專利名稱：制備棘酸的方法和含有棘酸的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備棘酸(acanthoic acid)((-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸)的方法和含有該酸的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療由白細(xì)胞介素-1(下文中稱為“IL-1”)或腫瘤壞死因子-α(下文中稱為“TNF-α”)的過量產(chǎn)生引起的疾病。
背景技術(shù)：
韓國五茄屬Nakai(Acanthopanax koreanum Nakai)(五茄科)上生土長于韓國的Cheju島，慣常用作為治療神經(jīng)痛，癱瘓，腰痛等等的藥物。已經(jīng)從其根皮分離出包括下列通式(A)的棘酸的各種有用成份(Kim，Y.H.和Chung，B.S.，J.Nat.Pro.，51，1080(1988))。 已經(jīng)有人報(bào)道棘酸具有各種藥理作用，例如，止痛和消炎活性，這種活性是由于其能夠抑制白細(xì)胞的遷移和前列腺素E2(PGE2)合成引起的，并且顯示了非常低的毒性，例如，施用到大鼠時最低致死劑量(MLD)為1000mg/kg(Lee，Y.S.，“(-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸)，韓國五茄屬Nakai的一種成份的藥理研究”，博士論文，韓國漢城大學(xué)，藥學(xué)系，1990)。
正如公知的，IL-1是一種參與寬范圍的人類防御和免疫機(jī)理的調(diào)節(jié)因子(參見，例如，Dinarello，D.A.，F(xiàn)ASEB J.，2，108(1988))。最初發(fā)現(xiàn)IL-1是由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，現(xiàn)在已經(jīng)用各種細(xì)胞，例如，成纖維細(xì)胞，角質(zhì)化細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞和腦的星形細(xì)胞產(chǎn)生和分泌IL-1；并且已經(jīng)有人報(bào)道它具有各種功能包括刺激CD4＋T細(xì)胞的增殖(Mizel，S.B.，Immunol..Rev.，63，51(1982))；通過與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合刺激胸腺Tc細(xì)胞的細(xì)胞致死作用(McConkey，D.J.，等人，J.Biol.Chem.，265，3009(1990))；誘導(dǎo)各種參與炎性機(jī)理的物質(zhì)，例如，PEG2，磷脂酶A2(PLA2)，和膠原酶的產(chǎn)生(Dejana，E.，等人，Bolid，69，695-699(1987))；誘導(dǎo)肝中急性期蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(Andus，T.，等人.，Eur.J.Immnol.，123，2928(1988))；升高血管系統(tǒng)的血壓(Okusawa，S.，等人，J.Clin.Invest.，81，1162(1988))；誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子例如，IL-6和TNF的產(chǎn)生(Dinarello，C.A.，等人，J.Immunol.，139，1902(1987))等等。
正如已經(jīng)報(bào)道的，IL-1涉及各種免疫疾病，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Nouri，A.M.，等人，Clin.Exp.Immunol.，58，402(1984))，腎臟移植后的排斥機(jī)理(Mauri和Teppo，Transplantation，45，143(1988))，和敗血病(Cannon，J.G.，等人，LymphokineRes.，7，457(1988))。還有人報(bào)道當(dāng)以大劑量施用到人體時IL-1可以誘導(dǎo)發(fā)熱和疼痛(Smith，J.，等人，Am.Soc.Clin.Oncol.，9，710(1990))。
已經(jīng)有人報(bào)道最初在用BCG(BacilleCalmette-Guerin)或LPS(脂多糖)治療的動物血清中發(fā)現(xiàn)的TNF-α(Carswell，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，72，3666(1975))，可由各種細(xì)胞產(chǎn)生，例如，活化的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。此外，有人報(bào)道TNF-α具有下列功能殺死纖維肉瘤L929細(xì)胞(Espevik和NissenMeyer，J.Immunol.Methods，95，99(1986))；刺激成纖維細(xì)胞的增殖(Sugarman，B.J.，等人，Science，230，943(1985))；誘導(dǎo)參與炎性應(yīng)答的PGE2，花生四烯酸等等的產(chǎn)生(Suttys，等人，Eur.J.Biochem.，195，465(1991))；誘導(dǎo)IL-6或其它生長因子的產(chǎn)生(Van Hinsbergh，等人，Blood，72，1467(1988))等等。
