專利名稱：預(yù)防和治療癌性疾病的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療癌性疾病的藥物組合物及其制備方法。
在癌癥治療中最常用的方法是外科手術(shù)、照射療法和化學(xué)療法[The Pharmacological Basis of Therapeutics，PergamonPress，Inc.，New York，pp.1202-1263(1990)；Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，12th ed.，InternationalEdition，McGraw-Hill，Inc.，New York，Vol.2，pp.1587-1599(1991)；Scientific American Medicine，ScientificAmerican，Inc.，New York，Vol.2，12(V)，pp.1-14(1984)]。在照射療法中，除了廣泛使用離子療法外，光線療法和局部高溫療法與照射療法和化學(xué)療法結(jié)合用于一些特殊情況例如皮膚癌。在化學(xué)療法的用藥中，按其作用、來源和結(jié)構(gòu)分類，也可以使用烷基化劑，植物生物堿、抗菌素、抗代謝物，其它藥物(如天冬酰胺酶)以及常用的各種激素。在化學(xué)療法中最新應(yīng)用的對(duì)策如下結(jié)合化學(xué)療法；為減少毒性長期少劑量靜脈或動(dòng)脈輸注化學(xué)療法的藥物；為克服藥物抗性的高劑量化學(xué)療法以及這種療法與自身骨髓移植結(jié)合；化學(xué)療法藥物與生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑結(jié)合；大量使用佐劑和新佐劑的化學(xué)療法。最常用的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑是干擾素、腫瘤壞死因子、淋巴因子如白細(xì)胞介素-2以及單克隆抗體。各種飲食療法，稍經(jīng)處理的血清制劑和運(yùn)用心理作用的Simonton方法也是目前用于治療腫瘤疾病的方法，但其效果沒有證實(shí)。
在上面參考文獻(xiàn)中詳述的目前所用的方法的最顯著缺點(diǎn)是毒性、顯著的副作用、低的腫瘤特異性、產(chǎn)生抗藥性和局限的有效范圍。用于癌癥治療的大多數(shù)細(xì)胞毒性藥物不能區(qū)別形成腫瘤的細(xì)胞和正常的增生細(xì)胞；因此，為了避免對(duì)重要的宿主組織(例如骨髓、腸)的任何不可逆損傷，藥物必須以通常證明不足以殺死所有存在的形成腫瘤的細(xì)胞的劑量給藥[Pharmac Ther.，49，43-54(1991)]。照射療法可引起放射損傷而且同時(shí)對(duì)缺氧細(xì)胞和某些類型的腫瘤無效。在化學(xué)療法中所用的藥物也具有各種毒副作用。它們可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血器官、胃和腸的粘膜以及所有的增生細(xì)胞。另外它們還可損害肝、腎、肺和心肌。幾乎所有有效的抗腫瘤劑都是免疫抑制劑[Proc.Roy.Soc.Med.，63，1063-1066(1970)]。它們中的大多數(shù)具有致畸或致癌作用，有時(shí)它們可能引起不育癥或增加腫瘤復(fù)發(fā)的頻率。通過化學(xué)療法對(duì)60-70％腫瘤產(chǎn)生影響是非常困難的或者是不可能的，而且在治療中還會(huì)產(chǎn)生抗藥性或交叉抗藥性。
令人遺憾地，利用生物體的自身防御機(jī)制使用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑治療具有同樣的缺點(diǎn)，因?yàn)楝F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它們僅對(duì)一些類型的腫瘤有效并且也具有毒副作用[Harrison’s Principles of InternalMedicine，12th ed.，International Edition，McGraw-Hill，Inc.，New York，Vol.2，pp.1587-1599(1991)]。干擾素也有許多嚴(yán)重的副作用，其中包括例如心臟中毒[Chest，99，557-561(1991)]。同樣使用單克隆抗體的希望也沒有實(shí)現(xiàn)[Eur.J.Cancer，27，936-939(1991)]。盡管自1980年以來已完成了四百多登記的免疫療法的臨床試驗(yàn)，但至今還沒有一種方法被引入治療任何一種類型的癌癥[J.R.Soc.Med.，84,321(1991)]。
PCT公開號(hào)WO86/025555涉及用于治療癌性疾病的藥物，它包括L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-蘋果酸和L-抗壞血酸。L-蘋果酸和L-抗壞血酸作為活化劑緩沖并穩(wěn)定氨基酸的酸形式，因此它們在低于6.8的酸度范圍內(nèi)使血液的pH值發(fā)生變化。在此公開文獻(xiàn)中，沒有證明惡性腫瘤生長停止或甚至被抑制的數(shù)據(jù)。
公開的日本專利申請?zhí)?2-135421涉及含有除L-異亮氨酸之外的特定氨基酸的氨基酸輸液，它表現(xiàn)出能抑制腫瘤繁殖的作用。該制劑的可能的但未被證實(shí)的作用是建立在一種氨基酸如異亮氨酸的缺乏之上。
本發(fā)明的目的是制備含有天然物質(zhì)的藥物組合物，它消除了用于腫瘤治療的已知組合物和方法的缺點(diǎn)如毒性、低特異性和局限的有效范圍。
本發(fā)明是建立在對(duì)不同生物體中腫瘤細(xì)胞的被動(dòng)防御系統(tǒng)[下文稱為被動(dòng)抗腫瘤防御系統(tǒng)(PADS)]的認(rèn)識(shí)上。該系統(tǒng)能破壞產(chǎn)生的和已經(jīng)存在的腫瘤細(xì)胞。參與PADS的物質(zhì)是存在于循環(huán)系統(tǒng)中的內(nèi)源的和外源的天然物質(zhì)，即氨基酸、維生素、核堿、糖類以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到一起使用這些物質(zhì)中的至少三種(這些物質(zhì)是循環(huán)系統(tǒng)中的成份并且因此可達(dá)到和進(jìn)入所有細(xì)胞)能協(xié)同增加彼此的作用，因此能夠破壞腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步建立在對(duì)由于協(xié)同作用而使正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞參與PADS行為具有顯著的不同性質(zhì)從而這兩種細(xì)胞能區(qū)分開來的認(rèn)識(shí)上。盡管因?yàn)槟[瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞外部不同，經(jīng)典的免疫系統(tǒng)能識(shí)別并選擇性地破壞腫瘤細(xì)胞，但由于其內(nèi)部不同，新識(shí)別的被動(dòng)抗腫瘤防御機(jī)理同樣能做到。
本發(fā)明進(jìn)一步建立在對(duì)由于循環(huán)系統(tǒng)中其成份濃度增加到對(duì)腫瘤細(xì)胞供應(yīng)過度的程度，上述成份選擇性地引起癌細(xì)胞中致命的代謝壓力的認(rèn)識(shí)上。
本發(fā)明最后是建立在根據(jù)所用劑量和施用途徑對(duì)不同腫瘤細(xì)胞可達(dá)到的預(yù)防或抗腫瘤作用的認(rèn)識(shí)上。對(duì)于以不同程度不同于正常細(xì)胞的各種類型的腫瘤，最有效的混合物的成份的性質(zhì)和用量可以用協(xié)同作用作為標(biāo)準(zhǔn)來確定。
基于上述認(rèn)識(shí)，本發(fā)明涉及預(yù)防和治療癌性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括至少三種存在于循環(huán)系統(tǒng)中的活性化合物至少一種氨基酸，至少一種維生素以及至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物，其條件是如果組合物除含有氨基酸外僅含蘋果酸和一種維生素，那么維生素不是抗壞血酸。該組合物還包括藥學(xué)中常用的載體、稀釋劑和/或其它助劑。
本發(fā)明的組合物可包括L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽作為氨基酸和d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5＇-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸、乳清酸和/或其鹽作為維生素。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物包括L-色氨酸、L-抗壞血酸，至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-葡糖胺和/或其可藥用鹽的化合物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選組合物包括L-精氨酸、核黃素-5＇-磷酸、至少一種選自D-甘露糖、蘋果酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選組合物包括30-44％(質(zhì)量)的L-精氨酸、27-35％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、38-62％(質(zhì)量)的蘋果酸和/或其可藥用鹽。
