說(shuō)明了它們之間DNA片段間的關(guān)系。圖10A和10C分別是HSP72(DnaK)和Fuc座位的限制圖譜。圖10B是實(shí)施例3中所述各種噬菌體和質(zhì)粒的插入片段。H(HindIII)；E(EcoRI)；V(EcoRV)；P(PstI)；和X(XhoI)說(shuō)明限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的位置。標(biāo)明了HSP72/DnaK座位上(■)、Fuc座位上(///)的DNA片段；以及用作Southern印跡分析探針的片段(

)。
圖11是重組74kDa蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和Western印跡分析。在存在(+)或不存在(-)IPTG條件下培養(yǎng)的，對(duì)用質(zhì)粒pJBDl79(道1)、pJBDf51(道2和3)和pJBDf62(道4和5)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細(xì)胞提取物進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后用考馬斯蘭染色(A)或使用HSP特異性MAb F1-Pn3.1的Western印跡肉眼觀察蛋白質(zhì)。左側(cè)為以kDa計(jì)的分子量。各組左側(cè)的箭頭表示74kDa蛋白質(zhì)標(biāo)記。
圖12描述用Western印跡分析檢測(cè)天然和重組HSP72抗原。對(duì)來(lái)自用質(zhì)粒pJBDk51(道1和3)和pJBDk291(道2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物和來(lái)自肺炎鏈球菌64(道4)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。用HSP特異性MAbF1-Pn3.1檢測(cè)免疫印跡。
圖13A-13D比較了肺炎鏈球菌HSP72開(kāi)放閱讀框架的預(yù)測(cè)氨基酸序列與以前報(bào)道的下列HSP70/DnaK蛋白質(zhì)ECOLI，大腸桿菌；BORBU，Borrelia burgdorferi；BRUOV，羊型布魯菌；CHLPN，肺炎衣原體；BACME，巨大芽胞桿菌；BACSU，枯草芽胞桿菌；STAAU，金黃色葡糖球菌；LACLA，Lactococcus lactis；和MYCTU，結(jié)核分枝桿菌。只標(biāo)明了錯(cuò)配的氨基酸。相同的和保守的氨基酸分別用框框起來(lái)和陰影表示。
圖14是SDS-PAGE的照片，說(shuō)明用親和層析純化的重組肺炎鏈球菌HSP72。來(lái)自大腸桿菌(JBDK51)溶解產(chǎn)物的上清液(道2)和20ug免疫親和純化的HSP72rec(道3)經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后通過(guò)考馬斯蘭染色來(lái)肉眼觀察蛋白質(zhì)。道1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(106 kDa，80 kDa，49.5kDa，32.5kDa，27.5kDa和18.5kDa)的遷移。
圖15是SDS-PAGE照片，說(shuō)明通過(guò)增溶包含體而純化的重組肺炎鏈球菌C-169片段。將不同量的純化C-169蛋白質(zhì)(道1，5ug；道2，2.5ug；道3，1ug)和來(lái)自用質(zhì)粒pDELTA1(道4)和pJBDΔ1(道5)轉(zhuǎn)化之大腸桿菌的全細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后通過(guò)考馬斯蘭染色來(lái)肉眼觀察蛋白質(zhì)。
圖16圖示說(shuō)明通過(guò)用HSP72rec接種，而使Balb/c小鼠免于肺炎鏈球菌感染的存活曲線。以每組10只小鼠，在14天的存活百分比表示數(shù)據(jù)。
圖17圖示說(shuō)明通過(guò)用C-169rec接種，而使Balb/c小鼠免于肺炎鏈球菌感染的存活曲線。以每組10只小鼠，在14天的存活百分比表示數(shù)據(jù)。
圖18是質(zhì)粒pURV3的圖譜，該質(zhì)粒含有C-151rec，即肺炎鏈球菌HSP72的羧基末端151個(gè)氨基酸的編碼區(qū)；AmpiR，即氨芐青霉素抗性編碼區(qū)；ColE1 ori，即復(fù)制原點(diǎn)；cI857，即噬菌體λcI857溫度敏感性阻遏基因；λPL，噬菌體λ轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；T1，T1轉(zhuǎn)錄終止子。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。BglII和BamHI是用于插入肺炎鏈球菌C-151rec編碼區(qū)的限制位點(diǎn)。
圖19說(shuō)明在來(lái)自用HSP72rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎鏈球菌滴定度的分布情況。在第一、第二和第三次注射1ug(O)或5ug(·)HSP72rec后，收集血清，分別用ELISA評(píng)估抗肺炎鏈球菌抗體。滴定度的定義為A410值比背景值高0.1的最高稀釋度，平線表示各組小鼠相互滴度倒數(shù)的中位值，而折線表示免疫前血清的中位值。
圖20說(shuō)明在來(lái)自用C-169rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎鏈球菌滴定度的分布情況。在第一、第二和第三次注射1ug(O)或5ug(·)C-169rec后，收集血清，分別用ELISA評(píng)估抗肺炎鏈球菌抗體。滴定度的定義為A410值比背景值高0.1的最高稀釋度，平線表示各組小鼠抗體滴度倒數(shù)的中位值，而折線表示免疫前血清的中位值。
圖21說(shuō)明在來(lái)自用C-151rec免疫的Balb/c小鼠血清中，抗肺炎鏈球菌滴定度的分布情況。在第一、第二和第三次注射0.5ugC-151rec后，收集血清，分別用ELISA評(píng)估抗肺炎鏈球菌抗體。滴定度的定義為A410值比背景值高0.1的最高稀釋度，平線表示各組小鼠抗體滴度倒數(shù)的中位值，而折線表示免疫前血清的中位值。
圖22說(shuō)明用重組HSP72抗原免疫的彌猴的抗體反應(yīng)。由2只猴子組成的組分別在第1天、第22天和第77天用HSP72rec或C-169rec蛋白質(zhì)接種。在接種過(guò)程中，有規(guī)律地收集血清，然后用Western印跡分析單個(gè)評(píng)估肺炎球菌HSP72特異性抗體。將滴度定義為可肉眼觀察到HSP72帶的最高稀釋度。
圖23說(shuō)明在固相ELISA中，超免疫血清與肽的結(jié)合。檢測(cè)來(lái)自用HSP72rec或C-169rec蛋白質(zhì)免疫的兔、小鼠和猴血清與肽的反應(yīng)性。用1∶100稀釋的血清得到光密度值，而對(duì)應(yīng)于兔血清與肽MAP2和鼠血清與肽MAP2和MAP4之反應(yīng)性的值是使用以1∶1000稀釋的血清得到的。
圖24描述從肺炎鏈球菌(spn-orf)、化膿鏈球菌(sga-orf)和無(wú)乳鏈球菌(sgb-orf)的hsp70/dnak開(kāi)放閱讀框架的DNA序列得到的共有序列，并說(shuō)明各種特異性的核苷酸取代和插入。
圖25描述從肺炎鏈球菌(spn-prot)、化膿鏈球菌(sga-prot)和無(wú)乳鏈球菌(sgb-prot)的HSP70蛋白質(zhì)序列得到的共有序列，并說(shuō)明各個(gè)種特異性的氨基酸取代和插入。
圖26是熒光圖，說(shuō)明熱休克對(duì)無(wú)乳鏈球菌蛋白質(zhì)合成以及用MabF2-Pn3.4免疫沉淀無(wú)乳鏈球菌蛋白質(zhì)的影響。用SDS-PAGE和熒光照像術(shù)分析源于生長(zhǎng)于37℃，且在37℃溫育(奇數(shù)道)或在43℃(偶數(shù)道)熱休克的無(wú)乳鏈球菌〔35S〕甲硫氨酸標(biāo)記蛋白的細(xì)胞溶解物。道3和道4顯示了用Mab F2-Pn3.4獲得的免疫沉淀。本發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，我們提供了肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的新熱休克蛋白，和含至少一個(gè)免疫原性表位的其類似物、同系物、衍生物片段。如本文所用的“熱休克蛋白”是在熱應(yīng)激條件下，抑制優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的天然蛋白質(zhì)。本發(fā)明的熱休克蛋白可以是天然的，或可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或常規(guī)化學(xué)合成技術(shù)得到。
如本文所用的，“免疫原性”指具有引發(fā)免疫反應(yīng)的能力。本發(fā)明新的熱休克蛋白的特征在于其引發(fā)抗鏈球菌感染，具體地說(shuō)，抗致死性肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)之能力。
本發(fā)明具體提供約72kDa(HSP 72)的肺炎鏈球菌熱休克蛋白質(zhì)(SEQID NO5為其推測(cè)的氨基酸序列)，含至少一個(gè)免疫原性表位的其類似物、同系物、衍生物片段。
如本文所用的，HSP72的“類似物”是其中HSP氨基酸序列(SEQ IDNO5)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代的肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)，條件是保持所述類似物蛋白質(zhì)的總功能性和免疫原性。所述類似物可以是天然的，或可以是合成或通過(guò)重組DNA技術(shù)，例如通過(guò)HSP72序列誘變而產(chǎn)生的。HSP72的類似物擁有至少一種能夠引發(fā)抗體的抗原，所述抗體與HSP72，如膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌反應(yīng)。
如本文所用的，HSP72的“同系物”是，來(lái)自除肺炎鏈球菌、膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌以外的鏈球菌種或鏈球菌之外的屬的蛋白質(zhì)，其中HSP氨基酸序列(SEQ ID NO5)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，條件是保持所述同系物蛋白質(zhì)的總功能性和免疫原性。所述同系物可以是天然的，或可以是合成或通過(guò)重組DNA技術(shù)而產(chǎn)生的。HSP72的同系物擁有至少一種能夠引發(fā)抗體的抗原，所述抗體與HSP72，如糞腸球菌反應(yīng)。
如本文所用的，“衍生物”是其中已改變了一種或多種物理、化學(xué)或生物學(xué)特性的多肽。所述改變包括，但不限于氨基酸取代、修飾、增加或缺失；脂化、糖基化或磷酸化模式的改變；游離氨基、羧基或在多肽氨基酸殘基中的羥基側(cè)基團(tuán)與其他有機(jī)和無(wú)機(jī)分子的反應(yīng)；以及任何可導(dǎo)致一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的其他改變。
本發(fā)明的“片段”至少有一個(gè)免疫原性表位?！懊庖咴浴北砦辉谝l(fā)免疫反應(yīng)的過(guò)程中，是功能性的表位。本發(fā)明優(yōu)選的片段可以引發(fā)免疫反應(yīng)，從而足以預(yù)防感染或降低感染，如肺炎鏈球菌感染的嚴(yán)重程度。HSP72的優(yōu)選片段包括所述多肽的C末端區(qū)。更優(yōu)選的片段包括C末端的169個(gè)殘基的片段(“C-169”)(SEQ ID NO5，殘基439-607)、C末端的151個(gè)殘基的片段(“C-151”)(SEQ ID NO5，殘基457-607)和C-169區(qū)內(nèi)，組成肽表位的較小片段。HSP72 C-169區(qū)內(nèi)，特別優(yōu)選的片段包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO5的殘基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO5的殘基586-600)，它們是肺炎鏈球菌專有的HSP72，或?qū)?yīng)于化膿鏈球菌或無(wú)如鏈球菌的簡(jiǎn)并片段(見(jiàn)圖25)。甚至更優(yōu)選的是引發(fā)抗鏈球菌菌株之特異性免疫反應(yīng)的片段。所述片段可選自下列肽CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880、CS882、MAP1、MAP2和MAP3、MAP4(見(jiàn)表5，同上文)或其同系物。
在本發(fā)明的另一方面，我們提供了與HSP70/72免疫學(xué)相關(guān)的多肽。如本文所用的，“免疫學(xué)相關(guān)的”多肽是特征在于有下列的一種或多種特性(a)它們與通過(guò)用肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物而產(chǎn)物的抗體有免疫反應(yīng)性，所述抗體與HSP72(SEQ ID NO5)和HSP70(SEQ ID NO20和SEQID NO22)有免疫反應(yīng)性；(b)它們能夠引發(fā)與HSP72(SEQ ID NO5)和HSP70(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)有免疫反應(yīng)性的抗體；(c)它們與用HSP72(SEQ ID NO5)免疫哺乳動(dòng)物而產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性。
根據(jù)定義，HSP70/72的類似物、同系物和衍生物是免疫學(xué)相關(guān)的多肽。此外，所有免疫學(xué)相關(guān)的多肽均含有至少一個(gè)HSP70/72抗原。因此，“HSP70/72”在HSP70/72本身中或免疫學(xué)相關(guān)多肽中找到。
在本發(fā)明的另一方面，我們提供了與HSP72免疫學(xué)相關(guān)的多肽。。如本文所用的，“免疫學(xué)相關(guān)的”多肽是特征在于有下列的一種或多種特性(a)它們與通過(guò)用肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物而產(chǎn)物的抗體有免疫反應(yīng)性，所述抗體與HSP72(SEQ ID NO5)有免疫反應(yīng)性；(b)它們能夠引發(fā)與HSP72(SEQ ID NO5)有免疫反應(yīng)性的抗體；(c)它們與用HSP72(SEQ ID NO5)免疫哺乳動(dòng)物而產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性。
根據(jù)定義，HSP72的類似物、同系物和衍生物是免疫學(xué)相關(guān)的多肽。此外，所有免疫學(xué)相關(guān)的多肽均含有至少一個(gè)HSP72抗原。因此，“HSP72”在HSP72本身中或免疫學(xué)相關(guān)多肽中找到。
如本文所用的，“相關(guān)細(xì)菌”是具有能夠引發(fā)與HSP72反應(yīng)之抗體的抗原。有關(guān)細(xì)菌的實(shí)例包括肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和糞腸球菌。
通過(guò)本發(fā)明的下列實(shí)施例應(yīng)理解，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員無(wú)需過(guò)分試驗(yàn)即可確定特定的類似物、同系物、衍生物、免疫學(xué)相關(guān)多肽、或片段是否可用于診斷、預(yù)防或治療疾病。有用的多肽和片段將會(huì)誘導(dǎo)與HSP72發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(實(shí)施例4)。優(yōu)選的，有用的多肽和片段表明了誘導(dǎo)抗致死細(xì)菌感染之保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力(實(shí)施例5)。
還包括本發(fā)明多肽的聚合形式。這些聚合形式包括例如，與交聯(lián)劑如鏈霉親和素/生物素、戊二醛或二甲基suberimidate進(jìn)行了交聯(lián)的一種或多種多肽。所述聚合形式還包括含有兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)或反向相連的連續(xù)的蛋白質(zhì)序列，這是通過(guò)重組DNA技術(shù)而得到的多順?lè)醋觤RNA而產(chǎn)生的。
本發(fā)明提供了基本上純的HSP72和免疫學(xué)相關(guān)多肽。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”指本發(fā)明的多肽、編碼它們的DNA序列基本上不含有細(xì)菌源的其他蛋白質(zhì)?；旧霞兊牡鞍踪|(zhì)制品可通過(guò)各種常規(guī)方法，如在實(shí)施例3和5中描述的方法得到。
在另一方面，本發(fā)明第一次提供了編碼肺炎鏈球菌熱休克蛋白質(zhì)，具體地說(shuō)，是HSP72的DNA序列(SEQ ID NO4，核苷酸682-2502)。
本發(fā)明的DNA序列還包括編碼HSP72之多肽類似物和同系物的DNA序列、編碼免疫學(xué)相關(guān)多肽的DNA序列、任何前述DNA序列的簡(jiǎn)并DNA序列、以及任何前述DNA序列的片段。很容易理解，在鑒定并分離了所述多肽后，用常規(guī)的DNA測(cè)序技術(shù)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以確定本發(fā)明任何多肽的DNA序列。
還可以用衍生于編碼本發(fā)明多肽之基因的寡核苷酸引物和其他核酸探針來(lái)分離并克隆來(lái)自肺炎鏈球菌和相關(guān)細(xì)菌的其他相關(guān)蛋白質(zhì)，所述相關(guān)細(xì)菌可能含有與本發(fā)明DNA序列同源的細(xì)菌DNA區(qū)。另外，可將本發(fā)明的DNA序列用于PCR反應(yīng)以檢測(cè)在生物樣品中是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌。
本發(fā)明的多肽可以用各種方法來(lái)制備，例如從適宜的細(xì)胞提取物中進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)分離、使用常規(guī)的分離技術(shù)如離子交換和凝膠色譜和電泳，或通過(guò)重組DNA技術(shù)。重組DNA技術(shù)的使用特別適合于制備本發(fā)明基本上純的多肽。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了生產(chǎn)HSP72、免疫相關(guān)多肽、和其片段的方法，所述方法包括步驟(1)培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主生物，所述載體含有編碼所述多肽或片段的DNA序列以及一種或多種與所述DNA序列可操作相連的表達(dá)控制序列，和(2)回收基本上純的多肽或片段。
如本領(lǐng)域熟知的，為了在宿主中高水平表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因，必需將基因與所選的表達(dá)宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列可操作相連。優(yōu)選地，將表達(dá)控制序列和所需基因包含在表達(dá)載體中，所述載體還可含有細(xì)菌選擇性標(biāo)記和復(fù)制原點(diǎn)。如果表達(dá)宿主是真核細(xì)胞，表達(dá)載體還應(yīng)含有一用于真核表達(dá)宿主的表達(dá)標(biāo)記。
編碼本發(fā)明多肽的DNA序列可編碼或不編碼一信號(hào)序列。如果表達(dá)宿主是真核，通常優(yōu)選的是應(yīng)編碼一信號(hào)序列以便可從真核宿主中分泌出成熟蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的表達(dá)多肽上可以有也可以沒(méi)有氨基末端的甲硫氨酸。如果表達(dá)宿主不切除末端甲硫氨酸，則如果需要的話，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)化學(xué)除去。
可以用各種表達(dá)宿主/載體組合來(lái)表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。用于真核宿主的有用的表達(dá)載體包括例如含有來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、巨細(xì)胞病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒之表達(dá)控制序列的載體。用于細(xì)菌宿主的有用的表達(dá)載體包括細(xì)菌質(zhì)粒，如來(lái)自大腸桿菌的那些，包括pBluescript、pGEX2T、pUC載體、col E1、pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物，更寬范圍的質(zhì)粒如RP4、噬菌體DNA，如噬菌體λ的大量衍生物，如λgt10和λgt11、NM989和其他噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。用于酵母細(xì)胞的有用的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒和其衍生物。用于昆蟲(chóng)細(xì)胞的有用的載體包括pVL941。
另外，可將各種表達(dá)控制序列用于這些載體以表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)控制序列包括與前述表達(dá)載體之結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的表達(dá)控制序列。有用的表達(dá)控制序列的實(shí)例包括例如SV40和腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，T3和T7啟動(dòng)子，噬菌體λ的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)，fd包被蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油激酶或其他糖酵解酶、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子如Pho5，酵母α-交配系統(tǒng)啟動(dòng)子和已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒之基因表達(dá)的其他組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，和其各種組合。T7RNA聚合酶啟動(dòng)子10在大腸桿菌中表達(dá)HSP72是特別有用的(實(shí)施例3)。
用前述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞形成了本發(fā)明的另一方面。各種單細(xì)胞宿主可用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。這些宿主可包括熟知的真核和原核宿主，如大腸桿菌、假單胞菌、芽胞桿菌、鏈霉菌、真菌、酵母的菌株，昆蟲(chóng)細(xì)胞如草地貪夜蛾(SF9)，動(dòng)物細(xì)胞如CHP和小鼠細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，人細(xì)胞和組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞。優(yōu)選的宿主生物包括細(xì)菌如大腸桿菌和枯草芽胞桿菌和組織培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
當(dāng)然應(yīng)理解不是所有的載體和表達(dá)控制序列都能夠同樣好地表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。也不是所有的宿主都同樣好地與同一的表達(dá)系統(tǒng)起作用。但是，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以對(duì)這些載體、表達(dá)控制序列和宿主進(jìn)行選擇而無(wú)需過(guò)分試驗(yàn)，而且也不會(huì)偏離本發(fā)明的范圍。例如在載體的選擇中，必需考慮宿主，因?yàn)檩d體必需要在其中進(jìn)行復(fù)制。還應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及由載體編碼的任何其他蛋白質(zhì)的表達(dá)如抗生素標(biāo)記。在表達(dá)控制序列的選擇中，還應(yīng)考慮各種因素。這些包括例如序列的相對(duì)長(zhǎng)度、其控制能力以及其與本發(fā)明DAN序列，特別是潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)的相容性。根據(jù)與所選載體的相容性、由本發(fā)明DNA序列編碼之產(chǎn)物的毒性、其分泌特征、其正確折疊蛋白質(zhì)的能力、其發(fā)酵或培養(yǎng)要求、是否容易從中純化由本發(fā)明DNA編碼的產(chǎn)物來(lái)選擇單細(xì)胞宿主。在這些參數(shù)內(nèi)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可選擇各種載體/表達(dá)控制序列/宿主組合，在發(fā)酵或大規(guī)模動(dòng)物培養(yǎng)中表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。
用包括下列的各種常規(guī)方法可以從發(fā)酵物或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離并純化由本發(fā)明DNA序列編碼的多肽液相色譜如用HPLC、FPLC的正相或反相等；親和色譜(如用無(wú)機(jī)配體或單克隆抗體)；大小排阻色譜；固定金屬螯合劑色譜；凝膠電泳等。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，可以選擇最適宜的分離和純化方法。
另外，可以用任何化學(xué)方法生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。例如用由R.B.Merrifield，“Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesis Of aTetrapeptide”，J.Am.Chem.Soc.，83，pp.2149-54(1963)描述的固相合成技術(shù)制備所述多肽，或可通過(guò)在溶液中合成來(lái)制備。肽合成技術(shù)的綜述參見(jiàn)E.Gross & H.J.Meinhofer，4 ThePeptidesAnalysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques Of Peptide AndAmino Acid Analysis，John Wiley & Sons，(1981) andM.Bodanszky，Principles Of Peptide Synthesis Springer-Verlag(1984)。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物和方法包括具有增強(qiáng)的免疫原性的多肽。當(dāng)修飾多肽的天然形式或其片段或?qū)ζ溥M(jìn)行處理以增強(qiáng)其在待試受者中的致免疫特征時(shí)，可得到所述多肽。優(yōu)選的多肽是鏈球菌特異性片段，如選自天然多肽C末端的片段?？墒褂酶鞣N可得到的、而且本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的技術(shù)，而不需進(jìn)行過(guò)分試驗(yàn)，就可極大增強(qiáng)本文公開(kāi)之多肽的免疫原性。例如通過(guò)與二硝基苯酚或阿散酸偶聯(lián)，或通過(guò)熱和/或SDS變性可修飾多肽。特別是，如果所述多肽是化學(xué)合成的小多肽，則期望將其與致免疫載體偶聯(lián)。當(dāng)然，偶聯(lián)必需不能干擾多肽或載體發(fā)揮正常的功能。有關(guān)偶聯(lián)策略的綜述參見(jiàn)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，ed.E.Harlow and D.Lane(1988)。有用的致免疫載體是本領(lǐng)域熟知的。所述載體的實(shí)例是匙孔蘭蛋白(KLH)；白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白，PPD(純化的結(jié)核菌素衍生物)；紅細(xì)胞；破傷風(fēng)類毒素；霍亂類毒素；瓊脂糖珠；活化的碳或膨潤(rùn)土。