已經(jīng)有人報(bào)道TNF-α直接或間接地與各種疾病有關(guān)；所述疾病的例子是由錐蟲，瘧原蟲屬菌株等等傳播的傳染病(Cerami，A.，等人，Immunol.Today，9，28(1988))；類似系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病(Fiers，W.，F(xiàn)EBS，285，199(1991))；AIDS(Mintz，M.，等人，Am.J.Dis.Chlld.，143，771(1989))；敗血癥(Tracey，K.J.，等人，Curr.Opin.Immunol.，1，454(1989))；和感染(Balkwill，F(xiàn).R.1989，Cytokines in CancerTherapy，Oxford University Press)。
這些觀察資料支持了調(diào)節(jié)IL-1和TNF-α的產(chǎn)生對于維持人體免疫系統(tǒng)的自身穩(wěn)定和對于相關(guān)疾病的治療和預(yù)防的重要性。
因此，已經(jīng)有人建議了許多調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素產(chǎn)生的方法。例如，有人報(bào)道通過利用天然存在的IL-1受體抑制劑(IL-1 Ra)抑制IL-1與其受體的結(jié)合可以降低動物模型中敗血癥，關(guān)節(jié)炎，炎癥等等的發(fā)生(Dinarello，C.A.和Thomopson，R.C.，Immunol.Today，12，404(1991))，和已經(jīng)有人建議了利用特定的抗體抑制IL-1活性的方法(Giovine，D.F.S.和Duff，G.W.，Immunol.Today，11，13(1990))。對于IL-6，通過利用抗IL-6的或IL-6受體的抗體已經(jīng)抑制了患有由于IL-6的過量分泌引起的骨髓瘤的患者的骨髓細(xì)胞的增殖(Suzuki，H.，Eur.J.Immuno.，22，1989(1992))。
但是，沒有人報(bào)道特異性抑制IL-1和TNF-α產(chǎn)生的物質(zhì)或方法，因此，需要繼續(xù)努力發(fā)現(xiàn)抑制IL-1和TNF-α產(chǎn)生的特異性抑制劑。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于從韓國五茄屬Nakai的根皮制備棘酸的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有治療有效量的棘酸和藥物可接受的載體的藥物組合物，該藥物組合物可用于治療由于IL-1或TNF-α的過量產(chǎn)生引起的免疫疾病。
附圖簡述結(jié)合附圖根據(jù)本發(fā)明的描述顯而易見地知道本發(fā)明的上述和其它目的和特征，其中

圖1顯示棘酸對人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性；圖2描述了棘酸對人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中IL-1的產(chǎn)生的抑制作用；圖3提供了棘酸對人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生的抑制作用；圖4表示了棘酸對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生的抑制作用；圖5證實(shí)了棘酸對人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的反應(yīng)氧類產(chǎn)生的抑制作用；圖6表示了棘酸對NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用；圖7表示棘酸對大鼠肺成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生的抑制作用；圖8反映了棘酸對大鼠肺組織中膠原的產(chǎn)生的抑制作用；圖9顯示棘酸對大鼠肝硬變的抑制作用；圖10證實(shí)了棘酸對患有誘發(fā)性肝硬變的大鼠血清中的GOT和GPT含量的作用；以及圖11記錄了棘酸對鼠肝硬變的作用。
發(fā)明的詳細(xì)說明本文所引用的全部參考文件這里都把它們的全文作為參考。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了從韓國五茄屬Nakai提取的棘酸具有特異性抑制IL-1或TNF-α產(chǎn)生的能力；所以，含有有效量的棘酸可用于治療各種由IL-1或TNF-α過量產(chǎn)生引起的免疫疾病。
所述棘酸可以使用各種有機(jī)溶劑如甲醇，二乙醚，或其混合物等等從韓國五茄屬Nakai根皮提取。特別是，可按照本發(fā)明描述的下文中的優(yōu)選實(shí)施例制備棘酸。
向1千克的韓國五茄屬Nakai于燥根中加入1-3升，優(yōu)選2升甲醇；在20-60℃溫度，優(yōu)選的是室溫下把該混合物加熱至少10小時，優(yōu)選的是12小時，并過濾。重復(fù)上述步驟，優(yōu)選重復(fù)三次，在減壓下濃縮合并的濾液獲得甲醇提取物。
用200-400毫升，優(yōu)選300毫升水和200-400毫升，優(yōu)選300毫升二乙醚萃取100克所述甲醇提取物。從中分離出二乙醚部分并減壓濃縮獲得二乙醚提取物。利用己烷和乙酸乙酯的混合物作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析純化所述提取物而獲得棘酸。
