專利名稱：治療骨吸收病的srcsh2特異性化合物的用途的制作方法
哺乳動物的骨不斷經(jīng)歷著骨重組，這是一個骨吸收和骨形成的動態(tài)過程。這些過程被特定的細胞類型介導(dǎo)骨形成是破骨細胞介導(dǎo)的礦化骨沉積的結(jié)果，而骨吸收是破骨細胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)溶解的結(jié)果。許多骨病是由骨形成相對骨吸收的不平衡引起的。例如，骨質(zhì)疏松癥和佩吉特病等疾病是以骨基質(zhì)的凈喪失為特征的。因此，抑制骨吸收的藥劑在治療這類疾病方面是有用的。
激活的破骨細胞通過吸附到骨基質(zhì)上，將蛋白酶、有機酸和質(zhì)子分泌到在細胞膜和骨基質(zhì)之間形成的密封區(qū)室中來再吸收骨。酸性環(huán)境和蛋白酶使得密封區(qū)室中的骨溶解到骨表面的嵴窩或腔中，當破骨細胞從骨上分離時，所述的嵴窩或腔是明顯的。
許多多肽生長因子和激素通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)其細胞效應(yīng)。從這些配體的細胞表面受體到細胞內(nèi)效應(yīng)器的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)常包括由調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶引起的特異性蛋白底物的磷酸化或去磷酸化。酪氨酸磷酸化可能是多細胞有機體中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要的，或者甚至可能是唯一的標志。結(jié)合的受體和細胞內(nèi)PTKS調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細胞中的細胞增殖、細胞分化和信號傳輸過程。
異常蛋白酪氨酸激酶活性與許多疾病(例如，糖尿病、動脈粥樣硬化、牛皮癬、膿毒性休克、骨喪失、貧血、多種癌和其它增殖性疾病)有關(guān)或被懷疑與這些疾病有關(guān)。因此，酪氨酸激酶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(所述激酶是該途徑的一部分)是藥物設(shè)計潛在的靶。綜述性文章參見Levitzki et al.，Science 267 1782-1788(1995)。
許多包含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)以低的水平存在，并常常具有相反的活性。這些信號傳輸分子的性質(zhì)允許細胞通過亞細胞定位和效應(yīng)器并列以及平衡激活與抑制來控制轉(zhuǎn)導(dǎo)，以便一個途徑的小的變化能獲得開關(guān)效應(yīng)。
通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用經(jīng)信號傳輸分子并列的轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成被特異性?？坑蛐蛄谢蚪閷?dǎo)。Src同源性2(SH2)域起著關(guān)鍵性的作用，所述域是約100個氨基酸的保守的非催化序列，該序列是在各種信號傳輸分子(例如非受體PTKs和激酶靶效應(yīng)器分子)和致癌蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的。SH2域?qū)υ谧粤姿峄疨TK受體或細胞內(nèi)酪氨酸激酶中發(fā)現(xiàn)的短的含磷酸化酪氨酸的肽序列而言是高度特異性的。
已鑒別了約60種蛋白質(zhì)，它們具有不同催化的或其它功能性區(qū)域，但共有保守的SH2域，即約100個氨基酸的保守序列。體內(nèi)哪一種生理反應(yīng)由這些SH2域中的每一種控制并不準確知道。而且，SH2域-配體/化合物相互作用是高度特異性的，以致配體/化合物結(jié)構(gòu)的微小改變將明顯改變配體/化合物結(jié)合到各種SH2域上的選擇性。
SH2域的非選擇性拮抗作用的結(jié)果可能是非常嚴重的。例如，盡管src SH2域、lck SH2域和fyn SH2域結(jié)構(gòu)相似，在域之間具有高度的保守性，但src SH2域的拮抗作用在本發(fā)明中表現(xiàn)為導(dǎo)致骨吸收，而lck SH2域或fyn SH2域的拮抗作用誘導(dǎo)免疫抑制。在骨吸收病的長期治療中，誘導(dǎo)免疫抑制是不希望的。
而且，在針對所有60種已知SH2域的結(jié)合研究中試驗潛在的src SH2域拮抗劑是不實際的。目前沒有與src SH2域選擇性相互作用的已知化合物。
提供經(jīng)拮抗src SH2域來治療骨吸收病但可避免產(chǎn)生在非選擇性的SH2域拮抗劑中觀察到的副作用的方法和化合物是合乎需要的。
如本文所公開的，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)可以通過針對SH2域子集的結(jié)合試驗鑒別選擇性的src SH2域拮抗劑，所述子集包括src SH2域、lck SH2域、fyn SH2域、SHPTP2 SH2域、p85域、Grb2 SH2域和hcp SH2域。
從下文所述的結(jié)合信息中，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)對人srcSH2域特異性的化合物用于治療骨吸收病是有效的，所述化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，所述化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合劑人lckSH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明也提供了一種治療受治療者骨質(zhì)疏松癥的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，所述化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lckSH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明還提供了一種削弱受治療者破骨細胞功能的方法，該方法包括給受治療者施用破骨細胞功能抑制量的一種化合物，所述化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本文使用的“骨吸收病”一詞指任何以由于破骨細胞活性引起的異常骨喪失為特征的疾病，特別是骨質(zhì)疏松癥。
本文使用的“治療”一詞及其派生詞指預(yù)防的或治療學(xué)的治療。
本文使用的“化合物”一詞指非肽化學(xué)化合物。
本文使用的“src SH2域拮抗劑”一詞，除非有另外的限定，指的是一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍，最好高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人srcSH2域，(b)以比低于50倍，最好低于100倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，所述化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明優(yōu)選的一方面提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
本發(fā)明優(yōu)選的一方面提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，所述化合物(a)以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于100倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明優(yōu)選的一方面提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，該化合物(a)以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
本發(fā)明也提供了一種治療受治療者骨質(zhì)疏松癥的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍，最好高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍，最好低于100倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明優(yōu)選的一方面提供了一種治療受治療者骨質(zhì)疏松癥的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍，最好是高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
本發(fā)明還提供了一種削弱受治療者破骨細胞功能的方法，該方法包括給受治療者施用破骨細胞功能抑制量的一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍，最好高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域，(b)以比低于50倍，最好低于100倍該化合物結(jié)合到這種src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcpSH2域、人Grb2 SH2域、人SH-PTP2 SH2域和人p85 SH2域。
本發(fā)明優(yōu)選的一方面提供了一種削弱受治療者破骨細胞功能的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，該化合物(a)以比高于50倍，最好是高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
使用在以下實施例11中詳細描述的作為融合蛋白在大腸桿菌中表達的SH2域在體外測定化合物在不同人SH2域的抑制活性。
附表1和2以及實施例12所示的數(shù)據(jù)表明，srcSH2域拮抗劑在胎鼠長骨(FRLB)試驗中具有明顯功效。在本領(lǐng)域，人們認為這一體外活性與體內(nèi)治療骨吸收病的功效相關(guān)聯(lián)，也與體內(nèi)削弱破骨細胞功能的功效相關(guān)聯(lián)。
因此，本發(fā)明提供了一種治療骨吸收病的方法，該方法包括以抑制骨吸收有效的量施用一定量的本文所限定的src SH2域拮抗劑。該藥物可以經(jīng)任何常規(guī)的給藥途徑(包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、皮下、真皮內(nèi)和腸胃外)給患有骨吸收病的或處于得骨吸收病危險中的病人施用。抑制骨吸收有效的量是從約0.001mg/kg到約10.0mg/kg受治療者體重。選擇的劑量是從約0.001mg/kg到約10.0mg/kg受治療者體重選擇的有效的、無毒的量。選擇的量按每天1-6次施用。
本發(fā)明公開的治療骨吸收病的方法也可以使用包含本文限定的src SH2域拮抗劑和藥物可接受載體的藥物組合物來完成。組合物可以含有在0.05mg到500mg之間的src SH2域拮抗劑，并可以構(gòu)成適于選擇的給藥方式的任何形式。適于口服給藥的組合物包括固體形式(例如，丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑和粉末)和液體形式(例如、溶液、漿劑、甘香酒劑(exlixer)和懸浮液)適用于腸胃外給藥的形式包括無菌溶液、乳劑和懸浮液。
本發(fā)明還提供了一種削弱破骨細胞功能的方法，該方法包括以抑制骨吸收有效的量施用一定量的本文所限定的src SH2域拮抗劑。該藥物可以經(jīng)任何常規(guī)的給藥途徑(包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、皮下、真皮內(nèi)和腸胃外)給患有骨吸收病的或處于骨吸收病危險中的病人施用。削弱破骨細胞功能有效的量是從約0.001mg/kg到約10.0mg/kg受治療者體重。選擇的劑量是從約0.001mg/kg到約10.0mg/kg受治療者體重選擇的有效的、無毒的量。選擇的量按每天1-6次給藥。