為了改變脂化狀態(tài)，修飾本文公開(kāi)之多肽的氨基酸序列也是一種方法，可以用這種方法來(lái)增強(qiáng)其免疫原性和生物化學(xué)特性。例如，多肽或其片段可以與或不與信號(hào)序列一起表達(dá)，所述信號(hào)序列可指導(dǎo)脂部分加成。
根據(jù)本發(fā)明，可用各種方法來(lái)制備多肽衍生物，包括體外操作編碼多肽的DNA，隨后表達(dá)修飾的DNA，化學(xué)合成衍生的DNA序列，或通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法操作表達(dá)的氨基酸序列。
例如，通過(guò)用不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)生產(chǎn)衍生物，保守取代是優(yōu)選的，例如3-甲基組氨酸可取代組氨酸，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸，5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸等。
例如通過(guò)引起電荷、構(gòu)型和其他生物性活性的變化，引起保守性降低的氨基酸取代也會(huì)得到所需的衍生物。所述取代包括例如可用親水殘基取代疏水殘基、用半胱氨酸或脯氨酸取代另一殘基，用具有小側(cè)鏈的殘基取代具有大側(cè)鏈的殘基或用具有凈正電荷的殘基取代帶凈負(fù)電荷的殘基。當(dāng)給定的取代之結(jié)果不能確定性地預(yù)測(cè)時(shí)，用本文公開(kāi)的方法很容易檢測(cè)衍生物以確定是否存在所需的特征。
根據(jù)增加穩(wěn)定性或提供更易于純化和制備之分子的目的，也可制備肽。一種所述技術(shù)是將多肽表達(dá)為含其他肺炎鏈球菌或非肺炎鏈球菌序列的融合蛋白。優(yōu)選含本發(fā)明多肽的融合蛋白是在DNA水平生產(chǎn)的，例如通過(guò)構(gòu)建編碼融合蛋白的核酸分子，用所述分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收融合蛋白。另外，在按照已知方法，進(jìn)行基因表達(dá)后，可生產(chǎn)融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白的一個(gè)實(shí)例是實(shí)施例3(見(jiàn)下文)的FucI/HSP72(C-169)蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是用重組或化學(xué)合成之較大的多聚體分子的一部分。所述多聚體還可包括與氨基酸以外包括類脂和碳水化合物的部分，融合或偶聯(lián)的多肽。
本發(fā)明多肽特別適用于產(chǎn)生抗體以及建立抗疾病的保護(hù)性反應(yīng)。因此，在本發(fā)明的另一方面，我們提供了具有HSP72免疫反應(yīng)性的抗體或其片段。本發(fā)明的抗體還可通過(guò)用HSP72或免疫相關(guān)肽來(lái)誘導(dǎo)，或通過(guò)其與HSP72或免疫相關(guān)肽的反應(yīng)性來(lái)鑒定。應(yīng)理解本發(fā)明的抗體不包括當(dāng)被天然肺炎鏈球菌感染后正常引發(fā)的，而且在引發(fā)的動(dòng)物內(nèi)未能被除去或改變的那些抗體。
本發(fā)明的抗體是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的完整免疫球蛋白分子或其片段，包括本領(lǐng)域已知的如F(v)，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2。還可通過(guò)遺傳工程方法或合成方法來(lái)生產(chǎn)抗體?？贵w或片段可以是動(dòng)物源，特別是哺乳動(dòng)物源的，更具體地說(shuō)是鼠、大鼠、猴子或人源的。它可以是天然抗體或片段，或如果需要，可以是重組抗體或片段。所述抗體或抗體片段可以是多克隆的，或優(yōu)選是單克隆的。它們可以是大量表位特異性的，但優(yōu)選是一種表位特異性的。特別優(yōu)選的是實(shí)施例2(見(jiàn)下文)的單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以使用本發(fā)明的多肽以生產(chǎn)其他單克隆抗體，所述單克隆抗體可根據(jù)其當(dāng)用于免疫初次受試動(dòng)物時(shí)賦予抗肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌或其他鏈球菌相關(guān)細(xì)菌感染的能力來(lái)進(jìn)行篩選。在發(fā)現(xiàn)特定的單克隆抗體賦予了保護(hù)作用后，就可鑒定被該抗體識(shí)別特定的表位。生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。所述方法的綜述參見(jiàn)antibodies，a LaboratoryManual同上文，和D.E.Yelton等，Ann.Rev.of Biochem.，50，pp657-80(1981)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，包括免疫印跡檢測(cè)和ELISA確定與本發(fā)明多肽的免疫反應(yīng)性。
本發(fā)明的抗體還可以是雜種分子，所述雜種分子可以是從不同種(如小鼠和人)的免疫球蛋白或從相同種的免疫球蛋白輕和重鏈部分形成的。它還可以是有多結(jié)合特異性的分子，例如用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的各種技術(shù)制備的雙功能抗體，所述技術(shù)包括雜種雜交瘤的生產(chǎn)；二硫鍵交換；化學(xué)交聯(lián)；在兩個(gè)單克隆抗體之間增加肽鍵；將兩組免疫球蛋白重和輕鏈導(dǎo)入特定的細(xì)胞系等。本發(fā)明的抗體還可以是人單克隆抗體，例如通過(guò)不死的人細(xì)胞系、SCID-hu小鼠或其他能夠生產(chǎn)“人”抗體的非人動(dòng)物或通過(guò)表達(dá)克隆的人免疫球蛋白基因而生產(chǎn)的抗體。
總之，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員按照本發(fā)明的教導(dǎo)，可以用各種方法來(lái)改變本發(fā)明抗體的生物學(xué)特性，所述方法包括增加或降低特定抗體分子的穩(wěn)定性或半衰期、免疫原性、毒性、親和性或產(chǎn)率，或以任何方式使其發(fā)生改變以便更適用于特定的應(yīng)用。
本發(fā)明的多肽、DNA序列和抗體可用于預(yù)防、治療和診斷組合物，所述組合物可用于預(yù)防、治療和診斷疾病。
可以將標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)與本發(fā)明的多肽和抗體一起使用以便將其作為免疫原和疫苗。具體地說(shuō)，用藥物有效量的多肽可注射給任何適宜的宿主以便產(chǎn)生單克隆或多價(jià)抗體或誘導(dǎo)抗疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)。優(yōu)選的，所述多肽選自HSP72(SEQ ID NO5)、HSP70(SEQ ID NO20和SEQ ID NO22)或其片段。
如本文所用的，多肽或抗體的“藥物有效量”指，當(dāng)施用于患者后，可引發(fā)免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)可有效地預(yù)防或降低鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度。
可以按照實(shí)施例10(見(jiàn)下文)中所述的任何方法，或各種其他的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)施用本發(fā)明的多肽或抗體。有關(guān)所述技術(shù)的詳細(xì)討論，參見(jiàn)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ed.E.Harlow and D.Lane(1988)。優(yōu)選的，如果使用多肽，則應(yīng)與可藥用佐劑如完全或不完全弗氏佐劑、RIBI(胞壁二肽)或ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)一起施用。優(yōu)選組合物包括油包水乳液或以氫氧化鋁作為佐劑并經(jīng)肌肉內(nèi)施用。在一定時(shí)間或在一系列的治療中給患者施用疫苗組合物。最有效的施用方式和最佳劑量方案取決于免疫原性水平、用于治療的特定組合物和/或佐劑、預(yù)期感染的嚴(yán)重性和過(guò)程、以前的治療、患者的健康狀況和對(duì)接種的反應(yīng)，以及醫(yī)生的判斷。例如在具免疫能力的患者中，多肽的致免疫性越高，則所需的接種劑量越低，次數(shù)越少。同樣，如果將多肽與佐劑一起施用，則就可減少劑量和必需的治療時(shí)間。
總之，劑量由約0.01-10mg，優(yōu)選0.1-1.0mgHSP72抗原/患者的首次注射(經(jīng)常是與佐劑一起)，然后是一次或可能多次的加強(qiáng)注射組成。優(yōu)選加強(qiáng)注射在開(kāi)始注射后的約1和6個(gè)月進(jìn)行。
本發(fā)明的多肽可以以可藥用鹽的形式使用。能夠與本發(fā)明多肽形成鹽的適宜的酸和堿是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的，包括無(wú)機(jī)和有機(jī)的酸和堿。
為了就共賦予抗肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌引起之疾病的能力、或其降低所述感染嚴(yán)重性的能力而篩選本發(fā)明的多肽和抗體，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以使用許多動(dòng)物模型?？梢允褂萌魏螌?duì)肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染敏感的動(dòng)物。實(shí)施例5的Bal/c小鼠(見(jiàn)下文)對(duì)于主動(dòng)免疫保護(hù)篩選是優(yōu)選的動(dòng)物模型，實(shí)施例5惡性復(fù)合免疫缺陷(severe-combined immunode ficient)小鼠是被動(dòng)篩選的優(yōu)選動(dòng)物模型。因此通過(guò)給這些動(dòng)物模型施用特定的多肽或抗體，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員無(wú)需過(guò)分實(shí)驗(yàn)就可以確定多肽或抗體是否在本文的方法和組合物中是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，我們描述了一種方法，該方法包括以足以預(yù)防或降低(在一段時(shí)間內(nèi))鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染嚴(yán)重程度的方式，用含有藥物有效量的本發(fā)明的任何多肽來(lái)治療患者。此外，用于所述方法的優(yōu)選多肽是HSP70/HSP72或其片斷。
本發(fā)明的多肽、DNA序列和抗體還是診斷方法以及用于檢測(cè)病原體生物之試劑盒的基礎(chǔ)。有多種不同的診斷方法。例如本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌的方法，所述方法包括下步驟(a)從患者體內(nèi)分離生物樣品；(b)將本發(fā)明的多肽或其片段與所述生物樣品一起培養(yǎng)以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的抗體或片段，從而表明是否存在肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌。用于該方法的優(yōu)選抗體包括單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
另外，本發(fā)明還提供了檢測(cè)生物樣品中肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌特異性抗體的方法，所述方法包括步驟(a)從患者體內(nèi)分離生物樣品；
(b)將本發(fā)明的多肽或其片段與所述生物樣品一起培養(yǎng)以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的多肽，從而表明是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌特異性的抗體。在上述檢測(cè)抗體的方法中，HSP72(SEQ IDNO5)、其C-169片段(SEQ ID NO5的殘基439-607)其C-151片段(SEQ ID NO5的殘基457-607)、和肽片段GFDAERDAAQAALDD(SEQ ID NO5的殘基527-541)和AEGAQATGNAGDDVV(SEQ ID NO5的殘基586-600)是優(yōu)選的多肽和片段。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以認(rèn)識(shí)到這些診斷實(shí)驗(yàn)可采用多種形式，包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫檢測(cè)或膠乳凝集實(shí)驗(yàn)。
可將診斷試劑包括在試劑盒中，試劑盒可包括使用說(shuō)明和其他適宜試劑，優(yōu)選當(dāng)結(jié)合多肽或抗體時(shí)，用于檢測(cè)的工具。例如可將多肽或抗體用一種檢測(cè)工具來(lái)標(biāo)記，這樣可以檢測(cè)與抗體結(jié)合的多肽，或檢測(cè)與肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌結(jié)合的抗體。檢測(cè)工具可以是熒光標(biāo)記試劑如異氰酸熒光素(FIC)、異硫氰酸熒光素(FITC)等，酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶等，產(chǎn)生γ射線的放射性元素如125I或51Cr，或與檢測(cè)溶液中的電子遭遇后，發(fā)出產(chǎn)生γ射線的正電子的放射性元素如11C、15O或13N。也可用其他方法，如經(jīng)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物檢測(cè)結(jié)合情況。檢測(cè)工具結(jié)合是本領(lǐng)域熟知的。例如通過(guò)將含放射性同位素的氨基酸摻入到培養(yǎng)基中，可代謝標(biāo)記由雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體，或可將多肽通過(guò)激活的功能基團(tuán)而與檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合或偶聯(lián)。
可用本發(fā)明的DNA序列設(shè)計(jì)用于檢測(cè)生物樣品中是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌的DNA探針。本發(fā)明以探針為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法包含下列步驟(a)從患者體內(nèi)分離生物樣品；(b)將具有本發(fā)明DNA序列的DNA探針與所述生物樣品一起溫育以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的DNA，以表明存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌。
還可將本發(fā)明的DNA探針用于檢測(cè)樣品中環(huán)化的核酸，例如可以用聚合酶鏈反應(yīng)，可作為診斷肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染的方法。所述探針可以用常規(guī)技術(shù)合成，并固定在固相上，或可用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。用于該應(yīng)用的優(yōu)選DNA探針是一種寡聚物，該寡聚物與HSP72(SEQ IDNO4，核苷酸682-2502)的至少約6個(gè)連續(xù)的核苷酸互補(bǔ)。
例如利用在抗原柱上免疫親和純化抗體的方法，本發(fā)明的多肽還可用于純化抗蛋白質(zhì)上表位的抗體。
按照本發(fā)明，例如利用在抗原柱上免疫親和純化抗體的方法，還可將本發(fā)明的抗體或抗體片段用于制備基本上純的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例為了更好地理解本發(fā)明，列舉了下列實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明的目的，而不以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實(shí)施例1描述了HSP72，即本發(fā)明免疫反應(yīng)性熱休克蛋白的鑒定。實(shí)施例2描述了抗HSP72表位之單克隆抗體的分離。實(shí)施例3描述了本發(fā)明HSP72和HSP72片段的制備。實(shí)施例4描述了本發(fā)明抗HSP72及免疫相關(guān)蛋白之單克隆抗體的抗原特異性和免疫反應(yīng)性的鑒定。實(shí)施例5描述了得到基本上純的HSP72的方法，HSP72或抗HSP72抗體以抵御肺炎鏈球菌感染的用途。實(shí)施例6描述了本發(fā)明HSP72的重組C-151片段的制備方法。實(shí)施例7描述了用本發(fā)明的重組HSP72或HSP72片段接種后，產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)。實(shí)施例8描述了HSP72上的線性B細(xì)胞表位的定位。實(shí)施例9描述了肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌的hsp70基因和HSP70蛋白質(zhì)。實(shí)施例10描述了HSP72抗原在人疫苗中的用途。實(shí)施例1鑒定免疫反應(yīng)性肺炎鏈球菌熱休克蛋白A方法除非特別說(shuō)明，在本文的全部實(shí)施例中均使用下列方法。
1細(xì)菌肺炎鏈球菌菌株是由Laboratorire de la Sante Publique duQuebéc，Sainte-anne de Bellevue。肺炎鏈球菌菌株包括4型菌株53和6型菌株64。如果未特別說(shuō)明，則使用肺炎鏈球菌6型菌株64。在巧克力瓊脂板上，使細(xì)菌菌株在37℃，5％二氧化碳中生長(zhǎng)過(guò)夜。
2抗原制備制備各種肺炎鏈球菌抗原以用于免疫和免疫實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在56℃預(yù)熱的水浴中將細(xì)菌懸浮液保溫20分鐘來(lái)得到熱殺死的全細(xì)胞抗原。按下述方法，從肺炎鏈球菌中提取可溶于洗滌劑的蛋白質(zhì)。將熱殺死的細(xì)菌懸浮在10mM Hepes緩沖液(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(Boehringer MannheimGmbH，Germany)(pH7.4)中，以20,000Kz/秒聲處理4次30秒。以1,700g離心20分鐘，除去完整細(xì)胞和大碎片。收集上清液并以100,000g離心60分鐘。將沉淀重懸在1ml Hepes緩沖液中，加入1ml 2％N-月桂酰肌氨酸(Sigma Chemical Co.，St.，Louis，MO)。在室溫將混合物保溫30分鐘，然后以100,000g離心60分鐘來(lái)收集溶于洗滌劑的餾分。
3熱休克處理將肺炎鏈球菌(4型，菌株53和6型，菌株64)重懸在不含甲硫氨酸的Eagle’s基本培養(yǎng)基(ICN Biomedicals Inc.，Costa Mesa，CA)中，37℃用補(bǔ)充1％ BIO-X(Quelab Laboratories，Montreal，Canada)15分鐘，然后分成等體積的餾分。在37℃或45℃，將樣品保溫5分鐘，然后用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸(ICN)在37℃標(biāo)記10、30或60分鐘。收集細(xì)菌，然后按照上述，用Tris-HCl溶解緩沖液或SDS-PAGE樣品緩沖液制備細(xì)胞提取物。
4免疫接種小鼠用肺炎鏈球菌抗原免疫接種雌性Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories，St-Constant，Quebéc，Canada)。通過(guò)皮下注射107熱殺死的細(xì)菌或20μg溶于洗滌劑的吸附與氫氧化鋁佐劑(Alhydrogel；CedarlaneLaboratories Ltd.，Horny，Ontario，Canada)的肺炎球菌蛋白，以2周的間隔從免疫接種的小鼠中得到肺炎鏈球菌6型菌株64的免疫血清。在免疫接種前和第一次和第二次免疫接種后7天收集血液樣品。
5SDS-PGAE和免疫檢測(cè)通過(guò)將細(xì)菌懸浮液在Tris-HCl溶解緩沖液(50mM Tris，150mMNaCl，0.1％十二烷基磺酸鈉，0.5％ Na deoxycholate，2％ Triton X-100,100μg/ml苯基甲基磺酰基氟化物和2μg/ml抑蛋白酶肽)(pH8.0)中，在冰上保溫30分鐘，將細(xì)胞提取物用于SDS-PGAE、Western印跡分析和放射性免疫沉淀檢測(cè)。通過(guò)離心清楚溶解的細(xì)胞，然后將上清液分成等份，然后在-70℃冷凍保藏。
按照Laemmli[Nature，227，pp.680-685(1970)]的方法，用Mini Protean系統(tǒng)(BioRad Laboratories Ltd.，Mississauga，Canada)，在10％聚丙烯酰胺凝膠上完成SDS-PGAE。通過(guò)在含2％2-巰基乙醇的樣品緩沖液中煮沸5分鐘而使樣品變性。用PhastGel Blue(Pharmacia Biotech Inc.，Baied’Urfé，Canada)染色聚丙烯酰胺凝膠來(lái)分辨蛋白質(zhì)。通過(guò)熒光照相肉眼觀察放射性標(biāo)記的產(chǎn)物。用激光光密度測(cè)量?jī)x掃描熒光圖。
按照Towbin等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，pp.4350-4354(1979)]的方法完成免疫印跡方法。用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白和鄰聯(lián)茴香胺顏色底物，通過(guò)間接抗體免疫實(shí)驗(yàn)來(lái)完成抗原與抗體反應(yīng)的檢測(cè)。
按照J(rèn).A.Wiley等[J.Virol.66，pp.5744-5751(1992)]的描述來(lái)完成放射性免疫沉淀試驗(yàn)。總之，將血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液加到含等量[35S]甲硫氨酸的放射性標(biāo)記的樣品中。4℃，將混合物保溫90分鐘，同時(shí)恒定攪拌。然后4℃，用牛血清白蛋白處理的蛋白質(zhì)A Sepharose(Pharmacia)將免疫復(fù)合物沉淀1小時(shí)。將珠沉淀，用pH8.0的Tris緩沖鹽洗滌3次，然后通過(guò)在樣品緩沖液中煮沸來(lái)離解抗原復(fù)合物。在SDS-PAGE上，通過(guò)電泳分析抗原。固定凝膠，用Amplify(Amersham CanadaLimited，Oakville，Ontario，Canada)增強(qiáng)熒光顯影，干燥然后暴露于X射線膠片。
B肺炎鏈球菌中熱休克反應(yīng)的表征在從37℃到45℃前后，我們通過(guò)蛋白質(zhì)合成的方式研究了肺炎鏈球菌的熱休克反應(yīng)。圖1表示當(dāng)肺炎鏈球菌6型菌株64(A組)和4型53菌株(B組)在37℃生長(zhǎng)，37℃(道1、3、5、7和9)或在45℃(道2、4、6、8和10)保溫5分鐘，然后用[35S]甲硫氨酸標(biāo)記10分鐘(道1、2和7、8)、30分鐘(道3、4和9、10)或60分鐘(道5、6)時(shí)的結(jié)果。
從SDS-PAGE得到的熒光圖表明增加溫度后，至少有3種蛋白質(zhì)的合成增加(圖1)。最顯著誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)是約72kDa(HSP72)、而另兩種是約80kDa(HSP80)和62kDa(HSP62)。在標(biāo)記10分鐘后(圖1，道1、2和7、8)，蛋白質(zhì)合成的增加已經(jīng)很明顯，而且當(dāng)標(biāo)記期延長(zhǎng)到30分鐘(圖1，道3、4和9、10)和60分鐘(圖1，道5、6)后，變得更加顯著。溫度增加對(duì)兩種不同肺炎鏈球菌菌株蛋白質(zhì)合成圖的影響相似，合成了分子量相似的HSP(A組的(6型64菌株)與B組(4型53菌株)相比)。
分析掃描蛋白質(zhì)合成圖譜的光密度測(cè)量示蹤可以估算蛋白質(zhì)的相對(duì)量。例如就熱休克的肺炎鏈球菌6型菌株64而言，標(biāo)記10分鐘后，HSP80和HSP62分別產(chǎn)生2.9％和6.8％的標(biāo)記蛋白，而37℃產(chǎn)生的不到0.1％(圖2)。在37℃和45℃檢測(cè)表觀分子量為72kDa的標(biāo)記蛋白(圖2)。但放射性免疫沉淀分析表明，在37℃檢測(cè)不到HSP72(上文；和圖3、4和6)，因此表明圖2的峰9對(duì)應(yīng)于與HSP72共遷移的蛋白質(zhì)組分。假設(shè)在該物質(zhì)的標(biāo)記中沒(méi)有改變，這些結(jié)果表明HSP72的量在熱休克處理后，占總標(biāo)記細(xì)胞蛋白質(zhì)的8.7％。比較光密度測(cè)量示蹤表明對(duì)應(yīng)于峰4、10、13、17、19和21的細(xì)胞蛋白質(zhì)是以與熱休克處理無(wú)關(guān)的相同速率合成的(圖2)。但是，在應(yīng)答熱休克處理過(guò)程中，多種蛋白質(zhì)(峰1、2、3、15、20、22、24和26)的合成有顯著的下降。
C對(duì)肺炎鏈球菌HSP的免疫反應(yīng)為了評(píng)估對(duì)肺炎球菌的抗體反應(yīng)，首先用放射性免疫沉淀檢測(cè)小鼠血清。圖3和4中列出了可被用肺炎鏈球菌免疫之小鼠的血清識(shí)別的標(biāo)記蛋白的所有組成成份。圖3是去垢劑可溶的蛋白質(zhì)制品。圖4是熱殺死的細(xì)菌制品。盡管用大多數(shù)抗血清檢測(cè)了許多帶，但HSP72主要是沉淀產(chǎn)物。通過(guò)檢測(cè)熱休克產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)(圖3，道4、6、8和10；和圖4；道4、6和8)來(lái)說(shuō)明HSP72抗體的特異性。令人驚奇的是，所有免疫的小鼠都識(shí)別HSP72。由于觀察到與異源肺炎鏈球菌HS片2的強(qiáng)反應(yīng)性，因此抗體與HSP72的反應(yīng)性對(duì)于在免疫過(guò)程中所用的菌株來(lái)說(shuō)不是特異性的。應(yīng)注意到，除HSP72外，一種血清沉淀在37℃和45℃標(biāo)記的共遷移產(chǎn)物(圖4，道4)。該72kDa產(chǎn)物可能對(duì)應(yīng)于圖2中峰9的組分，但在免疫印跡中檢測(cè)不到。HSP62是另一免疫靶，是通過(guò)一些而不是所有免疫血清沉淀的(圖3，道6；圖4，道4和6)。沒(méi)有一種試驗(yàn)血清與HSP80有反應(yīng)。當(dāng)從該研究所用的小鼠中取預(yù)血清來(lái)檢測(cè)是否存在與標(biāo)記產(chǎn)物反應(yīng)的抗體時(shí)，沒(méi)有蛋白質(zhì)沉淀。
如圖3和5中所描述的，在用洗滌劑可溶的蛋白質(zhì)或肺炎鏈球菌全細(xì)胞提取物免疫接種后，可以檢測(cè)HSP72抗體。另外，在第二次免疫接種后，觀察到對(duì)HSP72的抗體反應(yīng)顯著增加(圖3，比較4和6，及道8和10)。
