專利名稱：一種抗艾滋病病毒的中藥提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)的中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗愛滋病病毒的中藥有效成分以及其制備方法。
背景技術(shù)：
HIV(human immunodeficiency virus)，人免疫缺陷病毒，是艾滋病的病原體。HIV主要侵犯CD4+的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，在感染最初的幾年中，免疫系統(tǒng)能及時(shí)清除大量復(fù)制的病毒，感染者可不表現(xiàn)出任何癥狀；隨著病程延長(zhǎng)，CD4+細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，免疫系統(tǒng)趨向崩潰，當(dāng)CD4+細(xì)胞數(shù)目低至200個(gè)/ml時(shí)，感染者往往死于多種嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。從二十世紀(jì)八十年代起，HIV感染在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，95％發(fā)生在發(fā)展中國家。中國于1994年前后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，據(jù)統(tǒng)計(jì)，感染者已達(dá)八十五萬之多.抗-HIV的研究一直是全世界關(guān)注的熱點(diǎn)。目前尚未成功研制出安全、有效的疫苗；現(xiàn)有的化學(xué)合成的抗-HIV藥物只能暫時(shí)抑制病毒的復(fù)制，具有隨機(jī)性大、開發(fā)成本高、易產(chǎn)生耐藥、較嚴(yán)重的毒副作用等缺點(diǎn)，國際醫(yī)學(xué)界開始關(guān)注民族藥抗-HIV的研究。中醫(yī)中藥來源于中華民族幾千年來利用草藥防治疾病的經(jīng)驗(yàn)積累，中藥治病的特點(diǎn)是復(fù)方用藥。許多中藥方劑經(jīng)艾滋病人服用后證明能明顯改善生活質(zhì)量，提高免疫力。浙江省于1984年發(fā)現(xiàn)4例因輸進(jìn)口VIII因子而感染HIV的血友病病人，經(jīng)我們配制的中草藥沖劑治療后，病情進(jìn)展緩慢，其中一例存活長(zhǎng)達(dá)十八年之久。已有的研究表明，經(jīng)輸血途徑感染HIV后病情進(jìn)展迅速，平均存活期可短至二至五年左右。而服用我們的沖劑具有良好的治療效果。本研究經(jīng)大鼠最大耐受量實(shí)驗(yàn)證明臨床劑量安全無毒后(大鼠經(jīng)口最大耐受量相當(dāng)于人臨床用量的50-60倍)，對(duì)沖劑的八種草藥成分，進(jìn)行了體外抗-HIV的研究。
本發(fā)明的目的在于提取和篩選中藥的抗愛滋病病毒有效成分，提供一種制備抗愛滋病病毒的藥用原料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所公開的抗愛滋病病毒中藥提取物是金銀花的提取物，通過本發(fā)明的制備方法所獲得的金銀花提取物對(duì)HIV1吸附的抑制作用效果穩(wěn)定，重復(fù)性好。
本發(fā)明抗愛滋病病毒的中藥提取物的制備方法包括以下步驟
(1)將金銀花加水煎煮60-90分鐘后，濾出沉淀備用，并將湯藥濃縮至浸膏；(2)將濾出的沉淀用鞘乙醇除雜，用酸調(diào)節(jié)pH至1～2，攪拌，收集析出物；(3)將析出物50％、95％醇兩次洗滌，收集洗滌后的粉狀析出物；(4)將步驟(1)的浸膏和步驟(3)的粉狀析出物分別用最小量的去離子水緩慢溶解為原液，溶解時(shí)可在37℃條件下水浴、渦旋，室溫條件下封存放置過夜；(5)將完全溶解的浸膏溶液原液和粉狀析出物溶液原液在無菌條件下分別用0.45μm一次性濾器過濾，收集的浸膏溶液濾液和粉狀析出物溶液濾液即為金銀花的兩種有效成分。
上述浸膏溶液濾液和粉狀析出物溶液濾液按1～1.5∶1～2的體積比例混合用于制備抗艾滋病病毒的藥物。
本發(fā)明提取中藥的活性成分是根據(jù)國際通用的體外篩選抗-HIV藥物的方法，構(gòu)建HIV1-MT4培養(yǎng)系。MTT法初步確定各提取物的安全實(shí)驗(yàn)濃度，此濃度為MT4細(xì)胞能100％存活的最小濃度。藥物溶媒的選擇根據(jù)提取方法，如為醇提，應(yīng)先溶于200μl95％乙醇，然后溶于去離子水中，制成原液。設(shè)溶媒對(duì)照(乙醇+去離子水)證明所用溶媒對(duì)MT4無毒性作用。分別觀察安全實(shí)驗(yàn)濃度的各提取物在體外HIV1-MT4培養(yǎng)系中對(duì)HIV1復(fù)制的抑制作用(復(fù)制抑制實(shí)驗(yàn))和阻止HIV1向MT4細(xì)胞吸附作用(吸附抑制實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)選用的提取物都具有細(xì)胞保護(hù)作用(CPE抑制率可達(dá)100％)；十四種提取物和22種組方不能抑制病毒復(fù)制，但是部分具有阻止HIV1向MT4細(xì)胞吸附的作用。而本發(fā)明的金銀花提取物對(duì)HIV1吸附的抑制作用效果穩(wěn)定，重復(fù)性好。