本發(fā)明的另一優(yōu)選組合物包括0.002-70％(質(zhì)量)的至少一種選自L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽的化合物作為氨基酸，0.0004-80％(質(zhì)量)的至少一種選自d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5＇-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸、乳清酸和/或其鹽的化合物作為維生素以及0.003-80％(質(zhì)量)的至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選組合物包括0.9-25％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.8-19％(質(zhì)量)的L-色氨酸、1.1-48％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.9-46％(質(zhì)量)的d-生物素、1.2-16％(質(zhì)量)的吡哆素、0.03-42％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.05-18％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.5-60％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.7-68％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.6-40％(質(zhì)量)的D-甘露糖和/或其可藥用鹽。
本發(fā)明的一種非常有效的組合物包括0.005-34％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.002-25％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.02-23％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、0.04-30％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、0.04-50％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.03-34％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.05-22％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、0.01-60％(質(zhì)量)的d-生物素、0.01-20％(質(zhì)量)的吡哆素、0.0004-45％(質(zhì)量)的核黃素、0.0005-45％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.003-70％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.004-15％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.01-17％(質(zhì)量)的乳清酸、0.001-10％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.01-63％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.08-42％(質(zhì)量)的D-甘露糖、0.05-20％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.01-80％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.02-60％(質(zhì)量)的草乙酸、0.001-10％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽。
本發(fā)明的另一目的是制備上述組合物的方法，該方法包括使存在于循環(huán)系統(tǒng)中的活性化合物中的至少一種氨基酸，至少一種維生素以及至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。藥學(xué)上常用的載體、稀釋劑和/或其他助劑也可以以補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％所必需的量與活性組合物混合。
本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括將L-色氨酸、L-抗壞血酸、至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-葡糖胺和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括將L-精氨酸、核黃素-5＇-磷酸、至少一種選自D-甘露糖、蘋果酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括將30-44％(質(zhì)量)的L-精氨酸、27-35％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、38-62％(質(zhì)量)的蘋果酸和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括將0.002-70％(質(zhì)量)的至少一種選自L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽的化合物作為氨基酸，0.0004-80％(質(zhì)量)的至少一種選自d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5＇-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸、乳清酸和/或其鹽的化合物作為維生素和0.003-80％(質(zhì)量)的至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括將0.9-25％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.8-19％(質(zhì)量)的L-色氨酸、1.1-48％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.9-46％(質(zhì)量)的d-生物素、1.2-16％(質(zhì)量)的吡哆素、0.03-42％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.05-18％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.5-60％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.7-68％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.6-40％(質(zhì)量)的D-甘露糖和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
本發(fā)明方法的高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括將0.005-34％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.002-25％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.02-23％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、0.04-30％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、0.04-50％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.03-34％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.05-22％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、0.01-60％(質(zhì)量)的d-生物素、0.01-20％(質(zhì)量)的吡哆素、0.0004-45％(質(zhì)量)的核黃素、0.0005-45％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.003-70％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.004-15％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.01-17％(質(zhì)量)的乳清酸、0.001-10％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.01-63％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.08-42％(質(zhì)量)的D-甘露糖、0.05-20％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.01-80％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.02-60％(質(zhì)量)的草乙酸、0.001-10％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
為治療使用，本發(fā)明的組合物可按下述方法適宜地配制成藥物組合物，即為了經(jīng)腸或腸胃外給藥將它們與無毒惰性的固體或液體載體、稀釋劑、粘合劑和/或在藥物工業(yè)中常用的其它添加劑混合后，將它們轉(zhuǎn)化為一種常用的藥物制劑。適合于上述要求的載體、稀釋劑和粘合劑是例如水、明膠、乳糖、蔗糖、淀粉、果膠、硬脂酸、硬脂酸鎂、滑石、各種植物油以及二元醇類如丙二醇或聚乙二醇。藥物添加劑和助劑是例如防腐劑如4-羥基苯甲酸甲酯、各種天然或合成的乳化劑、分散劑、濕潤劑、著色劑、調(diào)味劑、緩沖劑以及促進(jìn)崩解或溶解的試劑、以及提高所需作用的其他物質(zhì)。