本發(fā)明公開的削弱破骨細胞功能的方法也可以使用包含本文限定的src SH2域拮抗劑和藥物可接受載體的藥物組合物來完成。組合物可以含有在0.05mg到500mg之間的src SH2域拮抗劑、并可以構(gòu)成適于選擇的給藥方式的任何形式。適于口服給藥的組合物包括固體形式(例如，丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑和粉未)和液體形式(例如，溶液、漿劑、甘香酒劑和懸浮液)適用于腸胃外給藥的形式包括無菌溶液、乳劑和懸浮液。
另外該藥物還可以制備成可以在給藥時用無菌水，鹽水或其它合適的無菌可注射介質(zhì)溶解或懸浮的無菌固體組合物。載體意在包括必需的和惰性的結(jié)合劑、懸浮劑、潤滑劑、香味劑、甜味劑、防腐劑、染劑和包衣。
給藥的最佳劑量可以由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員容易地確定，并且會隨著所用的特定的src SH2域拮抗劑、制劑的強度、給藥方式和疾病狀況的改善而變化。另一個取決于受治療特殊病人的因素(包括年齡、體重、飲食習(xí)慣和用藥時間)導(dǎo)致需要調(diào)整劑量。
本發(fā)明也提供了src SH2域拮抗劑在制造用于治療骨吸收病的藥物上的用途。
本發(fā)明也提供了src SH2域拮抗劑在制造用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物上的用途。
本發(fā)明也提供了src SH2域拮抗劑在制造用于抑制破骨細胞功能的藥物上的用途。
本發(fā)明也提供包含src SH2域拮抗劑的用于治療骨吸收病的藥物組合物。
本發(fā)明也提供了包含src SH2域拮抗劑的用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了包括src SH2域拮抗劑的用于抑制破骨細胞功能的藥物組合物。
當按照本發(fā)明使用本發(fā)明的方法時，預(yù)期無不可接受的毒理學(xué)作用。
相信不需進一步的說明本領(lǐng)域技術(shù)人員按前面的描述能最充分地利用本發(fā)明。因此，下列實施例只用來說明但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另有說明，本文使用的符號°意思是℃。
可用本領(lǐng)域公知的方法(例如“Thyoid Hormones andAnalogues.I.Synthesis，physical Properties and TheoreticalCalculations”E.C.Jorgensen，Hormonal Proteins andPeptides，Vol.VI，1978，Academic Press，NY和本文引證的參考資料中描述的方法)制備L-3，5-二溴酪氨酸。
可按下列步驟制備L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯(為用于實施例2 (e)和實施例2B(b))。
L-3，5-二溴酪氨酸(500g)懸浮在甲醇(5l)中，在攪拌的懸液中通入干燥的氯化氫5小時。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，殘渣懸浮在水(4l)中，用40％NaOH將pH調(diào)至6，收集沉淀，用水洗滌，得到L-3，5-二溴酪氨酸甲酯(467g，90％)，m.p.201°-203°。該酯(768g)懸浮在氯仿(2.7l)和乙酸乙酯(2.7l)中，然后在0.5小時內(nèi)保持溫度在35°以下加入三氟乙酸酐(565g)。將該混合物放置過夜，然后加入水(2l)，并加入飽和碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)至7。移去有機層，用水洗滌，用無水硫酸鎂干燥并蒸發(fā)將殘渣在含水甲醇中重結(jié)晶，得到L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯(786g，81％)，m.p.136°-7°。
用于以下實施例6的圖解1
4-反-氨甲基-環(huán)己基-羧酸1的氨基用標準保護基團例如用Boc基團(Boc酸酐、NaOH、H2O、二噁烷)保護形成2，使用一種偶聯(lián)劑，(例如DCC)將2連接到Kaiser肟樹脂(kaiser，E.T.et al.，J.Am ChemSoc 1985 107 7087-7092)上形成3。接著在標準條件(25％TFA、二氯甲烷)下將胺去保護形成4，再在標準條件下(如用于DMF或DCC中的HBTU，NMM或者用于DMF或NMP中的DIC)將4酰化以形成5，最后用各種胺將化合物從樹脂上裂解開來以形成最終所需的產(chǎn)物6。
按照以下實施例1-10制備化合物1-10。
實施例17-[D，L-α-氨基-α-(4-羧苯基)乙酰氨基]-3-[2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基]△3-cephem-4-羧酸(化合物1)的制備 a)4-羥甲基苯甲醛在冰浴中氮氣下向1，4-苯二甲醛(50.0g，0.373mol)的干燥四氫呋喃(200ml)溶液中逐滴加入500ml四氫呋喃中的氫化鋰三(叔丁氧)鋁(104.0g，0.410mol)。在冰浴中攪拌半小時后，將反應(yīng)混合物倒入2l冰冷的2N鹽酸中。用4份800ml的醚抽提該水溶液。用碳酸氫鈉溶液，鹽水洗滌合并的醚層，并干燥。蒸發(fā)掉溶劑，得到46克粗物質(zhì)，該物質(zhì)由色譜法(氧化鋁，醚洗脫)純化，得到結(jié)晶狀的標題化合物(17.6g，35％)，m.p.44.5-46℃。
b)5-(4-羥甲苯基)海因向加熱到50℃的在110ml60％含水乙醇中的4-羥甲基苯甲醛(10.0g，73.5mmol)和碳酸銨(17.1g，150mmol)的攪拌混合物中加入于10ml水中的氰化鈉(4.0g，81mmol)。攪拌混合物并在50-60℃下加熱3小時，接著在85℃下加熱1小時。在冰浴中冷卻后，加入濃鹽酸將pH調(diào)至6。冷卻一夜后將沉淀出的固體過濾、水洗并干燥，得到標題化合物(11.0g，72％)，m.p.189-196℃。
c)4-羥甲苯基甘氨酸將于125ml水中的實施例1(b)的化合物(10.9g，53mmol)和氫氧化鋇八水合物(25.5g，81mmol)的混合物在回流下攪拌18小時。冷卻反應(yīng)混合物，并用濃鹽酸酸化至pH1；過濾出硫酸鋇，用碳酸鉛將濾液的pH調(diào)至6。在過濾出硫酸鉛后，用硫化氫飽和濾液，并過濾掉硫化鉛。然后，經(jīng)減壓條件下與乙醇共沸將含水溶液濃縮至100ml，冷卻后，得到標題化合物(5.2g，54％)，m.p.230-231℃。
d)N-叔-丁氧羰基-4-羥甲苯基甘氨酸向160ml水中的4-羥甲苯基甘氨酸(8.0g，44mmol)和三乙胺(8.8g，87mmol)的溶液中加入于120ml四氫呋喃中的叔-丁氧羰基疊氮化物(6.95g，49mmol)。室溫下攪拌過夜后，反應(yīng)混合物用每份200ml的醚洗滌兩次。在冰浴中用醚覆蓋水層并用3N鹽酸酸化至pH3-3.5。用醚抽提酸性溶液，用鹽水洗滌合并的有機抽提物，干燥并蒸發(fā)，所形成的油狀物用氯仿-己烷研制并過濾掉固體，得到標題化合物(7.7g，63％)m.p.139-141.5℃。
e)N-叔-丁氧羰基-4-羥甲苯基甘氨酸甲酯向?qū)嵤├?(d)化合物(5.6g，20mmol)的溶液中加入于甲醇(10ml)中的硫酸二甲酯(3.1g，24mmol)和二異丙基胺(5.2g，40mmol)。將混合物回流20分鐘，接著用2N含水鹽酸處理。水溶液用乙酸乙酯抽提三次。用5％NaHCO3水溶液和鹽水洗滌合并的有機抽提物，蒸發(fā)掉溶劑，得到油狀的標題化合物(3.2g，55％)。
f)N-叔-丁氧羰基-4-羧苯基甘氨酸甲酯在25℃下，用過量的Jones試劑(8N鉻酸)處理于50ml丙酮中的實施例1(e)化合物(0.62g，2.1mmol)的溶液在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌2小時。過濾掉綠色的固體，用異丙醇分解過量的CrO3，濾液用無水硫酸鈉干燥并用活性炭處理。濾掉固體，蒸發(fā)濾液至干。得到0.38g白色固體狀的標題化合物m.p.126-128℃。
g)1，1-二甲基乙基N，N′-雙(1-甲基乙基)carbamimidate按照Santini等的方法(J.Org.Chem.1994，59，2261)使凈N，N′-二異丙基碳化二亞胺(1.0當量)與2-甲基-2-丙醇(1.15當量)在CuCl(0.01當量)存在下于室溫反應(yīng)一天來制備標題化合物。
h)N-叔-丁氧羰基-4-(叔-丁氧羰基)苯基甘氨酸甲酯將于干燥的二氯甲烷中的實施例1(f)化合物(1.0g，3.2mmol)和1，1-二甲基乙基N，N′-雙(1-甲基乙基)carbamimidate(1.3mg，6.5mmol)的溶液在室溫下攪拌過夜。濾掉二異丙基脲，用水分解過量的1，1-二甲基乙基N，N′-雙(1-甲基乙基)carbamimidate。分層，用5％NaHCO3水溶液和鹽水洗滌二氯甲烷溶液，用無水Na2SO4干燥。蒸發(fā)掉溶劑，殘渣用二乙醚處理。濾掉多余的二異丙基脲，蒸發(fā)有機濾液，得到油狀標題化合物(870mg，74％)。
i)N-叔-丁氧羰基-4(叔-丁氧羰基)苯基甘氨酸將于18ml l5％NaHCO3水溶液、18ml5％Na2CO3水溶液和36ml CH3OH中的實施例1(h)化合物(760mg，2.1mmol)的溶液在室溫下攪拌過夜5小時，用水稀釋反應(yīng)混合物，用乙酸乙酯洗滌，用新鮮的乙酸乙酯覆蓋水溶液，用3NHCl酸化至pH2。分層，用乙酸乙酯抽提水溶液兩次以上。乙酸乙酯溶液用無水Na2SO4干燥，蒸發(fā)，得到白色固體狀標題化合物(600mg，82％)m.p.77-79℃。
j)叔-丁基-7-氨基-3-[2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑)硫甲基]△3-cephem-4-羧酸酯將叔-丁基7-aminocephalosporanate(按照Blacklocketal，J.Org.Chem 1989，54，3907的方法經(jīng)在1，2-二甲氧基乙烷中與異丁烯和硫酸反應(yīng)從7-aminocephalosporanic acid制備)、NaHCO3和2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑在磷酸鹽緩沖液(pH6.4)中的溶液在60℃下攪拌6小時。反應(yīng)混合物用鹽酸/乙酸乙酯抽提得到標題化合物。
k)叔-丁基7-[D，L-α(叔-丁氧羰基氨基)-α-[4-(叔-丁氧羰基)苯基]乙酰氨基-3-[2-(5-甲基-1，3，4-thiadiazolyl)硫代甲基]△3-cephem-4羧酸酯將于于燥的二氯甲烷中的實施例1(i)的N-叔-丁氧羰基-4-(叔-丁氧羰基)苯基甘氨酸(351mg，1mmol)實施例1(j)的叔-丁基7-氨基-3-[2-(5-甲基-1，3，4-thiadiazolyl)硫甲基]△3-cephem-4-羧酸酯(368mg，1mmol)和DDC(212mg，1mmol)的混合物在室溫下攪拌3小時。濾掉二環(huán)己基脲，蒸發(fā)濾液至干。殘渣溶于乙酸乙酯中，用5％NaHCO3水溶液，2.5％硫酸、5％NaHCO3水溶液，鹽水洗滌乙酸乙酯溶液，用無水Na2SO4干燥。蒸發(fā)掉溶劑，得到0.6g粗產(chǎn)品。硅膠層析(用30∶70乙酸乙酯/苯洗脫)純化得到標題化合物(430mg，61％)m.p.110-112℃。