所述棘酸具有抗炎和抗纖維形成作用，抑制膠原合成和反應(yīng)氧類產(chǎn)生并且降低血清中的GOT和GPT的含量。所以，可用于藥物組合物治療由于IL-1或TNF-α的過量產(chǎn)生引起的免疫疾病，如敗血癥，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，肝硬變和矽肺。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥物可接受的賦形劑，載體或稀釋劑和作為活性成分的棘酸?？梢圆捎萌魏纬Ｒ?guī)方法制備該藥物制劑。
在制備組合物中，最好把該活性成分用一種載體混合或稀釋，或者用一種載體包埋，這種載體可以是膠囊，香囊或其他裝載形式。當(dāng)載體是稀釋劑時，它可以是具有作為活性成分的載體，賦形劑或介質(zhì)的固體，半固體或液體物質(zhì)。所以，該組合物可以是片，丸，粉末，香囊，醑劑，懸浮液，乳濁液，溶液，糖漿，氣霧劑，軟和硬明膠膠囊，無菌注射液，無菌包裝的粉末等等。
適當(dāng)?shù)妮d體，賦形劑或稀釋劑的例子有乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯樹膠，藻酸鹽，明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羥基苯甲酸鹽，丙基羥基苯甲酸鹽，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。
該制劑中還可以加入潤滑劑，濕潤劑，矯味劑，懸浮劑，防腐劑等等。本發(fā)明組合物可以采用本領(lǐng)域所熟知的任何方法進(jìn)行制備，以便在患者服用后提供快速，持續(xù)或緩慢釋放活性成分。
該藥物組合物能夠通過各種途徑如口，經(jīng)皮，皮下，靜脈和肌肉引入進(jìn)行給藥。通?；钚猿煞值拿咳沼昧靠梢栽?-500μg/kg體重，優(yōu)選30-300μg/kg體重，并且能夠一次或多次服用。但是，應(yīng)當(dāng)明白該活性成分的實(shí)際給藥量必須取決于各種相關(guān)因素如待治療狀況，所選擇的給藥途徑，不同患者的年齡和體重以及患者癥狀的嚴(yán)重程度；所以，上述劑量不是用于限定本發(fā)明的范圍。
下面的制備例和實(shí)施例用來更詳細(xì)地說明本發(fā)明但不限定其范圍；除非有其他說明，本文下面實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法是按照給出的參考實(shí)施例進(jìn)行實(shí)施的。
而且，除非作其他特別說明，下面所給出的固體和固體混合物，液體和液體以及固體和液體混合物的百分比是以wt/wt，vol/vol和wt/vol為準(zhǔn)。
制備例棘酸的制備把1.7千克左右的己完全干燥的韓國五茄屬Nakai根皮切細(xì)并用4升左右的甲醇在室溫下提取24小時，然后過濾。把該提取步驟重復(fù)三次并減壓濃縮合并的提取液，獲得200克左右的甲醇提取物。
用600毫升的蒸餾水和600毫升的二乙醚萃取所有所述的甲醇提取物。分離出二乙醚層并減壓濃縮，獲得110克的二乙醚提取物。
利用己烷和乙酸乙酯(20∶1(v/v)-5∶1(v/v))進(jìn)行硅膠柱層析純化所有所述二乙醚提取物獲得30克活性物質(zhì)，產(chǎn)量為1.76％。
利用薄層層析(TLC)，與標(biāo)準(zhǔn)物相比，鑒定出活性物質(zhì)為棘酸(Kim，Y.H.和Chung，B.S.，J.Nat.Pro.，51，1080(1988))，還可以進(jìn)一步由1H-NMR，13C-NMR，MS和IR確定。
參考例1用于檢測的細(xì)胞的分離(1)人單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞的分離把正常人的外周血進(jìn)行肝素處理并用等量的Hank氏平衡鹽溶液(HBSS無Ca2+和Mg2+)稀釋。把稀釋的血液放入含有堆積在密度為1.119的Ficoll-Hypaque層上的密度為1.077的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)層的離心管中，然后以700×g離心30分鐘從密度為1.077的Ficoll-Hypaque層和血清層之間獲得單核細(xì)胞，并且從密度為1.077的Ficoll-Hypaque層和密度為1.119的Ficoll-Hypaque層之間獲得嗜中性細(xì)胞。使用4℃HBSS(無Ca2+和Mg2+)洗滌兩次分離出的細(xì)胞并將其懸浮于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah，U.S.A.)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把該懸浮液加入24孔培養(yǎng)平板(Costar，Cambridge，MA，U.S.A.)的孔中并在37℃溫育2小時獲得單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞。
(2)成纖維細(xì)胞的分離使用如下對Phan，S.H.等在J.Clin.Invest.，76，241(1985)中所述的方法的改良方法從大鼠中分離成纖維細(xì)胞。