常用的藥物制劑是用上述藥物添加劑制備的口服組合物，這些組合物可以是固體形式如片劑、膠囊劑、粉劑、糖錠劑、丸劑或顆粒劑，或液體形式如糖漿劑、溶液、乳液或懸浮液；另外常用的藥物制劑為直腸給藥組合物如栓劑以及腸胃外給藥組合物如注射液或輸注液。
本發(fā)明的組合物的優(yōu)選日劑量取決于幾種因素，如所治療的疾病的性質(zhì)、病人的狀況、治療的方法等。優(yōu)選的日劑量為30-3000mg/kg體重。因此，合適每日給藥1-4個(gè)各含有0.2-3g活性組合物的片劑、膠囊或糖錠劑，或0.5-3L含有10-200g/L活性組合物的輸注液。
本發(fā)明另外涉及預(yù)防和治療癌性疾病的方法，該方法包括給需要治療的患者施用治療有效量的本發(fā)明組合物。
用下列表、圖和實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。在下列試驗(yàn)中使用的細(xì)胞得自“American Type Culture Collection”(Rockville，MD，USA)。
表1表示分別含有4種和5種活性成份的實(shí)施例1-20的組合物的成份對(duì)Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞(ATCC CRL 1581)的殺死腫瘤細(xì)胞作用和協(xié)同作用。
表2表示當(dāng)加入另外成份時(shí)含有5種活性成份的實(shí)施例21-37組合物對(duì)Sp2/0-Ag14細(xì)胞作用的增加。


圖1表示分別含有4種和5種活性成份的實(shí)施例1-20組合物的成份的作用和協(xié)同作用。
圖2表示含有5種活性成份的實(shí)施例102-106組合物和含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞的體外作用與相應(yīng)的對(duì)比混合物比較。
圖3表示含有21種活性成份的實(shí)施例107組合物對(duì)Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞的作用(為時(shí)間的函數(shù))并與未處理的細(xì)胞和合適的對(duì)比混合物比較。
圖4表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)K-562人紅白血病細(xì)胞(ATCC CCL 243)的體外作用與相應(yīng)的對(duì)比混合物比較。
圖5表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)HeLa人上皮樣癌子宮頸細(xì)胞(ATCC CCL 2)的體外作用與相應(yīng)的對(duì)比混合物比較。
圖6表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)HEp-2人表皮樣癌喉細(xì)胞(ATCC CCL 23)的體外作用與相應(yīng)的對(duì)比混合物比較。
圖7表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)正常的Vero African綠猴(green monkey)腎細(xì)胞(ATCC CCL 81)的體外作用與相應(yīng)的對(duì)比混合物比較。
圖8表示含有21種活性成份的實(shí)施例112組合物對(duì)BALB/c小鼠通過腹膜內(nèi)注射Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤的體內(nèi)作用與相應(yīng)的對(duì)比組比較。
圖9表示含有21種活性成份的實(shí)施例112組合物對(duì)BALB/c(nu/nu)小鼠皮下注射HeLa人上皮樣癌子宮頸細(xì)胞在皮下產(chǎn)生的固體腫瘤的體內(nèi)作用與相應(yīng)的對(duì)比組比較。
為了試驗(yàn)使用下列介質(zhì)對(duì)于Sp2/0-Ag14和K-562細(xì)胞使用RPMI 1640介質(zhì)(Sigma Chemie GmbH，D-8024 Deisenhofen，Germany，產(chǎn)品號(hào)R6504)，對(duì)于HEp-2、HeLa和Vero細(xì)胞使用MEM介質(zhì)(Sigma Chemie GmbH，產(chǎn)品號(hào)M4655)。
實(shí)施例1-37向裝有攪拌器的裝置中稱量加入表1和2中所示的給定量的活性試劑，然后向所得粉狀混合物中加入表1和2給定量的、為中和酸類成份所必需的碳酸氫鈉。在繼續(xù)攪拌下向混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用可參見表1和2以及圖1。
實(shí)施例38-67按實(shí)施例1-37的方法，不同的是用適量的碳酸氫鉀代替碳酸氫鈉中和酸類成份。按此方法制備的溶液的作用與表1和2以及圖1分別所示的實(shí)施例1-37的溶液的作用沒有明顯的不同。
實(shí)施例68-97按實(shí)施例1-37的方法，不同的是用適量的碳酸鈣代替碳酸氫鈉中和酸類成份。按此方法制備的溶液的作用與表1和2以及圖1分別所示的實(shí)施例1-37的溶液的作用沒有明顯的不同。
實(shí)施例98-101按實(shí)施例23、24、27和28的方法，不同的是用0.053％(質(zhì)量)的L-精氨酸鹽酸鹽、0.052％(質(zhì)量)的L-組氨酸鹽酸鹽、0.009％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸鹽酸鹽和0.025％(質(zhì)量)的L-酪氨酸鹽酸鹽分別代替實(shí)施例23、24、27和28中分別所用的L-精氨酸、L-組氨酸、L-甲硫氨酸和L-酪氨酸。在每種情況下相應(yīng)的碳酸氫鈉用量為0.054％(質(zhì)量)。按此方法制備的溶液的作用與表2中所示的實(shí)施例23、24、27和28的溶液的作用沒有明顯的不同。
實(shí)施例102向裝有攪拌器的裝置中稱量加入0.01％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.034％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.003％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.065％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.007％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸和0.091％(質(zhì)量)的碳酸氫鈉。然后在繼續(xù)攪拌下向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2中100％組合物所示。
實(shí)施例103按實(shí)施例102的方法，不同的是每種成份僅稱量加入80％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2中80％組合物所示。
實(shí)施例104按實(shí)施例102的方法，不同的是每種成份僅稱量加入60％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2中60％組合物所示。
實(shí)施例105按實(shí)施例102的方法，不同的是每種成份僅稱量加入40％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2中40％組合物所示。
實(shí)施例106按實(shí)施例102的方法，不同的是每種成份僅稱量加入20％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2中20％組合物所示。
實(shí)施例107向裝有攪拌器的裝置中稱量加入0.011％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.01％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.036％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、0.041％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、0.044％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.039％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.089％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、0.007％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.012％(質(zhì)量)的d-生物素、0.010％(質(zhì)量)的吡哆素、0.0004％(質(zhì)量)的核黃素、0.0006％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.0006％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.017％(質(zhì)量)的乳清酸、0.003％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.034％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.090％(質(zhì)量)的D-甘露糖、0.053％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.065％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.040％(質(zhì)量)的草乙酸、0.0015％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷以及0.087％(質(zhì)量)的碳酸氫鈉。然后在繼續(xù)攪拌下向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2、3、4、5、6和7中100％組合物所示。