l)7-[D，L-α-氨基-α-(4-羧苯基)乙酰氨基]-3-[2-(5-甲基-1，3，4-thiadiazolyl)硫甲基]△3-cephem-4-羧酸在7.2ml三氟乙酸和0.8ml苯硫酚中攪拌實施例1(K)化合物(400mg，0.57mmol)的溶液。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，在室溫下攪拌1小時。在40℃水浴中蒸發(fā)掉溶劑，殘渣用乙醚研制三次。固體產(chǎn)物溶解在少量的甲醇中，加入乙醚使產(chǎn)物沉淀，得到標題化合物(300mg)m.p.170-175℃實施例2L-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H)噠嗪基甲基)-甲狀腺原氨酸(化合物2)的制備 (a)將O-甲氧苯基乙腈(23.64g)和3，6-二氯噠嗪(23.93g)溶解在干燥的二甲基甲酰胺(50ml)中，在2小時內(nèi)向攪拌的溶液中分成幾部分緩慢地加入氫化鈉(50％油分散劑16.23g)，將混合物倒在過量的碎冰上，用二氯甲烷抽提。移走有機層，用水洗滌，無水MgSO4干燥、活性炭吸附并蒸發(fā)至干。從二氯甲烷/石油溶劑油中重結(jié)晶殘渣，得到1-(6-氯-3-噠嗪基)-1-(2-甲氧苯基)-乙腈(35.5g，85％)，m.p.91°-92°(b)將該腈(33.5g)溶解在濃鹽酸(200ml)、乙酸(100ml)和水(100ml)中，溶液在攪拌下回流。6小時后蒸發(fā)溶劑，從乙酸乙酯/石油溶劑油中重結(jié)晶殘渣，得到2-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基-茴香醚(21.4g，77％)，m.p.142°-3°。
(c)將該達嗪酮(15.7g)溶解在磷酰氯(22ml)中，在攪拌下于55℃(油浴)中加熱溶液一小時。將冷卻的混合物慢慢地倒在碎冰上，用二氯甲烷抽提。分離有機層，用飽和NaHCO3溶液洗滌，用無水硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。將該殘渣與較小批殘渣(從2.16g噠嗪酮獲得的)合并，用煮沸的石油溶劑油(60°-80°)抽提幾次。用活性炭吸附合并的抽提物并蒸發(fā)，得到2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)-茴香醚(16.95g，87％)，m.p.63°。
(d)向于-15°三氟乙酸酐(25ml)中的三三氟乙酸碘(由在乙酸酐和三氟乙酸中用發(fā)煙硝酸(5ml)處理碘(2.54g)制備)攪拌懸浮液中加入上述于三氟乙酸(20ml)和三氟乙酸酐(25ml)中的氯噠嗪(9.39g)，這一過程中保持溫度在-15°以下。在室溫下攪拌混合物過液，濃縮，然后加入乙酸鈉(25g)和高氯酸鈉(15g)的水(200ml)溶液?；旌衔镉寐确鲁樘?，有機溶液用無水硫酸鎂干燥，然后濃縮至50ml，倒入攪拌的醚(250ml)中。收集沉淀并干燥，得到粗的4，4′-二甲氧基-3，3′-雙(6-氯-3-噠嗪基-甲基)-二苯基碘高氯酸鹽(14g)。1HNMRδ(DMSO-d6)3.80(3H，S，-OCH3)，4.20(2H，S，-CH2Ar)，7.05(1H，m，Ar-5H)，7.65(2H，m，PyH)和8.00(2H，m，Ar-2，6H)。
(e)將上述碘鹽(12.45g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙?；野彼峒柞?8.98g)、三乙胺(4.05g)和青銅(1.0g)在二氯甲烷(50ml)中攪拌18小時。過濾混合物，用乙酸水溶液、2N氫氧化鈉和水洗滌，然后用MgSO4干燥并蒸發(fā)。將殘余物與小批殘余物(從0.72g碘鹽獲得)合并，經(jīng)硅膠(400g)柱層析純化，用乙酸乙酯/石油溶劑油(60°-80°)[1∶3]洗脫，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氯-3-噠嗪基甲基)-O-甲基-N-三氟乙?；?1-甲狀腺原氨酸甲酯(4.0g)，此為褐色泡沫。1HNMRδ(CDCl3)3.06(2H，m，ArCH2CH)，3.84和3.93(6H，2s-OCH3)，4.19(2H，S，ArCH2Py)、4.75(1H，m，Ar CH2CH)、6.62(3H，m，ArH)、7.17(2H，m，PyH)和7.23(2H，s，ArH)。
(f)將上述二溴化合物(3.27g)溶解在含乙酸鈉(0.79g)的乙酸(20ml)中，將溶液回流1.25小時，加入足量的水(約2ml)以溶解沉淀的NaCl，溶液蒸發(fā)至干。殘余物在水和乙酸乙酯間分配，移去有機層，用飽和NaHCO3洗滌，然后用無水MgSO4干燥并蒸發(fā)至干。從乙酸乙酯/石油溶劑油(60°-80°)中重結(jié)晶殘余物，得到L-3，5-二溴-O-甲基-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)-N-三氟乙?；谞钕僭彼峒柞?2.52g，79％)，m.p.176°-8°。
(g)將此噠嗪酮(2.45g)溶解到干燥的二氯甲烷(40ml)中，在0°下攪拌冷卻，加入于二氯甲烷(3ml)中的三溴化硼(6.46g)，形成紅棕色沉淀。在室溫下攪拌混合物1.5小時，然后加入碎冰。過濾混合物，收集沉淀并溶解在2N NaOH (30ml)中，將該溶液在蒸汽浴上加熱15分鐘，加入乙酸至pH5，冷卻混合物。收集形成的沉淀，洗滌并干燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)-甲狀腺原氨酸(1.74g，88％)，m.p.278°-9°(分解)。
另一種方法是在反應(yīng)步驟(e)中不用(d)中制備的高氯酸鹽，而用按以下步驟制備的碘三氟乙酸鹽將碘(159g)懸浮在三氟乙酸酐(1l)中，在氮氣下攪拌同時在1.5小時內(nèi)加入發(fā)煙硝酸(350ml)，這一過程中保持溫度在36°和40℃之間。然后加入三氟乙酸酐(300ml)，在氮氣流下使混合物保持在40°直到除去所有氧化氮，然后在室溫下靜置過液。減壓下除去溶劑，與三氟乙酸酐(2×300ml)共沸除去殘余的溶劑。在攪拌下將淡黃色的殘余固體懸浮在三氟乙酸酐(1.2l)中，冷卻至-20°。保持溫度在-10°和-20°之間逐滴加入2-(6-氯-3-噠嗪甲基)茴香醚(600g)的三氟乙酸(1.2l)溶液。在-10°下攪拌混合物1小時，并在室溫下攪拌過夜，然后在減壓下除去溶劑，在攪拌下將殘余物倒入Na2SO4(3.5Kg)的水(20l)溶液中。使用稀NaOH溶液將混合物的pH調(diào)至約pH2，接著用二氯甲烷抽提(2×3l，1×2l)，合并有機抽提物，干燥(MgSO4)、過濾，并濃縮至2l，然后加入到劇烈攪拌的乙醚(12l)中。濾掉黑灰色的固體沉淀，用醚洗滌，在40°真空烘箱中干燥6小時，得到4，4′-二甲氧基-3，3′-雙-(6-氯-3-噠嗪基甲基)二苯基碘三氟乙酸鹽(8.14g，90％)，m.p.145°-147°。
使用以上2 (e)、(f)和(g)所述的類似的方法用這種鹽進一步反應(yīng)，可得到所需要的L-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)甲狀腺原氨酸。
實施例2AL-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)-甲狀腺原氨酸(化合物2)的制備(a)將2-(6-氯-3-噠嗪基甲基)茴香醚(按實施例2(c)中所述的方法制備)(2.35g)溶解在于燥的二氯甲烷(20ml)中，攪拌下冷卻至-50°，然后逐滴加入三溴化硼(3ml)，使溶液溫熱到室溫。0.5小時后，將橙色的反應(yīng)混合物倒入冰/水(200ml)中，加入丙酮以溶解沉淀的固體。用二氯甲烷抽提混合物，分離有機提取物，用水洗滌，干燥并蒸發(fā)。從乙酸乙酯和石油溶劑油中重結(jié)晶殘余物，得到2-(6-氯-3-噠嗪甲基)-苯酚(1.75g，80％)，m.p.132°-132.5°。分析值C，59.61；H，4.13；N，12.47；Cl，16.09；C11H9ClN2O 計算值C，59.87；H，4.11；N，12.70；Cl，16.07％。
(b)向這一苯酚(2.4g)和尿素(14g)的75％無水硫酸水溶液(100ml)中緩慢加入叔丁醇(17ml)。將混合物充分攪拌，并在4小時后再加入18ml叔丁醇，24小時后加入5ml，28小時后加入20ml。在120小時后將混合物倒入水中，分離有機相，將之棄去，用乙醚充分抽提水相。將合并的乙醚抽提物用飽和鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)。從乙醚和石油溶劑的油中重結(jié)晶殘余物，得到2，4-二叔丁基-6-(6-氯-3-噠嗪基甲基)苯酚(3.43g，94％)，m.p.143.0°-143.5°。分析值C，68.32；H，7.51；N，8.36；Cl，10.89；C19H25ClN2O 計算值C，68.56；H7.57；N，8.41；Cl，10.65％。
(C)將這一酚(1.95g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙?；野彼峒柞?3.24g)的乙醚(100ml)溶液于室溫下在氬氣下攪拌接著用活性二氧化錳(3×5g)處理。4小時后過濾混合物，加入四氯化鈦(5ml)。2分鐘后，用水處理黑色溶液，并用乙酸乙酯充分抽提。合并有機抽提物，用飽和鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)。殘余物在硅膠上層析，并用石油溶劑油和乙醚洗脫，得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氯-3-噠嗪基甲基)-N-三氟乙酰基甲狀腺原氨酸甲酯(2.31g，55％)，m.p.84°-86°。
(d)將該二溴甲狀腺原氨酸(2.76g)和無水乙酸鈉(0.78g)的乙酸(25ml)溶液回流加熱10小時，然后冷卻并倒入冰水中。濾出固體沉淀，溶解在乙酸乙酯中，干燥并蒸發(fā)，得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)-N-三氟乙?；谞钕僭彼峒柞?2.4g，55％)，m.p.112°-115°。
(e)將該噠嗪酮(0.200g)和HBr(1ml)的冰醋酸(20ml)溶液回流加熱三天。然后冷卻溶液，用水稀釋，用2N NaOH水溶液堿化，并加入乙酸調(diào)節(jié)至pH6。過濾固體沉淀，洗滌并干燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H)-噠嗪基甲基)甲狀腺原氨酸(0.100g，65％)，m.p.245°-247°(分解)，與前面分離的(實施例2(g))光譜相同。
實施例2BL-3，5-二溴-3′-(6-氧代-3(1H-噠嗪基甲基)-甲狀腺原氨酸(化合物2)的制備。
(a)向冷卻到-10°的于乙酸酐(50ml)中的三三氟乙酸碘(由在乙酸酐和三氟乙酸中用發(fā)煙硝酸(20.95ml)處理碘(10.0g)制備)溶液中逐滴加入2-甲氧苯基氰化物(30.0g)的三氟乙酸(60ml)和乙酸酐(30ml)溶液，在加入過程中，混合物的溫度保持在0°以下，然后將混合物在室溫下靜置過夜。然后將混合物倒入充分攪拌的冰冷的乙酸鈉(100g)和高氯酸鈉(13.0g)水(600ml)溶液中。濾出溶液的固體，用水和乙醚洗滌，得到，3，3′-二氰基甲基-4，4′-二甲氧基-二苯基碘高氯酸鹽，它為米色固體(23.6g，57％)，m.p.183°-4°(從甲醇/乙醚重結(jié)晶)。
(b)將這一碘鹽(22.6g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙?；?酪氨酸甲酯、三乙胺(6.1g)于二氯甲烷(300ml)中的溶液用青銅(1g)處理，混合物在室溫下，攪拌20小時。然后過濾混合物，濾液用2N鹽酸水溶液(2×200ml)、水(2×200ml)和2N NaOH水溶液(3×200ml)洗滌。用MgSO4干燥有機溶液，并在減壓下蒸發(fā)。將油狀殘余物溶解在二氯甲烷(30ml)中，并倒入石油溶劑油中。濾出的固體沉淀，從二氯甲烷/石油溶劑油中重結(jié)晶，得到無色的晶狀固體L-3，5-二溴-3′-氰基甲基-O-甲基-N-三氟乙酰基甲狀腺原氨酸甲酯，m.p.，148°-149°。母液在硅膠上層析，得到另一些該化合物。(總量＝8.05g，31％)。
(c)向該二溴甲狀腺原氨酸(120mg)和3，6-二氯噠嗪(31mg)的干燥二甲基甲酰胺(2ml)溶液中加入氫化鈉(30mg，50％油懸浮液)，將反應(yīng)混合物在室溫下靜置50分鐘。然后用冰處理，用二氯甲烷抽提混合物水溶液。用飽和鹽水洗滌有機溶液，然后干燥并蒸發(fā)。殘余物用制備型硅膠層析板層析，從中分離出3，5-二溴-3′-(1-(6-氯-3-噠嗪基)-1-氰基甲基)-O-甲基-N-三氟乙酰基甲狀腺原氨酸甲酯(5mg)。
1H NMRδ(CDCl3)3.12(1H，m)，3.27(1H，m)，3.79(3H，s)，3.86(3H，s)，4.86(1H，m)，5.80(1H，s)，6.72(1H，dd)，6.83(1H，d)，7.04(1H，d)，7.15(1H，broad m)，7.37(2H，s)，7.50(2H，dd).
