專利名稱：丹參抗艾滋病病毒和抗乙型肝炎病毒的用途的制作方法
本申請是關(guān)于中草藥滇丹參和丹參新醫(yī)藥用途的發(fā)明，屬于藥物用途發(fā)明領(lǐng)域。
丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)為唇形科植物的根，屬于傳統(tǒng)的活血化瘀藥物?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為其具有多種藥理作用(參見《中華醫(yī)學(xué)雜志》1978；3180，金惠銘，丹參制劑的臨床運用及其活血化瘀原理的研究)。植化研究表明，丹參中已知的成份至少有二十種之多(參見，羅厚蔚，活血化瘀藥——丹參在國內(nèi)研究的進展，中成藥研究1978；和張德成，等，丹參水溶性有效成份的研究II.D(+)β(3，4-二羥基苯基)乳酸的結(jié)構(gòu)，上海第一醫(yī)學(xué)院學(xué)報1980；5384)。關(guān)于丹參用于治療慢性肝炎已有許多報道，目前用于肝病研究的大多為水溶性部分的制劑，如丹參煎劑、丹參注射液、復(fù)方丹參注射液及丹參素等。對于丹參的臨床研究表明，丹參制劑對慢性肝炎的作用主要表現(xiàn)為1.恢復(fù)肝功能；2.回縮肝脾、改善瘀癥；3.抗肝纖維化。對于丹參治療慢性肝炎的實驗研究表現(xiàn)為丹參具有降酶護肝作用，可促進肝細(xì)胞再生，改善肝臟血流供應(yīng)，抑制纖維增生，防止實驗性肝硬變發(fā)生。而且，丹參除有抑制纖維增生作用外，還可以使已形成的纖維消散、吸收。以上實驗或臨床資料說明丹參制劑對于治療慢性肝炎的確具有可靠的醫(yī)療作用，但是這些研究和應(yīng)用只是依靠了丹參對于人體肝臟的保護、修復(fù)和防止病情發(fā)展的作用，至今為止沒有人提出并證實丹參具有抗乙型肝炎病毒的作用。而且現(xiàn)有技術(shù)中指出在運用丹參治療慢性肝炎時還需要配合抗肝炎病毒藥(參見王禎苓，丹參治療慢性肝炎的臨床應(yīng)用及實驗研究現(xiàn)狀，中西醫(yī)結(jié)合雜志1985年第5卷第8期)。因此，治療慢性肝炎不僅需要保肝護肝，更重要的是要消滅病原體，從根本上解決問題，尋找一種能抗乙型肝炎病毒的中藥是目前醫(yī)學(xué)界的迫切需求。
艾滋病是一種嚴(yán)重威脅人類健康而又無特效治療藥物的傳染性疾病，艾滋病自1981年6月被發(fā)現(xiàn)以來，短短十幾年，已成為有史以來，傳播最迅速、最廣泛、社會影響最大的病毒性傳染病。迄今，世界艾滋病患者總數(shù)已超過60萬，HIV感染者估計為1400萬。與此同時，對艾滋病的研究愈來愈深入，有效藥物也日益增多，但是盡管如此，在預(yù)防和治療方面，都沒有取得突破性進展，既無疫茵，也不能治愈。艾滋病是由艾滋病病毒(HIV)引起的一種傳染性疾病，尋找一種能抗艾滋病病毒的藥物是世界醫(yī)學(xué)工作者為之努力的目標(biāo)。盡管許多醫(yī)學(xué)工作者在中藥中篩選了許多對艾滋病有效的藥物，但尚沒有關(guān)于丹參和滇丹參能抗艾滋病病毒的報道。
本發(fā)明目的在于證實丹參具有抗艾滋病病毒和抗乙型肝炎病毒的作用。
本發(fā)明的目的還在于將滇丹參和丹參開發(fā)成為抗艾滋病和乙型肝炎病毒的藥物。
本發(fā)明所說的滇丹參(Salvia Yunanensis C.H.wright)，別名紫丹參，小紅丹參，小紅參，為唇形科多年生植物。本品載入1974年云南藥品標(biāo)準(zhǔn)P.321，云南省自產(chǎn)自銷。根較小，呈紡錘狀，表面暗紫紅色，易折斷，斷面不平整，木質(zhì)部分淺棕黃色，氣微，味甘，微苦澀。生于海拔1800-2100米的山坡草地。來源于云南東部。顯微特征根的橫切面觀察，最外為木栓層，紫紅色，約10數(shù)列細(xì)胞；韌皮部寬廣，約占根半徑的1/3至2/3，薄壁組織內(nèi)有多數(shù)石細(xì)胞及纖維群散在；木質(zhì)部在中央，木質(zhì)束6-7個，呈放射狀排列，木質(zhì)束由導(dǎo)管及木纖維組成。