用熱殺死的肺炎鏈球菌免疫接種的15只小鼠的免疫印跡圖譜明顯與以前描述的放射性免疫沉淀結(jié)果一致。盡管對(duì)各種蛋白質(zhì)，會(huì)發(fā)生抗體反應(yīng)變化，但在第一次免疫接種后，HSP72主要是8種(53％)陽(yáng)性血清的免疫反應(yīng)抗原(圖5)。在第二次免疫接種后，在試驗(yàn)的15種免疫血清中的13種(87％)檢測(cè)到HSP72抗體。在5種(33％)和7種(47％)血清中，分別檢測(cè)到表觀分子量為53.5和47 kDa另兩種主要抗原(圖5)。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，用重組HSP72抗原確定72 kDa-反應(yīng)帶為肺炎球菌HSP72(見(jiàn)下文實(shí)施例3)。預(yù)免疫血清不能檢測(cè)任何肺炎球菌蛋白質(zhì)。實(shí)施例2分離抗HSP72表位的單克隆抗體A方法1免疫小鼠和融合用肺炎鏈球菌抗原免疫接種雌性Balb/c小鼠(Charles RiverLaboratories)。一組小鼠(融合試驗(yàn)1)通過(guò)腹膜注射107福爾馬林殺死的全細(xì)胞抗原(來(lái)自MTL菌株，懸浮在弗氏完全佐劑中)來(lái)免疫接種，以兩星期的間隔，用相同的抗原，然后加上來(lái)自熱殺死細(xì)菌的聲處理物(sonicate)(在弗氏完全佐劑中的)加強(qiáng)接種。第二組小鼠(融合試驗(yàn)2)以三個(gè)星期的間隔，用75μg來(lái)自菌株64(6型)的洗滌劑可溶的肺炎球菌抗原(在25μg Quil A佐劑(Cedarlane Laboratories Ltd.，Hornby，Ontario，Canada)中)免疫接種。融合前3天，所有小鼠腹膜內(nèi)注射只懸浮在PBS中的不同抗原。按照J(rèn).Hamel等[J.Med.Microbiol.，23，pp.163-170(1987)]所述，通過(guò)將脾細(xì)胞與非分泌SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)生產(chǎn)雜交瘤。通過(guò)系列限制稀釋克隆特異性的雜交瘤，然后擴(kuò)增并冷凍在液氮中。按照Martin等[Eur.J.Immunol.，18，pp.601-606(1988)]所述，用從Southern BiotechnologyAssociates Inc.(Birmingham，AL)得到的試劑確定MAbs的型、亞型和輕鏈。
2亞細(xì)胞分級(jí)分離按照Pearce[Mol.Microbiol.，9，pp.1037-1050(1993)]描述的技術(shù)，將肺炎球菌分離成亞細(xì)胞餾份?？偠灾?7℃使肺炎鏈球菌菌株64(6型)在用0.5％(w/v)酵母提取物補(bǔ)充的Todd Hewitt培養(yǎng)液中生長(zhǎng)6小時(shí)，然后離心分離。將細(xì)胞沉淀重懸在25mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，1mM苯甲基磺?；?PMSF)中，然后用15秒脈沖聲處理4分鐘。離心除去細(xì)胞碎片。以98,000離心4小時(shí)來(lái)分離細(xì)菌膜和胞質(zhì)重復(fù)。將胞質(zhì)(上清液)和膜(沉淀)餾份調(diào)到1mg蛋白質(zhì)/ml，然后進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析。
B鑒定并表征肺炎鏈球菌HSP72的MAbs按照D.Martin等(同上文)描述的方法，用來(lái)自肺炎鏈球菌菌株65(4型)的全細(xì)胞，通過(guò)點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)初步篩選雜交瘤的培養(yǎng)上清液。然后再通過(guò)免疫印跡檢測(cè)陽(yáng)性雜交瘤以便鑒定分泌與HSP72反應(yīng)之MAbs的雜交瘤。在免疫印跡中，26個(gè)雜交有抗肺炎鏈球菌反應(yīng)性，其中4個(gè)識(shí)別蛋白質(zhì)帶上的表位，所述蛋白質(zhì)的表觀分子量為72kDa。將這4個(gè)雜交瘤命名為F1-Pn3.1(來(lái)自融合實(shí)驗(yàn)1)和F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4(來(lái)自融合實(shí)驗(yàn)2)。同種型分析表明雜交瘤F1-Pn3.1(來(lái)自融合實(shí)驗(yàn)1)分泌IgG-2ak免疫球蛋白，而雜交瘤F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4(來(lái)自融合實(shí)驗(yàn)2)均分泌IgG1k。由于沒(méi)有抗[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的肺炎鏈球菌蛋白(從在37℃的培養(yǎng)物得到的)的放射性免疫沉淀活性，從而清楚地說(shuō)明了HSP72之MAbs的特異性，而72kDa蛋白與45℃保溫的熱休克衍生的溶解產(chǎn)物發(fā)生免疫沉淀。圖6(道5和6)表明了Mab F1-Pn3.1的結(jié)果。用Mabs F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4得到了相同的結(jié)果。
將用MAbs探測(cè)的來(lái)自非熱休克和熱休克肺炎鏈球菌細(xì)胞的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的溶解產(chǎn)物在SDS-PAGE凝膠上電泳，然后進(jìn)行Western印跡分析。所得的免疫印跡表明在兩種樣品中均存在HSP72抗原。圖7，A組表明了Mab F1-Pn3.1的結(jié)果。用Mabs F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4得到了相同的結(jié)果。因此，熱休克應(yīng)激不會(huì)顯著增加抗HSP72單克隆抗體的反應(yīng)性。但免疫印跡熒光圖清楚地表明發(fā)生了熱休克反應(yīng)(圖7，B組)。這些試驗(yàn)表明為應(yīng)答熱休克，肺炎鏈球菌HSP72的合成速率有所提高，但在熱休克后，HSP72的絕對(duì)量沒(méi)有增加。
CHSP72的細(xì)胞定位為了研究HSP72的細(xì)胞位置，通過(guò)差速離心來(lái)分離肺炎鏈球菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，從而得到可溶餾份和富集膜蛋白質(zhì)的顆粒餾份(同上文)。將肺炎鏈球菌的含15μg蛋白質(zhì)的膜餾份(道1)和胞質(zhì)餾份(道2)在SDS-PAGE上電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，用Mab F1-Pn3.1檢測(cè)。在所得的Western印跡中，在兩種餾份中均發(fā)現(xiàn)了HSP72，大部分蛋白質(zhì)與胞質(zhì)餾份有關(guān)(圖8)。實(shí)施例3編碼HSP72抗原之基因的分子克隆、測(cè)序和表達(dá)A方法1菌株和質(zhì)粒在表1中列處理在該研究中所用的菌株和質(zhì)粒。
表1細(xì)菌菌株、噬菌體和質(zhì)粒菌株、噬菌體、質(zhì)粒 相關(guān)特征 文獻(xiàn)或來(lái)源大腸桿菌菌株JM109 Δ(lac-proAB)[F’traD BRLproAB lacIqZΔM15]Y1090 rk-mk-lon sup[pMC9] AmershamBL21(DE3) lacUV5-T7 RNA聚合 Studier等見(jiàn)下文酶噬菌體λgt11 cI857 S100克隆載體 AmershamλJBD7 LacZ-HSP72融合片 本研究段；λgt11中的2.3kbEcoRI片段λJBD17 FucI-HSP72嵌合體；本研究2.4kb EcoRI片段和λgt11中的2.3kbEcoRI片段質(zhì)粒pWSK29 Ampr；低拷貝克隆載Wang等(見(jiàn)下文)體pWKS30 與pWSK29相同，但Wang等(見(jiàn)下文)有相反的多克隆位點(diǎn)pJBD171 與λJBD17相同，但在 本研究pWSK29中pJBD177 在pWKS30中的2.8 本研究
kb XhoI-EcoRI 片段，不含重組HSP72pJBD179FucI-HSP72融合體；本研究pWSK29中的2.4kbEcoRI片段和0.8kbEcoRI-EcoRV片段pT7-5 Ampr；T7啟動(dòng)子φ10 Tabor等(見(jiàn)下文)pT7-6 與pT7-5相同，但有Tabor等(見(jiàn)下文)相反的多克隆位點(diǎn)pJBDf51與pJBD179相同，但 本研究在T7-5中pJBDf62與pJBD179相同，但 本研究在T7-6中pDELTA1Ampr；Tn100 BRLpJBDΔ1與pJBD179相同，但 本研究在pDELTA1pJBD291HSP72；在pWSK29 本研究中的3.2 kbHindIII片段pJBDk51 與pJBD291相同，但 本研究在T7-5中pJBDΔ4 與pJBD291相同，但 本研究在pDELTA1中37℃在L肉湯或L瓊脂上使大腸桿菌菌株生長(zhǎng)。需要時(shí)，以50μg/ml的濃度將氨芐青霉素加到培養(yǎng)基中。用Magic/Wizard Mini-Prep試劑盒(Promega，F(xiàn)isher Scientific，Ottawa，Canada)分離質(zhì)粒。
2常規(guī)重組DNA技術(shù)從Boehringer Mannheim Canada，Laval，Quebec或PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden購(gòu)買限制核酸內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。按照J(rèn).Sambrook等[分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989]所述完成DNA限制核酸內(nèi)切酶消化和連接。用來(lái)自Boehringer Mannheim的TAE緩沖液(0.04 M Tris乙酸；0.002 MEDTA)，完成DNA片段瓊脂糖凝膠電泳。用Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories Ltd.，Mississauga，Ontario)，從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段。按照制造商提供的方法，用Gene Pulser(Bio-Rad)通過(guò)電穿孔完成轉(zhuǎn)化。
3構(gòu)建和篩選基因組文庫(kù)按照制造商提供的方法，用噬菌體表達(dá)載體λgt11(λgt11克隆系統(tǒng)，Amersham)制備肺炎鏈球菌的基因組DNA文庫(kù)。按照J(rèn).C.Paton等[Infect.Immun.，54，pp.50-55(1986)]的方法，制備肺炎鏈球菌6型64菌株的染色體DNA。用EcoRI部分消化肺炎鏈球菌的染色體DNA，從瓊脂糖凝膠上分離并純化4到7 kb的片段。將片段連接到λgt11臂，包裝，然后用所得的噬菌體化合物感染大腸桿菌Y1090。用HSP72特異性單克隆抗體F1-Pn3.1(同上文)免疫篩選表達(dá)重組HSP72抗原的噬菌斑。分離并純化被Mab F1-Pn3.1識(shí)別的表達(dá)肽的噬菌斑。制備液體溶解產(chǎn)物，然后按照制造商的說(shuō)明和常規(guī)DNA純化方法，從Promega LambdaSorb噬菌體吸附劑上純化DNA。
4Southern印跡分析在本實(shí)施例中，用從Boehringer Mannheim得到的非放射性DIG DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒完成Southern印跡分析。通過(guò)瓊脂糖凝膠純化篩選用作探針(見(jiàn)下文)的DNA片段，然后用洋地黃毒苷(DIG)-11-dUTP標(biāo)記。用HindIII消化肺炎球菌染色體DNA，然后在0.8％ SDS-PAGE凝膠上電泳分離消化片段，并按照J(rèn).Sambrook等(同上文)轉(zhuǎn)化到帶陽(yáng)性電荷的尼龍膜(Boehringer Mannheim)上。按照制造商的方法，用DIG-標(biāo)記的DNA探針印跡膜。
5DNA測(cè)序和序列分析首先將本實(shí)施例中待測(cè)序的DNA片段克隆到質(zhì)粒pDELTA 1(GIBCOBRL Life Technologies，Burlington，Ontario)中。按照供應(yīng)商同的方法，通過(guò)由Tn1000轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位(Deletion Factory System，GIBCO BRL)介導(dǎo)的體內(nèi)缺失，從兩條鏈產(chǎn)生系列嵌套缺失。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定這些缺失的大小，通過(guò)F.Sanger等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，pp/5463-5467(1977)]雙脫氧核苷酸鏈終止法來(lái)首先適宜的缺失衍生進(jìn)行測(cè)序。為了確定缺失模板之間缺口的序列，，用寡核苷酸合成儀392(ABI，Applied BiosystemsInc.，F(xiàn)oster City，CA)合成寡核苷酸。用Taq DyeDeoxy Terminatou Cycle測(cè)序試劑盒(ABI)，通過(guò)PCR(DNAThermal Cycler 480，Perkin Elmer)完成測(cè)序反應(yīng)，在自動(dòng)DNA測(cè)序儀373A(ABI)上進(jìn)行DNA電泳。
6在大腸桿菌T7 RNA pol/啟動(dòng)子系統(tǒng)中表達(dá)克隆的基因利用大腸桿菌中的噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)，完成本實(shí)施例中克隆基因的高水平表達(dá)。以其中將待表達(dá)基因置于噬菌體T7 RNA聚合酶特異性啟動(dòng)子10控制下的適宜方向，將說(shuō)明重組蛋白質(zhì)的DNA片段連接到質(zhì)粒pT7-5或pT7-6[S.Tabor and C.C.Richardson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，pp.1074-1078(1985)]。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌菌株BL21(DE3)[F.W.Studier andB.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189，pp.113-130(1986)]中，該菌株在其染色體上攜帶了位于可誘導(dǎo)lacUV5啟動(dòng)子下的T7 RNA聚合酶結(jié)構(gòu)基因。在IPTG誘導(dǎo)后，在BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體中誘導(dǎo)的T7 RNA聚合酶特異性地轉(zhuǎn)錄在T7啟動(dòng)子10控制下的基因。用Western印跡或考馬斯蘭染色來(lái)肉眼觀察過(guò)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。
7HSP72的N-末端氨基酸序列分析用Mab F1-Pn-3.1(同上文)和按照L.S.Daniels等[Microb.Pathogen.，1，pp..519-531(1986)]所述制備的肺炎鏈球菌菌株64的細(xì)胞壁提取物樣品作為抗原，通過(guò)免疫沉淀純化肺炎球菌HSP72。用SDS-PAGE分別免疫沉淀物，然后用P.Matsudaira[J.Biol.Chem.，262，pp.10035-10038(1987)]的方法，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。按照標(biāo)準(zhǔn)方法用考馬斯蘭將PVDF染色，切下HSP72帶，然后用自動(dòng)測(cè)序儀(ABI)分析。
B構(gòu)建對(duì)應(yīng)于C-169的含肺炎鏈球菌HSP72基因片段的質(zhì)粒用HSP-特異性MAb F1-Pn-3.1篩選λgt11肺炎鏈球菌基因組DNA文庫(kù)。從檢測(cè)的共1500個(gè)噬菌體中分離并純化17個(gè)免疫反應(yīng)性克隆。為了確定由重組噬菌體表達(dá)之蛋白質(zhì)的特異性，對(duì)重組噬菌體溶解產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析。在由MAb F1-Pn-3.1識(shí)別的17個(gè)陽(yáng)性克隆中，鑒定兩組克隆，將其代表鑒定為λJBD7和λJBD17以作進(jìn)一步表征用。如圖9所示，對(duì)來(lái)自肺炎鏈球菌菌株64(道1)和的全細(xì)胞提取物和來(lái)自λJBD17(道2和3)或λJBD7(道4和5)感染之大腸桿菌(存在(+)或不存在(-)IPTG條件下培養(yǎng)的)的噬菌體溶解產(chǎn)物進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。用HSP72特異性的MAb F1-Pn-3.1檢測(cè)免疫印跡?？寺ˇ薐BD17有兩個(gè)2.4kb和2.3kb的EcoRI-EcoRI插入片段(圖10)，表達(dá)在SDS-PAGE凝膠上，表觀分子量為74kDa的嵌合重組蛋白質(zhì)(圖9，道2和3)?？寺ˇ薐BD7含有2.3kb的EcoRI插入片段并產(chǎn)生一明顯的融合蛋白，該蛋白由LacZ和克隆λJBD17表達(dá)的74kDa嵌合蛋白組成。用SDS-PAGE估算，融合蛋白的表觀分子量為160kDa(圖9，道5)。噬菌體λJBD17編碼之嵌合重組蛋白的表達(dá)不受IPTG的誘導(dǎo)(圖9，道2和3)，而噬菌體λJBD7編碼之重組融合蛋白的表達(dá)依賴于lac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)(圖9，道4和5)。
為了亞克隆HSP72基因，提取克隆λJBD17的肺炎球菌DNA插入片段，純化并連接到低拷貝質(zhì)粒pWSK29[R.F.Wang andS.R.Kushner，Gene，100，pp.195-199(1991)]中，得到質(zhì)粒pJBD171。用限制圖譜(圖10)表征pJBD171的插入片段，完成一系列的亞克隆和免疫印跡以確定編碼有MAb F1-Pn-3.1反應(yīng)性之抗原的基因范圍。發(fā)現(xiàn)表達(dá)74kDa嵌合蛋白質(zhì)區(qū)域位于3.2kb EcoRI-EcoRV片段上，該片段由完整的2.4kb EcoRI-EcoRI片段和2.3kb EcoRI-EcoRI片段的0.8kbEcoRI-EcoRV部分組成。將攜帶3.2kb EcoRI-EcoRV插入片段的質(zhì)粒命名為pJBD179。
C編碼C-169之嵌合基因的表達(dá)和DNA序列分析為了進(jìn)一步確定74kDa嵌合蛋白質(zhì)編碼基因在3.2kb EcoRI-EcoRV片段上的轉(zhuǎn)錄方向，并提高用于免疫研究的74kDa嵌合蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，我們決定在大腸桿菌T7 RNA和T7啟動(dòng)子系統(tǒng)中表達(dá)74kDa嵌合蛋白質(zhì)。將來(lái)自pJBD179的3.2kb EcoRI-EcoRV連接到質(zhì)粒pT7-5和pT7-6中，其中將多克隆位點(diǎn)放在與T7 RNA聚合酶特異性T7啟動(dòng)子10相反的方向。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，按照J(rèn).Sambrook等[同上文]描述的菌落篩選方法鑒定有MAb F1-Pn-3.1反應(yīng)性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。將衍生于pT7-5和pT7-6的所得重組質(zhì)粒分別稱為pJBDf51和pJBDf62。用限制圖譜確定在這些重組質(zhì)粒中的完整3.2kb EcoRI-EcoRV插入片段和其方向。為了過(guò)表達(dá)74kDa嵌合蛋白，分開(kāi)將pJBDf51和pJBDf62轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。在37℃，用IPTG(1mM)將轉(zhuǎn)化體誘導(dǎo)3小時(shí)。收集細(xì)胞，洗滌并重懸在1％ SDS中，然后煮沸10分鐘。然后用溶解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析。如所預(yù)期的，兩個(gè)轉(zhuǎn)化體均生產(chǎn)74kDa嵌合蛋白，這通過(guò)利用Mab F1-Pn3.1的Western印跡很容易檢測(cè)到(圖11)。但是，在IPTG誘導(dǎo)的條件下，只有轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)(pJBDf51)過(guò)表達(dá)74 kDa嵌合蛋白(圖11A和B，道2)，這表明在3.2kb EcoRI-EcoRV片段上，該基因的轉(zhuǎn)錄方向是從EcoRI末端向EcoRV末端(圖10A)。
將3.2kb EcoRI-EcoRV片段克隆到轉(zhuǎn)錄pDELTA1中，得到質(zhì)粒pJBDΔ1。產(chǎn)生一系列的重疊缺失，然后作為DNA測(cè)序模板。完整3.2kbEcoRI-EcoRV插入片段的DNA序列是SEQ ID NO1。發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架(“ORFs”)，在圖10B中標(biāo)明了其方向”O(jiān)RF27”和”FucI-HSP72(C-169)”)。在這兩個(gè)ORF的前面，鑒定了推測(cè)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SEQ ID NO1，核苷酸8-21和760-763)。未檢測(cè)到明顯的-10和-35啟動(dòng)子。ORF27包括核苷酸30-755(SEQ ID NO1)，編碼計(jì)算分子量為27,066道爾頓的242個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列為SEQ ID NO2。我們將該基因稱為orf27，并將其與其它已知序列進(jìn)行比較。未發(fā)現(xiàn)同源基因或蛋白質(zhì)。大ORF(核苷酸771-2912，SEQ IDNO1)是預(yù)期分子量為79,238道爾頓的714個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列為SEQ ID NO3。將該ORF與其它已知序列進(jìn)行比較以確定其與其它氨基酸序列的關(guān)系。該分析表明該編碼蛋白質(zhì)與大腸桿菌巖藻糖異構(gòu)酶(FucI)和多種HSP70基因家族成員(也稱為DnaK基因)有高度的相似性。SEQ ID NO3和大腸桿菌FucI和HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)的排列表明對(duì)應(yīng)于74kDa嵌合蛋白氨基酸1-545(SEQID NO3)的N末端不斷與大腸桿菌FucI高度同源，而對(duì)應(yīng)于氨基酸546-714(SEQ ID NO3)的C末端部分與HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)相似。值得注意的是，在編碼74kDa蛋白質(zhì)之基因的這兩部分的連接處，有一EcoRI限制位點(diǎn)(SEQ ID NO1，在核苷酸2404和2405之間)。其它限制位點(diǎn)位于核苷酸971和971(PstI)、核苷酸1916和1917(PstI)、核苷酸1978和1979(XhoI)以及核苷酸3164和3165(EcoRV)之間。我們從這些資料得出結(jié)論，74kDa蛋白質(zhì)是一種嵌合蛋白，是由兩部分的肺炎鏈球菌染色體DNA編碼的，這兩部分是衍生于FucI同源基因的2.4kb EcoRI-EcoRI片段和衍生于HSP72基因的2.3kb EcoRI-EcoRI片段。
DSouthern印跡分析完成Southern印跡以確定74kDa蛋白質(zhì)是一種嵌合蛋白并試圖克隆完整的肺炎球菌HSP72基因。用HindIII完全消化肺炎鏈球菌染色體DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜(Boehringer Mannheim)上。然后用衍生于2.3kb EcoRI-EcoRI片段的0.8kb EcoRI-EcoRV探針或衍生于2.4kb EcoRI-EcoRI片段的1kb PstI-PstI探針印跡膜。用洋地黃毒苷-dUTP事先標(biāo)記這兩個(gè)探針。這兩個(gè)探針與不同大小的HindIII片段雜交(圖10B和圖C)。0.8kb EcoRI-EcoRV探針識(shí)別3.2kb HindIII片段，1kb PstI-PstI探針與4kbHindIII片段反應(yīng)。該結(jié)果還進(jìn)一步表明可引起74kDa嵌合蛋白質(zhì)表達(dá)的該基因可通過(guò)在框架中融合兩個(gè)EcoRI片段來(lái)產(chǎn)生，這兩個(gè)片段一個(gè)來(lái)自含肺炎鏈球菌FucI同系物之5’部分的片段，另一個(gè)衍生物攜帶肺炎球菌HSP72基因之C-169片段的片段。0.8kb EcoRI-EcoRV探針與單個(gè)3.2kb片段雜交的事實(shí)說(shuō)明在肺炎鏈球菌中只有一個(gè)拷貝的HSP72基因。
E生產(chǎn)重組HSP72通過(guò)將染色體DNA的HindIII消化物集合體(大小為2.8-3.7kb)連接到質(zhì)粒pWSK29/HindIII中來(lái)產(chǎn)生部分肺炎球菌基因組文庫(kù)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109，通過(guò)與0.8kb EcoRI-EcoRV探針雜交來(lái)篩選轉(zhuǎn)化體。將來(lái)自4個(gè)陽(yáng)性雜交克隆的一個(gè)質(zhì)粒命名為pJBD291。用插入片段的限制分析和轉(zhuǎn)化體細(xì)胞溶解產(chǎn)物的Western印跡證明質(zhì)粒pJBD291確實(shí)攜帶了3.2kb HindIII片段，該片段含有表達(dá)重組HSP72蛋白質(zhì)的HSP72基因(圖10B)。由該轉(zhuǎn)化體(pJBD291)表達(dá)的HSP72蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上與天然HSP72蛋白質(zhì)的遷移的位置相同(圖12)。為了測(cè)定完整HSP72的序列并過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)HSP72蛋白質(zhì)，從質(zhì)粒pJBD291分離3.2kb HindIII片段，然后亞克隆到質(zhì)粒pDELTA1和pT7-5中，分別得到pJBDΔ4和pJBDk5。
對(duì)質(zhì)粒pJBDΔ4攜帶的完整3.2kb HindIII DNA片段和質(zhì)粒pJBD177所含2.3kb EcoRI-EcoRI DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定?？傊?，所述核苷酸序列含有4320個(gè)堿基對(duì)并有兩個(gè)ORF(SEQ ID NO4)。將開(kāi)始于核苷酸682并終止于核苷酸2502(SEQ ID NO4)的第一個(gè)ORF鑒定為肺炎球菌HSP72基因，包括核苷酸3265到核苷酸4320(SEQ ID NO4)的第二個(gè)ORF位于HSP72結(jié)構(gòu)基因的764個(gè)堿基對(duì)下游，并鑒定為肺炎球菌DnaJ基因的5’部分。推測(cè)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“AGGA”)位于HSP72結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游9個(gè)堿基對(duì)處，而發(fā)現(xiàn)典型糖體結(jié)合位點(diǎn)(“AGGA”)位于DnaJ結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游66個(gè)堿基對(duì)上游。在這兩個(gè)基因前，沒(méi)有典型的5’調(diào)節(jié)區(qū)。限制位點(diǎn)位于核苷酸1和2(HindIII)、核苷酸1318和1319(EcoRI)、核苷酸1994和1995(EcoRI)、核苷酸3343和3344(HindIII)以及核苷酸4315和4316(EcoRI)之間。在肺炎鏈球菌中，HSP72(DnaK)和(DnaJ)的基因方向與大腸桿菌[Saito，H.andUchida，Mol.Gen.Genet.，164，1-8(1978)]以及其它幾種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[Wetzstein，M.等，J.Bacteriol.174，3300-3310(1992)]的方向相似。肺炎鏈球菌的基因內(nèi)區(qū)相當(dāng)大，在HSP72(DnaK)結(jié)構(gòu)基因的上游沒(méi)有發(fā)現(xiàn)grpE基因的ORF。
預(yù)測(cè)的HSP72蛋白質(zhì)有607個(gè)氨基酸，與用SDS-PAGE估算的72kDa分子量相比較，計(jì)算的分子量為64,755道爾頓。預(yù)測(cè)的HSP72蛋白質(zhì)酸性的，等電點(diǎn)(pI)為4.35。自動(dòng)Edman降解從肺炎鏈球菌菌株64中提取的純化天然HSP72蛋白質(zhì)表明SKIIGIDLGTIN-AVAVLE為該蛋白質(zhì)的19個(gè)氨基酸的N末端。未檢測(cè)到氨基末端的甲硫氨酸，這可能是由已知在許多蛋白質(zhì)中發(fā)生的原位加工造成的。在位置13未鑒定到氨基酸殘基。從天然HSP72蛋白質(zhì)得到的19個(gè)氨基酸的N末端與從重組肺炎鏈球菌HSP72基因(SEQ ID NO5)核苷酸序列得到的19個(gè)氨基酸的N末端序列完全一致，這表明克隆成功。該N末端序列與乳酸球菌的DnaK蛋白質(zhì)完全相同，與大腸桿菌的DnaK有68.4％的一致性。同樣，HSP72的預(yù)測(cè)氨基酸序列排列(SEQ ID NO5)與來(lái)自其它細(xì)菌HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)的序列排列也有高度的同源性(圖13A-13D)。例如，HSP72與大腸桿菌DnaK蛋白質(zhì)有54％的一致性。與革蘭氏陽(yáng)性菌Lactococcus lactis比較得到最高的一致性值，與HSP72有85％的一致性。象革蘭氏陽(yáng)性菌的其它HSP70蛋白質(zhì)一樣，當(dāng)與革蘭氏陰性菌的DnaK蛋白質(zhì)比較時(shí)，HSP72丟失了靠近氨基末端的24個(gè)氨基酸(圖13A-13D)。