用標準方法精心制作這一中間體可得到標題化合物。
實施例38，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮(化合物3)的制備 a)2-氰基-2-(4，4-亞乙二氧基亞己基)乙酸乙酯在室溫下向1，4-環(huán)己二酮-亞乙基縮酮(25g，0.160mol)和氰基乙酸乙酯(18g，0.160mol)于甲苯(400ml)中的混合物中逐滴加入二乙胺(25g，0.337mol)。將反應(yīng)混合物回流加熱過夜(使用Dean Stark裝置)。冷卻混合物并用乙酸乙酯和飽和NaHCO3水溶液分配(3X)。將有機提取物用Na2SO4干燥，過濾，真空濃縮，從乙醇中重結(jié)晶，得到標題化合物白色固體
(15.8g，45％)mp 80-81℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.28(q，J＝7.2Hz，2H)，4.00(s，4H)，3.18(t，J＝6.5Hz，2H)，2.85(t，J＝6.5Hz，2H)，1.89(t，J＝6.5Hz，2H)，1.82(t，J＝6.5Hz，2H)，1.35(t，J＝7.1Hz，3H).
(b)2-氨基-6，6-亞乙二氧基-4，5，6，7-四氫苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯在0℃于實施例3(a)化合物(10g，45.6mmol)、硫(1.6g，50.2mmol)的乙醇(164ml)懸液中逐滴加入二乙胺(3.6g，50.2mmol)的乙醇(26ml)溶液。將所形成的溶液在0℃下攪拌1小時，再在室溫下攪拌3.5小時。反應(yīng)混合物用乙酸乙酯驟冷，并用飽和氯化銨水溶液分配。用乙酸乙酯抽提水相，有機提取物用鹽水洗滌。合并的有機抽提物用Na2SO4干燥，過濾，真空濃縮和層析(硅膠，梯度5-10％CH2Cl2∶EtOAc)，得到油狀標題化合物(11.3g，87％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.25(q，J＝7.1Hz，2H)，4.02(s，4H)，2.92(t，J＝6.5Hz，2H)，2.74(s，2H)，1.90(t，J＝6.6Hz，2H)，1.33(t，J＝7.1，3H).
c) 7，7-亞乙二氧基-4-羥基-2-甲基-5，6，7，8-四氫苯并[b]噻吩并[2，3-6]吡啶-2-羧酸乙酯在室溫下，向?qū)嵤├?(b)化合物(11.2g，39.5mmol)的甲苯(307ml)溶液中加入3-乙氧基巴豆酸乙酯(12.4g，78.6mmol)和樟腦磺酸(0.78g，3.4mmol)。使用Dean Stark裝置將反應(yīng)混合物回流加熱3.5小時，冷卻反應(yīng)混合物，向其中逐滴加入新制備的1M乙氧基鈉溶液(49ml)。一旦添加完成后即將反應(yīng)混合物回流加熱3小時。冷卻混合物并濾出沉淀。將該鹽溶解在甲醇(60ml)中，加入水(500ml)和乙酸(2ml)，得到標題化合物黃色固體(10.4g，76％)mp 94-95℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.1Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.26(t，J＝6.5Hz，2H)，3.02(s，2H)，2.81(s，3H)，2.02(t，J＝6.5，2H)，1.47(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z350[M＋H]+；C17H19NO5S 計算值；C，58.44；H，5.48；N，4.01；實測值C，58.34；H，5.46；N，3.86.
d)7，7-亞乙二氧基-4-三氟乙?；酋Ｑ趸?2-甲基-5，6，7，8-四氫苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡啶-3-羧酸乙酯。
向?qū)嵤├?(c)化合物(5.0g，14，3mmol)的吡啶(50ml)溶液中逐滴加入三氟甲磺酸酐(4.0g，14.2mmol)。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物4小時至反應(yīng)完成。用硫酸銅水溶液(3X)、水(2X)和鹽水(2X)洗滌反應(yīng)混合物，蒸發(fā)有機層，用無水Na2SO4干燥，真空濃縮，用快速色譜(硅膠，1∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，得到標題化合物淡黃色固體(3.7g，54％)m.p.133-134℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.43(q，J＝7.2Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.16(t，J＝6.5Hz，2H)，3.10(s，2H)，2.77(s，3H)，2.03(t，J＝6.8Hz，2H)，1.41(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z 482[M＋H]+；C18H18F3NO7S2計算值；C，44.90；H，3.77；N，2.91；實測值C，45.03；H，3.62；N，2.89.
e)8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮。
在室溫下向?qū)嵤├?(d)化合物(2.4g，5.0mmol)的甲醇(40ml)溶液中加入一水合肼(4.1g，82.3mmol)。將反應(yīng)混合物回流加熱3小時，將混合物冷卻并在pH7水緩沖液和乙酸乙酯之間分配。用無水Na2SO4干燥有機層過濾，真空濃縮，從甲醇/乙酸乙酯中重結(jié)晶，得到標題化合物淡黃色固體(0.99g，60％)。
1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ4.05(s，4H)，3.15(t，J＝6.5Hz，2H)，3.04(s，2H)，2.82(s，3H)，2.06(t，J＝6.5Hz，2H)；MS(ESI)m/z318[M＋H]+；C15H15N3O3S；計算值 0.25 H2OC，55.97；H，4.85；N，13.05；實測值 C，55.85；H，4.75；N，13.30.
實施例44-[4-(4-甲基苯甲酰基)苯甲?；鵠苯基乙醛(化合物4)的制備 a)4-(4-甲基苯甲?；?苯甲酸甲酯將甲基對苯二酰氯(6.2g，31mmol)的250ml甲苯溶液于0℃在氬氛下用氯化銨(8.0g，60mmol)處理。攪拌混合物溫熱到35℃保持0.5小時，接著緩慢加入100g冰，150ml乙酸乙酯，50ml濃鹽酸和50ml水。分層，水相用100ml乙酸乙酯抽提兩次。合并的有機相用水(2×75ml)和鹽水(1×75ml)洗滌。用MgSO4干燥，過濾并濃縮成白色固體。從乙酸乙酯和己烷中重結(jié)晶得到6.0g(79％)標題化合物白色針狀物。熔點117-118C；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 8.15(d，J＝8.35Hz，2H)，7.83(d，J＝8.30Hz，2H)，7.73(d，J＝8.18Hz，2H)，7.31(d，J＝8.04Hz，2H)，3.98(s，3H)，2.46(s，3H)；MS(ESI)m/z 255(M＋H)+.
b)4-(4-甲基苯甲?；?苯甲酸將攪拌的4-(4-甲基苯甲酰基)苯甲酸甲酯(5.00g，20.0mmol)的150ml 2∶1 THF∶水溶液于65℃用-水合氫氧化鋰(2.0g，48mmol)處理。0.5小時后，使混濁的反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并用乙酸乙酯(300ml)和10％HCl(aq.)處理。分離有機相，用水(2×50ml)和鹽水(1×50ml)洗滌，用MgSO4干燥，過濾，并濃縮成白色泡沫。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.22(d，J＝8.34Hz，2H)，7.81(d，J＝8.31Hz，2H)，7.73(d，J＝.8.15Hz，2H)，7.31(d，J＝8.00Hz，2H)，2.46(s，3H).
c)4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲?；鵠茴香醚將實施例4(b)化合物的250ml甲苯溶液用草酰氯(21.8g，0.17mol)處理。所形成的混合物回流加熱2小時，濃縮，在0.5mmHg和25℃下靜置過夜。將該固體溶解在100ml茴香醚中，在0℃用氯化銨(11.2g，84mmol)處理?；旌衔锛訜岬?0℃保持1小時，接著慢慢加到100g冰中，接著加入150ml乙酸乙酯、50ml濃鹽酸和50ml水。分層，水相用100ml乙酸乙酯抽提。將合并的有機抽提液用水(2×75ml)和鹽水(1×75ml)洗滌，用MgSO4干燥、過濾，濃縮得白色固體。從乙酸乙酯和己烷重結(jié)晶得到4.6g(70％)標題化合物。
熔點167-169℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ.7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.06Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，7.0(d，J＝8.74Hz，2H)，3.92(s，3H)，2.47(s，3H)；MS(ESI)m/z 331(M＋H)+.
d)4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲?；鵠苯酚將實施例4(c)化合物(700mg，2.21mmol)的20ml二氯甲烷溶液用氯化鋁(1.0g，7.5mmol)和7.0ml 1.0M三氯化硼的二氯甲烷溶液處理，回流加熱1小時，再將該混合物用100ml二氯甲烷稀釋，用10％HCl(aq)(1×25ml)、水(1×25ml)和鹽水(1×25ml)洗滌。用MgSO4干燥有機相，過濾，濃縮成黑色殘余物，將該殘余物進行快速色譜純化(硅膠，用1∶1乙酸乙酯∶己烷洗脫)得到550mg(82％)標題化合物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ.7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.05Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，6.93(d，J＝8.6Hz，2H)，2.47(s，3H).
e)4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲酰基]苯基三氟甲磺酸鹽。
將實施例4(d)化合物(320mg，1.0mmol)的THF(20ml)溶液在0℃下用氫化鈉(40mg，1.67mmol)和N-苯基三氟甲烷磺酰亞胺(500mg，1.40mmol)處理，反應(yīng)混合物溫熱到室溫并在室溫下攪拌18小時。將反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和鹽水中分配；分層，將有機抽提物用MgSO4干燥，并蒸發(fā)。快速色譜(硅膠80∶20 己烷∶乙酸乙酯)純化得到標題化合物(300mg，66％)。
mp.180-181℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.96(d，J＝8.6Hz，2H)，7.89(s，4H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，7.45(d，J＝8.6Hz，2H)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H)，2.47(s，3H).