在無菌工作臺上把大鼠用乙醚麻醉并分離肺。把肺切成2-4mm大小的小片并懸浮于含有膠原酶和0.5％胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，在37℃把該組織消化2小時。用無菌紗布過濾該懸浮液除去沒消化的組織等等。使用PBS把分離出的細(xì)胞洗滌兩次或三次并懸浮于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把該懸浮液加入培養(yǎng)平板的孔中并在5％二氧化碳溫育器(Lunaire Environ，Inc.，Pennsylvania，U.S.A.)中37℃下溫育1-2天。使用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌該平板除去不能附著在平板上的細(xì)胞。向平板中加入新鮮的培養(yǎng)基并繼續(xù)溫育直到形成融合層。在下面試驗(yàn)中使用不超過5次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。
在如上所述的相同條件下在含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)NIH3T3成纖維細(xì)胞(ATCC CRL 1658)。
(3)使用棘酸處理細(xì)胞以各種不同的濃度把棘酸加入5×105/ml上述步驟獲得的細(xì)胞中，在5％二氧化碳溫育器中把細(xì)胞在37℃下預(yù)溫育1小時。然后，向其中加入硅石(100μg/ml)和含有2％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基各1毫升并且在如上述相同條件下把細(xì)胞培養(yǎng)48小時。收集培養(yǎng)物的上清液并在1,500rpm離心分離10分鐘除去這些細(xì)胞和硅石。把所獲得的上清液在PBS中進(jìn)行透析并用0.2um的過濾注射器過濾，然后，把濾液貯存在-20℃下。
參考例2棘酸細(xì)胞毒性的測定采用下列步驟測定棘酸的細(xì)胞毒性。
按照參考例1(3)的步驟，分別使用在制備例中獲得的并在相同條件下溫育的0.1，1，10或100μg/ml的棘酸處理在實(shí)施例1(1)中所獲得的各5×105個細(xì)胞/毫升的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。根據(jù)Alley，M.C.，等在CancerRes.，48，589(1988)中所描述的方法，把各培養(yǎng)物以1毫升/孔的量加入培養(yǎng)平板的孔中并向各孔加入0.5mg的3-4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基-四唑翁溴酸鹽(MTT，Sigma)。在37℃下溫育4小時后，把培養(yǎng)物離心分離除去上清液。把各100μl酸化異丙醇(0.04N HCl溶于異丙醇中)加入各孔的細(xì)胞中以洗脫由活細(xì)胞產(chǎn)生的甲，并且使用一臺ELISA讀數(shù)器(Titettek multiskan Mcc/340)在540nm測定光密度(O.D.)(圖1)。
圖1顯示了當(dāng)把沒有用棘酸處理的對照組的光密度看作100％時，樣品光密度與棘酸的濃度的相對值。當(dāng)由于棘酸的細(xì)胞毒性，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的成活率下降時，能夠引起光密度下降的甲的產(chǎn)生也在減少。直到棘酸的濃度達(dá)到10μg/ml，使用棘酸處理過的樣品與對照組也沒有顯著性差異。所以，可以確認(rèn)在低于10μg/ml的濃度下棘酸沒有細(xì)胞毒性，本文以后全部試驗(yàn)都是在這個濃度范圍內(nèi)進(jìn)行的。實(shí)施例1棘酸對入單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中IL-1產(chǎn)生的抑制使用0.1-100μg/ml的棘酸溫育參考例1(1)中獲得的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞1小時并使用100μg/ml的硅石處理48小時。把培養(yǎng)物離心分離獲得上清液，然后，將上清液在PBS中透析。下面根據(jù)Grey描述于Cellular Immunology，64，293-303(1981)的方法測定透析液中IL-1的活性。
把懸浮于含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中的1×107細(xì)胞/ml的C3H/HeJ鼠胸腺細(xì)胞用1μg/ml的植物細(xì)胞血凝集素(PHA，Burroughs Wellcome，Research TrianglePark，NC，U.S.A.)處理，把該懸浮液各100μl加入一個96孔培養(yǎng)平板(Costar，平底)的孔中。向各孔中加入50μl所述透析液和含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液。然后，在37℃5％二氧化碳下把平板溫育72小時。在溫育完成前16小時，以0.5μCi/孔將3H-胸苷加入孔中。溫育完成后，把細(xì)胞收集在玻璃纖維濾器中并使用液體閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman)測定摻入的3H-胸苷的量。
圖2顯示了當(dāng)以沒有使用棘酸處理的對照組的3H-胸苷摻入量看作100％時，摻入的3H-胸苷的量與棘酸的濃度的相對值。從圖2可以看到，棘酸是以依賴于濃度的方式抑制人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中IL-1的產(chǎn)生的。