盡管HSP72與來(lái)自其它生物的HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)有同源性，但它還具有某些特有的特征。HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)的序列趨異主要在兩個(gè)區(qū)(殘基244到330 510到607，SEQ ID NO5)。更具體地說(shuō)，HSP72不包括肽序列GFDAERDAAQAALDD(殘基527-541，SEQ IDNO5)和AEGAQATGNAGDDVV(殘基586-600，SEQ ID NO5)。HSP72 C末端的高度可變性表明該部分?jǐn)y帶了肺炎鏈球菌特異性的抗原決定基。與該假設(shè)一致，當(dāng)HSP72C-169片段(見(jiàn)下文)的單克隆抗體不與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌反應(yīng)，已知這兩種細(xì)菌均表達(dá)與HSP72相似的DnaK蛋白質(zhì)。
肺炎鏈球菌的截短DnaJ蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)有352個(gè)氨基酸，與L.lactis DnaJ蛋白質(zhì)(72％一致性)和大腸桿菌DnaJ蛋白質(zhì)(51％一致性)的相應(yīng)部分有高度的相似性。預(yù)測(cè)的截短DnaJ蛋白質(zhì)含有高含量的甘氨酸(15％)。在肺炎鏈球菌DnaJ蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)的氨基酸148到212之間鑒定了4個(gè)富集Gly-Cys的重復(fù)片段，每個(gè)重復(fù)片段均具有DnaJ蛋白質(zhì)的Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly基元序列特征[P.A.Silverand J.C.Way，Cell，74，pp.5-6(1993)]。發(fā)現(xiàn)3個(gè)靠近N末端的重復(fù)GGFGG序列(殘基75-79、81-8和90-94)。
F抗重組抗原之MAbs的反應(yīng)性檢測(cè)4個(gè)HSP72特異性MAbs(F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4，同上文)與大腸桿菌表達(dá)之蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，所述大腸桿菌是用含HSP72基因的重組噬菌體和質(zhì)粒感染或轉(zhuǎn)化的。4個(gè)MAbs與克隆λJBD7表達(dá)的lacz-HSP72融合蛋白反應(yīng)，因此將由這些MAbs識(shí)別的表位定位于C末端的169個(gè)殘基。令人驚奇的是，由λJBD17和pJBDΔ1中的肺炎球菌插入片段編碼的蛋白質(zhì)僅被4個(gè)單克隆抗體中的3個(gè)所識(shí)別。這些結(jié)果表明盡管在是用λJBD7和λJBD17感染的大腸桿菌中合成的C-169片段有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但它們有不同的構(gòu)型。F2-Pn3.2與某些重組蛋白質(zhì)沒(méi)有反應(yīng)性表明了這種特定單克隆抗體識(shí)別更復(fù)雜表位的可能性。盡管是復(fù)合物，但F2-Pn3.2在Western免疫印跡上仍是可識(shí)別的。由含重組質(zhì)粒pJBDΔ4的大腸桿菌表達(dá)的完整HSP72rec與所有4中單克隆抗體均有反應(yīng)性。實(shí)施例4 HSP72特異性單克隆抗體的抗原特異性和反應(yīng)性用D.Martin等(同上文)描述的點(diǎn)酶免疫實(shí)驗(yàn)和免疫印跡檢測(cè)單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4與細(xì)菌菌株收集物的反應(yīng)性，所述收集物包含表2中所列的20個(gè)代表16種莢膜血清型(型1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、14、15、19、20和22)的肺炎鏈球菌菌株和17個(gè)非肺炎球菌菌株。為了進(jìn)行點(diǎn)酶免疫實(shí)驗(yàn)，使細(xì)菌在巧克力其中平板上生長(zhǎng)過(guò)夜，然后懸浮在pH7.4的PBS中。將含約109CFU/ml的5μl懸浮液用于硝酸纖維素紙，用含3％牛血清白蛋白的PBS阻斷，然后依次與單克隆抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二級(jí)抗體保溫。通過(guò)在樣品合成儀中將細(xì)菌懸浮液煮沸5分鐘，來(lái)制備用于Western印跡分析的全細(xì)胞提取物。
表2用點(diǎn)酶免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的非肺炎球菌分離物菌株登記號(hào)屬種組或型C-2 化膿鏈球菌 A組C-3 無(wú)乳鏈球菌 B組C-7 糞腸球菌D組C-9 牛鏈球菌D組C-14 變異鏈球菌C-15 唾液鏈球菌C-19 血鏈球菌IC-20 血鏈球菌IC-21 血鏈球菌IC-22 血鏈球菌IIC-23 血鏈球菌IIC-24 血鏈球菌IIC-25 血鏈球菌IIC-27 Gemella morbillorumC-30 金黃色葡萄球菌C-33 芽孢桿菌C-36 大腸桿菌當(dāng)用點(diǎn)酶免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，各個(gè)單克隆抗體與各肺炎鏈球菌菌株和非肺炎球菌分離物反應(yīng)。這些結(jié)果是意想不到的，因?yàn)楸容^研究表明HSP72與已知的細(xì)菌HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)，如來(lái)自大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的那些非常相似。
然后進(jìn)行免疫印跡，進(jìn)一步研究我們的單克隆抗體的免疫反應(yīng)性。如表3所示，各單克隆抗體均有反應(yīng)性。盡管大腸桿菌氨基酸序列與HSP72氨基酸序列(SEQ ID NO5)的一致性百分比為54％，但4個(gè)HSP72特異性單克隆抗體不識(shí)別大腸桿菌HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)。同樣，HSP72特異性單克隆抗體不與C.trachomatisHSP70(DnaK)蛋白質(zhì)反應(yīng)，它與HSP72氨基酸序列有56％的氨基酸一致性。在HSP72和來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)之間觀察到高度的氨基酸序列同源性。但是，沒(méi)有一個(gè)HSP72特異性單克隆抗體與S.aureaus或芽孢桿菌革蘭氏陽(yáng)性菌反應(yīng)，分別與HSP72有74％和76％的氨基酸序列同源性。從這些資料清楚地看出，盡管HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與HSP72相關(guān)，但它們?cè)诿庖邔W(xué)上是不同的。在與至少一種單克隆抗體反應(yīng)的非肺炎球菌分離物中，有化膿鏈球菌、糞腸球菌、變異鏈球菌和血鏈球菌，它們都屬于鏈球菌或鏈球菌相關(guān)的腸球菌屬。到目前為止，在這些鏈球菌或腸球菌中，既未鑒定HSP70蛋白質(zhì)，也未確定基因結(jié)構(gòu)?？傊?，這些觀察結(jié)果表明HSP70(DnaK)蛋白質(zhì)內(nèi)的高可變氨基酸序列或殘基與抗原性有關(guān)。令人感興趣的是，免疫印跡分析表明在肺炎鏈球菌分離物和免疫反應(yīng)非肺炎球菌分離物中，分子量為HSP70(DnaK)的蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的改變。
表3單克隆抗體在WESTERN免疫印跡中與非肺炎球菌分離物的反應(yīng)性細(xì)菌菌株單克隆抗體登記號(hào) 屬/種型F1-F2- F2- F2-Pn3.1 Pn3.2 Pn3.3 Pn3.4C-2 化膿鏈球菌 A組 - + - ±aC-3 無(wú)乳鏈球菌 B組 - - - -C-7 糞腸球菌 D組 - + -C-9 牛鏈球菌 D組 - - - -C-14變異鏈球菌 - + - ±C-15唾液鏈球菌 - - - -C-19血鏈球菌 I + + - -C-20血鏈球菌 I + + - +C-21血鏈球菌 I + + + +C-22血鏈球菌 II+ + + +C-23血鏈球菌 II+ + - -C-24血鏈球菌 II+ + + +C-25血鏈球菌 II+ + + +C-27Gemella- - - -morbillorumC-30金黃色葡萄球 - - - -菌C-33芽孢桿菌 - - - -C-36大腸桿菌 - - - -C-RPChlamydia - - - -trachomatisba±表示與用肺炎鏈球菌抗原觀察到的反應(yīng)性相比，信號(hào)較弱b檢測(cè)C.trachomatis純化的原體(elemenrary body)。實(shí)施例5純化HSP72以及其作為抗致死肺炎鏈球菌感染之免疫原的用途A方法1制備純化的重組HSP72蛋白質(zhì)和重組C-169在大腸桿菌中用噬菌體T7RNA聚合酶/T7啟動(dòng)子系統(tǒng)完成HSP72基因的高水平排他性表達(dá)。以兩個(gè)方向?qū)?.2kb HindIII片段克隆在質(zhì)粒pT7-5內(nèi)的T7啟動(dòng)子前。然后將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。在加入IPTG達(dá)到1mM的終濃度后，通過(guò)在用抗生素補(bǔ)充的肉湯中培養(yǎng)3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)重組HSP72蛋白質(zhì)(HSP72rec)的過(guò)表達(dá)。通過(guò)離心濃縮大腸桿菌高水平表達(dá)的HSP72rec，然后通過(guò)在含0.2mg/ml溶菌酶的50mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA和100mM NaCl溶解緩沖液中進(jìn)行柔和的聲處理來(lái)溶解。以12,000g將細(xì)胞溶解產(chǎn)物離心15分鐘，然后收集上清液。通過(guò)利用固定在在Sepharose 4B珠(Pharmacia)上的單克隆抗體F1-Pn3.1，經(jīng)免疫親和法來(lái)純化HSP72rec。在SDS-PAGE上評(píng)估洗脫液的純度。
在用質(zhì)粒pJBDΔ1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109中，以不溶的包含體形式表達(dá)重組C-169蛋白質(zhì)(C-169rec)。按前述，通過(guò)聲處理破碎，從沉淀的細(xì)菌細(xì)胞中回收蛋白質(zhì)包含體。用含1mg/ml脫氧膽酸鹽的溶解緩沖液洗滌沉淀以除去污染物，然后將蛋白質(zhì)包含體溶解在6M脲中。以100,000g離心蛋白質(zhì)溶液，收集澄清的上清液，然后用磷酸緩沖鹽透析。純化后，通過(guò)Bio-Rad蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)(Bio-RadLaboratories，Mississauga，Ontario，Canada)確定蛋白質(zhì)含量。
2活性免疫保護(hù)研究用吸附到Alhydrogel佐劑上的純化HSP72rec或C-169rec抗原，以2星期的間隔，皮下注射3次，以免疫接種兩組10只雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratories)。試驗(yàn)兩種抗原劑量，約1和5μg。第三組對(duì)照小鼠以相同的方式只用Alhydrogel佐劑免疫接種。在各免疫接種前和第三次注射后5-7天從眶竇收集血樣。然后用約106CFU的3型肺炎鏈球菌菌株WU2攻擊小鼠。將肺炎鏈球菌攻擊接種物放在巧克力瓊脂平板上以確定CFU并確認(rèn)攻擊劑量。以6小時(shí)的間隔，記錄感染后3-4天的致死情況，然后以24小時(shí)的間隔，記錄14天內(nèi)的情況。在14或15天，殺死存活的小鼠，檢測(cè)血樣中是否操作肺炎鏈球菌生物。在實(shí)施例7中描述了應(yīng)答重組HSP72抗原的抗體反應(yīng)。
3被動(dòng)免疫保護(hù)作用研究用約50μg附到Alhydrogel佐劑上的純化C-169rec蛋白質(zhì)皮下多位點(diǎn)免疫接種一只NZW兔(Charles River Laboratories)。以2星期的間隔，用相同的抗原加強(qiáng)接種3次，在最后一次免疫接種后7天和14天收集血樣。集中血清樣品，通過(guò)40％飽和硫酸銨沉淀來(lái)純化抗體。
在用5000或880CFU的3型肺炎鏈球菌菌株WU2靜脈內(nèi)攻擊前1小時(shí)，用0.25ml的純化兔抗體腹膜內(nèi)注射惡性組合的免疫缺陷性SCID小鼠。對(duì)照SCID小鼠只接受無(wú)菌緩沖液或從非免疫兔血清中純化的抗體。將肺炎鏈球菌攻擊接種物放在巧克力瓊脂平板上以確定CFU并確認(rèn)攻擊劑量。有用其對(duì)肺炎鏈球菌感染的高度敏感性，所以選自SCID小鼠。將攻擊后24小時(shí)得到的血樣(各20μl)放在巧克力瓊脂上，然后檢測(cè)是否操作肺炎鏈球菌生物。檢測(cè)的水平是50CFU/ml。以24小時(shí)的間隔，記錄5天的致死情況。
B結(jié)果由于可以得到克隆的編碼完全或部分(C-160)HSP72蛋白質(zhì)的肺炎鏈球菌DNA插入片段，所以也就可以得到用于研究可作為疫之的HSP72蛋白質(zhì)的純化蛋白質(zhì)。HSP72rec和C-169rec蛋白質(zhì)均可以相對(duì)純的狀態(tài)得到，在考馬斯蘭染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)，沒(méi)有污染。
為了評(píng)估可作為疫苗的HSP72，我們首先檢測(cè)了HSP72rec引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力。用全長(zhǎng)HSP72rec(1μg或5μg的劑量)免疫10只小鼠組成的組，然后用4.2×106CFU的肺炎鏈球菌3型菌株WU2攻擊。用1μgHSP72rec的小鼠中的80％在攻擊后存活下來(lái)，用5μg HSP72的小鼠，有50％存活下來(lái)。用Alhydrogel佐劑而不用抗原免疫接種的自然小鼠沒(méi)有一只在攻擊后存活下來(lái)(圖16)。在14或15天從存活小鼠中收集的任何血樣中均未檢測(cè)到肺炎鏈球菌生物。這些觀察結(jié)果表明，HSP72rec引發(fā)了抗3型WU2肺炎球菌的保護(hù)作用，從而說(shuō)明衍生于從6型菌株提取之DNA的HSP72含有能夠引發(fā)保護(hù)作用的表位，所述保護(hù)作用可抵御具有不同莢膜型的異源菌株。
用經(jīng)嵌合fucI-HSP72基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌而表達(dá)的重組蛋白質(zhì)片段，我們進(jìn)一步研究了對(duì)HSP72蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。用純化C-169rec的免疫的小鼠可以抵御致死肺炎球菌的攻擊，因此說(shuō)明引發(fā)保護(hù)作用的某些(如果不是全部的話)表位存在于含有后169個(gè)殘基的HSP72分子的C末端區(qū)域內(nèi)。用全長(zhǎng)C-169rec(1μg或5μg的劑量)免疫10只小鼠組成的組，然后用6×106CFU的肺炎鏈球菌3型菌株WU2攻擊。用1μg C-169rec的小鼠中的60％在攻擊后存活下來(lái)，用5μg C-169rec的小鼠，有70％存活下來(lái)(圖17)。相反，所有自然小鼠均在攻擊后2天死亡。因此，肺炎鏈球菌HSP72的C末端部分(包括DnaK蛋白質(zhì)之間的最大趨異區(qū))是保護(hù)性免疫反應(yīng)的靶。
如在下列表4中所說(shuō)明的，兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)表明用兔抗C-169rec抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移的SCID小鼠可以抵御肺炎鏈球菌WU2的致死性感染。相反，15只對(duì)照小鼠沒(méi)有一只能存活下來(lái)。對(duì)照小鼠接受來(lái)自非免疫兔血清的抗體或只接受無(wú)菌緩沖液。另外，來(lái)自對(duì)照組的所有小鼠在攻擊后24小時(shí)都有陽(yáng)性肺炎鏈球菌血培養(yǎng)物，而只在共10只免疫SCID小鼠中的2只中檢測(cè)到肺炎鏈球菌生物。
表4被動(dòng)免疫研究表明抗C-169rec兔抗體對(duì)試驗(yàn)肺炎鏈球菌感染SCID小鼠的保護(hù)作用試驗(yàn) 注射 攻擊5天后存活肺炎鏈球菌陽(yáng)性的小鼠數(shù) 的試驗(yàn)小鼠數(shù)1 滅菌緩沖液 0/5 5/5抗重組C-160 4/5 2/5對(duì)照抗體 0/5 5/52 滅菌緩沖液 0/5 5/5抗重組C-160 5/5 0/5在試驗(yàn)1和2(表4)中，分別用5000和880 CFU的3型肺炎鏈球菌菌株WU2攻擊小鼠。表4中的結(jié)果表示為與各組中的小鼠總數(shù)相比，攻擊后小鼠的存活數(shù)，或肺炎鏈球菌的存在是否是陽(yáng)性。
以肺炎鏈球菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物為抗原，用Western印跡分析說(shuō)明通過(guò)用重組HSP72或C-169蛋白質(zhì)免疫而引發(fā)的抗體的抗HSP72特異性。所有試驗(yàn)兔和小鼠血清中均檢測(cè)到一個(gè)對(duì)應(yīng)于HSP72的帶。這些血清學(xué)結(jié)果表明有重組蛋白質(zhì)免疫后的保護(hù)作用歸因于產(chǎn)生了與肺炎鏈球菌HSP72反應(yīng)的抗體。實(shí)施例6用于高水平生產(chǎn)HSP72之C-151末端部分的熱可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)A構(gòu)建含肺炎鏈球菌HSP72 C-151末端編碼區(qū)的質(zhì)粒pURV3將編碼肺炎鏈球菌HSP72羧基末端的151個(gè)氨基酸的DNA區(qū)域插入到翻譯載體p629[H.J.George等，Bio/Technology 5，pp.600-603(1987)]的啟動(dòng)子λPL的下游。該載體含有噬菌體λcI857溫度敏感性阻遏基因，已經(jīng)從該基因中缺失了功能PR啟動(dòng)子。將溫度從30-37℃增加到37-42℃而使cI857阻遏物失活，從而在λPL的控制下誘導(dǎo)該基因。通過(guò)溫度增加而在大腸桿菌中誘導(dǎo)該基因的表達(dá)有利于大規(guī)模發(fā)酵，因?yàn)橛矛F(xiàn)代發(fā)酵罐很容易做到。但是，應(yīng)理解大腸桿菌是本文試驗(yàn)中所選的微生物，其他宿主生物，如較也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
肺炎鏈球菌477個(gè)核苷酸的片段(包括HSP72基因中2050-2506之間的的457個(gè)堿基)(SEQ ID NO4)用寡核苷酸引物OCRR26(5’-GGCAGATCTATGAAGGCCAAAGACCTTGGAAC)和OCRR27(5’-CGCGGATCCTTACTTTTCCGTAAACTCTCCGT)，從肺炎鏈球菌6型菌株64的基因組DNA經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。用Jayarao等的方法[J.Clin.Microbiol.，29，pp.2774-2778(1991)]從肺炎鏈球菌指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞的90ml培養(yǎng)物制備染色體DNA。用DNA Thermal Cycler，PerkinElmer，San Jose，CA進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)。在OCRR26中，一個(gè)ATG起始密碼子存在于框架中C-151氨基末端編碼區(qū)的上游。引物OCRR26和OCRR27分別含有一BglII(AGATCT)和BamHI(GGATCC)識(shí)別位點(diǎn)以有利于將PCR產(chǎn)物克隆到p629的去磷酸限制位點(diǎn)BglII和BamHI。用酚冷凍法[S.A.Benson，Biotechniques 2，pp.67-68(1984)]從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，然后用限制酶BglII和BamHI消化。然后將471個(gè)堿基對(duì)的BglII-BamHI片段連接到p629的去磷酸限制位點(diǎn)BglII和BamHI中。在圖18中列處理所得質(zhì)粒pURV3的部分圖譜。用Simanis的方法[Hanahan，D.InD.M.Glover編，DNA Cloning，pp.109-135，(1985)]，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到從Stratagene，La Jolla，CA得到的大腸桿菌菌株XLI BlueMRF’(Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]c。用與C-169rec反應(yīng)的單克隆抗體F1-Pn3.1，通過(guò)菌落免疫印跡[J.Sambrook等，同上文]來(lái)篩選在37℃生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體。從篩選的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒DNA，然后用AppliedBiosystems Inc.(ABI)的Taq Dye Deoxy terminator Cycle測(cè)序試劑盒通過(guò)PCR測(cè)定DNA插入片段的序列，然后在自動(dòng)DNA測(cè)序儀373A(ABI)上進(jìn)行DNA電泳。插入片段的核苷酸序列與HSP72基因的C-151編碼的核苷酸序列完全匹配。(參見(jiàn)SEQ ID NO24和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列SEQ IDNO26)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原養(yǎng)型大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27325)中以生產(chǎn)C-151rec。
BC-151rec的表達(dá)和抗原制備在含有質(zhì)粒pURV3的大腸桿菌菌株W3110中，用在其氨基末端的甲硫氨酸殘基合成重組C-151rec。30℃使大腸桿菌細(xì)胞在含有100μg氨芐青霉素/ml的LB肉湯中生長(zhǎng)，直到A600達(dá)到0.6。然后將細(xì)胞在40℃培養(yǎng)18小時(shí)以誘導(dǎo)C-151rec蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。用下列方法制備半純化的C-151rec蛋白質(zhì)。離心收集細(xì)菌細(xì)胞，然后洗滌所得的沉淀并重懸在磷酸緩沖的鹽中。加入溶菌酶，在通過(guò)脈沖聲處理破碎前，將細(xì)胞在冰上保溫15分鐘。離心分離細(xì)胞溶解產(chǎn)物，收集上清液，然后用Amicon’s超濾裝置(攪拌的細(xì)胞系列，Amicon Canada Ltd.Oakville，Ontario)分離?；厥詹荒苡蒠M30膜保留的超濾物，用SDS-PAGE分析并用考馬斯蘭R-250染色。通過(guò)將C-151rec蛋白質(zhì)的染色強(qiáng)度與用確定濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑所得到的強(qiáng)度進(jìn)行比較來(lái)估算蛋白質(zhì)濃度。
C抗C-151rec單克隆抗體的反應(yīng)性用按上述制備的YM3-超濾物，通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)根據(jù)其與肺炎鏈球菌HSP72蛋白質(zhì)的反應(yīng)性而篩選的一組10個(gè)單克隆抗體與C-151rec的反應(yīng)性。單克隆抗體包括對(duì)HSP72rec蛋白質(zhì)產(chǎn)生的6個(gè)單克隆抗體(F3-Pn3.5到F3-Pn3.10)和單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、F2-Pn3.4。與C-169rec有反應(yīng)的3個(gè)單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4也識(shí)別C-151rec片段。所有其他的單克隆抗體只與HSP72rec反應(yīng)，因此表明它們可以抗HSP72蛋白質(zhì)氨基末端區(qū)域中存在的表位。實(shí)施例7Balb/c小鼠和獼猴對(duì)重組HSP72抗原的抗體反應(yīng)A方法1動(dòng)物的免疫接種按照實(shí)施例5所述，用重組HSP72或重組C-169皮下免疫接種10只雌性Balb/c小鼠的組。微粒評(píng)估對(duì)重組C-151的抗體反應(yīng)，用吸附到Alhydrogel佐劑上的0.5μg重組C-151，以兩星期的間隔，腹膜內(nèi)注射3次來(lái)免疫接種6只小鼠。在各免疫接種前和在第3次免疫接種后4到7天，收集的血樣中的血清，然后通過(guò)用肺炎鏈球菌細(xì)胞壁提取物包被的平板，通過(guò)ELISA檢測(cè)所述血清與肺炎鏈球菌的抗體反應(yīng)。
在1、22和77天，用含有吸附到Alhydrogel佐劑上的150μg純化重組HSP72或重組C-169的0.5ml肌肉內(nèi)注射來(lái)免疫接種雌性獼猴。在各免疫接種前后收集血樣，然后通過(guò)Western印跡分析來(lái)檢測(cè)所述血清與肺炎鏈球菌HSP72抗原的抗體反應(yīng)。
通過(guò)Western印跡分析來(lái)確定肺炎鏈球菌HSP72的抗體與肺炎鏈球菌細(xì)胞提取物和純化重組抗原的特異性。
B結(jié)果在前述實(shí)施例5中描述的結(jié)果清楚地表明在用重組HSP72抗原免疫接種后引發(fā)了抗體反應(yīng)的保護(hù)性。在此，我們監(jiān)測(cè)了在免疫過(guò)程中小鼠(圖19、20和21)以及猴(圖22)中，血清抗體反應(yīng)的出現(xiàn)。兩個(gè)種對(duì)作為免疫原的全長(zhǎng)和截短的重組HSP72蛋白質(zhì)都有強(qiáng)烈的反應(yīng)，在第三次注射后，平均滴度為1∶64000。各血清的詳細(xì)分析表明在產(chǎn)生與肺炎鏈球菌HSP72有反應(yīng)的抗體的過(guò)程中，各個(gè)動(dòng)物對(duì)免疫接種均有應(yīng)答。
在用重組C-169免疫的小鼠中，試驗(yàn)的兩種劑量，即1和5μg有相似的效果，同時(shí)有相似的抗體滴度誘導(dǎo)作用(圖20)。在用重組C-169第二次注射后，觀察到強(qiáng)的加強(qiáng)反應(yīng)，而在第三次注射后，抗體滴度沒(méi)有提高。與此相反，我們觀察到對(duì)重組HSP72的免疫反應(yīng)是劑量依賴性的。在用重組HSP72或C-151進(jìn)行第二次和第三次注射后(圖19和21)，觀察到特異性抗體滴度的增加。
猴免疫反應(yīng)的研究清楚地表明重組HSP72抗原的免疫原性不限于嚙齒類如兔和小鼠。用兩種抗原第二次注射后的激素反應(yīng)的特征在于HSP72特異性抗滴度有顯著增加，而且可持續(xù)數(shù)周，其抗體滴度都不會(huì)有顯著的降低(圖22)。另外，在用重組抗原一次注射后，即可監(jiān)測(cè)到各猴血清中的特異性血清抗體。實(shí)施例8HSP72應(yīng)激蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位圖譜在實(shí)施例3中，表明HSP72蛋白質(zhì)序列的顯著改變主要是位于對(duì)應(yīng)于肺炎鏈球菌HSP72蛋白質(zhì)的氨基酸殘基244-330和510-607這兩個(gè)區(qū)內(nèi)。這些可變區(qū)可含有引起實(shí)施例4中所述抗原不均一性的B細(xì)胞表位。為了研究這種可能性，對(duì)經(jīng)過(guò)選擇基本上覆蓋了這些區(qū)域的14種肽來(lái)檢測(cè)多克隆和單克隆抗體與肺炎鏈球菌HSP72的反應(yīng)性。