f)4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲酰基]苯基乙醛向?qū)嵤├?(e)化合物(445mg，1.0mmol)的DMF(10ml)溶液中加入烯丙基三丁基錫(0.35ml，1.12mmol)、氯化雙(三苯基膦)鈀(II)(55mg，0.077mmol)和氯化鋰(125mg，2.95mmol)，將反應(yīng)混合物加熱到90℃，保持1小時，在乙酸乙酯和鹽水間分配前冷至室溫。有機層用MgSO4干燥，濃縮成包含所需產(chǎn)物，3-[4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲酰基]苯基]-1-丙烯和含錫副產(chǎn)物的殘渣。將這一物質(zhì)進行快速色譜(硅膠，用95∶5己烷∶乙酸乙酯洗脫)?？焖偕V可除去大多數(shù)(但不是全部)雜質(zhì)。經(jīng)第二次色層(梯度5％-10％乙酸乙酯/己烷)純化，得到100mg(30％)純凈的烯烴將該烯在-78℃溶入CH2Cl2/CH3OH(3∶1，16ml)中。向該溶液通臭氧5分鐘。用5滴二甲基硫醚將反應(yīng)猝火，在-78℃繼續(xù)攪拌30分鐘。蒸發(fā)掉溶劑，經(jīng)快速色譜(硅膠，用梯度85∶15到75∶25己烷∶乙酸乙酯洗脫)純化所形成的物質(zhì)得到標題化合物(40mg，40％).mp.188-190℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.83(s，1H)，7.88(s，4H)，7.86(d，J＝8.1Hz，2H)，4.03(s，4H)，3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z 343(M＋H)+.
實施例51，4-二甲基-8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮(化合物5)的制備 1，4-二甲基-8，8-亞乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氫-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮將實施例3(d)化合物(0.4g，0.83mmol)的甲醇(6.7ml)溶液在室溫下用甲基肼(0.16g，3.45mmol)處理，將混合物回流加熱2小時。冷卻混合物，濾出含150mg2，4-二甲基位置異構(gòu)體(regioisomer)的沉淀。蒸發(fā)濾液并用快速色譜(硅膠，用80∶20∶5乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸洗脫)純化，得到標題化合物黃色固體(22mg)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.03(s，4H)，3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z332(M＋H)+.
實施例64-羧基-二苯酮-4-羧酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-己基羧酰胺(化合物6)的制備 a)N-叔丁氧基羰基-反-4-氨甲基環(huán)己基羧酸將NaOH(1N，100ml，100mmol)水溶液在0℃加入到4-反-氨甲基-環(huán)己基-羧酸(9.0g，60mmol)的二氧六環(huán)(100ml)和水(100ml)溶液中。加入Boc酐(15.9g，66mmol)，將反應(yīng)混合物加熱到室溫并攪拌過夜。所得溶液濃縮到50ml，然后用EtOAc(100ml)稀釋，用KHSO4(1N)水溶液酸化至pH2。有機層用水(100ml)抽提兩次，真空濃縮有機相，所得固體從EtOAc/己烷重結(jié)晶，得到9.2g＋3.4g(第二次收獲)白色固體(80％產(chǎn)率)。MS(ES)m/e242[M＋H]+。
b)N-叔丁氧基羰基-反-4-氨甲基環(huán)己基(Kaiser肟樹脂)羧酸酯將Kaiser肟樹脂(20g，0.7mmol/g載量，AdvancedChem Tech)加入到N-叔-丁氧基羰基-反-4-氨甲基環(huán)己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)的CH2Cl2(200ml)溶液中，在室溫下輕輕攪拌過夜。過濾并收集固體，用CH2Cl2(5×100ml)洗滌。然后將樹脂懸浮在CH2Cl2(200ml)中。向其中加入N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基環(huán)己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)，在室溫下輕輕攪拌過夜。過濾并收集固體，用CH2Cl2洗滌(5×100ml)，然后真空干燥過夜。IR(KBr，cm-1)＝1820，1771，1520。
c)反-4-氨甲基環(huán)己基(Kaiser肟樹脂)羧酸酯將N-叔-丁氧羰基-反-4-氨甲基環(huán)己基(Kaiser肟樹脂)羧酸酯(20g)懸浮在CH2Cl2(100ml)中，加入TFA(25ml)。輕輕攪拌反應(yīng)物0.5小時，接著過濾和收集固體，然后用CH2Cl2(5×100ml)洗滌，最后真空干燥過夜。IR(KBr，cm-1)＝3150、1770、1526。
d)4-羧基-二苯酮-4-羧酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-(Kaiser肟樹脂)羧酸酯將反-4-氨甲基環(huán)己基(Kaiser肟樹脂)羧酸酯(200mg)懸浮在DMF(3.0ml)和N-甲基嗎啉(0.2ml)中，加入4，4′-二苯酮二甲酸(190mg，0.7mmol)和HBTU(265mg，0.7mmol)。輕輕攪拌反應(yīng)物3小時，過濾并收集固體，并用DMF(3×20ml)，水(3×20ml)洗滌，然后懸浮在DMF(3.0ml)和N-甲基嗎啉(0.1ml)中，加入4，4′-二苯酮二甲酸(0.35mmol)和HBTU(0.35mmol)，輕輕攪拌反應(yīng)物3小時。過濾并收集固體，接著用DMF(3×20ml)、水(3×20ml)、CH5Cl2(5×20ml)洗滌。最后真空干燥。
e)4-羧基-二苯酮-4-羧酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-己基羧酰胺將4-羧基-二苯酮-4-羧酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-(Kaiser肟樹脂)羧酸酯(200mg)懸浮在CH2Cl2(3.0ml)中，加入己胺(0.3mmol)。輕輕攪拌反應(yīng)物3小時，過濾，真空濃縮濾液，得到標題化合物MS(ES)m/e 493[M＋H]+。
實施例74-硝基-苯甲酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-己基羧酰胺(化合物7)的制備 4-硝基-苯甲酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-己基羧酰胺除了用4-硝基苯甲酸替代4，4′-二苯酮二甲酸外，按照實施例6(a)-(e)的方法制備標題化合物MS(ES)m/e 390[M＋H]+。
實施例8
4-乙酰氨基-苯甲酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-1-(氨基-R-2-(甲氧甲基)吡咯烷)羧酰胺(化合物8)的制備 除用4-乙酰氨基-苯甲酸替代4，4′-二苯酮二甲酸，用R-1-氨基-2-(甲氧甲基)吡咯烷(RAMP)替代己胺外，按照實施例6(a)-(e)的方法制備標題化合物。MS(ES)m/e 331[M＋H]+。
實施例94-甲?；?E-肉桂酰氨基-反-4-甲基-環(huán)己基-N-(丙基)羧酰胺(化合物9)的制備 除用4-甲?；?肉桂酸替代4，4′-二苯酮二甲酸，用丙胺替代己胺外，按照實施例6(a)-(e)的方法制備標題化合物。MS(ES)m/e 357[M＋H]+。
實施例102，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮(化合物10)的制備 a)4-羥基-2-甲基-5，6，7，8-四氫苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡啶-2-羧酸乙酯將2-氨基-4，5，6，7-四氫苯并[b]噻吩-3-羧酸乙酯(8.9g，39mmoL)和3-乙氧基巴豆酸乙酯(12.4g，78mmol)的甲苯(300ml)溶液用樟腦磺酸(0.78g，3.4mmol)處理。使用Dean Stark裝置將反應(yīng)混合物回流加熱3小時。再將混合物冷至室溫，接著用新制備的1M乙氧基鈉溶液(48ml，48mmol)處理。添加完成后，將混合物回流加熱3小時。將混合物冷卻，濃縮，殘余物溶解在乙酸乙酯中，加入乙酸(2ml)，蒸去溶劑，所形成的固體用甲醇研制。得到標題化合物灰白色固體(8.4g，74％)mp 140℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.2Hz，2H)，3.04(br s，2H)，2.81(s，3H)，2.80(br s，2H)，1.87(brs，4H)，1.47(t，J＝7.2Hz，3H)；；C15H17NO3S計算值C，61.83；H，5.88；N，4.81；實測值C，61.69；H，5.81；N，4.73.
b)4-氯-2-甲基-5，6，7，8-四氫苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡啶-2-羧酸乙酯將實施例10(a)化合物(8.0g，27.4mmol)的磷酰氯溶液(100ml)回流3.5小時。在真空下除去磷酰氯。殘余的油狀物溶解在乙酸乙酯中，用5％NaHCO3水溶液洗滌，在無水Na2SO4上干燥，蒸去溶劑，得到標題化合物晶狀固體(8.5g，95％)，mp 65-66℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.47(q，J＝7.1Hz，2H)，3.10(br s，2H)，2.85(br s，2H)，2.60(s，3H)，1.89(br s，4H)，1.43(t，J＝7.1Hz，3H)；Anal.Calcd.for C15H16ClNO2S.0.125 H2OC，57.73；H，5.25；N，4.49；FoundC，57.69；H，5.08；N，4.30.
c)2，3，7，8，9，10-六氫-4-甲基-1H-苯并[b]噻吩并[2，3-b]吡唑并[3，4-d]吡啶-3-酮。
將實施例10(b)的化合物(2.0g，6.4mmol)的甲醇(50ml)溶液用肼-水合物(10ml)處理。反應(yīng)混合物回流加熱16小時。反應(yīng)物倒在稀鹽酸水溶液中，標題化合物以黃色固體(1.8g)沉淀出來。
1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ3.01(br s，2H)，3.00(s，3H)，2.92(br s，2H)，2.00(br s，4H)；Anal.Calcd.for C13H13N3OS.HCl.0.25H2OC，52.00；H，4.87；N，13.99；FoundC，51.92；H，5.01；N，13.70.
