專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)酶法水解動(dòng)物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用酶解法從動(dòng)物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法。
動(dòng)物屠宰血是富含蛋白質(zhì)和有益微量元素的天然資源，但以往除了部分作為食用外，大量屠宰血都白白浪費(fèi)，同時(shí)還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN 1080282A從屠宰血提取氨基酸，CN1094618A從畜血中提取血紅素與蛋白質(zhì)粉，兩者均采用有機(jī)溶劑提取，存在回收溶劑等問(wèn)題。
近年來(lái)發(fā)展了生物酶解方法，如CN 1084890A用胃蛋白酶水解動(dòng)物血來(lái)制備食用血紅素，歐洲專(zhuān)利EP 436747采用胃蛋白酶水解與超濾技術(shù)相結(jié)合的方法制備血紅素。它們采用單一的胃蛋白酶，水解不完全，成本也高，形成的血紅素是不溶性膠體，不易被人體吸收。
本發(fā)明的目的是提供成本較低的混合酶水解屠宰血的方法，以利于變廢為寶，減少環(huán)境污染，開(kāi)發(fā)利用蛋白質(zhì)再生資源。本發(fā)明的另一目的是提供一種水解較徹底的混合酶水解方法，使得到的水解產(chǎn)物能被人體充分吸收。
本發(fā)明的方法包括以下步驟1.取血抗凝，干燥成粉；2.在pH3-5、溫度30°-60℃條件下，用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解4-6小時(shí)；3.在pH7-9、溫度30°-60℃條件下，用胰蛋白酶和/或堿性蛋白酶水解4-6小時(shí)；
4.調(diào)節(jié)pH至中性，加熱滅活酶，過(guò)濾。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案詳述如下在即獲的畜、禽類(lèi)屠宰血中加入0.5-1％抗凝劑，在60°-90℃溫度下干燥，使成為粉末狀，備用。酶解時(shí)將蛋白粉溶于水中，調(diào)整pH至弱酸性(pH3-5)。在30°-60℃保溫條件下，加入0.2-1.0％木瓜蛋白酶和/或0.2-0.5％酸性蛋白酶水解4-6小時(shí)，再調(diào)整pH至中性偏酸性(pH7-9)，加入0.1-0.3％胰蛋白酶和/或0.1-0.3％堿性蛋白酶，繼續(xù)反應(yīng)4-6小時(shí)。然后，將pH調(diào)至中性，升溫至70°-90℃滅活15分鐘至1小時(shí)。以上過(guò)程應(yīng)盡量按無(wú)菌要求進(jìn)行操作，水解鍋?zhàn)詈檬欠忾]的。
將水解物過(guò)濾，除去沉淀顆粒。在濾液中添加賦形劑后冷凍干燥或噴霧干燥成粉末。
更佳的是，在水解物過(guò)濾后，將濾液以3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20-30分鐘，上清液以常規(guī)方法制成口服液或靜脈注射液，沉淀物冷凍干燥后制成膠囊。
在本發(fā)明的方法中采用的抗凝劑為枸櫞酸鈉或草酸鈉等，調(diào)節(jié)pH值的試劑為稀鹽酸、稀硫酸、稀醋酸、氫氧化鈉或碳酸氫鈉水溶液等，賦形劑為淀粉、羧甲基纖維素(CMC)、甲基纖維素(MC)或甘露醇等。
本發(fā)明方法采用混合蛋白酶分階段處理動(dòng)物屠宰血，使粘度高、分子量大、不易吸收的血蛋白降解為小分子多肽及少量氨基酸。


圖1是水解物經(jīng)離心后的上清液的質(zhì)譜圖。
從圖1可見(jiàn)，上清液中所含水解產(chǎn)物的分子量均在2000道爾頓以下，其中大部分在1000道爾頓左右，為小分子多肽和部分氨基酸。
離心后的沉淀物中多為小分子蛋白質(zhì)和少量多肽。
本發(fā)明方法所得水解產(chǎn)物溶解性好，分散度佳，十分穩(wěn)定，吸收率達(dá)95％以上。
本發(fā)明方法所得水解產(chǎn)物富含鐵質(zhì)，是十分理想的補(bǔ)鐵營(yíng)養(yǎng)品，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，具有升高白細(xì)胞和血紅蛋白的作用。
本發(fā)明方法所得水解產(chǎn)物是極好的食品、保健品和食源性藥物(包括靜脈高營(yíng)養(yǎng)制劑)的原料，粗制品也是極好的飼料蛋白質(zhì)添加劑。
以下用實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說(shuō)明。這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例僅僅是說(shuō)明性的，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
實(shí)施例1在新鮮豬血中按重量加入0.8％枸櫞酸鈉，80℃干燥，得到粉末狀物，備用。
10克豬血粉加90克蒸餾水，混勻，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，加入0.2克木瓜蛋白酶(酶活力21-40U/mg)和0.2克酸性蛋白酶(活力2000U/mg)，在無(wú)菌封閉的反應(yīng)鍋內(nèi)連續(xù)反應(yīng)6小時(shí)。
降溫以停止反應(yīng)，加1N NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5，加入0.3克堿性蛋白酶(活力2000U/mg)，在56℃下連續(xù)反應(yīng)6小時(shí)。
降溫停止反應(yīng)，用稀鹽酸將pH調(diào)至中性，在80℃下保溫45分鐘。將反應(yīng)物用紗布過(guò)濾。濾液以3000轉(zhuǎn)/分離心半小時(shí)，取上清液加入1％甘露醇，冷凍干燥成粉末狀。
實(shí)施例2取新鮮雞血按重量加0.7％枸櫞酸鈉。在70℃溫度下干燥成粉末狀備用。
10公斤雞血粉加90公斤蒸餾水混勻，將pH調(diào)至5，加入1％木瓜蛋白酶(酶活力6000U/mg)，在無(wú)菌、封閉、恒溫條件下(35℃)，連續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。
降溫(停止反應(yīng))，調(diào)pH至8，加入0.1％胰蛋白酶(活力1∶250)和0.1％堿性蛋白酶(活力2000U/mg)，在35℃條件下，繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)。