A方法緩沖14到30個(gè)氨基酸殘基的14種肽。在表5中列出了肽序列和其在蛋白質(zhì)中的位置。用自動(dòng)肽合成儀，由Biochem ImmunosystemInc.(Montreal，Canada)緩沖肽CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880和CS882。由Service deSequence de Peptides de l’Est du Quebec Centre de recherche duCHUL(Sainet-Foy，Canada)在作為多抗原肽(MAP)的分支賴氨酸核心上緩沖肽MAP1、MAP2、MAP3和MAP4。用反相高壓液相色譜純化肽。將肽溶劑在蒸餾水中，而將肽CS874和CS876溶劑在小體積的6M鹽酸胍或二甲亞砜中，然后用蒸餾水調(diào)到1mg/ml。
用包被到Immunolon 4微滴定板(DynatechLaboratories，Inc.，Chantilly，VA)上的緩沖肽完成肽ELISA。為了確定單克隆抗體與肽的反應(yīng)性，確定液相肽一種單克隆抗體與固體HSP72結(jié)合的能力。為了進(jìn)行抑制試驗(yàn)，用肺炎鏈球菌細(xì)胞壁提取物包被微滴定板。4℃，將含HSP72-特異性的單克隆抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液與不同濃度的肽保溫過(guò)夜。按照上述，用ELISA檢測(cè)處理的肽和對(duì)照上清液。
免疫血清來(lái)自用重組HSP72抗原免疫了三次的動(dòng)物。按照實(shí)施例5中的免疫方法，用37.5μg的純化重組HSP72免疫接種一只兔子。鼠血清池來(lái)自疏水腫瘤用重組HSP72免疫的3只Balb/c小鼠，猴血清池來(lái)自用重組HSP72或重組C-169免疫的兩只動(dòng)物。
表5對(duì)應(yīng)于肺炎鏈球菌HSP72之氨基酸殘基的合成肽的序列和位置

>
B線性B細(xì)胞表位的鑒定和定位圖23中所列的結(jié)果表明用位于氨基酸殘基457-607內(nèi)的肽來(lái)觀察大部分的免疫反應(yīng)，所述肽對(duì)應(yīng)于HSP72的C-151。來(lái)自用重組HSP72或重組C-169免疫之動(dòng)物的兔、小鼠和猴血清抗體與肽MAP2和肽MAP4均可反應(yīng)。令人驚奇的是，肽MAP2和MAP4的序列跨高可變的羧基末端區(qū)，含有序列GFAERDAAQAALDD(殘基527到541)和AEGAQATGNAGDDVV(殘基586到600)，這兩個(gè)序列是肺炎鏈球菌HSP72特有的，這是以與數(shù)據(jù)庫(kù)中的HSP70蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較而得出的。因此我們的數(shù)據(jù)表明這兩種肽序列均含有線性B細(xì)胞表位。另外，只有肽MAP4也可被單克隆抗體F1-Pn3.1所識(shí)別。通過(guò)液相抑制試驗(yàn)確定所述反應(yīng)性，其中10μg/ml的MAP4會(huì)完全抑制F1-Pn3.1與HSP72的結(jié)合。來(lái)自用全長(zhǎng)HSP72重組蛋白質(zhì)免疫之動(dòng)物的多克隆血清也識(shí)別位于CS875、MAP1和MAP3上的B細(xì)胞表位。在有這些數(shù)據(jù)表明HSP72的高可變C-151末端片段刺激B細(xì)胞反應(yīng)，并可能構(gòu)成HSP72蛋白質(zhì)的免疫優(yōu)勢(shì)部分。單克隆抗體F2-Pn3.3和F2-Pn3.4與合成肽沒(méi)有反應(yīng)性表明它們與HSP72C末端區(qū)上的構(gòu)型決定基反應(yīng)。在C-151區(qū)中保護(hù)性表位的存在在實(shí)施例5中得到顯著地說(shuō)明，其中用純化重組C-169免疫的小鼠可抵御肺炎鏈球菌強(qiáng)菌株的致死感染，因此說(shuō)明肺炎鏈球菌HSP72的羧基末端片段C-169或C-151或甚至其更小的片段對(duì)應(yīng)疫苗的發(fā)展是非常有用的。
氨基酸殘基244-330內(nèi)的可變區(qū)還構(gòu)成了一個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域。用高免疫血清鑒定在重疊肽CS877(氨基酸257-271)和CS878(氨基酸268-281)、肽CS880(氨基酸286-299)和肽CS882(氨基酸315-333)上的線性表位。實(shí)施例9來(lái)自化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的HSP70(DnaK)hsp70基因的分子克隆和DNA測(cè)序；核苷酸和蛋白質(zhì)序列分析；與肺炎鏈球菌的抗原相關(guān)性；在對(duì)熱的反應(yīng)中，增加的無(wú)乳鏈球菌HSP70的合成A方法1細(xì)菌菌株和質(zhì)粒載體在本研究中所用的化膿鏈球菌(A型鏈球菌)和無(wú)乳鏈球菌(B型鏈球菌)菌株是由Laboratoire de la Sante Publique duQuebéc(LSPQ)，Sainte-Anne de Bellevue，Quebéc，Canada提供的。無(wú)乳鏈球菌II型菌株V8對(duì)應(yīng)于ATCC菌株12973?；撴溓蚓闎runo對(duì)應(yīng)于ATCC菌株19615。從Stratagene得到大腸桿菌菌株XLI Blue MRF’。37℃在5％ CO2保溫箱中使鏈球菌菌株生長(zhǎng)。將鏈球菌劃在含5％羊血(LesLaboratoires Quelab，Montreal，Canada)的胰蛋白酶大豆瓊脂板上。用心灌注液肉湯(Difco Laboratories，Detroit，MI)，不用攪拌制備液體培養(yǎng)基。37℃，使大腸桿菌菌株在L肉湯中生長(zhǎng)，以250rmp的速率攪拌或在L瓊脂上生長(zhǎng)。
從Stratagene購(gòu)買常規(guī)的克隆噬菌粒pBluescript KS(-)。
2重組DNA技術(shù)按照供應(yīng)商(Pharmacia[Canada]Inc.Baie d’Urfe，Canada；and NewEngland Biolabs Ltd.，Mississauga，Canada)的說(shuō)明試驗(yàn)限制酶、T4 DNA連接酶和牛腸磷酸酶。按照J(rèn).Sambrood等所述(同上文)，完成通過(guò)在CsCl-溴化乙錠梯度平衡離心來(lái)制備質(zhì)粒、DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交和菌落DNA雜交。用適合于90ml細(xì)菌培養(yǎng)的B.M.Jayarao等的方法[J.Clin.Microbiol.，29，pp.2774-2778(1991)]制備鏈球菌的染色體DNA。按照Ish-Horowicz等的方法[Nucl.Acids Res.9，pp.2989-2998]完成快速質(zhì)粒制備。用QiagenInc.(Chatsworth，CA)的質(zhì)粒試劑盒純化用于DNA測(cè)序的質(zhì)粒。用酚冷凍法[S.A.Benson，Biotechniques 2，pp.67-68(1984)]從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段。用Boehringer Mannheim(Laval，Canada)的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，用P-dCTP或洋地黃毒苷(DIG)-11-dUTP標(biāo)記DNA探針。用Simanis的方法[Hanahan，D.In D.M.Glover(ed.)，DNACloning，pp.109-135(1985)]完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。用合成的寡核苷酸測(cè)定質(zhì)粒中基因組DNA插入片段的序列。用Taq Dye Deoxy Terminator Cycle測(cè)序試劑盒(ABI)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)完成測(cè)序反應(yīng)，然后在自動(dòng)DNA測(cè)序儀373A(ABI)上完成DNA電泳。用來(lái)自Gene CodesCorporation(Ann Arbor，MI)的program Sequencher 3.0完成DNA序列的組裝。用來(lái)自Intelligenetics，Inc.(Mountain View，CA)的程序Gene Works2.45完成DNA序列和其推測(cè)多肽的分析。用DNA Thermal Cycler480，Perkin Elmer完成DNA擴(kuò)增反應(yīng)。用寡核苷酸合成儀394型(ABI)合成寡核苷酸。
3無(wú)乳鏈球菌和化膿鏈球菌hsp70/dnaK基因的分子克隆用具有回文六聚核苷酸識(shí)別序列的各種限制酶完全消化無(wú)乳鏈球菌和化膿鏈球菌的染色體DNA。用標(biāo)記的PCR-擴(kuò)增的DNA探針通過(guò)Southern雜交分析消化產(chǎn)物，所述探針對(duì)應(yīng)于肺炎鏈球菌HSP72基因(見(jiàn)SEQ IDNO4)從起始密碼子ATG下游332個(gè)堿基開(kāi)始的782個(gè)堿基對(duì)。選擇該DNA區(qū)是因?yàn)樵谒碚鞯母锾m氏陽(yáng)性菌的hsp70基因中，它是相對(duì)高度保守的。用寡核苷酸OCRR2(5’-AAGCTGTTATCACAGTTCCGG)和OCRR3(5’-GATACCAAGTGACAATGGCG)，在肺炎鏈球菌基因組DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)從瓊脂糖凝膠中提取對(duì)應(yīng)大小的基因組片段來(lái)部分純化足夠大小的編碼70kDa多肽(＞1.8kb)的雜交基因組限制片段。用標(biāo)記的782-肺炎鏈球菌DNA探針，通過(guò)Southern雜交證明在純化的基因組限制片段中純化hsp70基因。
將純化的基因組DNA限制片段克隆到pBluescript KS(-)的去磷酸化匹配的限制位點(diǎn)中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XLI Blue MRF’中。用標(biāo)記的782-肺炎鏈球菌DNA探針，通過(guò)DNA雜交來(lái)篩選菌落。用各種限制酶消化提取的質(zhì)粒以評(píng)估插入片段的大小并用標(biāo)記的782-肺炎鏈球菌DNA探針，通過(guò)Southern雜交證明hsp70基因的存在。質(zhì)粒pURV5含有無(wú)乳鏈球菌基因組DNA的4.2kb HindIII插入片段。質(zhì)粒pURV4含有化膿鏈球菌基因組DNA的3.5kb HindIII片段。
4熱休克和蛋白質(zhì)標(biāo)記按照前文實(shí)施例1所述，用[35S]甲硫氨酸，通過(guò)脈沖標(biāo)記來(lái)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌對(duì)熱休克的應(yīng)激反應(yīng)。離心沉淀在SMAM中生長(zhǎng)過(guò)夜的無(wú)乳鏈球菌(用1mg/l甲硫氨酸、1％(v/v)Isovitalex和1mg/l膽堿鹽酸鹽補(bǔ)充的)，然后重懸在無(wú)甲硫氨酸的SMAM培養(yǎng)基中。將細(xì)菌在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后分成等體積的兩份。將樣品在37℃或43℃保溫10分鐘，然后在37℃，用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸標(biāo)記30分鐘。用PCS劇烈洗滌細(xì)菌，按照用于DNA分離的方法，用mutanolysine和溶菌酶處理(M.Jayarao等，同上文)，然后是聲處理來(lái)制備細(xì)胞提取物。
5免疫學(xué)特征通過(guò)Western印跡分析，檢測(cè)6個(gè)抗重組HSP72蛋白質(zhì)的單克隆抗體(F3-Pn3.5-F3-Pn3.10)和單克隆抗體F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、F2-Pn3.4與化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌之HSP70抗原的反應(yīng)性。通過(guò)用mutanolysine和溶菌酶處理(M.Jayarao等，同上文)，聲處理，然后在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸得到來(lái)自化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌中的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸，檢測(cè)來(lái)自大腸桿菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，所述大腸桿菌是用產(chǎn)生截短的化膿鏈球菌HSP70抗原的pURV4或pURV6轉(zhuǎn)化的。
B化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和肺炎鏈球菌之hsp70/dnak基因的DNA序列分析確定質(zhì)粒pURV5中4.2kb HindIII插入片段的2438個(gè)堿基的區(qū)。該序列含有一個(gè)編碼609個(gè)氨基酸之多肽的1830個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，該多肽的分子量為64907(見(jiàn)SEQ ID NO7)。該ORF在位置248有一ATG起始密碼子，在位置2077有一TAA終止密碼子。在位置237開(kāi)始的序列GAGG在ATG起始密碼子之前，該序列與16S rRNA互補(bǔ)并作為大腸桿菌中的核糖體結(jié)合位點(diǎn)[G.D.Stormo等，Nucleic AcidsRes.10，pp.2971-2996(1982)]。無(wú)乳鏈球菌HSP70的ORF和多肽分別與肺炎鏈球菌HSP72的ORF和多肽有85％和95％的一致性。
與肺炎鏈球菌HSP72的一級(jí)序列相比較表明質(zhì)粒pURV4中的3.5kbHindIII插入片段沒(méi)有化膿鏈球菌hsp70的3’末端編碼區(qū)。克隆含完整化膿鏈球菌hsp70編碼區(qū)的3kb SalI基因組片段產(chǎn)生了含3.1kb插入片段的質(zhì)粒pURV6，所述3.1kb插入片段沒(méi)有該具有的5’末端編碼區(qū)。組裝在質(zhì)粒pURV4和pURV6中存在的hsp70基因區(qū)得到了一個(gè)2183個(gè)核苷酸的區(qū)，該區(qū)含有一編碼608個(gè)氨基酸之多肽(見(jiàn)SEQ ID NO20)的1824個(gè)堿基的ORF，所述多肽的分子量為64847。ATG起始密碼子是在位置204開(kāi)始的，而TAA終止密碼子延伸到位置2030。與化膿鏈球菌hsp70相似，在位置193開(kāi)始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列GAGG在ATG起始密碼子之前[G.D.Stormo，同上文]?；撴溓蚓鷋sp70的ORF和推測(cè)的多肽分別與肺炎鏈球菌HSP72的ORF和多肽有85％和94％的一致性。質(zhì)粒pURV4的ORF沒(méi)有編碼化膿鏈球菌HSP79羧基末端之41個(gè)氨基酸的125個(gè)堿基對(duì)；因此該ORF編碼HSP70(重組N-567)氨基末端的567個(gè)氨基酸。質(zhì)粒pURV6的ORF沒(méi)有編碼化膿鏈球菌HSP79氨基末端之38個(gè)氨基酸的114個(gè)堿基對(duì)；因此該ORF編碼HSP70(重組N-570)氨基末端的570個(gè)氨基酸。
化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和肺炎鏈球菌的HSP70/DnaK之DNA開(kāi)放閱讀框架(圖24)和氨基酸序列(圖25)的綜合比較表明，其一致性分別為82％和93％。
C無(wú)乳鏈球菌對(duì)熱作出反應(yīng)而使HSP70的合成增加用[35S]甲硫氨酸脈沖標(biāo)記的無(wú)乳鏈球菌的熱休克細(xì)胞提取物和對(duì)照的一維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，在施加了熱應(yīng)激后，70kDa的合成顯著增加(圖26，道1和2)。放射性免疫沉淀分析表明用單克隆抗體F2-Pn3.4在43℃很容易檢測(cè)到熱可誘導(dǎo)的70kDa蛋白質(zhì)，因此說(shuō)明該蛋白質(zhì)屬于熱休克HSP70(hsp70/DnaK)家族(圖26，道3和4)。
D肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌中HSP70蛋白質(zhì)的抗原相關(guān)性在本研究中，用一組單克隆抗體研究化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和肺炎鏈球菌HSP70蛋白質(zhì)的抗原相關(guān)性。10個(gè)單克隆抗體中的8個(gè)與所有3種鏈球菌都發(fā)生反應(yīng)，因此表明沒(méi)有B細(xì)胞表位廣泛地分布在肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌中。直接抗一個(gè)位于肺炎鏈球菌HSP72的氨基酸殘基584和607之間的表位的單克隆抗體F1-Pn3.1不與來(lái)自化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌的HSP70抗原反應(yīng)。3種鏈球菌該區(qū)域的比較表明在氨基酸589和596之間有5到8個(gè)氨基酸的差異?？勾嬖谟贑-151區(qū)中之表位的單克隆抗體F2-Pn3.3與無(wú)乳鏈球菌反應(yīng)，但不與化膿鏈球菌反應(yīng)。這些資料清楚地說(shuō)明，來(lái)自鏈球菌的HSP79蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)上是相關(guān)的。但存在免疫學(xué)差異。
單克隆抗體F3-Pn3.5、F3-Pn3.6、F3-Pn3.7和F3-Pn3.10與截短的重組化膿鏈球菌HSP70抗原的反應(yīng)性分析使得可以鑒定位于肺炎鏈球菌HSP72氨基末端附近的抗原區(qū)。這些單克隆抗體與表達(dá)N末端567個(gè)氨基酸殘基的構(gòu)建體反應(yīng)，但不能與表達(dá)C-570片段的構(gòu)建體反應(yīng)。這些資料將由單克隆抗體F3-Pn3.5、F3-Pn3.6、F3-Pn3.7和F3-Pn3.10識(shí)別的表位定位于HSP72蛋白質(zhì)的殘基1和38之間。實(shí)施例10HSP70/HSP72作為人疫苗的用途為了配制用于人的疫苗，從本文所述的多肽中選擇試驗(yàn)的HSP72抗原。例如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以設(shè)計(jì)含一個(gè)致免疫表位的HSP70/HSP72多肽或其片段周圍的疫苗。分子生物學(xué)技術(shù)特別適用于制備基本上純的重組抗原。
疫苗組合物可采用各種形式。這些包括，但不限于固體、半固體和液體劑量形式，如粉末、液體溶液或懸浮液和脂質(zhì)體。我們認(rèn)為當(dāng)施用于人時(shí)，本發(fā)明的HSP70/HSP72抗原可引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，以此為基礎(chǔ)，本發(fā)明的組合物與使用其他蛋白質(zhì)或多肽來(lái)免疫接種人以抵御如破傷風(fēng)和白喉的那些組合物相似。因此，本發(fā)明組合物優(yōu)選含有可藥用佐劑如不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁、胞壁酰肽、油包水乳液、脂質(zhì)體、ISCOM或CTB，或來(lái)自霍亂毒素的無(wú)毒的B亞單位。最優(yōu)選的是，組合物以油包水乳液或氫氧化鋁為佐劑。
可以以包括肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部的各種可藥用形式，將所述組合物施用于患者。優(yōu)選肌肉內(nèi)施用疫苗。
通常，施用由首次注射(最可能與佐劑一起)，以及此后最可能的一次或多次加強(qiáng)注射組成，初次注射的劑量為每個(gè)患者約0.01-10mg，優(yōu)選0.1-1.0mg。優(yōu)選加強(qiáng)注射在初次注射后約1和6個(gè)月。
有關(guān)肺炎球菌疫苗發(fā)展的一個(gè)重要考慮是粘膜免疫問(wèn)題。理想的粘膜疫苗可以以一種或多種劑量，安全口服或鼻內(nèi)使用，并在適宜的表面上引發(fā)保護(hù)性抗體，城市全身免疫。粘膜疫苗組合物可包含佐劑、惰性顆粒載體或重組活載體。
本發(fā)明的抗HSP72抗體可用于因肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染的人的被動(dòng)免疫治療和免疫預(yù)防。所述被動(dòng)免疫的劑量形式和方案與其他被動(dòng)免疫治療的相似。
本發(fā)明的抗體可以是由生產(chǎn)單克隆抗體F1-Pn3.1的雜交瘤生產(chǎn)的，該雜交瘤于1995年7月21日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，并將其鑒定為鼠雜交瘤細(xì)胞系F1-Pn3.1。該保藏物的登記號(hào)為HB11960。
盡管我們描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案，但顯然，我們的實(shí)施方案可以改變以提供其他利用本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案。因此，應(yīng)理解本發(fā)明的范圍包括在前述說(shuō)明書(shū)和其權(quán)利要求書(shū)中所定義的所有其他的實(shí)施方案和改變；而且本發(fā)明不受本文作為實(shí)施例所列的具體實(shí)施方案的限制。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Hamel，JoseeBrodeur，Bernard RMartin，DenisRioux，Clement(ii)發(fā)明題目HSP70家族的鏈球菌熱休克蛋白質(zhì)成員(iii)序列數(shù)26(iv)通訊地址(A)收件人Goudreau Gage Dubue & Martineau Walker(B)街道800 Place Victoria，Suite 3400，Stock Exchange Tower(C)城市Montreal(D)州魁北克(E)國(guó)家加拿大(F)郵政編碼H4ZIE9(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version，#1.25(vi)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/472,534(B)申請(qǐng)日1995年6月7日(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/001,805(B)申請(qǐng)日1995年8月4日(viii)代理人/代理資料(A)姓名Leclere/Dubuc/Prince，Alain/Jean/Gaetan(C)文獻(xiàn)/文檔號(hào)BIOVAC2-PCT(ix)通信資料(A)電話(514)397-7400(B)電傳(514)397-4382(2)SEQ I的NO1的資料(I)序列特征(A)長(zhǎng)度3167個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)來(lái)源(A)生物肺炎鏈球菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置30..755(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置771..2912(D)其他資料/產(chǎn)物＝“FucI/SP72(C-169)”(xi)序列描述SEQ ID NO1GAACTTCATT TTTAGAAAGG AGTGAGTTT ATG TCT CAA GAT GAA AAA TTA ATT 53Met Ser Gln Asp Glu Lys Leu Ile1 5CGT GAA CAG ATT TGT GAT GTT TGT CAT AAG ATG TGG CAA CTT GGT TGG101Arg Glu Gln Ile Cys Asp Val Cys His Lys Met Trp Gln Leu Gly Trp10 15 20GTT GCT GCT AAC GAT GGG AAT GTA TCT GTT CGA TTA GAT GAG GAT ACC149Val Ala Ala Asn Asp Gly Asn Val Ser Val Arg Leu Asp Glu Asp Thr25 30 35 40ATT CTT GCA ACA CCT ACT GGT ATC AGC AAA AGT TTT ATT ACA CCA GAA197Ile Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ile Ser Lys Ser Phe Ile Thr Pro Glu45 50 55AAG CTG GTG AAG TTA AAT CTT AAA GGA GAG ATT TTA GAA GCA GAA GGT245Lys Leu Val Lys Leu Asn Leu Lys Gly Glu Ile Leu Glu Ala Glu Gly60 65 70GAT TAC TGT CCT TCT AGT GAA ATT AAA ATG CAC ATT CGG TGC TAC GAA293Asp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu Ile Lys Met His Ile Arg Cys Tyr Glu75 80 85GAA CGT GAG GAT GTT CGT TCA GTT GTT CAC GCG CAT CCA CCG ATT GCA341Glu Arg Glu Asp Val Arg Ser Val Val His Ala His Pro Pro Ile Ala90 95 100ACA GGA TTT GCT CTT GCA CAC ATT CCT TTA GAT ACT TAT TCA CTA ATT389Thr Gly Phe Ala Leu Ala His Ile Pro Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Ile105 110 115 120GAG AGC GCG ATT GTG GTT GGG GCA ATT CCT ATT ACC CCA TTT GGA GTA437Glu Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Pro Ile Thr Pro Phe Gly Val125 130 135CCG TCT ACA ATG GAA GTG CCA GAA GCA ATT ACA CCT TAT CTG CCC GAT485Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu Ala Ile Thr Pro Tyr Leu Pro Asp140 145 150CAT GAT GTC ATG CTA TTA GAA AAT CAT GGA GCT CTG ACT GTC GGA AGC533His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn His Gly Ala Leu Thr Val Gly Ser155 160 165GAT GTC ATT ACA GCA TAC TAC CGT ATG GAA ACT TTA GAA TTA GTC GCA581Asp Val Ile Thr Ala Tyr Tyr Arg Met Glu Thr Leu Glu Leu Val Ala170 175 180AAG ACA ACC TTC CAC GGA AGA ATG TTA CTT TCT ACA AAG GGC ATT GAG629Lys Thr Thr Phe His Gly Arg Met Leu Leu Ser Thr Lys Gly Ile Glu185 190 195 200GAG CAA GAA ATT GCT CGT CCG ACT TTA GAA CGT CTA TTC TCA ATG CGA677Glu Gln Glu Ile Ala Arg Pro Thr Leu Glu Arg Leu Phe Ser Met Arg205 210 215GAA AAT TAT AAG GTT ACA GGT CGT CAC CCA GGC TAC CGT AAA TAT AAT725Glu Asn Tyr Lys Val Thr Gly Arg His Pro Gly Tyr Arg Lys Tyr Asn220 225 230GGC GAT GGT AGT ATA AAA GAA ACA AAA AAA TAAGAGGAAA GTATT ATG ATC 776Gly Asp Gly Ser Ile Lys Glu Thr Lys Lys Met Ile.