實施例11測定SH2域拮抗劑潛能的方案使用作為融合蛋白在大腸桿菌中表達的SH2域在體外測定化合物在不同人SH2域的抑制活性。這里使用的SH2域是src SH2域、Grb2 SH2域、lck SH2域、fynSH2域、SH-PTP2 SH2域、p85 SH2域和hcp SH2域的人型。
含有src、lck和hcp SH2域的所述融合蛋白被表達為總的序列DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-SH2，其中DET1、DET2、間隔區(qū)、eK和SH2是如下所述的。DET1(“確定的附加表位1”)(SEQ ID NO1 )為一在1型人免疫缺損病毒(HIV-1)包膜蛋白gp120(或gP160)中發(fā)現(xiàn)的11個氨基酸的序列。HIV-1gp120(或gp160)各種表位的單克隆抗體是本領(lǐng)域公知的，參見，例如US專利5,166,050。一個優(yōu)選的例子是單克隆抗體1781(參見，例如 Thiriart et al.，J.Immunol.，1431832-1836(1989))，該抗體是通過用得自菌株BH10的酵母表達的HIV-1gp160分子免疫小鼠制備的(Ratner et al.，Nature，313277-284(1985))。這一標記物可用于檢測表達(用Western印跡)、純化蛋白質(zhì)(用親和層析)，也可用于使用178.1抗體俘獲或固定融合蛋白的成形試驗(configuring assays)。DET2是結(jié)合到含鎳樹脂上并用于純化目的的六組氨酸序列標記物(SEQ IDNO2)。間隔區(qū)(SEQ ID NO3)是用于在構(gòu)建體指示位置設(shè)定BamH1限制性位點。-ek-一詞指腸激酶蛋白酶的識別序列(SEQ ID NO4)，所述酶導(dǎo)致選擇性地從SH2域除去標記物，從而產(chǎn)生不含多余氨基酸的SH2域。對晶體學(xué)研究來說，不含多余氨基酸的SH2域比標記蛋白質(zhì)更好。SH2指不同蛋白質(zhì)的SH2域。
設(shè)計編碼每-DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-SH2的DNA序列，以便指示的限制性位點(BamHI和XbaI)位于間隔區(qū)-ek-SH2區(qū)側(cè)翼，從而使不同間隔區(qū)-ek-SH2構(gòu)建體易于取代到以下步驟2或3所描述的任何一種載體中，以產(chǎn)生DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-SH2標記蛋白質(zhì)。也設(shè)計編碼每-DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-SH2構(gòu)建體，以便完整的標記SH2域能作為NdaI-XbaI片斷移入任一表達載體中，所述載體在大腸桿菌轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列下游的合適距離處含有一個NdeI位點和一個與XbaI匹配的下游克隆位點。盡管任何合適的載體都會產(chǎn)生類似的結(jié)果(例如，pET-lla；Novagen，Inc.)但用于本實驗的載體是大腸桿菌表達載體pEAlKnRBS3。此載體是Shatzman，A，Gross，M，和Rosenberg，M，1990，“Expres-sion Using Vectors with phage lambda regulatorysequence”，InCurrent Protocols in MolecularBiology(F.A.Ausubel et al，eds.)，PP.16.3.1-16.3.11，Greene Publishing and Wiley-Interscience，N.Y.(此后F.A.Ausubel et al.)中描述的系列載體的衍生物。Bergsmaet al.，1991，J.Biol.Chem.26623204-23214中描述了該特異性載體pEAlKnRBS3。
以下步驟描述雞src.人src.人lck和人hcp CH2域的表達。首先，雞src SH2域表達為DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2。然后，其它SH2域插入到這一載體中取代雞src以便以DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-間隔區(qū)-SH2的形式表達蛋白質(zhì)。
步驟1含有標記DET1和DET2的雞src SH2域(DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2)的克隆和表達。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法采用以下引物從含有雞src基因的cDNA克隆(p5H；Levy et al.，1986.Proc NatlAcad Sci USA 834228)PCR擴增編碼標記蛋白質(zhì)DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2的DNA序列5’TTCCATATGAAAAGTATTCGTATTCAGCGTGGCCCGGGCCGTCACCACCACCACCACCACGGGATCCCCGCTGAAGAGTGGTACTTT 3’(SEQ ID NO17)下面劃線的位點是NdeI識別位點(5′)和BamHI識別位點(3′)5’GGAATTCTAGATTACTAGGACGTGGGGCAGACGTT 3’(SEQ ID NO18)下面劃線的區(qū)是XbaI識別位點。
用NdeI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，接著在瓊脂糖凝膠上分離消化的片斷。將該片斷連接到經(jīng)NdeI-XbaI消化的已由瓊脂糖凝膠純化為6.5Kbp片斷的pEAlKnRBS3載體(Bergsma et al.，同上)上。將連接反應(yīng)用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294cI+(F.A.Ausubel et al.，同上)。包含正確片斷插入的質(zhì)粒由DNA測序鑒別和證實。所形成的質(zhì)粒在噬菌體λPL啟動子和調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制下編碼DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2。從MM294cI+中純化質(zhì)粒DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株AR120。在此宿主菌株中，噬菌體啟動子的表達可按F.A.Ausubel et al.，同上中描述的經(jīng)在生長培養(yǎng)物中加入萘啶酮酸來誘導(dǎo)。用萘啶酮酸誘導(dǎo)含有此質(zhì)粒的AR120，接著經(jīng)用考馬斯藍染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析細胞蛋白質(zhì)(F.A.Ausubeet al.，同上)導(dǎo)致出現(xiàn)表觀分子量為15,000的蛋白質(zhì)帶。在未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞中或在含有缺乏PCR擴增片斷的pEAlKnRBS3的誘導(dǎo)過的細胞中觀察不到該帶。West-ern印跡證實誘導(dǎo)蛋白質(zhì)帶與抗-DET1單克隆抗體178.1反應(yīng)。
步驟2含有標記物和腸激酶蛋白酶切割位點的人src SH2域(DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-src SH2的克隆，表達和純化。
使用以下引物從含有人src基因的cDNA克隆中PCR擴增編碼蛋白質(zhì)ek-src SH2的DNA序列(與Takeya，T和Hanafusa，H，1983 Cell 32881-890中描述的相同的c-src SH2 DNA序列)5’CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGCTGAGGAGTGGTATTTT 3’(SEQ ID NO19)下面劃線的位點是BamHI識別位點5’GGAATTCTAGACTATTAGGACGTGGGGCACACGGT 3’(SEQ ID NO20)下面劃線的區(qū)是XbaI識別位點。
用BamHI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，接著在瓊脂糖凝膠上分離消化的片斷。將該片斷連接到經(jīng)BamHI-XbaI消化的含有如上步驟1所述的經(jīng)標記雞src基因DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2的表達載體上。在該載體中，BamHI位點位于DET2和SH2編碼區(qū)之間，且XbaI位點位于SH2編碼區(qū)的3′-未端之后。將連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294cI+。構(gòu)建體DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-src SH2由DNA測序(SEQ ID NO5)證實，并按以上步驟1描述的方法在大腸桿菌菌株AR120中誘導(dǎo)。在萘啶酮酸誘導(dǎo)后觀察到一經(jīng)考馬斯藍染色的、Western印跡為陽性、表觀分子量為16,000的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)帶。
在有溶菌酶存在下于中性PH中經(jīng)超聲處理使細胞裂解，離心后，將可溶性提取物在Ni++NTA柱上分離層析。在用平衡緩沖液(PH8，含有0.5M NaCl的Tris緩沖液)和含有15mM咪唑的相同緩沖液洗滌柱子后，用含25mM咪唑的平衡緩沖液以高純形式洗脫蛋白質(zhì)。在以下描述的“結(jié)合試驗”中發(fā)現(xiàn)用這種方式純化的SH2域用高的親和力以特異性的可飽和的方式結(jié)合到合適的pY肽上，這說明標記物不影響功能。為了測定化合物選擇性抑制人src SH2域的特異性，可將此經(jīng)表達的融合蛋白DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-src SH2用于以下所述的“結(jié)合試驗”中。
步驟3含有標記物和腸激酶蛋白酶切割位點的人lck SH2域(DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-lck SH2)的克隆和表達。
使用以下引物從含有人lck基因的cDNA克隆(Genbank入藏號M36881)中PCR擴增編碼蛋白質(zhì)ek-lck SH2的DNA序列。5’CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGAGCCCGAACCCTGGTTCTT 3’(SEQ ID NO21)下面劃線的位點是BamHI識別位點。5’GCTCTAGACTATTACTGGGGCTTCTGGGTCTG 3′(SEQ ID NO22)下面劃線的區(qū)是XbaI識別位點。
用BamHI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，接著在瓊脂糖凝膠上分離消化的片斷。將該片斷連接到經(jīng)BamHI-XbaI消化的含有以上步驟1所述的經(jīng)標記雞src基因DET1-DET2-間隔區(qū)-SH2的表達載體上。在該載體中，BamHI位點位于DET2和SH2編碼區(qū)之間，且XbaI位點位于SH2編碼區(qū)的3′-未端之后。因此，ek-lck SH2序列在上述載體中取代了src SH2序列。將連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294cI+。含有DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-lck SH2的構(gòu)建體由DNA測序(SEQ ID NO6)證實，并按以上步驟1所述的方法在大腸桿菌菌株AR120中誘導(dǎo)。在萘啶酮酸誘導(dǎo)后觀察到一經(jīng)考馬斯藍染色的，Western印跡為陽性表觀分子量為17,000的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)帶。
在有溶菌酶存在下于中性pH中經(jīng)超聲處理使細胞裂解，離心后，將可溶性提取物在Ni++NTA柱上分離層析。在用平衡緩沖液(pH8，含有0.5M NaCl的Tris緩沖液)和含有15mM咪唑的相同緩沖液洗滌柱子后，用含25mM咪唑的平衡緩沖液以高純形式洗脫蛋白質(zhì)。在以下描述的“結(jié)合試驗”中發(fā)現(xiàn)用這種方式純化的SH2域用高的親和力以特異性的可飽和的方式結(jié)合到合適的pY肽上，說明標記物不影響功能。為了測定化合物選擇性抑制人lck SH2域的特異性，將此表達融合蛋白DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-lck SH2用于以下所述的“結(jié)合試驗”中。
步驟4含有標記物和腸激酶蛋白酶切割位點的人hcp SH2域(DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-hcp SH2)的克隆和表達。
從人胎肝RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR-擴增編碼蛋白質(zhì)ek-hcp SH2的DNA序列。按制造商的說明使用Tri-Reagent(Molecular Researeh Center lnc.)和逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)(GIBCO-BRL)以分離RNA。使用以下引物進行PCR5’GAAGATCTTGGACGACGACGACAAATCCCGTGGGTGGTTTCAC3’(SEQ ID NO23)下面劃線的位點是BglII識別位點。5’ GCTCTAGACTATTAACTAGTGGGATCGGAGCA 3’ (SEQ ID NO24)下面劃線的區(qū)域是XbaI識別位點。
用BglII和XbaI消化PCR產(chǎn)物，接著在瓊脂糖凝膠上分離消化的片斷。將該片斷連接到以上步驟2所述的BamHI-XbaI消化的含有標記人src基因DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-src SH2的表達載體上。在該載體中，BamHI位點位于DET2和ek編碼區(qū)之間，且XbaI位點位于SH2編碼區(qū)的3′-未端之后。因此在上述載體中，ek-hcp SH2序列取代了ek-src SH2序列。將連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294cI+。含有DET1-DET2-間隔區(qū)-ek-hcp SH2的構(gòu)建體經(jīng)DNA測序證實(SEQ ID NO7)，且將之用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌GI698(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。菌體λ啟動子的誘導(dǎo)作用按制造商的說明通過在培養(yǎng)基中加入色氨酸至10mg/ml來誘導(dǎo)。在30℃細胞生長的色氨酸誘導(dǎo)后觀察到一經(jīng)考馬斯藍染色的，Western印跡為陽性表觀分子量為15,000的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)帶。
在溶菌酶的存在下于中性pH中經(jīng)超聲處理使細胞裂解。離心后，不溶的離心沉淀用含8M尿素的Tris緩沖液(pH8)溶解，并結(jié)合到Ni++NTA柱上。用平衡緩沖液(含0.5MNaCl、8M尿素和5mMBME的Tris緩沖液，pH8)和含有15mM咪唑的相同緩沖液洗滌該樹脂。蛋白質(zhì)在5mM BME存在下在除去尿素期間在柱上重折疊，用含300mM咪唑的Tris緩沖液(pH8)洗脫純化的重折疊蛋白質(zhì)。在以下所述的“結(jié)合試驗”中發(fā)現(xiàn)以這種方式純化的SH2域用高的親和力以特異性的可飽和的形式結(jié)合到合適的pY肽上，說明標記物不影響功能且蛋白質(zhì)成功地重折疊。為了測定化合物選擇性抑制人hcpSH2域的特異性，這種表達的融合蛋白DETI-DET2-間隔區(qū)-ek-hcp-SH2用于以下描述的“結(jié)合試驗”中。
按從Pharmacia(New Jersey)獲得的GST基因融合試劑盒系統(tǒng)中描述的方法制備具有結(jié)構(gòu)GST-X-SH2的融合蛋白質(zhì)。GST是fyn、Grb2和SH-PTP2的標記序列谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表位(SEQ ID NO8)，且是p85的標記序列谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表位(SEQ ID NO9)。SH2指fyn、Grb2、P85和SH-PTP2的SH2域，它是按照“Current Protocols in Molecular Biology”，ed.FM Ausubel et al.，pub.John Wiley and Sons，Inc.，(1995)，p16.7.1所述的方法使用谷胱甘肽 Sepharose4B(Pharmacia)表達和純化的。X是合適的接頭，優(yōu)選的為6到21個堿基對，用于將SH2構(gòu)建體保持在讀框和互補克隆中。因此，X序列不是關(guān)鍵性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地構(gòu)建合適的接頭。設(shè)計編碼每-GST-X-SH2融合蛋白的DNA序列以便指示的限制性位點(BamHI和EcoRI)位于SH2區(qū)的側(cè)翼。用于本實驗中的載體是fyn、Grb2和SH-PTP2的大腸桿菌表達載體pGEX-2T(Pharmacia)和p85的大腸桿菌表達載體pGEX-3X(Pharmacia)。這些載體中的每一個產(chǎn)生如下所述的含有額外C-未端氨基酸的SH2構(gòu)建體。