升溫至70℃，保持60分鐘，降至常溫，調(diào)pH至中性，將反應(yīng)物用紗布過(guò)濾。
濾液在5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液灌裝安瓿，密封，滅菌。
將沉淀物冷凍干燥，制成膠囊。
實(shí)施例3按上述實(shí)施例2同樣的方法操作，原料改為豬血，水解產(chǎn)物離心后，取上清液加入2％CMC，冷凍干燥成粉末狀，作藥用原料。
實(shí)施例4新鮮鴨血按重量加0.5％枸櫞酸鈉。在65℃溫度下干燥成粉末狀備用。
10公斤鴨血粉加10公斤蒸餾水混勻，將pH調(diào)至4，加入0.3％木瓜蛋白酶(活力6000U/mg)和0.5％酸性蛋白酶(活力2000U/mg)，在無(wú)菌、封閉、恒溫(45℃)條件下，連續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。
停止反應(yīng)(降溫)用NaHCO3調(diào)pH至7.2，加入0.3％胰蛋白酶(活力1∶250)，在45℃條件下，繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)。
升溫至90℃，保持30分鐘，再降至常溫，將反應(yīng)物用紗布過(guò)渡。
在濾液中加入2％淀粉，冷凍干燥成粉末。
實(shí)驗(yàn)例1選擇昆明種小鼠40只，體重36-42g，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，每組10只雌鼠，10只雄鼠。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、2、3天每天眼眶放血，造成失血性貧血模型，第4、5、6天每天按60mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺以抑制紅細(xì)胞再生，從第7天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組每天灌服實(shí)施例4產(chǎn)物的水混懸液30mg/kg，對(duì)照組灌服等體積2％淀粉，連續(xù)灌服8天，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第0天、第6天和第14天從尾靜脈取血，測(cè)定小鼠的血紅蛋白含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 蛋白水解產(chǎn)物對(duì)失血性貧血小鼠的升血紅蛋白作用
以上結(jié)果表明，本發(fā)明方法制得的水解產(chǎn)物對(duì)失血性貧血具有一定的升高血紅蛋白的作用。
實(shí)驗(yàn)例2選擇昆明種小鼠40只，體重36-42g，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，每組10只雌鼠，10只雄鼠。測(cè)定正常白細(xì)胞數(shù)后，用100mg/kg環(huán)磷酰胺連續(xù)腹腔注射三天，造成低白細(xì)胞模型測(cè)白細(xì)胞數(shù)，作為給藥前的白細(xì)胞數(shù)，然后對(duì)照組每天灌服5％蔗糖水10ml/kg一次，實(shí)驗(yàn)組每天灌服實(shí)施例4產(chǎn)物的混懸液30mg/kg，連續(xù)灌服20天，分別在第10天和20天采血，計(jì)算白細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如表2。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本發(fā)明方法的水解產(chǎn)物具有顯著的升高白細(xì)胞的作用。
權(quán)利要求
1.從動(dòng)物血制取多肽及氨基酸的方法，其特征在于1)取血抗凝，干燥成粉；2)在pH3-5，溫度30-60℃條件下，用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解4-6小時(shí)；3)在pH7-9、溫度30-60℃條件下，用胰蛋白酶和/或堿性蛋白酶水解4-6小時(shí)；4)調(diào)節(jié)pH至中性，加熱滅活酶，過(guò)濾。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其中抗凝劑為0.5-1％枸緣酸鈉。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其中木瓜蛋白酶濃度為0.2-1.0％。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其中酸性蛋白酶的濃度為0.2-0.5％。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其中胰蛋白酶的濃度為0.1-0.3％。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其中堿性蛋白酶的濃度為0.1-0.3％。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其中酶滅活的溫度為70-90℃，滅活時(shí)間為15分鐘至1小時(shí)。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其中水解物過(guò)濾后的濾液加賦形劑后冷凍干燥或噴霧干燥成粉。
9.按權(quán)利要求1-7所述的方法，其中水解物過(guò)濾后的濾液再以3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20-30分鐘，取上清液。
10.按權(quán)利要求9所述的方法，其中離心后的淀淀物冷凍干燥成粉。
全文摘要
本發(fā)明提供用混合酶水解動(dòng)物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法，即在pH3-5、溫度30-60℃條件下用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解以及在pH7-9、溫度30-60℃條件下用胰蛋白酶和/或堿性蛋白酶水解。采用混合酶分階段處理，使血蛋白水解完全，所得產(chǎn)物為小分子多肽和氨基酸。水解產(chǎn)物溶解性好、分散度佳、十分穩(wěn)定，吸收率達(dá)95％以上。
文檔編號(hào)A61K38/01GK1144273SQ9511600
公開(kāi)日1997年3月5日 申請(qǐng)日期1995年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月1日
發(fā)明者鄭國(guó)亮 申請(qǐng)人:鄭國(guó)亮