丹參(Salvia Miltirrhiza Bunge)與滇丹參同屬，分布于全國各地。
丹參的抗艾滋病和乙肝病毒的藥理作用主要通過丹參中所含有效成份表現(xiàn)出來的，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的制劑方法，可以將丹參制成各種不同的藥物劑型。
本發(fā)明為了方便實驗需要，提取丹參的兩種有效成分(D1，E1)，以證實丹參抗艾滋病和乙型肝炎病毒的作用。
丹參提取物的制備方法和工藝(1)丹參有效成分(D1，E1)提取流程取一定量丹參，粉碎至一定程度，上到索氏提取器中①氯仿回流提取，至無色。
②藥渣再用無水乙醇提取，至無色。
③藥渣涼干至無乙醇味，用3倍量無鹽水提取3次，每次浸泡30分鐘，過濾，濾液凍干，得成分D1。
④提取后藥渣，再用3倍量無鹽水沸騰提取3次，每次30分種，過濾，濾液凍干，得成分E1。
(2)冷水浸泡后，通過樹脂柱，經(jīng)乙醇洗脫，冷干后得D2。
(3)水煮沸后，通過樹脂柱，經(jīng)乙醇洗脫，冷干后得E2。
本發(fā)明進行了大量的實驗，證實了丹參和滇丹參的抗艾滋病和乙型肝炎病毒的藥理作用。下列的實驗例更加詳細(xì)地說明了丹參和滇丹參的醫(yī)療用途。
實驗例1細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗艾滋病病毒活性(1).在艾滋病毒1型AZT敏感或耐藥株感染人的細(xì)胞培養(yǎng)中對P24抗原的抑制作用細(xì) 胞 病 毒 D1冷水浸E1煮沸IC50 TC50 TI IC50 TC50 TIμg/ml μg/ml μg/ml μg/mlPBMC018a，AZT(S) 12.7 964.3 77.5 2.24 61.3 27.37人外周血018c，AZT(R) 7.3 ＞1333182.6 2.6 ＞1333512.7單核細(xì)胞IIIB 11.3 ＞1333117.96 4.4 ＞1333303.0H9 IIIB 28.7 2000 ＞84.649.07 500 ＞55.45人T淋巴細(xì)胞 ±14.1 ±47.49±0.83 ±4.91H9 MN7 44.2C8166 IIIB 0° 14.5 ＞1000＞68.972.2 ＞250 ＞113.64細(xì)胞病 毒DR1冷水浸 DR2煮沸IC50 TC50 TI IC50 TC50 TIμg/ml μg/ml μg/ml μg/mlDR6冷水 DR3沸水C8166 IIIB 6.4 250 39.061.5250 166.67DR8 DR218.9 ＞1000 ＞52.91 12.3 250 108.7DR10 DR420.4 ＞1000 49.022.0250 125.0(2).樣品抗艾滋病病毒活性的穩(wěn)定性1994年5--9月，提取D19批，E13批，室溫放置半年后，1994年11月測定活性，除D1-8效果不佳外，其余11種都有效。D1-3，4，5效果較好。見圖2。
1994年12月采用柱層析方法提取的DR不同樣品與D1-3和E1-2于1995年1月同時測定，效價相似。
(3).D1、E1與AZT在人外周血細(xì)胞培養(yǎng)中對AZT耐藥株的協(xié)同作用
D1和E1與AZT有協(xié)同作用，見下表藥物細(xì)胞病毒 D1IC50(μg/ml)AZTE1D1 PBMC018c，42.28AZT耐藥AZT0.12D1+AZT3.3 0.053FIC 0.52 ↑12.81倍↑2.26有協(xié)同作用E1 ＞20AZT0.033E1+AZT 0.017 0.27FIC 0.54 ↑17.94倍 ↑74.35倍有協(xié)同作用實驗例2D1在小鼠體內(nèi)對鼠白血病病毒感染的效果Balb/c小鼠50只，10只正常鼠對照，其余40只腹腔注射鼠白血病病毒RVB株感染鼠脾10％懸液0.3ml/只，分4組，每組10只，稱體重，2小時后分別口服D1 0.5、1和2g/kg，對照組口服生理鹽水，每天2次20天，稱體重，殺鼠取脾稱重，計算脾指數(shù)，取抗凝血，測白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)數(shù)和血色素％(Hb％)。