實(shí)施例2棘酸對人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TNF-α產(chǎn)生的抑制根據(jù)實(shí)施例1中相同的方法用棘酸處理人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且根據(jù)如J.Biol.Chem.，260，2345(1985)描述的Aggarwal的方法采用細(xì)胞溶解檢測法確定TNF-α的活性。
將TNF-α依賴性L929成纖維細(xì)胞(ATCC CCL1)懸浮于含有5％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中并且以3×104細(xì)胞/孔的量加入到96孔培養(yǎng)平板中。將該板在37℃溫育2小時使細(xì)胞吸附到培養(yǎng)平板上。然后除去培養(yǎng)基并且向每個孔中加入1μg/ml的放線菌素D(Sigma)和50μl的實(shí)施例1獲得的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物透析液。將每個孔中FBS的最終濃度調(diào)至5％并且在37℃5％二氧化碳中將細(xì)胞溫育24小時。
溫育完成之后，除去培養(yǎng)基并且用PBS洗滌細(xì)胞二次，用溶于20％甲醇中的5％的結(jié)晶紫溶液染色5分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞三次并且干燥。然后，向每個孔中加入100μl的33％的乙酸使染料釋放，然后利用ELISA讀數(shù)器用570nm閱讀濾光片和405nm的參照濾光片確定每個孔中獲得的樣品的O.D.值。根據(jù)相當(dāng)于內(nèi)部對照組，即rHu TNF-α(Genzyme)的O.D.值計(jì)算出釋放染料的量。
如圖3中所示的，3.5μg/ml或以上的棘酸抑制TNF-α的產(chǎn)生至少為90％。
實(shí)施例3棘酸對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中TNF-α產(chǎn)生的抑制作用把大鼠用氯胺酮麻醉并向大鼠的氣管鰓中插入一只無菌的薄管再用一只30ml的注射器重復(fù)注射三次并吸取10mlRPMI 1640培養(yǎng)基獲得大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。把所獲得的細(xì)胞以400xg離心分離5分鐘，懸浮于50ml含有10％的FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后在37℃溫育2小時使這些細(xì)胞粘著在培養(yǎng)平板上。用PBS把該平板洗滌兩次除去肺泡漂浮的細(xì)胞獲得肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
把肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞各以2×105個細(xì)胞/孔的量加入24孔培養(yǎng)平板的孔中并向每個孔中加入10μg/ml的棘酸。將細(xì)胞在37℃預(yù)培養(yǎng)1小時并且用100μg/ml的硅石處理3天。在PBS中透析該培養(yǎng)物。按照實(shí)施例2中所述的步驟使用TNF-α依賴性L929細(xì)胞系測定透析液中的TNF-α的活性。
正如從圖4看到的，棘酸對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生也有抑制作用。在圖4中，培養(yǎng)基，Si和Si+棘酸分別表示沒有處理的對照組，硅石刺激的樣品和棘酸處理又硅石刺激的樣品。
實(shí)施例4棘酸對反應(yīng)氧類產(chǎn)生的抑制作用我們知道炎性反應(yīng)是包括從被各種刺激物刺激的免疫細(xì)胞中分泌各種細(xì)胞因子如IL-1；由該細(xì)胞因子刺激的其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生磷脂酶A2，溶媒體酶，反應(yīng)氧類等等；和由上述產(chǎn)物誘發(fā)的組織壞死這些串聯(lián)反應(yīng)(Pruzanski，W.和Vadas，P.，Immunol.Today，12，143(1991))。通過測定棘酸對反應(yīng)氧類如H2O2和O2的抑制作用來證實(shí)棘酸阻斷炎性反應(yīng)的能力。
如下使用一臺具有96孔微平板的微型測量器來測定H2O2的量。向含有RPMI1640培養(yǎng)基的各孔中加入5×105個嗜中性細(xì)胞，并且再向各孔中加入25μl的辣根過氧化物酶(500μg/ml；II型，Sigma)和75μl的酚紅(1mg/ml)。此后，將細(xì)胞用10，20和50μg/ml的棘酸處理1小時，用10-7M的十四酰佛波乙酸酯(PMA)刺激細(xì)胞，然后在37℃培養(yǎng)60分鐘。溫育完成后，把3M的NaOH以25μl/孔的量加入這些孔中來終止反應(yīng)并使用ELISA讀數(shù)器(DynatechLab.Inc)測定620nm處的O.D.來判定與酚紅氧化相關(guān)的顏色變化。使用由稀釋的H2O2(Sigma)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定H2O2的量。