235 2401CAA CAT CCA CGT ATT GGG ATT CGT CCG ACT ATT GAT GGT CGT CGT CAA 824Gln His Pro Arg Ile Gly Ile Arg Pro Thr Ile Asp Gly Arg Arg Gln5 10 15GGT GTA CGC GAA TCA CTT GAA GTA CAA ACA ATG AAC ATG GCT AAA AGT 872Gly Val Arg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Met Asn Met Ala Lys Ser20 25 30GTG GCA GAT TTG ATT TCA AGC ACA TTG AAA TAT CCA GAT GGG GAA CCT 920Val Ala Asp Leu Ile Ser Ser Thr Leu Lys Tyr Pro Asp Gly Glu Pro35 40 45 50GTG GAA TGT GTG ATT TCT CCA TCT ACC ATT GGT CGT GTT CCA GAG GCT 968Val Glu Cys Val Ile Ser Pro Ser Thr Ile Gly Arg Val Pro Glu Ala55 60 65GCA GCT TCC CAT GAG TTG TTT AAA AAA TCA AAT GTT TGC GCA ACA ATT 1016Ala Ala Ser His Glu Leu Phe Lys Lys Ser Asn Val Cys Ala Thr Ile70 75 80ACA GTT ACA CCA TGC TGG TGT TAT GGT AGT GAA ACT ATG GAT ATG TCT 1064Thr Val Thr Pro Cys Trp Cys Tyr Gly Ser Glu Thr Met Asp Met Ser85 90 95CCA GAT ATT CCT CAT GCT ATT TGG GGA TTT AAT GGG ACA GAA CGC CCA 1112Pro Asp Ils Pro His Ala Ile Trp Gly Phe Asn Gly Thr Glu Arg Pro100 105 110GGA GCT GTC TAT CTT GCA GCT GTA CTA GCT TCA CAT ACT CAA AAA GGG 1160Gly Ala Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser His Thr Gln Lys Gly115 120 125 130ATT CCA GCC TTT GGG ATT TAT GGT AGA GAT GTT CAG GAA GCT AAT GAT 1208Ile Pro Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Val Gln Glu Ala Asn Asp135 140 145ACA GCT ATT CCA GAA GAT GTC AAA GAA AAA CTT TTA CGT TAT GCG CGG 1256Thr Ala Ile Pro Glu Asp Val Lys Glu Lys Leu Leu Arg Tyr Ala Arg150 155 160GCA GTT CTT GCA ACT GGC TTG ATG AGA GAC ACT GCT TAC CTA TCA ATG 1304Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Met Arg Asp Thr Ala Tyr Leu Ser Met165 170 175GGT AGT GTT TCG ATG GGG ATT GGT GGT TCT ATT GTA AAT CCA GAT TTC 1352Gly Ser Val Ser Met Gly Ile Gly Gly Ser Ile Va1 Asn Pro Asp Phe180 185 190TTC CAA GAA TAC TTA GGA ATG CGA AAT GAA TCG GTA GAT ATG ACG GAG 1400Phe Gln Glu Tyr Leu Gly Met Arg Asn Glu Ser Val Asp Met Thr Glu195 200 205 210TTC ACG CGC CGT ATG GAC CGT GGT ATT TAC GAC CCT GAA GAG TTC GAA 1448Phe Thr Arg Arg Met Asp Arg Gly Ile Tyr Asp Pro Glu Glu Phe Glu215 220 225CGT GCG CTC AAA TGG GTG AAA GAA AAC GTA AAA GAA GGA TTC GAC CAT 1496Arg Ala Leu Lys Trp Val Lys Glu Asn Val Lys Glu Gly Phe Asp His230 235 240AAC CGT GAA GAC CTT GTT TTA AGC CGT GAA GAA AAA GAT AGA CAA TGG 1544Asn Arg Glu Asp Leu Val Leu Ser Arg Glu Glu Lys Asp Arg Gln Trp245 250 255GAA TTT GTT ATT AAG ATG TTC ATG ATT GGA CGT GAC TTA ATG GTT GGT 1592Glu Phe Val Ile Lys Met Phe Met Ile Gly Arg Asp Leu Met Val Gly260 265 270AAC CCA AGA CTT GCT GAA CTT GGT TTT GAG GAA GAA GCA GTT GGT CAC 1640Asn Pro Arg Leu Ala Glu Leu Gly Phe Glu Glu Glu Ala Val Gly His275 280 285 290CAT GCT TTA GTA GCT GGT TTC CAA GGT CAA CGT CAG TGG ACA GAC CAT 1688His Ala Leu Val Ala Gly Phe Gln Gly Gln Arg Gln Trp Thr Asp His295 300 305TTT CCA AAT GGG GAC TTT ATG GAA ACT TTC CTC AAT ACT CAG TTT GAC 1736Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Thr Phe Leu Asn Thr Gln Phe Asp310 315 320TGG AAT GGT ATT CGA AAA CCA TTT GTA TTT GCG ACA GAG AAT GAT TCA 1784Trp Asn Gly Ile Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn Asp Ser325 330 335CTA AAT GGT GTG TCT ATG CTC TTT AAT TAT CTA TTA ACA AAT ACT CCA 1832Leu Asn Gly Val Ser Met Leu Phe Aan Tyr Leu Leu Thr Asn Thr Pro340 345 350CAA ATC TTT GCT GAT GTG CGT ACT TAT TGG AGT CCA GAG GCT GTT GAA 1880Gln Ile Phe Ala Asp Val Arg Thr Tyr Trp Ser Pro Glu Ala Val Glu355 360 365 370CGT GTA ACA GGA TAT ACT TTA GAG GGT CGT GCT GCA GCT GGA TTC TTA 1928Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Gly Phe Leu375 380 385CAT CTA ATC AAC TCT GGA TCT TGT ACA TTG GAT GGT ACA GGT CAA GCT 1976His Leu Ile Asn Ser Gly Ser Cys Thr Leu Asp Gly Thr Gly Gln Ala390 395 400ACT CGA GAT GGC AAA CCT GTT ATG AAA CCA TTC TGG GAG TTG GAT GAA 2024Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Phe Trp Glu Leu Asp Glu405 410 415AGT GAA GTA CAG GCT ATG CTT GAA AAT ACA GAC TTC CCA CCA GCA AAC 2072Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Glu Asn Thr Asp Phe Pro Pro Ala Asn420 425 430CGC GAA TAC TTC CGT GGA GGA GGA TTC TCA ACT CGT TTC TTG ACG AAG 2120Arg Glu Tyr Phe Arg Gly Gly Gly Phe Ser Thr Arg Phe Leu Thr Lys435 440 445 450GGG GAT ATG CCA GTA ACA ATG GTA CGT CTC AAT CTT TTA AAA GGG GTT 2168Gly Asp Met Pro Val Thr Met Val Arg Leu Asn Leu Leu Lys Gly Val455 460 465GGT CCA GTG CTA CAA ATT GCA GAA GGT TAC ACA CTT GAA CTT CCT GAA 2216Gly Pro Val Leu Gln Ile Ala Glu Gly Tyr Thr Leu Glu Leu Pro Glu470 475 480GAT GTT CAC CAT ACT TTA GAT AAT CGT ACA GAT CCA GGA TGG CCA ACT 2264Asp Val His His Thr Leu Asp Asn Arg Thr Asp Pro Gly Trp Pro Thr485 490 495ACT TGG TTT GCT CCA CGT TTG ACA GGA AAA GGT GCT TTC AAG TCT GTC 2312Thr Trp Phe Ala Pro Arg Leu Thr Gly Lys Gly Ala Phe Lys Ser Val500 505 510TAT GAC GTC ATG AAT AAT TGG GGA GCT AAT CAC GGA GCC ATA ACA TAT 2360Tyr Asp Val Met Asn Asn Trp Gly Ala Asn His Gly Ala Ile Thr Tyr515 520 525 530GGA CAC ATT GGA GCA GAC TTG ATT ACC TTG GCT TCT ATG TTG AGA ATT 2408Gly His Ile Gly Ala Asp Leu Ile Thr Leu Ala Ser Met Leu Arg Ile535 540 545CCT CAA ATC GAA GTA ACA TTT GAC ATC GAC AAG AAC GGT ATC GTG TCT 2456Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser550 555 560GTT AAG GCC AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC 2504Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Tle Val Ile565 570 575CAA TCG AAC TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA 2552Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys580 585 590GAT GCA GAA GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA 2600Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val595 600 605 610GAC CTT CGT AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC TTT GCG ACT GAA AAG ACA 2648Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr615 620 625ATC AAG GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC 2696Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala630 635 640CAA GCT GCC CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG 2744Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu645 650 655GAC GAC ATG AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA 2792Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly660 665 670CTT GCT GTT AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA 2840Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln675 680 685 690GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC 2888Glu Gly Ala Glu Gly Als Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val695 700 705GTA GAC GGA GAG TTT ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTATTGGATG AAGAGTATCT2942Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys710AAAAAATACA CGAAAAGTTT ATAATGATTT TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC 3002AAAAGATTTT ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT 3062AGCTGAGCAT GATAGTTGTG TCAAAAATGA TGAAGCGGTA AGGAATTTTG TTACCTCAGT 3122ATTGTTGTCT GCATTTGTAT CGGCGATGGT ATCAGCTATG ATATC 3167(2)SEQ I的NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度242個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Gln Asp Glu Lys Leu Ile Arg Glu Gln Ile Cys Asp Val Cys1 5 10 15His Lys Met Trp Gln Leu Gly Trp Val Ala Ala Asn Asp Gly Asn Val20 25 30Ser Val Arg Leu Asp Glu Asp Thr Ile Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ile35 40 45Ser Lys Ser Phe Ile Thr Pro Glu Lys Leu Val Lys Leu Asn Leu Lys50 55 60Gly Glu Ile Leu Glu Ala Glu Gly Asp Tyr Cys Pro Ser Ser Glu Ile65 70 75 80Lys Met His Ile Arg Cys Tyr Glu Glu Arg Glu Asp Val Arg Ser Val85 90 95Val His Ala His Pro Pro Ile Ala Thr Gly Phe Ala Leu Ala His Ile100 105 110Pro Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Ile Glu Ser Ala Ile Val Val Gly Ala115 120 125Ile Pro Ile Thr Pro Phe Gly Val Pro Ser Thr Met Glu Val Pro Glu130 135 140Ala Ile Thr Pro Tyr Leu Pro Asp His Asp Val Met Leu Leu Glu Asn145 150 155 160His Gly Ala Leu Thr Val Gly Ser Asp Val Ile Thr Ala Tyr Tyr Arg165 170 175Met Glu Thr Leu Glu Leu Val Ala Lys Thr Thr Phe His Gly Arg Met180 185 190Leu Leu Ser Thr Lys Gly Ile Glu Glu Gln Glu Ile Ala Arg Pro Thr195 200 205Leu Glu Arg Leu Phe Ser Met Arg Glu Asn Tyr Lys Val Thr Gly Arg210 215 220His Pro Gly Tyr Arg Lys Tyr Ash Gly Asp Gly Ser Ile Lys Glu Thr225 230 235 240Lys Lys(2) SEQ I的NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度714個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ile Gln His Pro Arg Ile Gly Ile Arg Pro Thr Ile Asp Gly Arg1 5 10 15Arg Gln Gly Val Arg Glu Ser Leu Glu Val Gln Thr Met Asn Met Ala20 25 30Lys Ser Val Ala Asp Leu Ile Ser Ser Thr Leu Lys Tyr Pro Asp Gly35 40 45Glu Pro Val Glu Cys Val Ile Ser Pro Ser Thr Ile Gly Arg Val Pro50 55 60Glu Ala Ala Ala Ser His Glu Leu Phe Lys Lys Ser Asn Val Cys Ala65 70 75 80Thr Ile Thr Val Thr Pro Cys Trp Cys Tyr Gly Ser Glu Thr Met Asp85 90 95Met Ser Pro Asp Ile Pro His Ala Ile Trp Gly Phe Asn Gly Thr Glu100 105 110Arg Pro Gly Ala Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Ala Ser His Thr Gln115 120 125Lys Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Val Gln Glu Ala130 135 140Asn Asp Thr Ala Ile Pro Glu Asp Val Lys Glu Lys Leu Leu Arg Tyr145 150 155 160Ala Arg Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Met Arg Asp Thr Ala Tyr Leu165 170 175Ser Met Gly Ser Val Ser Met Gly Ile Gly Gly Ser Ile Val Asn Pro180 185 190Asp Phe Phe Gln Glu Tyr Leu Gly Met Arg Asn Glu Ser Val Asp Met195 200 205Thr Glu Phe Thr Arg Arg Met Asp Arg Gly Ile Tyr Asp Pro Glu Glu210 215 220Phe Glu Arg Ala Leu Lys Trp Val Lys Glu Asn Val Lys Glu Gly Phe225 230 235 240Asp His Asn Arg Glu Asp Leu Val Leu Ser Arg Glu Glu Lys Asp Arg245 250 255Gln Trp Glu Phe Val Ile Lys Met Phe Met Ile Gly Arg Asp Leu Met260 265 270Val Gly Asn Pro Arg Leu Ala Glu Leu Gly Phe Glu Glu Glu Ala Val275 280 285Gly His His Ala Leu Val Ala Gly Phe Gln Gly Gln Arg Gln Trp Thr290 295 300Asp His Phe Pro Asn Gly Asp Phe Met Glu Thr Phe Leu Asn Thr Gln305 310 315 320Phe Asp Trp Asn Gly Ile Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn325 330 335Asp Ser Leu Asn Gly Val Ser Met Leu Phe Asn Tyr Leu Leu Thr Asn340 345 350Thr Pro Gln Ile Phe Ala Asp Val Arg Thr Tyr Trp Ser Pro Glu Ala355 360 365Val Glu Arg Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Gly370 375 380Phe Leu His Leu Ile Asn Ser Gly Ser Cys Thr Leu Asp Gly Thr Gly385 390 395 400Gln Ala Thr Arg Asp Gly Lys Pro Val Met Lys Pro Phe Trp Glu Leu405 410 415Asp Glu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Glu Asn Thr Asp Phe Pro Pro420 425 430Ala Asn Arg Glu Tyr Phe Arg Gly Gly Gly Phe Ser Thr Arg Phe Leu435 440 445Thr Lys Gly Asp Met Pro Val Thr Met Val Arg Leu Asn Leu Leu Lys450 455 460Gly Val Gly Pro Val Leu Gln Ile Ala Glu Gly Tyr Thr Leu Glu Leu465 470 475 480Pro Glu Asp Val His His Thr Leu Asp Asn Arg Thr Asp Pro Gly Trp485 490 495Pro Thr Thr Trp Phe Ala Pro Arg Leu Thr Gly Lys Gly Ala Phe Lys500 505 510Ser Val Tyr Asp Val Met Asn Asn Trp Gly Ala Asn His Gly Ala Ile515 520 525Thr Tyr Gly His Ile Gly Ala Asp Leu Ile Thr Leu Ala Ser Met Leu530 535 540Arg Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile545 550 555 560Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile565 570 575Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met580 585 590Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu595 600 605Glu Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu610 615 620Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp625 630 635 640Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn645 650 655Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala660 665 670Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln675 680 685Ala Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp690 695 700Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys705 710(2) SEQ I的NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4320個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)來(lái)源(A)生物肺炎鏈球菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置682..2502(D)其他資料/產(chǎn)物＝“熱休克蛋白72”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3265..4320(D)其他資料/產(chǎn)物-“DNAJ的NH2末端部分”(ix)特征(A)名稱/鍵mat-peptide(B)位置682..2502(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGCTTGATT CACGCTTTGA AAGAAGAAGG AATTGAAGAA ATCGCAGCAG ATGGCGAATT 60TGACCATAAC TACCATATGG CCATCCAAAC TCTCCCAGCA GACGATGAAC ACCCAGTAGA 120TACCATCGCC CAAGTCTTTC AAAAAGGCTA CAAACTCCAT GACCGCATCC TACGCCCAGC 180AATGGTAGTG GTGTATAACT AAGATACAAA GCCCGTAAAA AGCTCGCAGT AAAAATAGGA 240GATTGACGAA GTGTTCGATG AACACAAGAA AATCTATCTT TTTTACTCAG AGCTTAGGGC 300GTGTTCGATT CGGCAATTCT GACGGTAGCT AAAGCAACTC GTCAGAAAAC GGCAGTCGCT 360ATGGCGTTTC TCTAGCTTCC TTACTAACTC GTCGTCGAAA TAAAATCGAT TTCGACTCTT 420CGTGTCGCAA TTTACATAAT AGAAAACTTG TCCGAAACGA CAATAAACTA TGAAGAAAGA 480TAAAATATGT TTGGCTTTGT AATAGTGAGC GAAGCGAACC AAAGACGATA CTCTTCGCTG 540TGGCGCTATT TGCGCAAATT TTGAGACCTT AGGCTCAAAG TTTAGTCAAA GAGATTGACA 600AAGTCAAGCT CTGACGGCGT CGCCACTTAA GAAGAGTATC AAAAAGAAAA ATAGAAAATT 660AACTAACAAG GAGAAAAACA C ATG TCT AAA ATT ATC GGT ATT GAC TTA GGT 711Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly1 5 10ACA ACA AAC TCA GCA GTT GCA GTT CTT GAA GGA ACT GAA AGC AAA ATC 759Thr Thr Asn Ser Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile15 20 25ATC GCA AAC CCA GAA GGA AAC CGC ACA ACT CCA TCT GTA GTC TCA TTC 807Ile Ala Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe30 35 40AAA AAC GGA GAA ATC ATC GTT GGT GAT GCT GCA AAA CGT CAA GCA GTT 855Lys Asn Gly Glu Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val45 50 55ACA AAC CCA GAT ACA GTT ATC TCT ATC AAA TCT AAG ATG GGA ACT TCT 903Thr Asn Pro Asp Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser60 65 70GAA AAA GTT TCT GCA AAT GGA AAA GAA TAC ACT CCA CAA GAA ATC TCA 951Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser75 80 85 90GCT ATG ATC CTT CAA TAC TTG AAA GGC TAC GCT GAA GAC TAC CTT GGT 999Ala Met Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly95 100 105GAG AAA GTA ACC AAA GCT GTT ATC ACA GTT CCG GCT TAC TTC AAC GAC 1047Glu Lys Val Thr Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp110 115 120GCT CAA CGT CAA GCA ACA AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCT GGT CTT GAA 1095Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu125 130 135GTA GAA CGT ATT GTT AAC GAA CCA ACT GCA GCA GCT CTT GCT TAT GGT 1143Val Glu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly140 145 150TTG GAC AAG ACT GAC AAA GAA GAA AAA ATC TTG GTA TTT GAC CTT GGT 1191Leu Asp Lys Thr Asp Lys Glu Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly155 160 165 170GGT GGT ACA TTC GAC GTC TCT ATC CTT GAA TTG GGT GAC GGT GTC TTC 1239Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe175 180 185GAC GTA TTG TCA ACT GCA GGG GAC AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC TTT 1287Asp Val Leu Ser Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe190 195 200GAC CAA AAA ATC ATT GAC CAC TTG GTA GCA GAA TTC AAG AAA GAA AAC 1335Asp Gln Lys Ile Ile Asp His Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn205 210 215GGT ATC GAC TTG TCT ACT GAC AAG ATG GCA ATG CAA CGT TTG AAA GAT 1383Gly Ile Asp Leu Ser Thr Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Lys Asp220 225 230GCG GCT GAA AAA GCG AAG AAA GAC CTT TCT GGT GTA ACT TCA ACA CAA 1431Ala Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Ser Thr Gln235 240 245 250ATC AGC TTG CCA TTT ATC ACT GCA GGT GAG GCT GGA CCT CTT CAC TTG 1479Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu255 260 265GAA ATG ACT TTA ACT CGT GCG AAA TTT GAT GAT TTG ACT CGT GAC CTT 1527Glu Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu270 275 280GTT GAA CGT ACA AAA GTT CCA GTT CGT CAA GCC CTT TCA GAT GCA GGT 1575Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly285 290 295TTG AGC TTG TCA GAA ATC GAC GAA GTT ATC CTT GTT GGT GGT TCA ACT 1623Leu Ser Leu Ser Glu Ile Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr300 305 310CGT ATC CCT GCC GTT GTT GAA GCT GTT AAA GCT GAA ACT GGT AAA GAA 1671Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu315 320 325 330CCA AAC AAA TCA GTA AAC CCT GAT GAA GTA GTT GCT ATG GGT GCG GCT 1719Pro Asn Lys Ser Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala335 340 345ATC CAA GGT GGT GTG ATT ACT GGT GAT GTC AAG GAT GTT GTC CTT CTT 1767Ile Gln Gly Gly Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu350 355 360GAT GTA ACG CCA TTG TCA CTT GGT ATC GAA ACA ATG GGT GGA GTA TTT 1815Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe365 370 375ACA AAA CTT ATC GAT CGC AAC ACT ACA ATC CCA ACA TCT AAA TCA CAA 1863Thr Lys Leu Ile Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln380 385 390GTC TTC TCA ACA GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAC GTT 1911Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val395 400 405 410CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAG ACT CTT GGA CGC 1959Leu Gln Gly Glu Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg415 420 425TTC CAA TTG ACT GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATT CCT CAA ATC 2007Phe Gln Leu Thr Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile430 435 440GAA GTA ACA TTT GAC ATT GAC AAG AAC GGT ATC GTG TCT GTT AAG GCC 2055Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala445 450 455AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC CAA TCG AAC 2103Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Va1 Ile Gln Ser Asn460 465 470TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA GAT GCA GAA 2151Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu475 480 485 490GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA GAC CTT CGT 2199Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Arg495 500 505AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC TTT GCG ACT GAA AAG ACA ATC AAG GAA 2247Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu510 515 520ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC CAA GCT GCC 2295Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ala Ala525 530 535CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG GAC GAC ATG 2343Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met540 545 550AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA CTT GCT GTT 2391Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val555 560 565 570AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA GAA GGA GCA 2439Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln Glu Gly Ala575 580 585GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC GTA GAC GGA 2487Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val Val Asp Gly590 595 600GAG TTT ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTATTGGATG AAGAGTATCT AAAAAATACA 2542Glu Phe Thr Glu Lys605CGAAAAGTTT ATAATGATTT TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC AAAAGATTTT 2602ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT AGCTGAGCAT 2662GATAGTTGTG TCAAAAATGA TGAAGCGGTA AGGAATTTTG TTACCTCAGT ATTGTTGTCT 2722GCATTTGTAT CGGCGATGGT ATCAGCTATG ATATCATTAG AAATACAAAC ATATAAATTT 2782GTAATACCGT TCATAATTGG TATGATTTGG ACAGTAGTTG TATTTCTTAT GATCAATTGG 2842AATTATATAG GCAAATACTA AGAAGAGACA AAAATATATA AATATTTCTG TACTTATAGG 2902ATATTTAAAA TCCAAATAAA GTTAATTTAC TTATTTGCAG AGGTTGCAAC CCAGCCTCTG 2962TTTTTCGATA AAAAGGGACG GAATCTCATT TGTTTGGGTT TTGTCTCATC AATAGAAAGG 3022AACAAAGAGT GTTCGTAACT GAACACGGGT TTCAGAATTT CTTACTAAAT ATAAAAGAAA 3082GGAATTGAAC CCGACCTAAA TGGTGGTTCG ATTCAGAACA TCAATAGAAA GGAATAAGGG 3142TGTTCGTAAC TGAACACGGG CTACGGACTG TGCCAAAAAG ATAGTTTTTT CTAGGACGTA 3202AGCGTCCGTC GTCAAAACTC CTAGATGGCT GTGTCCGTTT GACGCCCTTT GTATCTTGAA 3262TT ATG AAC AAT ACT GAA TTT TAT GAT CGT CTG GGG GTA TCC AAA AAC 3309Met Asn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn1 5 10 15GCT TCG GCA GAC GAA ATC AAA AAG GCT TAT CGT AAG CTT TCC AAA AAA 3357Ala Ser Ala Asp Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys20 25 30TAT CAC CCA GAT ATC AAC AAG GAG CCT GGT GCT GAG GAC AAG TAC AAG 3405Tyr His Pro Asp Ile Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Asp Lys Tyr Lys35 40 45GAA GTT CAA GAA GCC TAT GAG ACT TTG AGT GAC GAC CAA AAA CGT GCT 3453Glu Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala50 55 60GCC TAT GAC CAG TAT GGT GCT GCA GGC GCC AAT GGT GGT TTT GGT GGA 3501Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly65 70 75GCT GGT GGT TTC GGC GGT TTC AAT GGG GCA GGT GGC TTC GGT GGT