與對照比較，計算抑制％和統(tǒng)計學(xué)t值和p值。 結(jié)果D1在小鼠體內(nèi)對鼠白血病病毒RVB感染的作用組別觀 察 指標(biāo)鼠數(shù)體重脾重脾指數(shù) WBC RBCHb％RVB病毒 10 20.71.420.069 26830 407.9 9.78±1.34 ±0.34 ±0.017 ±9926.07 ±62.08±1.09D1 10 21.20.85** 0.04** 14070** 586.7**12.72**2g/kg ±1.23 ±0.18 ±0.008 ±4455.2±76.36±0.93Bid×20 變化％ 2.42％ -41.86％** -47.56％** 43.83％** 30.06％**D1 10 20.70.88** 0.043** 13830** 547.8**12.16**1g/kg ±1.42 ±0.13 ±0.0075±4258.3±92.63±1.17Bid×20 變化％ 0 -37.50％** -48.45％** 34.30％** 24.34％**D1 10 20.71.480.071 21960 387.8 9.930.5g/kg ±1.42 ±0.31 ±0.014 ±7861.33 ±44.91±8.15Bid×20 變化％ 0 3.20％ -18.15％-4.93％ 1.53％
感染后2小時，口服0.5、1.0和2.0g/kg，1天2次20天。1.0和2.0g/kg組抑制RVB病毒感染鼠的脾指數(shù)和白血球數(shù)，增加紅血球數(shù)和血色素％，與RVB病毒感染對照組比較，有非常顯著的意義。0.5g/kg組無效。重復(fù)實驗，結(jié)果一致。見圖3。
E1因藥量不足，未進行小鼠體內(nèi)對鼠白血病病毒RVB感染作用的實驗。
實驗例3D1在猴體內(nèi)對猴艾滋病病毒(SIV)感染的效果恒河猴5-7kg，8只，雄性，實驗前體檢無淋巴結(jié)腫大，猴艾滋病病毒抗體陰性。D1，1-6批樣品棕色粉末，1994年5-7月制備，細(xì)胞培養(yǎng)檢測對HIV-1 IIIB P24抗原有抑制作用，用0.5％甲基纖維素配制溶液。8只猴用美國SIVmac病毒液20-200MID50/ml靜脈注射，4只猴給D1灌胃喂服100，300mg/kg，各2只，在感染前一天及當(dāng)天給藥，每天一次8周，病毒對照組口服0.5％甲基纖維素，一天一次，灌胃8周，給藥前，給藥第10、14、17、21及30天，及停藥后6天(治療第62天)和36天(治療第44天)，取血，分離血漿，在HuT78細(xì)胞培養(yǎng)中測定病毒。結(jié)果1.血漿病毒動態(tài)治療組和對照組猴血漿病毒陽性數(shù)血清平均病毒滴度(TCID50/ml)組別 感染 血漿病毒陽性數(shù)/血清平均病毒滴度猴數(shù) 10天 14天 17天 21天 30天 62天 90天D1 1/4 1/6.21/31.20/0 0/0 1/12.50/0 0/0感染對照 3/4 0/0 2/12.53/192.5 1/43.71/12.51/12.5 0/04只SIV感染猴口服D18周病毒感染率和血漿病毒滴度與4只感染對照猴比較，感染率減少，血漿病毒滴度低，持續(xù)時間短。
2.淋巴結(jié)病變D1治療組比感染對照組減輕E1因藥量不足，未進行猴體內(nèi)對STV感染作用的實驗。
實驗例4D1和E1對乙型肝炎病毒的作用1.D1和E1在2215細(xì)胞中的毒性D1對2215細(xì)胞培養(yǎng)的半數(shù)中毒濃度(TC50)為3962.78μg/ml，E1為672μg/ml。藥物藥物濃度和細(xì)胞毒性TC50(μg/ml)50002500 1250625 312.5 156.25D1細(xì)胞2 1 - - -- -- 3962.78病變3(58.33％)1(25％) - -2 1 - -20001000 500 250 12562.5E1細(xì)胞4 3 2 - - -病變4 (100％) 3(75％) 1(33.33％) - 0 - 0- 06724 3 1 - - -