本發(fā)明以β-actin為內(nèi)對(duì)照，對(duì)十四種提取物和部分組方進(jìn)行HIV1RNA表達(dá)的半定量研究。設(shè)立AZT為有效對(duì)照，AZT為第一個(gè)被正式批準(zhǔn)用于臨床治療HIV1感染的藥物，是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。結(jié)果表明，AZT抑制作用為94.4％，金銀花提取物抑制作用為25.4％。
金銀花提取物在體外能有效滅活HIV1，具有穩(wěn)定的阻止HIV1向MT4細(xì)胞吸附作用，有光明的開發(fā)前景。藥物阻止病毒吸附的作用，具有重要的意義可以阻止感染細(xì)胞向非感染細(xì)胞的吸附；阻止病毒向正常細(xì)胞的吸附。前者具有治療意義，可以延緩疾病的進(jìn)展；后者具有重要的預(yù)防意義。HIV的攻克還需要一段時(shí)間，但是蔓延速度確呈幾何指數(shù)上升，因此在積極研制特效藥物的同時(shí)，干預(yù)措施一樣發(fā)揮著不可替代的作用，殺微生物劑的研究正是發(fā)展干預(yù)措施的一個(gè)熱點(diǎn)。


圖1為金銀花提取物濃度與吸附抑制作用的量效關(guān)系。
圖2為金銀花的兩種提取物浸膏與析出物的混合組方ZF3與AZT在體外MT4細(xì)胞/HIV-1SF33培養(yǎng)系阻止HIV-1向MT4細(xì)胞吸附作用比較。
在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，抑制作用增強(qiáng)；濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞存活率下降。ZF3為金銀花的兩種提取物浸膏與析出物按1∶1配比的混合組方，兩種提取物單用無作用，混合后表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗-HIV吸附作用(85.1％)。
具體實(shí)施例方式
以下以具體實(shí)施例加以進(jìn)一步說明新鮮的干金銀花630g，水煎煮1-1.5小時(shí)后濾出沉淀，湯藥濃縮至浸膏，得浸膏3.767g；收集濾出的沉淀，用鞘乙醇除雜，加HCL酸化至PH 1.5，攪拌，析出固體物，經(jīng)50％、95％乙醇兩次洗滌，得粉狀析出物3.886g。
浸膏和析出物如暫時(shí)不用，可在95％酒精中保存。
將浸膏和析出物分別先加入少量去離子水，反復(fù)37℃水浴，渦旋，用封口膜封口，室溫放置過夜。第二天，分別逐漸添加去離子水，反復(fù)37℃水浴。用封口膜封口，室溫放置過夜。第三天將已溶解的浸膏和析出物在超凈臺(tái)中用0.45μm一次性濾器過濾得原液，經(jīng)測(cè)定原液中含金銀花有效成分提取物為2g/ml。原液在4℃冰箱放置保存。
按1～1.5∶1～2的體積比例將浸膏原液和析出物原液混合，命名為ZF3，ZF3在體外MT-4細(xì)胞/HIV-1SF33培養(yǎng)系滅活HIV-1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2AZT為82％；ZF3為85.1％(＞80％有為效)。
表1說明ZF3對(duì)HIV1的滅活作用在第九天時(shí)為99％，判定為具有高效的滅活作用。ZF3對(duì)HIV-1的吸附抑制作用可能與對(duì)HIV1的高效滅活作用有關(guān)。
表1

MTT的實(shí)驗(yàn)安全濃度是浸膏1.63-1.30mg/ml，析出物0.10-0.15mg/ml。
圖1為ZF3實(shí)驗(yàn)濃度與吸附抑制作用的量效關(guān)系。在一定濃度范圍(浸膏2-1mg/ml析出物0.25-0.10mg/ml)內(nèi)，隨著濃度增加，抑制作用增強(qiáng)；濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞存活率下降。
ZF3為金銀花的兩種提取物——浸膏與析出物的混合組方，兩種提取物單獨(dú)使用無作用，混合后表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗-HIV吸附作用(85.1％)。
權(quán)利要求
1.一種抗艾滋病病毒的中藥提取物及其制備方法，其特征在于下述步驟(1)將金銀花加水煎煮60～90分鐘后，濾出沉淀備用，并將湯藥濃縮至浸膏；(2)將濾出的沉淀用鞘乙醇除雜，用酸調(diào)節(jié)pH至1～2，攪拌，收集析出物；(3)將析出物經(jīng)50％、95％乙醇兩次洗滌，收集洗滌后的粉狀析出物；(4)將步驟(1)的浸膏和步驟(3)的粉狀析出物分別用最小量的去離子水緩慢溶解為原液，溶解時(shí)可在37℃條件下水浴、渦旋，室溫條件下封存放置過夜；(5)將完全溶解的浸膏溶液原液和粉狀析出物溶液原液在無菌條件下分別用0.45μm一次性濾器過濾，收集的浸膏溶液濾液和粉狀析出物溶液濾液即為金銀花的兩種有效成分。
2.按權(quán)利要求1所述一種抗艾滋病病毒的中藥提取物及其制備方法，其特征在于上述浸膏溶液濾液和粉狀析出物溶液濾液按1～1.5∶1～2的體積比例混合用于制備抗艾滋病病毒的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗艾滋病病毒的中藥提取物及其制備方法，通過本發(fā)明的制備方法獲得的金銀花提取物對(duì)HIV
文檔編號(hào)A61P31/00GK1850144SQ200610049689
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者吳南屏, 吳霞, 張小玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)