為了測定所產(chǎn)生的O2-的量，把懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中濃度為1×106個細(xì)胞/800μl的嗜中性細(xì)胞加入24孔平板的一部分孔中并向空余的孔中加入10μg/ml過氧化物歧化酶(SOD，Sigma)。把該平板在37℃下培養(yǎng)2分鐘，并且把細(xì)胞色素C(3mg/ml，Sigma)以100μl/孔的濃度加入這些孔中。用10，20和50μg/ml的棘酸處理細(xì)胞1小時并加入10-7M的PMA促進(jìn)劑在37℃下反應(yīng)20分鐘。向這些孔中加入1mM的N-乙基順丁烯二酰亞胺(Sigma)來終止反應(yīng)并在1,600xg把培養(yǎng)基離心分離10分鐘獲得上清液。使用一臺紫外可見分光光度計(jì)(Kontron Instrument，Milano，Italy)測定550nm處的由細(xì)胞色素C的還原引起的上清液的顏色變化。所產(chǎn)生的O2-的量可以使用SOD的濃度來表示，SOD能夠在20分鐘抑制1×106個細(xì)胞的細(xì)胞色素C的還原，或者使用細(xì)胞色素C的消光系數(shù)(E550nm＝1.83×104mM-1cm-1)來表示。
從表I可以看到，50μg/ml的棘酸能夠抑制85％的H2O2的產(chǎn)生，和72％的O2-的產(chǎn)生。這種結(jié)果表明棘酸對炎性反應(yīng)具有強(qiáng)抑制活性。表I棘酸對人嗜中性細(xì)胞中反應(yīng)氧類產(chǎn)生的抑制作用
另一方面，重復(fù)上述相同的步驟測定由5×105個人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的H2O2和O2-的量，其中的人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞使用10μg/ml的棘酸在37℃下處理了1小時，然后用100μg/ml的硅石進(jìn)行刺激。從圖5可以看到，棘酸處理并硅石刺激的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(Si+棘酸)與僅用硅石處理的對照組(Si+med)相比H2O2和O2-的量顯著降低。
實(shí)施例5棘酸對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用成纖維細(xì)胞的增殖或膠原的合成大大地增加了纖維化的發(fā)生。為了證實(shí)棘酸對成纖維細(xì)胞的增殖的作用，用10μg/ml的棘酸處理人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并且按照參考例1(3)描述的方法培養(yǎng)。在PBS中透析該培養(yǎng)物，向培養(yǎng)平板的每個孔中加入50μl的透析液。向每個孔中加入5×103細(xì)胞的NIH3T3成纖維細(xì)胞(ATCC CRL 1658)并且在37℃，5％CO2中培養(yǎng)5天。向培養(yǎng)物中加入3H-胸苷之后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)16小時。利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中摻入的3H-胸苷的量(圖6)。正如從圖6看到的，與僅用硅石處理的對照組(si+med)相比，在棘酸處理并硅石刺激的成纖維細(xì)胞(si+棘酸)中顯著地抑制了成纖維細(xì)胞的增殖。已經(jīng)有人推論這種抑制作用是由于棘酸降低了白細(xì)胞介素或其它引起纖維化的纖維形成生長因子的產(chǎn)生，或誘導(dǎo)抗纖維形成因子引起的。
實(shí)施例6棘酸對膠原合成的抑制我們已知IL-1和TNF-α是能夠引起大鼠成纖維細(xì)胞的纖維發(fā)生和誘發(fā)成纖維細(xì)胞的膠原合成的細(xì)胞因子(Kang，H.S.等，Korean.J.Immunol.，14,193(1992))。為了證實(shí)棘酸對IL-1和TNF-α作用的抑制能力，測定它對大鼠肺成纖維細(xì)胞和肺泡組織中膠原合成的抑制作用。采用間接ELISA方法測定大鼠肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的膠原量，通過測定羥脯氨酸的濃度并使用內(nèi)部對照組的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中膠原的量來決定肺泡培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的膠原量。
為了測定大鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中所合成的膠原量，把作為內(nèi)部對照組的膠原(Sigma，I型)完全溶于含有1mg/ml胃蛋白酶的1M乙酸中，并使用包被緩沖液(0.05M碳酸鹽，pH9.6)把該溶液以1μg-16pg的濃度范圍連續(xù)稀釋5倍。把稀釋的溶液以100μl/孔的量加入平底微滴平板(Dynatech，Immulon 2)的孔中。
另一方面，使用快速真空干燥器(Savant，Hieksville，NY，U.S.A.)把1ml參考例1(2)中所獲得的大鼠肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液濃縮10-20倍并溶于100μl包被緩沖液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3；用Na2CO3把pH調(diào)節(jié)到9.6)，以100μl/孔的量把該溶液加入孔中，然后在4℃下包被過夜。