2.D1和E1在2215細(xì)胞培養(yǎng)中對HBeAg表達有抑制作用半數(shù)有效濃度1148、1154μg/ml；治療指數(shù)分別為3.45和3.44。
對HBsAg表達D1 2000μg/ml，E1 500μg/ml最大耐受濃度無抑制作用。
D1和E1在2215細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HBV的作用
3.在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)的治療效果1日齡北京鴨靜脈感染鴨乙型肝炎病毒(DHBV)陽性鴨血清0.2ml/只，7天后口服D1，E1各2g/kg，1天2次10天，病毒對照口服生理鹽水，每組5只鴨，給藥前、給藥后5、10天及停藥后3天取血測定血清DHBV-DNA，結(jié)果可見給口服D1或E1 2g/kg，Bid×20與病毒對照組比較，可非常顯著抑制鴨血清病毒DNA。見圖D1及E1治療組與病毒對照組在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA抑制率的比較實驗 組 別 鴨數(shù)抑制率(％)批次 (只) T5 T10 P3I 病毒對照組6 -54.19 -6.77-53.94D1 po，Bid×102g/kg 6 64.15** 32.3871.69*E1 po，Bid×102g/kg 6 53.04** 74.71** 62.61II 病毒對照 5 -5.72 0.80 -2.23D1 po，Bid×102g/kg 5 19.23 43.78** 13.24*D1 po，Bid×104g/kg 5 52.47** 62.61** 66.55給藥治療組不同時間DHBV-DNA抑制率分別與病毒對照組相同時間DHBV-DNA抑制率比較(成組t檢驗)，*P＜0.05，**P＜0.01。
實驗例5D1及E1在小鼠體內(nèi)誘生干擾素的作用。
昆明種小鼠體重20g，♂，每劑量組20只，D1口服37.5，75和150mg/kg一次。E1口服75，150和300mg/kg一次。蕓芝多糖(PSK)口服250，500和2000mg/kg一次。2，6，18和24小時分別取5只殺剖取血，分離血清，用培養(yǎng)液稀釋1∶10后2倍稀釋，處理用小鼠纖維母細(xì)胞L929傳代細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，傾去培養(yǎng)液，加入水泡性口炎病毒48小時，設(shè)病毒感染，和正常細(xì)胞對照，當(dāng)病毒對照完全時，觀察樣品細(xì)胞病變程度，按Reed-Muench法，計算樣本半數(shù)抑制稀釋度即為干擾素相對效價。結(jié)果見下表血清干擾素效價u/ml藥物 劑量 給藥途徑 2 6 18 24小時D13150mg/kg 口服300- - -75234.4 - - -37.5 141.25 - - -E11300 口服- - - -150 - - - -75- - - -PSK1000 口服200- - -500 100- - -250 100- - -150 - - - -* - 0.1ml 1∶10無效。
實驗結(jié)果表明小鼠口服D1 37.5，75和150mg/kg一次2小時后分別誘生血清干擾素。141.25，234.4和300相對效價u/ml，6.18和24小時后均＜100u/ml。小鼠口服E1 25，150和300mg/kg一次，2，6，18，24小時均＜100u/ml。小鼠口服蕓芝多糖150，250，500和1000mg/kg一次，2小時后分別測出血清干擾素相對效價200，100，100u/ml，說明小鼠口服D1誘生血清干擾素，優(yōu)于蕓芝多糖37.5mg/kg約相當(dāng)于蕓芝多糖250，500mg/kg。小鼠口服E1 300mg/kg，未能誘生干擾素。