將編碼人fyn SH2區(qū)的序列(氨基酸143-252)(yamamoto，T.et al.Proc.Natl Acad Sci USA 83，5459-5463(1986)克隆到表達載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的PCR技術(shù)克隆包含額外C-未端氨基酸亮氨酸一蘇氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-絲氨酸(SEQ ID NO10)的SH2域，以產(chǎn)生表達融合蛋白GST-X-fyn。為了測定化合物選擇性抑制人fyn SH2域的特異性，然后將此表達的融合蛋白用于下述的“結(jié)合試驗”中。
人p85 SH2域?qū)⒕幋a人p85 SH2域的序列(氨基酸321-440)(Skolnik，E.et al.，Cell 65，83-90(1991))克隆到表達載體pGEX-3X的BamHI和EcoRI位點。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的PCR技術(shù)克隆包含附加C-未端氨基酸天冬酰胺-絲氨酸-絲氨酸(SEQ ID NO11)的SH2域，以產(chǎn)生表達融合蛋白GST-X-p85。為了測定化合物選擇性抑制人p85 SH2域的特異性，然后將此表達融合蛋白用于下述的“結(jié)合試驗”中。
人SH-PTP2 SH2域?qū)⒕幋a人SH-PTP2的SH2域的序列(氨基酸1-106)(Bastien，L.et al，BiochemBiophys，Res Commun 196，124-133(1993)克隆到表達載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的PCR技術(shù)克隆包含額外C-未端氨基酸谷氨酰胺-苯丙氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸(SEQ ID NO12)的SH2域，以產(chǎn)生表達融合蛋白GST-X-SH-PTP2。為了測定化合物選擇性抑制人SH-PTP2 SH2域的特異性，然后將此表達融合蛋白用于下述的“結(jié)合試驗”中。
人Grb2 SH2域?qū)⒕幋a人Grb2的SH2域的序列(氨基酸58-159)(lowenstein，E.et al.，Cell70，431-442(1992))克隆到表達載體pGEX-2T的BamHI和EcoRI位點。用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的PCR技術(shù)克隆包含額外C-未端氨基酸異亮氨酸一組氨酸-精氨酸-天冬氨酸(SEQ ID NO25)的SH2域，以產(chǎn)生表達融合蛋白GST-X-Grb2。在GST和SH2域之間使用一個六核苷酸接頭并形成氨基酸甘氨酸和絲氨酸。為了測定化合物選擇性抑制人Grb2 SH2域的特異性，然后將此表達融合蛋白用于下述的“結(jié)合試驗”中。
結(jié)合試驗根據(jù)這種化合物選擇性抑制SH2域結(jié)合到各自的特異性pY肽的能力測定該化合物在所述SH2域的潛能。
SH2域和pY肽的結(jié)合試驗用ELISA基96孔培養(yǎng)板試驗完成。在96孔微孔濾膜板上，向親水DuraporeR(孔徑0.65um，Cat No.MADVN6550)加入2ul(50％懸液)G蛋白Sepharose(從Pharmacia N.J.獲得，Cat No l7-0618-01)和2ul 2mg/ml的MAB178.1(對gp120/SH2域融合蛋白src、lek和hcp而言)或0.25ul抗-GST多克隆抗血清(從Pharmacia N.J.獲得)(對GST/SH2域融合蛋白fyn、Grb2、p85和SH-PTP2而言)。將10pmol待試SH2域融合蛋白加入到它們各自的孔中。用TBS-T(tris緩沖鹽水加0.05％吐溫-20)將體積加到100ul，在室溫下培養(yǎng)和振蕩1小時。然后，用TBS-T(4℃)洗滌一次。再將90ul TBS-T加入到每一孔中。用TBS-T將特異性pY生物素化的肽稀釋到濃度為1.0uM(這些肽可以從Bachem Bioscience ofPennsylvania，Genosys Biotechnologies of Texas andCalifornia Peptide Researeh of California獲得)。將10ul等分到每孔中以得到0.1uM的終濃度(接近每一SH2域/肽對的Kd)和100ul的終體積。培養(yǎng)這些試驗板直到達到結(jié)合平衡(4℃下振蕩3小時)。試驗板每孔用TBS-T(4℃)洗滌兩次，然后向每孔中加入100ulSABC(鏈霉親和素生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物，從Califonia的Zymed corporation獲得，Cat.no.93-0043，每10ml TBS-T中加入1滴試劑A(鏈霉親和素)和1滴試劑B(AH-生物素結(jié)合的辣根過氧化物酶)，在37℃溫育30分鐘，然后冷卻到4℃)，接著在4℃溫育30-60分鐘。再用TBS-T洗滌試驗板四次(4℃)(250ul/孔/次)。向每孔中加入100ul含1mg/mlOPD (O-苯基二胺，Sigma Chemical Corporation，St.Louis Missouri)的檸檬酸鹽緩沖液。為了終止反應(yīng)，向每孔中加入100ul 10％硫酸。然后，從試驗板的每孔移去150ul，置入ELISA培養(yǎng)板中。接著測定每-ELISA培養(yǎng)板的A490。
表I(IC50)的測定重復(fù)試驗每一對照或化合物。平均這些重復(fù)值，從平板獲得要減去的背景值和無抑制作用的最大值，然后，將所有其它數(shù)據(jù)點表示成最大值的百分數(shù)(或表示為％對照)。這些％對照數(shù)據(jù)值用Macintosh的Kaleidagraph(配合軟件)作圖。這些圖上的曲線符合公式F(X)＝Emax/(1＋(Kd/conc)λSlope)的非線性曲線，其中符號Kd代表每一曲線的IC50。
表II(Ki)的測定由下面的公式計算各個化合物的Ki(參見參考文獻)。由于pY生物素化的肽濃度并未超過SH2域融合蛋白很多(100X)，因此，在此試驗條件下，必須使用這一展開的公式。IC50是用Kaleidagraph從非線性曲線擬合(curve fit)外推法求得的。Rtot和*D是引入到試驗中的試劑的已知值。KD一般必須對每一SH2域融合蛋白和pY生物素化的肽的組合實驗測定。KI＝(IC50－Rtot＋Rtot/2((*D/(KD＋*D))＋(KD/(KD＋*D＋Rtot/2)))/(1＋*D/KD＋Rtot/KD((KD＋*D/2)/(KD＋*D)))KI＝(um)競爭劑的KDIC50＝(uM)經(jīng)每一SH2域競爭選擇性試驗數(shù)據(jù)的非線性曲線擬合衍生的抑制劑IC50Rtot＝(uM)在1個試驗(微量滴定板)孔內(nèi)的SH2域的總濃度*D＝(uM)每一SH2域的特異性pY和生物素化的肽的濃度KD＝(uM)每一SH2域的特異性pY和生物素化的肽的KD值IC50是在應(yīng)答或信號被抑制50％時的抑制劑的濃度KD是在受體/配體相互作用中配體的解離常數(shù)，通常等于飽和結(jié)合曲線上1/2Vmax處的配體濃度用于上述結(jié)合試驗中的pY肽配體如下用于src、lcK和fynSH2域的含有一個氨基己酸(Aca)接頭的生物素化的pY肽配體Glu-Pro-Gln-pTyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu (SEQ ID NO13)用于P85 SH2的含有一個氨基己酸(Aca)接頭的生物素化pY肽配體Asp-Gly-Gly-pTyr-Met-Asp-Met-Ser-Lys-Asp-Glu (SEQ ID NO14)用于SH-PTP2 SH2的含有一個氨基己酸(Aca)接頭的生物素化pY肽配體Glu-Asn-Gly-Leu-Asn-pTyr-Ile-Asp-Leu-Asp-Leu (SEQ ID NO15)用于hcp SH2的含有一個氨基己酸(Aca)接頭的生物素化pY肽配體Thr-Pro-Pro-His-Leu-Lys-pTyr-Phe-Tyr-Phe-Val-Val-Ser-Asp-Ser-Gly(SEQ ID NO16)用于Grb2 SH2的含有一個氨基己酸(Aca)接頭的生物素化pY肽配體Leu-Pro-Val-Pro-Glu-pTyr-Ile-Asn-Gln-Ser-Val(SEQ ID NO26)結(jié)合試驗的結(jié)果表I和II說明SH2拮抗劑在指示的SH2域的交叉反應(yīng)性。僅化合物7在src SH2域具有比高于50倍在其它SH2域的結(jié)合親和力/抑制濃度更大的結(jié)合親和力/抑制濃度。
表ISrc SH2域拮抗劑在克隆化人 SH2域的交叉反應(yīng)性(IC50)化合物Src Lck Fyn SH-PTP2 p85 Grb2 Hcp1 6uM 6uMNI NI NINIX2 NI NI NI NI NINI0.9uM3 16.1uM 22.9uM NI NI NINI1.2uM4 40uM163uM NI XNINI30uM5 63uM100uM NI NI NINI0.1uM6 20uMNI NI XNINIX7 7.4uM 383uM NI NI NININI8 16uM126uM NI NI NINI＞100uM9 131uM 200uM NI NI NINI12uM10 X X NI NI NINI1.2uMNI-300uM以上未觀察到抑制作用X-未試驗表IISrc SH2域拮抗劑在克隆比人SH2域的交叉反應(yīng)性(Ki)化合物Src LckFynSH-PTP2p85Grb2Hcp1 7uM X NI NINI NI X2 NI NI NI NINI NI X3 6uM 11uM NI NINI NI X4 40uM163uM NI XXNI NI X5 28uM149uM NI NINI NI X6 13uM50uM NI NINI NI X7 20uM320uM NI NINI NI X8 12uM360uM NI NINI 330X9 55uM146uM NI NINI NI X10 XX XX NI NINI NI XNI-1000uM以上未觀察到抑制作用X-未計算XX-未試驗實施例12src SH2域拮抗劑的活性用胎鼠長骨(FRLB)試驗試驗4-[4-(4-甲基苯甲?；?苯甲?；鵠苯乙醛(化合物4)抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收的潛能。Raisz LG (1965)J.Clin Invest44103-116；Stern PH et al.，(1979) Skeletal ResearchAnexperimental Approach.New yorkAcademic Press，21-59和Votta BJ etal.，(1994)Bone 15533-538中描述了此試驗。
為了完成實驗，在妊娠的第18天向定時懷孕的Sprague Dawley大鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)皮下注射200μci45CaCl2，室內(nèi)圈養(yǎng)一夜，然后用Innovar-Vet (Pittman-Moore，Mundelein，IL)麻醉，由頸部脫位宰殺。無菌移去胎兒，切下無周圍軟組織和軟骨未端的撓骨和骨。在含有1mg/ml牛血清白蛋的BGJb培養(yǎng)基(Sigma)中培養(yǎng)上述骨18-24小時，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中在無或有化合物4的存在下培養(yǎng)另外的48小時。用液體閃爍光譜法測定釋放到培養(yǎng)基中的45Ca和骨中的總鈣。數(shù)據(jù)表示為從處理過的骨釋放的不Ca與相應(yīng)的對照骨比較的百分比。通過采用非配對樣品差異的單向分析估計統(tǒng)計學(xué)上的差異。數(shù)據(jù)表示成平均值±s.e.m.，n＝4。實驗重復(fù)兩次。
在上述試驗中，4-[4-(4-甲基苯甲酰基)苯甲?；鵠苯乙醛(化合物4)表現(xiàn)出19uM的IC50值。
上述數(shù)據(jù)表明，src SH2域拮抗劑在治療骨吸收病上的治療效果。
盡管以上舉例說明了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。但應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于這里所公開的準確說明的內(nèi)容，且來源于本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的任何改變均是受到保護的。
序列表(1)綜合信息(i)申請人DUNNINGTON，DAMIEN(ii)發(fā)明名稱治療骨吸收病的SRC SH2特異性化合物的用途(iii)序列數(shù)26(iV)通訊地址(A)聯(lián)系人Smithkline Beecham Corporation(B)街709 Swedeland Road(C)城市King of Prussia(D)洲PA(E)國家USA(F)郵區(qū)偏號19406(V)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計算機IBM(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Fast SEQ片本1.5
(vi)現(xiàn)行申請的資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請的資料(A)申請?zhí)?8/386，381(B)申請日10-FEB-1995(A)申請?zhí)?8/400，220(B)申請?zhí)?995年3月7日(A)申請?zhí)?8/497，357(B)申請日1995年6月30(viii)代理人/代理機構(gòu)信息(A)姓名Dustman，Wayne J(B)登記號33，870(C)查詢/提要號P50323-2S2(ix)電信信息(A)電話610-270-5023(B)傳真(C)電報(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO2His His His His His His1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度3個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO3Gly Ile Leu1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Asp Asp Asp Lys15(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度130個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Glu Glu Trp Tyr Phe20 25 30Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu35 40 45Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly50 55 60Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn65 70 75 80Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile85 90 95Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr100 105 110Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro115 120 125Thr Ser130(2) SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度134個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(iv)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro Glu Pro Trp phe20 25 30phe Lys Asn Leu Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro
35 40 45Gly Asn Thr His Gly Ser Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Thr Ala50 55 60Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu65 70 75 80Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr85 90 95Ile Ser Pro Arg Ile Thr Phe Pro Gly Leu His Glu Leu Val Arg His100 105 110Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ser Arg Pro Cys115 120 125Gln Thr Gln Lys Pro Gln130(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度133個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln ArG Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ser Arg Gly Trp Phe His20 25 30Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly35 40 45Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp50 55 60Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile65 70 75 80Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala85 90 95Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu100 105 110Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys115 120 125Ser Asp Pro Thr Ser130(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度224個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220(2)ID NO9信息(i)序列特征(A)長度225個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Set Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly210 215 220Arg225(2)SQE ID NO10信息(i)序列特征(A)長度117個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu Gly Arg Lys Asp1 5 10 15Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Ash Pro Arg Gly Thr Phe Leu20 25 30Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg35 40 45Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr Lys Ile Arg50 55 60Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg Ala Gln Phe Glu65 70 75 80Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg Glu Arg Ala Ala85 90 95Gly Leu Cys Cys Arg Leu Val Val Pro Cys His Lys Gly Met Pro Arg100 105 110Leu Thr Asn Ser Ser115(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度123個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Met Asn Asn Asn Met Ser Leu Gln Asn Ala Glu Trp Tyr Trp Gly1 5 10 15Asp Ile Ser Arg Glu Glu Val Asn Glu Lys Leu Arg Asp Thr Ala Asp20 25 30Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ala Ser Thr Lys Met His Gly Asp Tyr35 40 45Thr Leu Thr Leu Arg Lys Gly Gly Asn Asn Lys Leu Ile Lys Ile Phe50 55 60His Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Ser Asp Pro Leu Thr Phe Ser Ser65 70 75 80Val Val Glu Leu Ile Asn His Tyr Arg Asn Glu Ser Leu Ala Gln Tyr85 90 95Asn Pro Lys Leu Asp Val Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ser Lys Tyr Gln100 105 110Gln Asp Gln Val Val Lys Glu Asp Asn Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度112個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala1 5 10 15Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg20 25 30Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn35 40 45Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp50 55 60Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr65 70 75 80Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile85 90 95Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Gln Phe Ile Val Thr Asp100 105 110(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置4...4(D)其它信息磷酸化的酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO13Glu Pro Gln Tyr Glu Glu Ile Pro Ile Tyr Leu1 5 1015(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無
(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(A)名稱/關(guān)鏈詞其它(B)位置4...4(D)其它信息磷酸化酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO14Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置6…6(D)其它信息磷酸化酪氨酸殘基
(xi)序列描述SEQ ID NO15Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu1 5 1015(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置7…7(D)其它信息磷酸化酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO16Thr Pro Pro His Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Val Val Ser1 5 10Asp Ser Gly15
(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度87個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO17TTCCATATGA AAAGTATTCG TATTCAGCGT60GGCCCGGGCC GTCACCACCA CCACCACCACGGGATCCCCG CTGAAGAGTG GTACTTT87(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO18GGAATTCTAG ATTACTAGGA CGTGGGGCAG38ACGTT(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO19CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGCTGA46GGAGTGGTATTTT(2)SEQ ID NO20信息
(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAATTCTAG ACTATTAGGA CGTGGGGCAC38ACGGT(2)SEQ ID NO2l信息(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型
(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO21CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGAGCC48CGAACCCTGGTTCTT(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來原(xi)序列描述SEQ ID NO22GCTCTAGACT ATTACTGGGG CTTCTGGGTC35TG(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO23GAAGATCTTG GACGACGACG ACAAATCCCG46TGGGTGGTTTCAC(2) SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO24GCTCTAGACT ATTAACTAGT GGGATCGGAG
35CA(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度106個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(iv)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO25His Pro Trp Phe Phe Gly Lys Ile Pro Arg Ala Lys Ala Glu Glu Met1 5 10 15Leu Ser Lys Gln Arg His Asp Gly Ala Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu20 25 30Ser Ala Pro Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Lys Phe Gly Asn Asp Val35 40 45Gln His Phe Lys Val Leu Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp50 55 60Val Val Lys Phe Asn Ser Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser65 70 75 80Thr Ser Val Ser Arg Asn Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln85 90 95Val Pro Gln Gln Pro Thr Ile His Arg Asp100 105(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假擬無(iv)反義無(v)片斷類型內(nèi)(vi)原始來源(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置6…6(D)其它信息磷酸化酪氨酸殘基(xi)序列描述SEQ ID NO26Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val1 5 10
權(quán)利要求
1.一種化合物在制造用于治療骨吸收病的藥物上的用途，所述化合物a.以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大結(jié)合親和力結(jié)合到人srcSH2域；b.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2 SH2域；d.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
2.按照權(quán)利要求書1的用途，其中的化合物以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
3.按照權(quán)利要求1的用途。其中化合物a.以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域；b.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2-SH2域；d.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
4.按照權(quán)利要求3的用途，其中的化合物以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
5.一種化合物在制造用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物上的用途，所述化合物a.以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lckSH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人srcSH2域；b.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于50倍該化合物合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2 SH2域；d.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
6.按照權(quán)利要求5的用途，其中的化合物以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合劑人src SH2域。
7.按照權(quán)利要求5的用途，其中化合物a.以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域；b.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2 SH2域；d.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
8.按照權(quán)利要求7的用途，其中的化合物以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
9.一種化合物在制造用于削弱破骨細胞功能的藥物上的用途，所述化合物a.以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人srcSH2域；b.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2 SH2域；d.以比低于50倍該化合物結(jié)合以所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于50倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
10.按照權(quán)利要求9的用途，其中的化合物以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
11.按照權(quán)利要求9的用途，其中化合物a.以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域；b.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcp SH2域；c.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人SH-PTP2 SH2域；d.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人p85 SH2域；和e.以比低于100倍該化合物結(jié)合到所述src SH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人Grb2 SH2域。
12.按照權(quán)利要求11的用途，其中的化合物以比高于100倍該化合物結(jié)合到人lck SH2域和人fyn SH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人src SH2域。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療受治療者骨吸收病的方法，該方法包括給受治療者施用治療有效量的一種化合物，所述化合物以比高于50倍該化合物結(jié)合到人lckSH2域和人fynSH2域的結(jié)合親和力更大的結(jié)合親和力結(jié)合到人srcSH2域，以比低于50倍該化合物結(jié)合到這種srcSH2域的結(jié)合親和力更小的結(jié)合親和力結(jié)合到人hcpSH2域、人Grb2SH2域、人SH-PTP2SH2域和人p85SH2域。
文檔編號A61K31/38GK1135333SQ9610436
公開日1996年11月13日 申請日期1996年2月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月10日
發(fā)明者D·J·鄧寧頓 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司