TTT 3549Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe80 85 90 95GAG GAT ATT TTC TCA AGT TTC TTC GGC GGA GGC GGT TCT TCG CGC AAT 3597Glu Asp Ile Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn100 105 110CCA AAC GCT CCT CGC CAA GGA GAT GAT CTC CAG TAT CGT GTC AAT TTG 3645Pro Asn Ala Pro Arg Gln Gly Asp Asp Leu Gln Tyr Arg Val Asn Leu115 120 125ACC TTT GAA GAA GCT ATC TTC GGA ACT GAG AAG GAA GTT AAG TAT CAT 3693Thr Phe Glu Glu Ala Ile Phe Gly Thr Glu Lys Glu Val Lys Tyr His130 135 140CGT GAA GCT GGC TGT CGT ACA TGT AAT GGA TCT GGT GCT AAG CCA GGG 3741Arg Glu Ala Gly Cys Arg Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly145 150 155ACA AGT CCA GTC ACT TGT GGA CGC TGT CAT GGC GCT GGT GTC ATT AAC 3789Thr Ser Pro Val Thr Cys Gly Arg Cys His Gly Ala Gly Val Ile Asn160 165 170 175GTC GAT ACG CAG ACT CCT CTT GGT ATG ATG CGT CGC CAA GTA ACC TGT 3837Val Asp Thr Gln Thr Pro Leu Gly Met Met Arg Arg Gln Val Thr Cys180 185 190GAT GTC TGT CAC GGT CGA GGA AAA GAA ATC AAA TAT CCA TGT ACA ACC 3885Asp Val Cys His Gly Arg Gly Lys Glu Ile Lys Tyr Pro Cys Thr Thr195 200 205TGT CAT GGA ACA GGT CAT GAG AAA CAA GCT CAT AGC GTA CAT GTG AAA 3933Cys His Gly Tnr Gly His Glu Lys Gln Ala His Ser Val His Val Lys210 215 220ATC CCT GCT GGT GTG GAA ACA GGT CAA CAA ATT CGC CTC GCT GGT CAA 3981Ile Pro Ala Gly Val Glu Thr Gly Gln Gln Ile Arg Leu Ala Gly Gln225 230 235GGT GAA GCA GGC TTT AAC GGT GGA CCT TAT GGT GAC TTG TAT GTA GTA 4029Gly Glu Ala Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly Asp Leu Tyr Val Val240 245 250 255GTT TCT GTG GAA GCT AGT GAC AAG TTT GAA CGT GAA GGA ACG ACT ATC 4077Val Ser Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe Glu Arg Glu Gly Thr Thr Ile260 265 270TTC TAC AAT CTC AAC CTC AAC TTT GTC CAA GCG GCT CTT GGT GAT ACA 4125Phe Tyr Asn Leu Asn Leu Asn Phe Val Gln Ala Ala Leu Gly Asp Thr275 280 285GTA GAT ATT CCA ACT GTT CAC GGT GAT GTT GAA TTG GTT ATT CCA GAG 4173Val Asp Ile Pro Thr Val Hie Gly Asp Val Glu Leu Val Ile Pro Glu290 295 300GGA ACT CAG ACT GGT AAG AAA TTC CGC CTA CGT AGT AAG GGG GCA CCG 4221Gly Thr Gln Thr Gly Lys Lys Phe Arg Leu Arg Ser Lys Gly Ala Pro305 310 315AGC CTT CGT GGC GGT GCA GTT GGT GAC CAA TAC GTT ACT GTT AAT GTC 4269Ser Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Asp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val320 325 330 335GTA ACA CCG ACA GGC TTG AAC GAC CGC CAA AAA GTA GCC TTG AAA GAA 4317Val Thr Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu340 345 350TTCPhe 4320(2)SEQ I的NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度607個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1 5 10 15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly20 25 30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile35 40 45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp Thr Val50 55 60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65 70 75 80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr85 90 95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr Lys Ala100 105 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr115 120 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn130 135 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Thr Asp Lys145 150 155 160Glu Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val165 170 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ser Thr Ala180 185 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp195 200 205His Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Thr210 215 220Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225 230 235 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Ser Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile245 250 255Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr Arg260 265 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Val275 280 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile290 295 300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305 310 315 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn325 330 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile340 345 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser355 360 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg370 375 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385 390 395 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro405 410 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile420 425 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile435 440 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln450 455 460Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu465 470 475 480Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp485 490 495Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala500 505 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe515 520 525Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys530 535 540Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545 550 555 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala565 570 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr580 585 590Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys595 600 605(2)SEQ I的NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度352個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Asn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn Ala1 5 10 15Ser Ala Asp Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys Tyr20 25 30His Pro Asp Ile Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Asp Lys Tyr Lys Glu35 40 45Val Gln Glu Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Asp Gln Lys Arg Ala Ala50 55 60Tyr Asp Gln Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gly Gly Ala65 70 75 80Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asn Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Phe Glu85 90 95Asp Ile Phe Ser Ser Phe Phe Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asn Pro100 105 110Asn Ala Pro Arg Gln Gly Asp Asp Leu Gln Tyr Arg Val Asn Leu Thr115 120 125Phe Glu Glu Ala Ila Phe Gly Thr Glu Lys Glu Val Lys Tyr His Arg130 135 140Glu Ala Gly Cys Arg Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr145 150 155 160Ser Pro Val Thr Cys Gly Arg Cys His Gly Ala Gly Val Ile Asn Val165 170 175Asp Thr Gln Thr Pro Leu Gly Met Met Arg Arg Gln Val Thr Cys Asp180 185 190Val Cys His Gly Arg Gly Lys Glu Ile Lys Tyr Pro Cys Thr Thr Cys195 200 205His Gly Thr Gly His Glu Lys Gln Ala His Ser Val His Val Lys Ile210 215 220Pro Ala Gly Val Glu Thr Gly Gln Gln Ile Arg Leu Ala Gly Gln Gly225 230 235 240Glu Ala Gly Phe Asn Gly Gly Pro Tyr Gly Asp Leu Tyr Val Val Val245 250 255Ser Val Glu Ala Ser Asp Lys Phe Glu Arg Glu Gly Thr Thr Ile Phe260 265 270Tyr Asn Leu Asn Leu Asn Phe Val Gln Ala Ala Leu Gly Asp Thr Val275 280 285Asp Ile Pro Thr Val His Gly Asp Val Glu Leu Val Ile Pro Glu Gly290 295 300Thr Gln Thr Gly Lys Lys Phe Arg Leu Arg Ser Lys Gly Ala Pro Ser305 310 315 320Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Asp Gln Tyr Val Thr Val Asn Val Val325 330 335Thr Pro Thr Gly Leu Asn Asp Arg Gln Lys Val Ala Leu Lys Glu Phe340 345 350(2) SEQ I的NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Thr Ser Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Glu Ala1 5 10 15(2) SEQ I的NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr1 5 10 15(2) SEQ I的NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp1 5 10(2) SEQ I的NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val1 5 10 15(2)SEQ I的NO11的資料(i)序列特征(A)14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Thr Lys Val Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu1 5 10(2)SEQ I的NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile1 5 10 15(2)SEQ I的NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID NO13Leu Thr Asp Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala1 5 10(2)SEQ I的NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu1 5 10 15Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp20(2)SEQ I的NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys1 5 10 15(2)SEQ I的NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ NO16Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg1 5 10 15Asp Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys20 25(2)SEQ I的NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17
Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu -1 5 10 15Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly Leu Ala Val Lys Leu Tyr20 25 30(2)SEQ I的NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Gln Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp1 5 10 15Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys20 25(2)SEQ I的NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2183個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義:無(wú)(vi)來(lái)源(A)生物化膿鏈球菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置204..2030(xi)序列描述SEQ ID NO19CAGCGATGGT AGTTGTTTAT AACTAAGGTA AATGAGTTTT CGTTTTTGTC CGTAATGACA60GTAAACTAGA TAGCAAGTTA GAAGCTATTT CGCTTGCTGA TTAAACTATA GTGATTGCTT 120AGAATTGGAA GTAAAATAAT TCGAGTGCTT ACTAAGATAA ATTGAAATAA AAAGTAATAA 180AGTATAAAAT AAGAGGTATT AAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA 230Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu1 5GGT ACA ACA AAC TCA GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA 278Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys10 15 20 25ATC ATT GCT AAC CCA GAA GGC AAT CGT ACA ACT CCT TCA GTA GTA TCA 326Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser30 35 40TTC AAA AAT GGT GAA ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGC CAA GCA 374Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala45 50 55GTG ACA AAC CCA GAA ACA GTA ATC TCT ATT AAA TCT AAA ATG GGA ACT422Val Thr Asn Pro Glu Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr60 65 70TCT GAA AAA GTT TCT GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT470Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile75 80 85TCA GCA ATG ATT CTT CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA GAC TAT CTT518Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu90 95 100 105GGA GAA AAA GTA GAA AAA GCA GTT ATT ACT GTT CCA GCT TAT TTC AAC566Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn110 115 120GAT GCA CAA CGT CAA GCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT614Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu125 130 135GAA GTA GAA CGT ATC GTT AAT GAA CCA ACA GCA GCT GCA CTT GCT TAT662Glu Val Glu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr140 145 150GGT ATG GAC AAG ACT GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT710Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu155 160 165GGT GGT GGT ACA TTT GAC GTA TCA ATC CTT GAA TTA GGT GAT GGT GTC758Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ila Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val170 175 180 185TTC GAC GTT CTT GCA ACA GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC806Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp190 195 200TTT GAC CAA AAA ATT ATT GAT TTC TTA GTG GCT GAA TTT AAG AAA GAA854Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp Phe Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu205 210 215AAT GGT ATT GAC TTA TCA CAA GAT AAG ATG GCA CTT CAA CGC TTG AAA902Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys220 225 230GAT GCT GCT GAA AAA GCT AAA AAA GAT CTT TCA GGT GTG ACA CAA ACA950Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr235 240 245CAA ATT TCA TTA CCG TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC998Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His250 255 260 265TTA GAG ATG AGC TTA TCT CGT GCT AAA TTT GAC GAT CTC ACT CGT GAC 1046Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp270 275 280CTT GTT GAA CGT ACG AAA ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA 1094Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala285 290 295GGA TTG TCA TTG TCA GAA ATT GAT GAA GTT ATC CTT GTT GGT GGA TCA 1142Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ila Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser300 305 310ACT CGT ATC CCA GCA GTT GTC GAA GCT GTA AAA GCT GAA ACT GGT AAA 1190Thr Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys315 320 325GAA CCA AAT AAA TCT GTA AAC CCT GAT GAA GTG GTT GCT ATG GGT GCT 1238Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala330 335 340 345GCT ATC CAA GGT GGG GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTC CTT 1286Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu350 355 360CTT GAC GTA ACA CCA TTG TCA CTT GGT ATT GAA ACA ATG GGT GGT GTC 1334Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val365 370 375TTC ACT AAA TTG ATC GAC CGC AAT ACA ACT ATC CCA ACA TCT AAA TCA 1382Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser380 385 390CAA GTC TTC TCA ACA GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAT 1430Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His395 400 405GTT CTT CAA GGT GAA CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAG ACT CTT GGT 1478Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly410 415 420 425CGC TTC CAA TTG ACT GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA 1526Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln430 435 440ATT GAA GTA ACA TTT GAT ATC GAT AAA AAC GGT ATT GTT TCT GTA AAA 1574Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys445 450 455GCT AAA GAC CTT GGT ACG CAA AAG GAA CAA CAC ATC GTT ATC AAA TCA 1622Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln His Ile Val Ile Lys Ser460 465 470AAC GAC GGA CTT TCT GAA GAA GAA ATT GAT CGC ATG ATG AAA GAC GCT 1670Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala475 480 485GAA GCT AAT GCC GAA GCC GAT GCG AAA CGT AAA GAA GAA GTT GAC CTT 1718Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu490 495 500 505AAA AAC GAA GTT GAC CAA GCT ATC TTT GCT ACT GAA AAA ACA ATC AAA 1766Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys510 515 520GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTT GAC ACA GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA 1814Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser525 530 535GCT CTT GAC GAG TTA AAA GCT GCG CAA GAA TCT GGC AAC CTT GAC GAC 1862Ala Leu Asp Glu Leu Lys Ala Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp540 545 550ATG AAA GCT AAA CTT GAA GCA TTA AAT GAA AAA GCG CAA GCT TTG GCT 1910Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala555 560 565GTT AAA ATG TAC GAG CAA GCT GCA GCA GCT CAA CAA GCA GCA CAA GGT 1958Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly570 575 580 585GCA GAA GGT GCA CAA GCT AAT GAT TCA GCA AAT AAT GAT GAT GTT GTA 2006Ala Glu Gly Ala Gln Ala Asn Asp Ser Ala Asn Asn Asp Asp Val Val590 595 600GAT GGC GAA TTT ACA GAA AAG TAATGATTTA GTTATCTAGT AACATTAATA 2057Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys605TCCGAATTCA GAGGTTGTAC CAAACCTCTG TTTTTGGCTA AATAAAATGT AAAAATGCTG 2117ACGTCAAAAT ATTTTAAGAA AGGAATACAA GTTCGATTAT TCGAACACAG GCTAAAGCGT 2177GTAAAG2183(2)SEQ I的NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度608個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO20Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1 5 10 15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly20 25 30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile35 40 45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Glu Thr Val50 55 60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65 70 75 80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr85 90 95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala100 105 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr115 120 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn130 135 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys145 150 155 160Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val165 170 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala180 185 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp195 200 205Phe Leu Val Ala Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln210 215 220Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225 230 235 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile245 250 255Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg260 265 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr275 280 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile290 295 300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305 310 315 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn325 330 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile340 345 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser355 360 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg370 375 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385 390 395 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro405 410 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile420 425 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile435 440 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln450 455 460Lys Glu Gln His Ile Val Ile Lys Ser Asn Asp Gly Leu Ser Glu Glu465 470 475 480Glu Ile Asp Arg Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp485 490 495Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala500 505 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe515 520 525Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Lys Ala530 535 540Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545 550 555 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Lys Met Tyr Glu Gln Ala565 570 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gla Gly Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Asn580 585 590Asp Ser Ala Asn Asn Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys595 600 605(2)SEQ I的NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2438個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)來(lái)源(A)生物無(wú)乳鏈球菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置248..2077(xi)序列描述SEQ ID NO21CTTTCAAAAG GGATATAAAT TGCACGAGCG TCTGCTAAGA CCAGCGATGG TAGTTGTCTA 60TAACTAAGGT AAATGAGTTT TCGTTTTTGT CCGTAATGAC AGTAAACTAG ATAGCAAGTT120AGAAGCTATT CAGCTTGCTG ATTAAACTAT AGTGATTGCT TAGAATTGGA AGTAAAATAA180TTCGAGTGCT TACTAAGATA AATTGAAATA AAAAGTAATA AAGTATTATA AAATAAGAGG240TATTAAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA GGT ACA ACA AAC TCA 289Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser1 5 10GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA ATC ATT GCT AAC CCA 337Ala Val Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro15 20 25 30GAA GGC AAT CGT ACA ACT CCT TCA GTA GTA TCA TTC AAA AAT GGT GAA 385Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu35 40 45ATT ATC GTG GGT GAT GCT GCA AAA CGT CAA GCG GTA ACA AAT CCA GAT 433Ile Ile Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp50 55 60ACT GTT ATC TCT ATC AAA TCA AAG ATG GGA ACT TCT GAA AAA GTT TCT 481Thr Val Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser65 70 75GCA AAT GGT AAA GAA TAT ACT CCT CAA GAA ATT TCA GCA ATG ATT CTT 529Ala Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu80 85 90CAA TAC CTT AAA GGT TAT GCT GAA GAC TAT CTT GGA GAA AAA GTA GAA 577Gln Tyr Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu95 100 105 110AAA GCA GTT ATT ACT GTT CCA GCT TAC TTC AAC GAT GCA CAA CGT CAG 625Lys Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln115 120 125GCA ACT AAA GAC GCT GGT AAA ATT GCA GGT CTT GAA GTA GAA CGT ATC 673Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile130 135 140GTT AAC GAA CCA ACA GCA GCC GCA CTT GCT TAT GGT ATG GAC AAG ACT 721Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr145 150 155GAC AAG GAT GAA AAA ATC TTA GTT TTT GAC CTT GGT GGT GGT ACA TTT 769Asp Lys Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe160 165 170GAC GTA TCA ATC CTT GAA TTA GGT GAT GGT GTC TTC GAC GTT CTT GCA 817Asp Val Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala175 180 185 190ACA GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC TTT GAC CAG AAA ATT 865Thr Ala Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile195 200 205ATT GAT TTC TTG GTA GAA GAA TTC AAG AAA GAA AAT GGT ATT GAT CTT 913Ile Asp Phe Leu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu210 215 220TCT CAA GAC AAA ATG GCT CTT CAA CGC TTG AAA GAT GCT GCT GAA AAA 961Ser