實(shí)施例108按實(shí)施例107的方法，不同的是每種成份僅稱量加入80％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2、3、4、5、6和7中80％組合物所示。
實(shí)施例109按實(shí)施例107的方法，不同的是每種成份僅稱量加入60％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2、3、4、5、6和7中60％組合物所示。
實(shí)施例110按實(shí)施例107的方法，不同的是每種成份僅稱量加入40％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2、3、4、5、6和7中40％組合物所示。
實(shí)施例111按實(shí)施例107的方法，不同的是每種成份僅稱量加入20％量。然后向該混合物中加入合適的介質(zhì)以便補(bǔ)充組合物的質(zhì)量至100％。按此方法制備的溶液的作用如圖2、3、4、5、6和7中20％組合物所示。
實(shí)施例112向裝有攪拌器的裝置中稱量加入1.47％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、1.01％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.036％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、1.63％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、1.71％(質(zhì)量)的L-精氨酸、1.53％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.18％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、1.94％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、1.21％(質(zhì)量)的d-生物素、2.02％(質(zhì)量)的吡哆素、0.038％(質(zhì)量)的核黃素、0.05％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.02％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.09％(質(zhì)量)的乳清酸、0.068％(質(zhì)量)的腺嘌呤、1.32％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、1.8％(質(zhì)量)的D-甘露糖、1.1％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、1.32％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.040％(質(zhì)量)的草乙酸、0.11％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷、1.34％(質(zhì)量)的碳酸氫鈉和0.04％(質(zhì)量)的碳酸氫鉀。在繼續(xù)攪拌下，向該混合物中加入含有0.02％(質(zhì)量)的KH2PO4和0.3％(質(zhì)量)的Na2HPO4的83.168％(質(zhì)量)的緩沖液。按此方法制備的溶液并用于治療動(dòng)物的效果如圖8和9所示。
實(shí)施例113向混合器中稱量加入20％(質(zhì)量)的L-色氨酸、62％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸和18％(質(zhì)量)的D-葡糖胺。充分混合后，所得粉狀混合物用于頸防試驗(yàn)。
實(shí)施例114按實(shí)施例113的方法，不同的是使用32％(質(zhì)量)的L-精氨酸、28％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸和40％(質(zhì)量)的蘋果酸。
實(shí)施例115按實(shí)施例113的方法，不同的是使用23％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.2％(質(zhì)量)的吡哆素、17.8％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸和59％(質(zhì)量)的草乙酸。
實(shí)施例116按實(shí)施例113的方法，不同的是使用19％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、61％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.2％(質(zhì)量)的腺嘌呤和19.8％(質(zhì)量)的L-組氨酸。
實(shí)施例117按實(shí)施例113的方法，不同的是使用31％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、53％(質(zhì)量)的d-生物素、0.2％(質(zhì)量)的腺嘌呤和15.8％(質(zhì)量)的乳清酸。
實(shí)施例118按實(shí)施例113的方法，不同的是使用27％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、33％(質(zhì)量)的核黃素、0.2％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷和39.8％(質(zhì)量)的D-甘露糖。
實(shí)施例119按實(shí)施例113的方法，不同的是使用32％(質(zhì)量)的L-組氨酸、9％(質(zhì)量)的硫辛酸和59％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖。
實(shí)施例120按實(shí)施例113的方法，不同的是使用12％(質(zhì)量)的L-精氨酸、11％(質(zhì)量)的吡哆素和77％(質(zhì)量)的蘋果酸。
實(shí)施例121向混合器中稱量加入10％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、3％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.2％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、10.9％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、22.7％(質(zhì)量)的L-精氨酸、10％(質(zhì)量)的L-組氨酸、1.1％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、11.9％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.1％(質(zhì)量)的d-生物素、0.2％(質(zhì)量)的吡哆素、0.05％(質(zhì)量)的核黃素、0.35％(質(zhì)量)的核黃素-5＇-磷酸、0.1％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.6％(質(zhì)量)的乳清酸、0.3％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.9％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、11.5％(質(zhì)量)的D-甘露糖、7％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、8％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.4％(質(zhì)量)的草乙酸和0.7％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷。充分混合后，將所得的粉狀混合物用于預(yù)防試驗(yàn)。
用Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞試驗(yàn)實(shí)施例1-37組合物的作用和活性成份的協(xié)同作用(與單一成份的作用比較)。
在試驗(yàn)中，使用科學(xué)文獻(xiàn)提供的最新方法。對(duì)于Sp2/0-Ag14和K562系，從介質(zhì)中收集呈對(duì)數(shù)增長的細(xì)胞并再懸浮于用于細(xì)胞培養(yǎng)的96孔板中，最終濃度分別為每孔250μl合適的介質(zhì)中有4×104個(gè)Sp2/0-Ag14細(xì)胞和2×104個(gè)K562細(xì)胞且每孔中含有預(yù)定濃度的試驗(yàn)物質(zhì)。對(duì)于HeLa、HEp-2和Vero細(xì)胞，從含有0.2％胰蛋白酶的75％融合組織培養(yǎng)物燒瓶中收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并以密度為105個(gè)細(xì)胞/ml再懸浮于合適的介質(zhì)中。將等份試樣(100μl)加至96孔微板中并培養(yǎng)24小時(shí)。然后除去介質(zhì)并用含有預(yù)定濃度的試驗(yàn)化合物的250μl新介質(zhì)來代替。使各種細(xì)胞增生48小時(shí)。然后用錐蟲藍(lán)染料排除法用顯微鏡數(shù)活的Sp2/0-Ag14和K562細(xì)胞的數(shù)量。HeLa、HEp-2和Vero細(xì)胞的存活率通過評(píng)定細(xì)胞的內(nèi)源性堿性磷酸酯酶活性來計(jì)量。用Student＇s t-試驗(yàn)評(píng)估結(jié)果。在表中的平均值后面的數(shù)據(jù)和圖中的標(biāo)志含義為“平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差”(SEM)。