用洗滌緩沖液(PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)把平板洗滌三次，并且把1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)以100μl/孔的量加入孔中。在室溫下溫育平板2小時來封閉沒被包被的部分。用上述相同的緩沖液洗滌平板四次，然后以100μl/孔的量向孔中加入用稀釋緩沖液(0.05M Tris-HCl，1mM MgCl2H2O，0.15M NaCl，0.02％NaN3，1％BSA，0.05％Tween20，pH8.1)稀釋了1,000倍的堿性磷酸酶-結(jié)合的兔抗山羊IgG(Cappel，Durham，NC，U.S.A.)。
在37℃下溫育平板2小時，然后用上述相同的緩沖液洗滌平板三次。以100μl/孔的量向孔中加入用底物緩沖液(0.05MNaHCO3，10mMMgCl2·6H2O，pH9.8)稀釋的1mg/ml濃度的對硝基苯基磷酸鹽，并且用一臺ELISA讀數(shù)器在405nm測定培養(yǎng)物的O.D.。由O.D.值與內(nèi)部對照組的膠原量的關(guān)系計(jì)算出所產(chǎn)生的膠原量。
正如從圖7看到的，用棘酸預(yù)處理的肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中合成的膠原量顯著下降。在圖7中，Si+PBS和Si+棘酸分別表示用硅石刺激的樣品和棘酸處理又硅石刺激的樣品。
而且，為了測定大鼠肺泡組織中所合成的膠原量，按照如下所述測定羥脯氨酸的量。
在一只Pyrex試管(Corning，Rochester，NY，U.S.A.)中把0.1-0.2g的大鼠肺泡組織與1ml的PBS混合，然后將其粉碎。用一臺超聲發(fā)生器(Heat system，W-380)破碎所獲得的組織提取物，向其中加入1ml鹽酸并把該混合物在120℃的干燥烘箱中干燥過夜。用冰箱冷凍所獲得的物質(zhì)，在冷凍干燥器(Labconco)中凍干并向其中加入1ml蒸餾水完全溶解。把50μl所獲得溶液加入一只微量離心試管中并向其中加入50μl蒸餾水稀釋該溶液。作為內(nèi)部對照組，把順式-γ-羥基-L-脯氨酸(Sigma)稀釋到20μg-150pg的濃度范圍內(nèi)，并且把100μl的各種稀釋溶液加入微量離心試管中。向試管中加入0.9ml的由1.41g的氯胺-T(N-氯-對甲苯氨磺酰鈉)溶于10ml的正丙醇制得的溶液和10ml蒸餾水，將其在室溫下貯存20分鐘。然后，向所獲得的混合物中加入1ml醛/高氯酸溶液，該溶液是由15g對二甲基氨基苯甲醛溶于62ml正丙醇，然后向其中加入26ml60％的高氯酸使總體積為100ml而制成，把所獲得的溶液完全混合，將該微量離心試管放入65℃的水浴15分鐘使顯色，在650nm測定樣品的O.D.，使用內(nèi)部對照組的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中羥脯氨酸的量。
從圖8的結(jié)果可以看到，當(dāng)把正常大鼠肺泡組織(正常)所產(chǎn)生的膠原量當(dāng)作100％時，只用硅石處理(Si+PBS)或用硅石和二甲亞砜處理(Si+DMSO)的大鼠肺泡組織中所合成的膠原量顯著升高，同時，用硅石，DMSO和棘酸(Si+棘酸)處理的大鼠肺泡組織中所合成的膠原量下降50％。上述結(jié)果表明棘酸具有抗纖維產(chǎn)生的能力。
實(shí)施例7棘酸對IL-6產(chǎn)生的抑制作用為了證實(shí)棘酸的體內(nèi)抗纖維形成活性，建立試驗(yàn)矽肺模型并且確定給藥后棘酸對矽肺模型的作用。
根據(jù)如下如Am.J.Pathol.，109，27-36(1982)描述的Lugamo的方法通過從其中除去污染物例如三氧化二鐵而精煉硅石。將硅石粉(Sigma，St.Louis，MO；直徑為5μm的顆粒的含量為至少80％)懸浮于1N HCl中并且加熱該懸浮液，用蒸餾水洗滌。通過在200℃干加熱2小時將得到的物質(zhì)滅菌，然后用于下面的試驗(yàn)。
通過腹膜內(nèi)注射2-5毫克氯酮胺使7-8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠和5周齡的雌性ICR小鼠麻醉。利用一個1ml注射器將溶于0.5ml無菌PBS中的50毫克硅石注射到大鼠的小支氣管中，將溶于0.1ml無菌PBS中的2mg硅石注射到小鼠中。從硅石注射第二天，給大鼠和小鼠口服10毫克的棘酸，每周2次，共給藥12-18周。
此后，根據(jù)常規(guī)方法，將大鼠和小鼠的肺分離出來，并在10％中性福爾馬林中固定，鋪開成4mm厚包埋于石蠟中。將包埋的組織切成5mm厚的片，用蘇木精曙紅，Masson′s三色和羥基鏈霉素染色，然后用顯微鏡觀察(圖9)。
正如從圖9看到的，對于用硅石和DMSO(A)給藥的大鼠的肺，觀察到許多顯示過量的纖維化和相連組織的形成，過量的單核細(xì)胞浸潤，纖維化和透明化的連合肉芽腫，而在用硅石，DMSO和棘酸(B)給藥的大鼠的肺觀察到僅有互相不聯(lián)合和稍微的纖維化的尺寸較小的肉芽腫。這些結(jié)果顯示棘酸能夠抑制試驗(yàn)矽肺。
實(shí)施例8棘酸對肝硬變的抑制肝硬變(肝硬化)的特征是整個肝臟纖維化，纖維間隔把肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞全部破碎以及再生瘤形成。它們多數(shù)源于慢性肝炎或慢性酒精中毒，準(zhǔn)確的原因還不清楚。在肝硬變患者中，細(xì)胞因子如參與發(fā)炎和纖維產(chǎn)生的TNF-α處于增多狀態(tài)；所以，通過抑制TNF-α的活性可以測定棘酸對肝硬變的抑制。