Gln Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys225 230 235GCT AAA AAA GAC CTT TCA GGT GTA ACT CAA ACT CAA ATT TCA TTA CCG 1009Ala Lys Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro240 245 250TTC ATC ACT GCT GGT TCT GCT GGT CCT CTT CAC TTG GAG ATG AGC TTA 1057Phe Ile Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu255 260 265 270TCA CGT GCT AAA TTT GAC GAT CTC ACT CGT GAC CTT GTT GAA CGT ACG 1105Ser Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr275 280 285AAA ACT CCA GTT CGT CAA GCT CTT TCA GAT GCA GGC TTG TCA TTG TCA 1153Lys Thr Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser290 295 300GAA ATT GAT GAA GTT ATC CTC GTT GGT GGA TCA ACA CGT ATC CCA GCA 1201Glu Ile Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala305 310 315GTT GTT GAA GCT GTA AAA GCT GAA ACT GGT AAA GAA CCA AAT AAA TCT 1249Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser320 325 330GTT AAC CCT GAT GAA GTG GTT GCC ATG GGT GCT GCT ATC CAA GGT GGT 1297Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly335 340 345 350GTT ATC ACT GGG GAT GTG AAA GAC GTT GTA CTT CTT GAC GTA ACA CCA 1345Val Ile Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro355 360 365TTG TCA CTT GGT ATT GAA ACA ATG GGT GGT GTC TTC ACT AAA TTG ATC 1393Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile370 375 380GAC CGC AAC ACA ACT ATC CCA ACA TCT AAA TCA CAA GTC TTC TCA ACA 1441Asp Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr385 390 395GCA GCA GAC AAC CAA CCA GCC GTT GAT ATC CAT GTT CTT CAA GGT GAA 1489Ala Ala Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu400 405 410CGC CCA ATG GCA GCA GAT AAC AAA ACA CTC GGT CGC TTC CAA TTG ACT 1537Arg Pro Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr415 420 425 430GAT ATC CCA GCT GCA CCT CGT GGA ATC CCA CAA ATT GAA GTA ACA TTT 1585Asp Ile Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe435 440 445GAT ATC GAT AAA AAT GGT ATT GTA TCT GTT AAA GCT AAA GAT CTC GGT 1633Asp Ile Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly450 455 460ACT CAA AAA GAA CAA CAC ATT GTT ATC CAA TCT AAT TCA GGA TTA ACT 1681Thr Gln Lys Glu Gln His Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr465 470 475GAT GAA GAA ATT GAT AAA ATG ATG AAA GAT GCT GAA GCA AAT GCT GAA 1729Asp Glu Glu Ile Asp Lys Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu480 485 490GCA GAT GCA AAA CGT AAA GAA GAA GTT GAT CTT AAA AAT GAA GTT GAC 1777Ala Asp Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp495 500 505 510CAA GCC ATC TTT GCA ACA GAA AAA ACT ATT AAA GAA ACT GAA GGC AAA 1825Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys515 520 525GGT TTT GAT ACA GAA CGC GAT GCA GCG CAA TCA GCA CTT GAT GAG TTG 1873Gly Phe Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu530 535 540AAA AAA GCT CAA GAA TCA GGT AAC CTT GAC GAC ATG AAA GCT AAA CTT 1921Lys Lys Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu545 550 555GAA GCT CTT AAC GAA AAA GCA CA GCT CTT GCA GTT AAA CTT TAC GAA 1969Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Geu Ala Val Lys Leu Tyr Glu560 565 570CAA GCG GCT GCA GCA CAA CAA GCA GCT CAA GGG GCT GAA GGT GCA CAA 2017Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly Ala Glu Gly Ala Gln575 580 585 590TCA GCT GAT TCA TCA AGC AAG GGT GAT GAT GTT GTA GAT GGC GAA TTC 2065Ser Ala Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe595 600 605ACT GAG AAA TAATTATTAA TATTGTTCAG ATTCATTTGA ATATAAGCAT 2114Thr Glu Lys610GAAAACTATA CTAGCATAGT AAAGTTCTTC GTGATAGGGA TTGCTCAATA ATCTAGATAA 2174GTTTCAGATT ACATAAGCTA ATTTCGCTAT CACTAAATAA AAACATATTA ATAATAAATA 2234GGCGGGGCGC CTCGCTCCGT CTGTTTTATT AAGTGTCATA TATATGTTAA CTATTTAGAG 2294CTGTAACTGG GCAAGAATAA TTGTTAATCT CTTCAAGTGT AGTATATGAA CAAAATATAA 2354AGGATTAGAT AATGAACAAT ACAGAATTTT ATGATCGTCT TGGCGTTTCA AAAGATGCTT 2414CTCAGGACGA AATAAAAAAA GCTT 2438(2) SEQ I的NO: 22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度609個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO22Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val1 5 10 15Ala Val Leu Glu Gly Thr Glu Ser Lys Ile Ile Ala Asn Pro Glu Gly20 25 30Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ser Phe Lys Asn Gly Glu Ile Ile35 40 45Val Gly Asp Ala Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Asp Thr Val50 55 60Ile Ser Ile Lys Ser Lys Met Gly Thr Ser Glu Lys Val Ser Ala Asn65 70 75 80Gly Lys Glu Tyr Thr Pro Gln Glu Ile Ser Ala Met Ile Leu Gln Tyr85 90 95Leu Lys Gly Tyr Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Glu Lys Val Glu Lys Ala100 105 110Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr115 120 125Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Glu Val Glu Arg Ile Val Asn130 135 140Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp Lys Thr Asp Lys145 150 155 160Asp Glu Lys Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val165 170 175Ser Ile Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Phe Asp Val Leu Ala Thr Ala180 185 190Gly Asp Asn Lys Leu Gly Gly Asp Asp Phe Asp Gln Lys Ile Ile Asp195 200 205Phe Leu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gln210 215 220Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Lys Asp Ala Ala Glu Lys Ala Lys225 230 235 240Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Gln Thr Gln Ile Ser Leu Pro Phe Ile245 250 255Thr Ala Gly Ser Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Ser Leu Ser Arg260 265 270Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Thr275 280 285Pro Val Arg Gln Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu Ser Leu Ser Glu Ile290 295 300Asp Glu Val Ile Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Ala Val Val305 310 315 320Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu Pro Asn Lys Ser Val Asn325 330 335Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile340 345 350Thr Gly Asp Val Lys Asp Val Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser355 360 365Leu Gly Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asp Arg370 375 380Asn Thr Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala385 390 395 400Asp Asn Gln Pro Ala Val Asp Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Pro405 410 415Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe Gln Leu Thr Asp Ile420 425 430Pro Ala Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile435 440 445Asp Lys Asn Gly Ile Val Ser Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln450 455 460Lys Glu Gln His Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu465 470 475 480Glu Ile Asp Lys Met Met Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp485 490 495Ala Lys Arg Lys Glu Glu Val Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp Gln Ala500 505 510Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe515 520 525Asp Thr Glu Arg Asp Ala Ala Gln Ser Ala Leu Asp Glu Leu Lys Lys530 535 540Ala Gln Glu Ser Gly Asn Leu Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala545 550 555 560Leu Asn Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala565 570 575Ala Ala Ala Gln Gln Ala Ala Gln Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ser Ala580 585 590Asp Ser Ser Ser Lys Gly Asp Asp Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu595 600 605Lys(2)SEQ I的NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu1 5 10 15Pro Asn Lys(2)SEQ I的NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Gln Thr Ile Val Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu1 5 10 15(2)SEQ I的NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度460個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(vi)來(lái)源(A)生物肺炎鏈球菌(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..456(D)其他資料/產(chǎn)物＝“HSP72的C末端151殘基片段(C-151)”(xi)序列描述SEQ ID NO25ATG AAG GCC AAA GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC 48Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile1 5 10 15CAA TCG AAC TCA GGT TTG ACT GAC GAA GAA ATC GAC CGC ATG ATG AAA 96Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys20 25 30GAT GCA GAA GCA AAC GCT GAA TCC GAT AAG AAA CGT AAA GAA GAA GTA144Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val35 40 45GAC CTT CGT AAT GAA GTG GAC CAA GCA ATC GCG ACT ACT GAA AAG ACA192Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr50 55 60ATC AAG GAA ACT GAA GGT AAA GGC TTC GAC GCA GAA CGT GAC GCT GCC240Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala65 70 75 80CAA GCT GCC CTT GAT GAC CTT AAG AAA GCT CAA GAA GAC AAC AAC TTG288Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu85 90 95GAC GAC ATG AAA GCA AAA CTT GAA GCA TTG AAC GAA AAA GCT CAA GGA336Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly100 105 110CTT GCT GTT AAA CTC TAC GAA CAA GCC GCA GCA GCG CAA CAA GCT CAA 384Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln115 120 125GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA GCA ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC 432Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val130 135 140GTA GAC GGA GAG TTT ACG GAA AAG TAAG460Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys145 150(2)SEQ I的NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度152個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gln Lys Glu Gln Thr Ile Val Ile1 5 10 15Gln Ser Asn Ser Gly Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Arg Met Met Lys20 25 30Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Val35 40 45Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp Gln Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr50 55 60Ile Lys Glu Thr Glu Gly Lys Gly Phe Asp Ala Glu Arg Asp Ala Ala65 70 75 80Gln Ala Ala Leu Asp Asp Leu Lys Lys Ala Gln Glu Asp Asn Asn Leu85 90 95Asp Asp Met Lys Ala Lys Leu Glu Ala Leu Asn Glu Lys Ala Gln Gly100 105 110Leu Ala Val Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Gln Gln Ala Gln115 120 125Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gln Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val130 135 140Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys145 150
權(quán)利要求
1 選自下列的多肽(a)具有SEQ ID NO5之氨基酸序列的HSP72多肽；(b)具有SEQ ID NO20之氨基酸序列的HSP70(DnaK)多肽；(c)具有SEQ ID NO22之氨基酸序列的HSP70(DnaK)多肽；(d)與用肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物宿主產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性的多肽，所述抗體與(a)、(b)或(c)中的多肽有免疫反應(yīng)性；(e)能夠引發(fā)抗體的多肽，所述抗體與(a)、(b)或(c)中的多肽有免疫反應(yīng)性；(f)與抗體有免疫反應(yīng)性的多肽，所述抗體是用(a)、(b)或(c)中的多肽免疫接種而引發(fā)的；(g)前述多肽的任何片段，或者單獨(dú)或者與其他多肽組合以形成融合蛋白。
2 權(quán)利要求1的多肽，其中(d)中的多肽選自鏈球菌和腸球菌屬的多肽。
3 權(quán)利要求1的多肽，其中(d)中的多肽選自肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌和糞腸球菌。
4 權(quán)利要求1的多肽，其中(d)中的多肽選自肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌。
5 權(quán)利要求1的多肽，其中(d)中的多肽選自SEQ ID NO5的氨基酸439-607(C-169)、SEQ ID NO5的氨基酸457-607(C-151)、SEQ IDNO5的氨基酸527-541和SEQ ID NO5的氨基酸586-600。
6 具有SEQ ID NO5之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
7 具有SEQ ID NO20之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
8 具有SEQ ID NO22之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
9 具有SEQ ID NO26之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
10 具有SEQ ID NO7之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
11 具有SEQ ID NO8之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
12 具有SEQ ID NO9之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
13 具有SEQ ID NO10之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
14 具有SEQ ID NO11之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
15 具有SEQ ID NO12之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
16 具有SEQ ID NO13之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
17 具有SEQ ID NO14之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
18 具有SEQ ID NO15之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
19 具有SEQ ID NO16之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
20 具有SEQ ID NO17之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
21 具有SEQ ID NO18之氨基酸序列的多肽，其類似物、同系物和衍生物。
22 權(quán)利要求1到21和100-101的任一多肽，其中所述多肽引發(fā)鏈球菌菌株特異性的免疫反應(yīng)。
23 選自下列的多肽(a)具有SEQ ID NO5之氨基酸序列的HSP72多肽；(b)與用肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物宿主產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性的多肽，所述抗體與(a)中的多肽有免疫反應(yīng)性；(c)能夠引發(fā)抗體的多肽，所述抗體(a)中的HSP72多肽有免疫反應(yīng)性；(d)與抗體有免疫反應(yīng)性的多肽，所述抗體是用(a)中的HSP72多肽免疫接種而引發(fā)的；(e)前述多肽的任何片段，或者單獨(dú)或者與其他多肽組合以形成融合蛋白。
24 權(quán)利要求23的多肽，其中(b)中的多肽選自鏈球菌屬和腸球菌屬的多肽。
25 權(quán)利要求23的多肽，其中(b)中的多肽選自化膿鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌和糞腸球菌。
26 權(quán)利要求23的多肽，其中(e)中的多肽選自SEQ ID NO5的氨基酸439-607(C-169)、SEQ ID NO5的氨基酸527-541和SEQ ID NO5的氨基酸586-600。
27 權(quán)利要求23的多肽，其中(e)的融合蛋白是具有SEQ ID NO3之氨基酸序列的巖藻糖異構(gòu)酶HSP72(C-169)蛋白質(zhì)。
28 選自下列的DNA序列(a)SEQ ID NO4的HSP72 DNA序列；(b)SEQ ID NO19的HSP70(DnaK)DNA序列；(c)SEQ ID NO21的HSP70(DnaK)DNA序列；(d)編碼與因肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物宿主而產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)之多肽的DNA序列，所述抗體與HSP72多肽(SEQ ID NO5)有免疫反應(yīng)；(e)編碼能夠引發(fā)抗體之多肽的DNA序列，所述抗體與HSP72多肽(SEQ ID NO5)發(fā)生免疫反應(yīng)；(f)編碼與抗體有免疫反應(yīng)之多肽的DNA序列，所述抗體是通過(guò)用HSP72多肽(SEQ ID NO5)免疫而引發(fā)的；(g)與前述DNA序列有簡(jiǎn)并性的DNA序列；和(h)前述任何DNA序列的片段，或者單獨(dú)或者與其他DNA序列組合形成融合DNA序列。
29 權(quán)利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列選自鏈球菌和腸球菌屬的DNA序列。
30 權(quán)利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列選自肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌和糞腸球菌的DNA序列。
31 權(quán)利要求28的DNA序列，其中(d)中的DNA序列選自肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌的DNA序列。
32 來(lái)自SEQ ID NO4中核苷酸682到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，編碼HSP72。
33 來(lái)自SEQ ID NO4中核苷酸1996到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，編碼HSP72的C-169片段。
34 來(lái)自SEQ ID NO4中核苷酸2050到核苷酸2502的DNA序列或其衍生物，編碼HSP72的C-151片段。
35 來(lái)自SEQ ID NO4中核苷酸2260到核苷酸2304的DNA序列或其衍生物。
36 來(lái)自SEQ ID NO4中核苷酸2437到核苷酸2481的DNA序列或其衍生物。
37 來(lái)自SEQ ID NO19中核苷酸204到核苷酸2027的DNA序列或其衍生物，編碼無(wú)乳鏈球菌的HSP70。
38 來(lái)自SEQ ID NO21中核苷酸248到核苷酸2074的DNA序列或其衍生物，編碼化膿鏈球菌的HSP70。
39 來(lái)自SEQ ID NO25中核苷酸4到核苷酸456的DNA序列或其衍生物，編碼HSP72的C末端151-殘基片段(C-151)。
40 編碼權(quán)利要求1-21和100-101任一多肽的DNA序列。
41 選自下列的DNA序列(a)SEQ ID NO4的HSP72 DNA序列；(b)編碼與因肺炎鏈球菌細(xì)胞感染哺乳動(dòng)物宿主而產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)之多肽的DNA序列，所述抗體與HSP72多肽(SEQ ID NO5)有免疫反應(yīng)；(c)編碼能夠引發(fā)抗體之多肽的DNA序列，所述抗體與HSP72多肽(SEQ ID NO5)發(fā)生免疫反應(yīng)；(d)編碼與抗體有免疫反應(yīng)之多肽的DNA序列，所述抗體是通過(guò)用HSP72多肽(SEQ ID NO5)免疫而產(chǎn)生的；(e)與前述DNA序列有簡(jiǎn)并性的DNA序列；和(f)前述任何DNA序列的片段，或者單獨(dú)或者與其他DNA序列組合形成融合DNA序列。
42 權(quán)利要求41的DNA序列，其中(b)中的DNA序列選自鏈球菌和腸球菌屬的DNA序列。
43 權(quán)利要求41的DNA序列，其中(b)中的DNA序列選自肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變異鏈球菌、血鏈球菌和糞腸球菌的DNA序列。
44 權(quán)利要求41的DNA序列，其中(f)中的片段選自SEQ ID NO4的核苷酸1996-2502(氨基酸439-607)(C-169)；SEQ ID NO4的核苷酸2260-2304(氨基酸527-541)；SEQ ID NO4的核苷酸2437-2481(氨基酸586-600).
45 權(quán)利要求41的DNA序列，其中(f)中的融合DNA序列是巖藻糖異構(gòu)酶-SEQ ID NO1的HSP72(C-169)DNA序列(核苷酸771-2912)。
46 包含與啟動(dòng)子可操作地相連的權(quán)利要求41中至少一個(gè)DNA序列的表達(dá)載體。
47 含有權(quán)利要求28到40任一DNA序列，和與所述DNA序列可操縱相連的一個(gè)或多個(gè)控制序列的重組DNA分子。
48 權(quán)利要求47的重組DNA分子，其中所述表達(dá)控制序列是可誘導(dǎo)表達(dá)載體。
49 權(quán)利要求48的重組DNA分子，其中所述表達(dá)載體含有λPL啟動(dòng)子。
50 權(quán)利要求47的重組分子由選自下列的質(zhì)粒構(gòu)成pURV3、pURV4、pURV5、pURV6、pJBD291、pJBDΔ4、pJBDk51、pJBD177、pJBD171、pJBD177、pJBD179、pJBDΔ1、pJBDf51和pJBDf62。
51 用權(quán)利要求46的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主。
52 用權(quán)利要求47的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的單細(xì)胞宿主。
53 根據(jù)權(quán)利要求52的單細(xì)胞宿主，其中所述宿主選自大腸桿菌XLIBlue MRF’、W3110、JM109、Y1090和BL21(DE3)菌株。
54 生產(chǎn)多肽或其片段的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求51的單細(xì)胞宿主并分離所述多肽或片段。
55 與權(quán)利要求23的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片段。
56 與由單克隆抗體F1-Pn3.1識(shí)別之表位特異性結(jié)合的抗體或其片段。
57 權(quán)利要求55的抗體或片段，是單克隆抗體。
58 權(quán)利要求57的單克隆抗體或片段，是鼠源的。
59 權(quán)利要求58的單克隆抗體或片段鼠是IgG型。
60 權(quán)利要求59的單克隆抗體，選自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
61 單克隆抗體F1-Pn3.1。
62 分離權(quán)利要求55的抗體的方法，包括(a)將權(quán)利要求23的多肽制備物導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物中；和(b)從含所述抗體的哺乳動(dòng)物中分離血清。
63 分離權(quán)利要求57的單克隆抗體的方法，包括(a)將權(quán)利要求23的多肽制備物導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中；和(b)將抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞；和(c)從雜交瘤細(xì)胞中分離所述單克隆抗體。
64 含有權(quán)利要求23之多肽的藥物組合物。
65 權(quán)利要求64的藥物組合物，它是疫苗。
66 權(quán)利要求64的藥物組合物，它還含有一種或多種可藥用賦形劑。
67 預(yù)防肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染患者的方法，包括施用藥物有效量的權(quán)利要求65的疫苗。
68 含有權(quán)利要求55之一種或多種抗體或其片段的藥物組合物。
69 權(quán)利要求68的藥物組合物，它是疫苗。
70 權(quán)利要求69的藥物組合物，它還含有可藥用賦形劑。
71 權(quán)利要求69的藥物組合物，其中所述抗體選自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
72 權(quán)利要求69的藥物組合物，其中所述抗體是F1-Pn3.1。
73 治療感染有或懷疑感染有肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌的病人方法，包括施用藥物有效量的權(quán)利要求69的疫苗。
74 檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將權(quán)利要求55的抗體或片段與生物樣品一起保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的抗體或片段，以表明是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌。
75 權(quán)利要求74的方法，其中所述抗體選自F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3和F2-Pn3.4。
76 權(quán)利要求74的藥物組合物，其中所述抗體是F1-Pn3.1。
77 檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌特異性抗體的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將權(quán)利要求23的多肽與生物樣品一起保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的多肽，以表明是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌特異性抗體。
78 檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將具有權(quán)利要求41之DNA序列的DNA探針與生物樣品一起保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的DNA探針，以表明是否存在肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌。
79 權(quán)利要求78的方法，其中所述DNA探針是一寡聚物，它具有與權(quán)利要求41之DNA序列中的至少約6個(gè)連續(xù)的核苷酸互補(bǔ)的序列。
80 權(quán)利要求79的方法，還包括(a)提供一組用作聚合酶鏈反應(yīng)方法之引物并位于靶區(qū)側(cè)翼的寡聚物；和(b)經(jīng)聚合酶鏈方法擴(kuò)增靶區(qū)。
81 藥物有效量的權(quán)利要求23的多肽用于預(yù)防人中肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染的用途。
82 藥物有效量的HSP72特異性抗體用于人的預(yù)防肺炎鏈球菌或相關(guān)細(xì)菌感染的用途。
83 生產(chǎn)多肽或其片段的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求52或53的單細(xì)胞宿主并分離所述多肽或片段。
84 用權(quán)利要求83的方法得到的基本上純的多肽。
85 與權(quán)利要求1或2的多肽特異性結(jié)合的抗體或片段。
86 分離權(quán)利要求86之抗體的方法，包括；(a)將權(quán)利要求1或22的多肽制備物導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物中；和(b)從含所述抗體的哺乳動(dòng)物中分離血清。
87 含有權(quán)利要求1或22之多肽的藥物組合物。
88 權(quán)利要求87的藥物組合物，它是疫苗。
89 權(quán)利要求87的藥物組合物，它還含有一種或多種可藥用賦形劑。
90 預(yù)防患者被肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌感染的方法，包括施用藥物有效量的權(quán)利要求88的疫苗。
91 與權(quán)利要求1或22的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片段。
92 檢測(cè)生物樣品中肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將權(quán)利要求91的抗體或片段與生物樣品保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的抗體或片段，表明是否存在肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌。
93 檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌特異性抗體的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將權(quán)利要求1或22的多肽與生物樣品一起保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的多肽，以表明是否存在肺炎鏈球菌或化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌特異性抗體。
94 檢測(cè)生物樣品中的肺炎鏈球菌或化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌的方法，包括(a)從患者中分離生物樣品；(b)將具有權(quán)利要求28之DNA序列的DNA探針與生物樣品一起保溫以形成混合物；和(c)檢測(cè)混合物中特異性結(jié)合的DNA探針，以表明是否存在肺炎鏈球菌或化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌。
95 權(quán)利要求94的方法，其中所述DNA探針是一寡聚物，含有與權(quán)利要求28之DNA序列的至少約6個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的序列。
96 權(quán)利要求95的方法，其中還包括(a)提供一組用作聚合酶鏈反應(yīng)方法之引物并位于靶區(qū)側(cè)翼的寡聚物；和(b)經(jīng)聚合酶鏈方法擴(kuò)增靶區(qū)。
97 藥物有效量的權(quán)利要求1或22的多肽用于預(yù)防人的肺炎鏈球菌或化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌感染的用途。
98 藥物有效量的HSP72特異性抗體用于人的預(yù)防肺炎鏈球菌或化膿鏈球菌或無(wú)乳鏈球菌感染的用途。
99 藥物有效量的權(quán)利要求2到21中任一多肽用于預(yù)防人的鏈球菌感染的方法。
100 具有SEQ ID NO23之氨基酸序列的多肽、其類似物、同系物或衍生物。
101 具有SEQ ID NO24之氨基酸序列的多肽、其類似物、同系物或衍生物。
全文摘要
描述了表觀分子量為70—72kDa的肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的新熱休克蛋白(HSP)、免疫相關(guān)多肽、肺炎鏈球菌HSP72的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶4;SEQ ID NO∶5)化膿鏈球菌HSP70的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶19;SEQ ID NO∶20)、無(wú)乳鏈球菌HSP70的核苷酸和衍生氨基酸序列(SEQ ID NO∶21;SEQID NO∶22)、與HSP結(jié)合的抗體和用于生產(chǎn)HSP和免疫相關(guān)多肽的重組DNA方法。本發(fā)明的多肽、DNA序列和抗體提供了用于診斷、預(yù)防和/或治療鏈球菌疾病的新方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1192241SQ96195891
公開(kāi)日1998年9月2日 申請(qǐng)日期1996年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者J·哈梅爾, B·R·布羅德烏爾, D·馬丁, C·里奧克斯 申請(qǐng)人:生化疫苗公司