表1的第1欄表示實(shí)施例編號(hào)、第2欄表示對(duì)比試驗(yàn)的編號(hào)、其他6欄表示在試驗(yàn)中所用成份的量，并用％(質(zhì)量)表示。對(duì)比混合物由相同量的化學(xué)上類似但沒有藥理學(xué)作用的作為活性成份的物質(zhì)(0.026％(質(zhì)量)的L-絲氨酸、0.033％(質(zhì)量)的L-天冬酰胺、0.029％(質(zhì)量)的L-纈氨酸、0.018％(質(zhì)量)的L-丙氨酸、0.006％(質(zhì)量)的甘氨酸、0.059％(質(zhì)量)的甜菜堿(trimethylglicine)和0.006％(質(zhì)量)的L-脯氨酸作為氨基酸；0.017％(質(zhì)量)的鹽酸硫胺素、0.006％(質(zhì)量)的煙酸、0.019％(質(zhì)量)的葉酸鈉、0.001％(質(zhì)量)的D-泛酸半鈣、0.012％(質(zhì)量)的尿嘧啶和0.0008％(質(zhì)量)的辛酸作為維生素；0.003％(質(zhì)量)的次黃嘌呤、0.038％(質(zhì)量)的D(-)核糖、0.090％(質(zhì)量)的葡萄糖、0.055％(質(zhì)量)的N-乙?；咸前贰?.081％(質(zhì)量)的琥珀酸二鈉、0.080％(質(zhì)量)的富馬酸二鈉和0.0015％(質(zhì)量)的鳥苷三磷酸三鈉鹽)組成。最后兩欄分別表示含有4種和5種活性成份的組合物的作用和成份本身的作用(對(duì)比試驗(yàn))，即培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞的數(shù)目和以未處理細(xì)胞的量的百分比表示的細(xì)胞的量(未處理細(xì)胞的量為100％)。對(duì)于L-色氨酸例如第2-4對(duì)比試驗(yàn)表示分別單用0.002、0.006和0.01％(質(zhì)量)的L-色氨酸對(duì)細(xì)胞數(shù)目的作用。實(shí)施例2-4表示使用相同量的L-色氨酸但與其他4種活性成份一起使用時(shí)的作用。
從表1的最后兩欄的數(shù)據(jù)可以看出，在單獨(dú)使用上述物質(zhì)時(shí)，它們均不表現(xiàn)出殺腫瘤細(xì)胞的作用，事實(shí)上，使用給定量的L-色氨酸時(shí)，細(xì)胞增生只有稍微增長。同時(shí)從這些欄中的數(shù)據(jù)還可以看出每種物質(zhì)以協(xié)同作用方式與其用量成比例地增加了另外四種活性成份的作用。例如0.01％(質(zhì)量)的L-色氨酸將四種其它活性成份的作用由73.1％增加至92.3％。相同量(0.01％(質(zhì)量))的L-色氨酸本身在無其它四種成份時(shí)僅稍微增加了細(xì)胞的增生，這清楚地證明了協(xié)同作用。
在此使用最大量時(shí)(例如對(duì)于L-色氨酸為0.01％(質(zhì)量)時(shí))含有4種活性成份的組合物(實(shí)施例1、5、9、13和17)的作用與含有5種活性成份的組合物(實(shí)施例4、8、12、16和20)的作用在所有情況下均明顯不同(P＜0.01)，因此所有物質(zhì)均明顯地增加了其它4種成份的作用。
表1本發(fā)明組合物和單-活性成份對(duì)Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞的作用
含有5種活性成份的實(shí)施例1-20的組合物的協(xié)同作用如圖1所示。其中用未處理細(xì)胞量的百分?jǐn)?shù)(未處理細(xì)胞量為100％)表示的Sp2/0-Ag14細(xì)胞的量在縱軸上表示，橫軸為用％(質(zhì)量)表示的L-色氨酸、2-脫氧-D-核糖、腺嘌呤、蘋果酸和L-抗壞血酸的量。白框表示單獨(dú)用上述物質(zhì)培養(yǎng)48小時(shí)后用未處理的細(xì)胞的量的百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞的量，黑框表示當(dāng)它們與其它4種活性成份一起使用時(shí)所得的結(jié)果。增加單一物質(zhì)的用量時(shí)白框和黑框發(fā)生不同程度的變化(對(duì)于L-色氨酸甚至是以反方向變化)證明了協(xié)同作用。黑框表明組合物有較強(qiáng)的殺腫瘤細(xì)胞作用。
基于實(shí)施例21-37，表2表示當(dāng)加入另外的成份時(shí)，含有5種活性成份的組合物對(duì)Sp2/0-Ag14細(xì)胞的作用是怎樣增加的，表2中用％(質(zhì)量)并乘以1000表示物質(zhì)的量，因此表中的數(shù)字應(yīng)讀成×10-3，例如在實(shí)施例21中，對(duì)于L-色氨酸，數(shù)字6表示6×10-3，即0.006％(質(zhì)量)。試驗(yàn)條件同前。
與表1相同，從表2中的最后兩欄數(shù)據(jù)(用細(xì)胞數(shù)目和％表示)可以看出單獨(dú)使用上述物質(zhì)時(shí)沒有一種具有減少細(xì)胞增生的作用，而通過L-苯丙氨酸(對(duì)比例22)、L-精氨酸(對(duì)比例23)、L-組氨酸(對(duì)比例24)和核黃素(對(duì)比例29)的作用，細(xì)胞的數(shù)目與未處理細(xì)胞的數(shù)目(對(duì)比例21)相比甚至稍有增加。也可以看出當(dāng)使用同樣量時(shí)相同的物質(zhì)協(xié)同地增加了實(shí)施例21的組合物的作用。沒有潛在的物質(zhì)時(shí)，含有5種活性成份的實(shí)施例21組合物的作用在所有情況下均明顯低于與其它化合物一起使用時(shí)的作用。
含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物的作用與含有5種活性成份且具有的相同量的常用活性成份的實(shí)施例102-106組合物的作用也進(jìn)行了比較。為了與以前的結(jié)果比較，也使用了Sp2/0-Ag14細(xì)胞，并且試驗(yàn)條件同前。結(jié)果如圖2所示?？v軸表示用未處理細(xì)胞的量的百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞的量的變化，橫軸表示用％表示的組合物量的變化(活性成份量的變化)。含有5種活性成份的實(shí)施例102組合物被看作為100％，因此，實(shí)施例103的80％組合物含有80％量的各成份，對(duì)于含有21種活性成份組合物，實(shí)施例107組合物被看作為100％。
表2本發(fā)明組合物和單一活性成份對(duì)Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞的作用
<p>表2(續(xù))本發(fā)明組合物和單一活性成份對(duì)Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細(xì)胞的作用
為了排除所測的作用是滲透作用或營養(yǎng)素的非特異過載或氨基酸不平衡的結(jié)果的可能性，也制備了對(duì)比混合物。這些對(duì)比混合物含有在以前試驗(yàn)中被證實(shí)對(duì)PADS無效的物質(zhì)。對(duì)比混合物的組合物如表1所示用實(shí)施例102-106和107-111的組合物和用對(duì)比混合物試驗(yàn)所得的結(jié)果如圖2所示，其中有空心園符號(hào)的曲線表示對(duì)比混合物培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量的變化，有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示對(duì)于含有5種活性成份的實(shí)施例102-106組合物時(shí)細(xì)胞數(shù)量的變化，而有空心三角符號(hào)的曲線表示對(duì)于含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物時(shí)細(xì)胞數(shù)量的變化。在用實(shí)施例102和107的100％組合物進(jìn)行的試驗(yàn)中，如圖2所示，單個(gè)活性成份的使用量要使得對(duì)細(xì)胞數(shù)量基本沒有影響(這可從表1和2所示的以前的試驗(yàn)結(jié)果看出)。從圖2可以看出，當(dāng)一起使用時(shí)這些成份具有顯著的抗腫瘤作用。此事實(shí)再一次證明了活性成份的協(xié)同作用。從圖2也可看出，對(duì)比混合物對(duì)細(xì)胞的數(shù)目不會(huì)產(chǎn)生任何大的作用。因此，基于這些試驗(yàn)可以排除所測的作用是滲透作用或營養(yǎng)素的非特異過載或氨基酸不平衡的結(jié)果。
為了弄清楚抗衡離子是否對(duì)組合物的作用有影響，用K+(實(shí)施例38-67)或Ca++(實(shí)施例68-97)離子代替Na+離子進(jìn)行試驗(yàn)。使用不同抗衡離子時(shí)組合物的作用沒有明顯不同，事實(shí)上，結(jié)果完全一致。