實驗例6D1和E1體內(nèi)毒性D1口服毒性小，小鼠靜脈急性毒性，口服急性、亞急性毒性和雛鴨口服亞急性毒性和猴口服慢性毒性，及E1鴨口服亞急性毒性見表。
藥物毒性 動物 實驗 動物數(shù)給藥方案 觀察時間 死亡D1 急毒 昆明種小鼠 1 5 40g/kg po×1 7天 0/51 5 2g/kg iv×1 7天 0/52 5 40g/kg po×1 7天 0/52 5 2g/kg iv×1 7天 0/5亞急毒 1 5 4g/kg po，Bid×20 20天 0/52 5 4g/kg po，Bid×20 20天 0/5亞急毒 北京鴨 1 5 2g/kg po，Bid×10 13天 0/52 5 4g/kg po，Bid×10 13天 0/5慢毒 恒河猴 1 2 100mg/kg pd×56 3月 0/2300mg/kg qd×56 3月 0/2E1 亞急毒 北京鴨 1 5 2g/kg po，Bid×1013天 0/5急毒 昆明種小鼠 1 5 30g/kg po×1 7天 0/51 5 2g/kg iv×1 7天 5/51 5 1g/kg iv×1 7天 2/51 5 0.5g/kg iv×17天 1/5D1在小鼠、雛鴨和猴體內(nèi)毒性小。E1因藥量不足，僅進行了鴨體內(nèi)毒性實驗口服2g/kg，1天2次10天，未見毒性。
實驗例7丹參提取物Do和丹參酮11-A及丹參素在人T-淋巴細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對艾滋病病毒的抑制作用。樣品1.丹參提取物Do制備方法水煎酒沉，冷干。
2.丹參酮IIA(Tanshinone IIA)。
3.丹參素(b-(3，4-二羥基苯基)乳酸鈉，Danshensu)。病毒艾滋病病毒(HTLV-IIIB)細(xì)胞人T-淋巴細(xì)胞(C8166，H9)病毒指標(biāo)細(xì)胞病變巨細(xì)胞形成(CPE)；P24抗原(P24ng/ml)毒性指標(biāo)細(xì)胞病變(CPE)，3HTdR摻入(cpm)表丹參和丹參素及丹參酮II-A在人T-淋巴細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對艾滋病病毒的抑制作用藥品 細(xì)胞 病毒 指標(biāo)IC50 TC50 TIug/ml ug/mlD0C8166HTLV-IIIB巨細(xì)胞形成(CPE) 176.77 1000.0 5.663HTdR摻入(cpm) 343.21.94丹參酮C8166HTLV-IIIB巨細(xì)胞形成(CPE) 26.90 176.86.573HTdR摻入(cpm) 108.24.02丹參素H9 HTLV-IIIBP24(ng/ml) 30.43HTdR摻入(cpm) 348.011.4權(quán)利要求
1.丹參用于制備抗病毒藥物的應(yīng)用。
2.丹參用于制備抗艾滋病藥物的應(yīng)用。
3.丹參用于制備抗艾滋病病毒藥物的應(yīng)用。
4.丹參用于制備抗乙型肝炎病毒藥物的應(yīng)用。
5.丹參用于制備抗白血病病毒藥物的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的丹參的應(yīng)用，其中的丹參包括滇丹參。
全文摘要
本發(fā)明證實了丹參和滇丹參具有抗艾滋病和乙型肝炎病毒的作用及其抗白血病病毒的作用，并公開了丹參和滇丹參在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/12GK1136928SQ9510590
公開日1996年12月4日 申請日期1995年5月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月29日
發(fā)明者陳鴻珊, 閻旭光, 張興權(quán), 滕立, 李壯, 盧耀增, 吳小嫻 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所