為了在四周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠誘發(fā)試驗(yàn)性肝硬變，采用Nakataukasa，H.，等，J.Clin.Invest.，85，1833-1843(1990)的方法，給大鼠一周兩次腹膜內(nèi)注射1.0ml/100g體重的四氯化碳溶液(50％四氯化碳+50％玉米油)，并且在注射四氯化碳的同時給大鼠一周兩次口服各0.2ml的韓國五茄屬Nakai的甲醇提取物和棘酸。開始試驗(yàn)13周后，把每只大鼠用乙醚麻醉并從心臟中獲得血液樣品來測定血清谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(sGOT)值和血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(sGPT)值(圖10)。
從圖10可以看到，當(dāng)與從使用CCl4，DMSO和作為對照組的PBS處理的大鼠中獲得的血液樣品進(jìn)行比較時，從使用韓國五茄屬Nakai的甲醇提取物(CCl4+A.M.)和棘酸(CCl4+棘酸)處理的大鼠中獲得的血液樣品的sGOT值分別降低20％和30％。但是，從使用棘酸(CCl4+棘酸)處理的大鼠中獲得的血液樣品的sGOT值下降40％以上。
為了對上述大鼠分離出的肝臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，把肝臟在10％的中性福爾馬林水溶液中固定，切成4mm厚，然后包埋在石蠟中。把包埋的組織切成5mm厚的片，用蘇木精曙紅和Masson氏三色染色，然后在顯微鏡下觀察(圖11)。
從圖11可以看到，在只使用四氯化碳的大鼠(B，C和D)的肝臟中，有變厚纖維帶的肝小葉的瘤的形成比正常肝臟(A)更明顯。在使用四氯化碳和韓國五茄屬Nakai的甲醇提取物(E)給藥的大鼠的肝臟中，盡管表現(xiàn)出了肝硬變的癥狀，但是，肝小葉瘤周圍的纖維帶比從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的肝小葉瘤周圍的纖維帶更薄，與從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的瘤相比，許多瘤形成不完整，并且與從只使用四氯化碳處理的大鼠中獲得的肝臟的肝細(xì)胞的再生變化相比，肝細(xì)胞的再生變化下降。在使用四氯化碳和棘酸(F)的大鼠的肝臟中，對肝硬變的抑制作用低于E組。
下列制劑例僅用于詳細(xì)說明而不是對本發(fā)明范圍的限定。
制劑例使用下列組分制備硬明膠膠囊用量(mg/膠囊)活性成分 20干淀粉160硬脂酸鎂 20總量 200mg把上述組分混合并以每個單位膠囊200mg的量填充到硬明膠膠囊中。
在上述具體實(shí)施例描述本發(fā)明的同時，我們應(yīng)該清楚可以作出的各種改良和變化并且它們也屬于下列權(quán)利要求所限定的本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，含有治療有效量的棘酸和藥物可接受的載體，用于治療由白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α過量產(chǎn)生引起的免疫疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述免疫疾病是由膠原合成、反應(yīng)氧類過量產(chǎn)生、成纖維細(xì)胞增殖或血清中GOT和/或GPT水平增加引起的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述疾病是敗血癥，炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肝硬化或矽肺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述棘酸是從韓國五茄屬Nakai提取的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述棘酸是用有機(jī)溶劑提取的。
6.一種用于制備棘酸的方法，包括下列步驟向韓國五茄屬Nakai根皮中加入甲醇；在20-60℃溫度下把該混合物加熱2-8小時或在室溫下加熱至少10小時，過濾該被加熱的混合物獲得濾液；濃縮濾液獲得甲醇提取物；用水和二乙醚萃取所述甲醇提取物獲得二乙醚組分；濃縮獲得二乙醚組分獲得濃縮液；利用己烷和乙酸乙酯的混合物作為洗脫劑進(jìn)行硅石膠柱層析純化所述濃縮液。
全文摘要
用于制備(-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸(棘酸)的方法和含有該酸的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療由白細(xì)胞介素-1或腫瘤壞死因子-α的過量產(chǎn)生引起的疾病。
文檔編號A61P11/00GK1150758SQ95193619
公開日1997年5月28日 申請日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月13日
發(fā)明者邊光浩, 崔仁杓, 姜馨植, 李晶埈, 金榮鎬 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院