研究作為時(shí)間函數(shù)的實(shí)施例107的100％組合物對(duì)Sp2/0-Ag14細(xì)胞的作用并與100％對(duì)比混合物和未處理的細(xì)胞比較。試驗(yàn)條件與以前的試驗(yàn)相同，只是在此情況下，細(xì)胞不僅在48小時(shí)后計(jì)數(shù)而且在6、12、24和36小時(shí)后也計(jì)數(shù)。這些動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示?？v軸表示細(xì)胞數(shù)目/ml，橫軸表示時(shí)間，單位為小時(shí)。有空心園符號(hào)的曲線表示未處理細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目的變化，有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示用對(duì)比混合物時(shí)細(xì)胞數(shù)目的變化，有實(shí)心三角符號(hào)的曲線表示用含有21種活性成份的實(shí)施例107組合物時(shí)細(xì)胞數(shù)量的變化。所述變化為時(shí)間的函數(shù)。從圖3可以看出，對(duì)比混合物對(duì)細(xì)胞數(shù)目沒有任何顯著的作用，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量隨時(shí)間指數(shù)地增加，曲線的形狀與未處理細(xì)胞增生所示的曲線的形狀一致。本發(fā)明的組合物對(duì)腫瘤有毒，并隨著時(shí)間的推移使腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少。因此本發(fā)明組合物不僅能抑制細(xì)胞增生而且具有細(xì)胞毒性作用。選擇含有21種物質(zhì)的上述組合物中的活性成份的量，以使當(dāng)它們分別使用時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有任何顯著作用(當(dāng)然，這對(duì)于其中活性劑的量為20％、40％等或更低的80％、60％等組合物來說更為正確)，因?yàn)閷⑼瑯拥慕M合物用于所有體外試驗(yàn)時(shí)其結(jié)果證實(shí)在所有情況下均是活性成份的協(xié)同作用。
上述結(jié)果證實(shí)了按照構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)選擇的物質(zhì)的協(xié)同作用所產(chǎn)生的作用。另外這些結(jié)果也證實(shí)了這些認(rèn)識(shí)是正確的，因?yàn)楦鞣N癌細(xì)胞以不同程度不同于正常細(xì)胞，對(duì)癌細(xì)胞最有效的本發(fā)明組合物彼此也不同。這意味著對(duì)于每種腫瘤應(yīng)使用殺腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用作為標(biāo)準(zhǔn)選擇最合適的組合物，然而為了預(yù)防或當(dāng)腫瘤類型不能確定時(shí)或?yàn)橹委熞延昧嗽S多時(shí)間時(shí)，優(yōu)選使用含有21種活性成份的一般組合物，因此在下一個(gè)試驗(yàn)中將研究這些組合物作用的一般性和其功效怎樣。
研究含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)K-562人紅白血病細(xì)胞的作用并與上述對(duì)比混合物的作用比較。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。與圖2相同，縱軸表示以未處理細(xì)胞量的百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞量的變化，橫軸表示以％表示的組合物量的變化(活性成份量的變化)。有空心園符號(hào)的曲線表示對(duì)比混合物的作用，而有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示含有21種活性成份的組合物的作用。從圖4可以看出，本發(fā)明的組合物對(duì)K-562人紅白血病細(xì)胞也具有顯著的殺腫瘤細(xì)胞作用。
下面將研究含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物對(duì)HeLa人上皮樣癌子宮頸細(xì)胞和HEp-2人表皮樣癌喉細(xì)胞的作用并與對(duì)比混合物的作用比較。為了證明以前的結(jié)果是一般性的并且與所用介質(zhì)、懸浮方法、計(jì)數(shù)和測定方法的干擾作用無關(guān)必須進(jìn)行該試驗(yàn)。通過評(píng)定細(xì)胞的內(nèi)源性堿性磷酸酯酶活性來測量HeLa、HEp-2和Vero細(xì)胞的存活率。簡言之，在培養(yǎng)后，通過洗滌除去未粘連(假定被損傷的)細(xì)胞。然后向各孔中加入溶解在150μl新鮮的10％二乙醇胺緩沖液(pH9.8)中的150μg堿性磷酸酯酶底物(磷酸4-硝基苯基酯，Sigma片劑，第111-112號(hào))。將平板在30℃下培養(yǎng)直到未處理細(xì)胞的吸收度達(dá)到大約1的值。通過向各孔中加入50μl 3M NaOH使反應(yīng)停止。借助Dynatech ELISA讀數(shù)器在405nm處測量吸收度。從各次讀數(shù)中減去本底(backround)值。結(jié)果如圖5(用HeLa細(xì)胞時(shí))和圖6(用HEp-2細(xì)胞時(shí))所示。與圖2和4相同，在此兩圖中縱軸表示以未處理細(xì)胞的量的百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞的量的變化。在這些情況下細(xì)胞數(shù)目的變化是通過測量滅活來測定的。橫軸表示以％表示的組合物量的變化(活性成份量的變化)。在圖5和6中，有空心園符號(hào)的曲線表示對(duì)比混合物的作用，而有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物的作用。從這些圖可以看出，這些組合物對(duì)兩種細(xì)胞系都有效。如果考慮到HEp-2被稱為抗御環(huán)境作用的硬(hardy)細(xì)胞系”，則這些結(jié)果更有價(jià)值[(American Type Culture Collection Catalogue of CellLines and Hybridomas，5th ed.，pp.15-16(1985)]。
按照本發(fā)明的理論基礎(chǔ)，本發(fā)明組合物僅選擇性地對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生作用。為了進(jìn)一步證實(shí)此論述，也研究了含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物和對(duì)比混合物對(duì)正常的細(xì)胞系Vero African綠猴(green monkey)腎細(xì)胞的作用。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示?？v軸表示以未處理細(xì)胞的細(xì)胞量的百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞的量的變化，橫軸表示以％表示的組合物量的變化(活性成份量的變化)。有空心園符號(hào)的曲線表示對(duì)比混合物的作用，而有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示含有21種活性成份的實(shí)施例107-111組合物的作用。從圖7可以看出本發(fā)明的組合物對(duì)正常的Vero細(xì)胞系不產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，因?yàn)閷?shí)施例107的100％組合物對(duì)增生的作用當(dāng)對(duì)時(shí)間作曲線時(shí)，類似于圖3所示的對(duì)比混合物的作用。Vero屬于快速增生細(xì)胞系[(American TypeCulture Collection Catalogue of Cell Lines andHybridomas，5th ed.，pp.45-46(1985)]，因此該試驗(yàn)證實(shí)與細(xì)胞生長抑制劑相反，本發(fā)明組合物對(duì)所有快速增生細(xì)胞無毒，但它選擇性地僅對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用。基于上述結(jié)果，本發(fā)明組合物被認(rèn)為是抗腫瘤藥，而不是細(xì)胞毒性制劑。
為了證明本發(fā)明組合物的體內(nèi)效果，亦進(jìn)行藥理學(xué)試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，總是使用科學(xué)文獻(xiàn)中所提供的方法和條件。用Sp2/0-Ag14細(xì)胞進(jìn)行這些試驗(yàn)。為了試驗(yàn)，使用5-6周齡雌性BALB/c小鼠。用兩組每組各包括10只小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。給小鼠腹膜內(nèi)注射懸浮在200μl不完全的RPMI 1640介質(zhì)中的5×104Sp2/0-Ag14細(xì)胞。注射當(dāng)天作為試驗(yàn)0天。通過致瘤試驗(yàn)確定試驗(yàn)所必需的細(xì)胞數(shù)目。注射細(xì)胞后24小時(shí)(即為試驗(yàn)的第一天)開始處理動(dòng)物并持續(xù)10天。在每次處理時(shí)用200μl PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)腹膜內(nèi)注射對(duì)比組，而處理組腹膜內(nèi)注射同樣體積的含有21種活性成份的實(shí)施例112組合物。
處理的最有效的方法是將組合物成份的濃度保持于相當(dāng)高的水平的持續(xù)輸注。由于實(shí)際操作上的困難，而使用大致持續(xù)的周期性的處理，即每天處理動(dòng)物6次。試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。橫軸表示從試驗(yàn)開始經(jīng)過的天數(shù)，縱軸表示存活率％的值，即在給定的那天存活的小鼠的數(shù)目。因此，10只小鼠意味著100％，8只小鼠意味著80％。白框表示處理過的小鼠的存活率，黑框表示未處理的小鼠的存活率。從圖8可以看出，例如在第16天時(shí)沒有一只未處理的小鼠存活，而所有處理過的小鼠均存活。在第16天時(shí)所有未處理的小鼠均死亡，而處理過的小鼠在第25天死亡?？梢钥闯鲇捎谔幚恚瑝勖@著地增長了。對(duì)于處理組，半數(shù)(median)存活時(shí)間為21天，而對(duì)于未處理組為14天。由這些半數(shù)存活時(shí)間計(jì)算的T/C％值(150％)遠(yuǎn)高于作為有效標(biāo)準(zhǔn)的125％。按照文獻(xiàn)所述，基于這些數(shù)值，本發(fā)明組合物可作為對(duì)給定細(xì)胞系具有有效抗腫瘤作用的制劑。
為了證明存活時(shí)間的增長是實(shí)施例112組合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用的結(jié)果而不是強(qiáng)促茁(roborating)作用的結(jié)果，進(jìn)行另一試驗(yàn)。按同樣的方式處理10-10只小鼠。處理10天后，從兩組小鼠的腹腔中取出細(xì)胞然后計(jì)數(shù)。兩組鼠的平均細(xì)胞數(shù)目(分別為5.55×105和5.95×107)之差很明顯(P＜0.001)，由此證明了本發(fā)明組合物的體內(nèi)效果。
為了進(jìn)一步證明本發(fā)明組合物的效果并排除這些結(jié)果僅是局部作用(細(xì)胞位于腹腔中并通過腹膜內(nèi)處理)的結(jié)果的可能性，用人固體腫瘤皮下(s.c.)注射的先天性免疫缺損(胸腺缺損)(裸體)的小鼠進(jìn)行另一試驗(yàn)。為了試驗(yàn)，使用HeLa細(xì)胞和6-8周齡雌性BALB/c(nu/nu)小鼠，在鼠的下肢皮下注射5×106個(gè)細(xì)胞。當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到50mm3的平均體積時(shí)開始用實(shí)施例112組合物處理。處理的時(shí)間表、處理的時(shí)間和用于處理的溶液(實(shí)施例112)與以前的藥理學(xué)試驗(yàn)相同。用數(shù)字測徑器(callipers)(Mitutoyo，Inc.，Tokyo，Japan)每周兩次測量腫瘤的大小[長(L)，寬(W)，高(H)]。計(jì)算腫瘤的體積(用公式LWH/2計(jì)算)以及相對(duì)腫瘤體積Vt/Vo[Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.，21，1253-1260(1988)]，其中Vt是實(shí)際腫瘤體積，而Vo是開始處理時(shí)的腫瘤體積。結(jié)果總結(jié)于圖9中，縱軸表示Vt/Vo值的平均值，橫軸表示開始處理后的天數(shù)。有空心園符號(hào)的曲線表示開始處理對(duì)比小鼠后相對(duì)腫瘤體積的增加，而有實(shí)心園符號(hào)的曲線表示開始處理處理動(dòng)物后相對(duì)腫瘤體積的增加值，從圖9中可以看出處理能極大地減慢了腫瘤增長。例如對(duì)于對(duì)比小鼠，腫瘤體積在16.5天內(nèi)增加至9倍數(shù)值，而對(duì)于處理小鼠，同樣9倍的生長則需要33天。由處理組和對(duì)比組的Vt/Vo值計(jì)算T/C％。在所有情況下的T/C％值均低于42％(即可接受作為有效標(biāo)準(zhǔn)之值)[Europ.J.Cancer，17,129-142(1981)]。此試驗(yàn)再一次表明本發(fā)明組合物具有顯著的抗腫瘤作用?？紤]到由于技術(shù)問題，我們遠(yuǎn)非采用了最佳處理方法和最大的耐受劑量，而且同樣的處理在臨床條件下進(jìn)行將更為有效(更長的處理時(shí)間、永久性作用，例如通過輸注等)，這些結(jié)果特別有可能成功。
在處理過程中體重的變化是一種良好的通用的表示處理的毒性的特征的指標(biāo)，因此在上述試驗(yàn)中測量了動(dòng)物的體重。按照文獻(xiàn)，當(dāng)平均體重降低10-15％時(shí)，制劑被認(rèn)為是有毒的[Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.，21,1253-1260(1988)]。在本發(fā)明人的試驗(yàn)中，對(duì)于對(duì)比組，平均體重變化為-5.9±4.1％，而對(duì)于處理組為-6.6±3.9％。因此，在兩組間沒有明顯的差別，這意味著本發(fā)明組合物沒有毒副作用。
為了證明本發(fā)明組合物的預(yù)防有用性，按下述方法處理2-2組BALB/c小鼠(每組10只小鼠)使處理動(dòng)物的食物按1∶1比例與實(shí)施例113-121組合物混合，并使動(dòng)物任意進(jìn)食。開始處理后5天向兩組動(dòng)物腹膜內(nèi)預(yù)防注射1×104Sp2/0-Ag14細(xì)胞。繼續(xù)處理100天。在注射細(xì)胞后100天殺死鼠時(shí)，進(jìn)食過1-1的實(shí)施例113-121組合物與常規(guī)食物的混合物的小鼠沒有顯示出腹膜內(nèi)的腫瘤增長跡象。而同時(shí)在注射了Sp2/0-Ag14細(xì)胞后在不同試驗(yàn)組中的對(duì)比動(dòng)物的存活時(shí)間為21至26天。
根據(jù)劑量和處理方法的不同，本發(fā)明組合物可用于預(yù)防癌性疾病、抑制AIDS和器官移植中腫瘤的生長、阻止轉(zhuǎn)移瘤的形成以及輔助、結(jié)合和直接治療腫瘤患者。
本發(fā)明組合物的主要優(yōu)點(diǎn)如下a)使用適當(dāng)?shù)膭┝浚景l(fā)明組合物可用于預(yù)防癌性疾病、抑制AIDS和移植中的腫瘤形成、阻止轉(zhuǎn)移瘤形成以及直接、輔助或結(jié)合治療和治愈癌性疾病。
b)本發(fā)明組合物無毒?；跍y量動(dòng)物體重降低的毒性試驗(yàn)證明了本發(fā)明組合物無毒。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，所述組合物的單一成份的毒性非常低，當(dāng)這些物質(zhì)一起使用時(shí)，甚至這種低毒性進(jìn)一步降低。另外，靈長目動(dòng)物耐受這些物質(zhì)勝于用于測定毒性值的小動(dòng)物?？紤]到所有這些事實(shí)，表明本發(fā)明組合物應(yīng)被認(rèn)為是無毒的。
c)本發(fā)明組合物沒有或僅有可被忽略的副作用。由于幾乎所有的成份(除2-脫氧-D-核糖之外)已用于某種治療(僅有抗壞血酸用于抗癌治療中)中或作為食品添加劑，故已收集了各成份副作用的大量觀察數(shù)據(jù)。根據(jù)這些申請中收集的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，很明顯本發(fā)明組合物實(shí)際上沒有副作用。
d)本發(fā)明組合物具有選擇性。該選擇性被我們自己的試驗(yàn)所證實(shí)，試驗(yàn)表明對(duì)各種癌細(xì)胞有毒的本發(fā)明組合物分別對(duì)正常的Vero細(xì)胞、試驗(yàn)動(dòng)物或其正常的細(xì)胞無毒。由于正常細(xì)胞多于癌細(xì)胞并且癌細(xì)胞累積了組合物的成份，而對(duì)于正常細(xì)胞其攝取被控制，因此提高了選擇性。
e)本發(fā)明組合物可廣泛使用，它們的作用是一般性的。已經(jīng)研究了本發(fā)明組合物對(duì)小鼠骨髓瘤(Sp2/0-Ag14)、人紅白血病(K-562)、人上皮樣癌子宮頸(HeLa)和人表皮樣癌喉(HEp-2)細(xì)胞系的作用。這些細(xì)胞代表了廣譜性，因?yàn)樗鼈儼ㄈ撕蛣?dòng)物腫瘤，甚至于人腫瘤有白血病和兩種極不相同的固體腫瘤為代表。用這些細(xì)胞系進(jìn)行的試驗(yàn)所得的結(jié)果支持上述論述，即本發(fā)明組合物具有一般性作用，并可廣泛使用。
f)本發(fā)明組合物在制備上無任何困難，組合物成份是低分子量的物質(zhì)并且容易得到，所以本發(fā)明組合物容易制備。
g)本發(fā)明組合物可溶于水中，因此容易服用。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防和治療癌性疾病的藥物組合物，它包括至少三種存在于循環(huán)系統(tǒng)中的活性化合物至少一種氨基酸、至少一種維生素以及至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物，其條件是如果組合物除含有氨基酸外僅含蘋果酸和一種維生素，那么維生素不是抗壞血酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，該組合物除含有活性化合物外還包括藥學(xué)中常用的載體、稀釋劑和/或其它助劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述氨基酸為L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述維生素是d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5’-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸、乳清酸和/或其鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括L-色氨酸、L-抗壞血酸和至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-葡糖胺和/或其可藥用鹽的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括L-精氨酸、核黃素-5’-磷酸和至少一種選自D-甘露糖、蘋果酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括0.002-70％(質(zhì)量)的至少一種選自L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽的化合物作為氨基酸，0.0004-80％(質(zhì)量)的至少一種選自d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5’-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸乳清酸和/或其鹽的化合物作為維生素以及0.003-80％(質(zhì)量)的至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括0.9-25％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.8-19％(質(zhì)量)的L-色氨酸、1.1-48％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.9-46％(質(zhì)量)的d-生物素、1.2-16％(質(zhì)量)的吡哆素、0.03-42％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、0.05-18％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.5-60％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.7-68％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.6-40％(質(zhì)量)的D-甘露糖和/或其可藥用鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括0.005-34％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.002-25％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.02-23％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、0.04-30％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、0.04-50％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.03-34％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.05-22％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、0.01-60％(質(zhì)量)的d-生物素、0.01-20％(質(zhì)量)的吡哆素、0.0004-45％(質(zhì)量)的核黃素、0.0005-45％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、0.003-70％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.004-15％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.01-17％(質(zhì)量)的乳清酸、0.001-10％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.01-63％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.08-42％(質(zhì)量)的D-甘露糖、0.05-20％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.01-80％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.02-60％(質(zhì)量)的草乙酸、0.001-10％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽。
10.一種預(yù)防和治療癌性疾病的方法，它包括給待治療的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，它包括30-44％(質(zhì)量)的L-精氨酸、27-35％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、38-62％(質(zhì)量)的蘋果酸和/或其可藥用鹽。
12.制備權(quán)利要求1組合物的方法，該方法包括使存在于循環(huán)系統(tǒng)中的活性化合物中的至少一種氨基酸、至少一種維生素以及至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷的化合物，以及，如果需要的話還有藥學(xué)上常用的載體、稀釋劑和/或其他助劑進(jìn)行混合制成藥物組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，它包括將L-色氨酸、L-抗壞血酸、至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-葡糖胺和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，它包括將L-精氨酸、核黃素-5’-磷酸、至少一種選自D-甘露糖、蘋果酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，該方法包括將30-44％(質(zhì)量)的L-精氨酸、27-35％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、38-62％(質(zhì)量)的蘋果酸和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，該方法包括將0.002-70％(質(zhì)量)的至少一種選自L-甲硫氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、N-苯甲酰甘氨酸和/或其鹽的化合物作為氨基酸，0.0004-80％(質(zhì)量)的至少一種選自d-生物素、吡哆素、核黃素、核黃素-5’-磷酸、L-抗壞血酸、硫辛酸、乳清酸和/或其鹽的化合物作為維生素和0.003-80％(質(zhì)量)的至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽的化合物混合制成藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，該方法包括將0.9-25％質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.8-19％(質(zhì)量)的L-色氨酸、1.1-48％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.9-46％(質(zhì)量)的d-生物素、1.2-16％(質(zhì)量)的吡哆素、0.03-42％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、0.05-18％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.5-60％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.7-68％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.6-40％(質(zhì)量)的D-甘露糖和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，該方法包括將0.005-34％(質(zhì)量)的L-甲硫氨酸、0.002-25％(質(zhì)量)的L-色氨酸、0.02-23％(質(zhì)量)的L-酪氨酸、0.04-30％(質(zhì)量)的L-苯丙氨酸、0.04-50％(質(zhì)量)的L-精氨酸、0.03-34％(質(zhì)量)的L-組氨酸、0.05-22％(質(zhì)量)的N-苯甲酰甘氨酸、0.01-60％(質(zhì)量)的d-生物素、0.01-20％(質(zhì)量)的吡哆素、0.0004-45％(質(zhì)量)的核黃素、0.0005-45％(質(zhì)量)的核黃素-5’-磷酸、0.003-70％(質(zhì)量)的L-抗壞血酸、0.004-15％(質(zhì)量)的硫辛酸、0.01-17％(質(zhì)量)的乳清酸、0.001-10％(質(zhì)量)的腺嘌呤、0.01-63％(質(zhì)量)的2-脫氧-D-核糖、0.08-42％(質(zhì)量)的D-甘露糖、0.05-20％(質(zhì)量)的D-葡糖胺、0.01-80％(質(zhì)量)的蘋果酸、0.02-60％(質(zhì)量)的草乙酸、0.001-10％(質(zhì)量)的三磷酸腺苷和/或其可藥用鹽混合制成藥物組合物。
19.用作藥物的權(quán)利要求1的組合物。
20.用于治療癌癥的權(quán)利要求19的組合物。
21.用作藥物的權(quán)利要求1的組合物和藥物載體和/或助劑。
22.用作抗腫瘤藥劑的權(quán)利要求21的組合物。
23.用作治療癌癥的佐藥的權(quán)利要求1的組合物。
24.以片劑、糖錠劑、栓劑、膠囊劑或輸注液形式用于治療癌癥的權(quán)利要求1的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，該組合物包括治療活性量的權(quán)利要求1的產(chǎn)物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，該組合物包括0.2-420g權(quán)利要求1的產(chǎn)物。
27.權(quán)利要求1的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。
28.權(quán)利要求1的組合物用于制備以片劑或膠囊劑形式口服給藥治療癌癥的藥物的用途。
29.權(quán)利要求1的組合物用于制備以輸注液形式腸胃外給藥治療癌癥的藥物的用途。
30.權(quán)利要求1的組合物用于制備以片劑或膠囊劑形式口服給藥預(yù)防癌癥的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療癌性疾病的藥物組合物及其制備方法。這些組合物包括至少三種存在于循環(huán)系統(tǒng)中的化合物至少一種氨基酸、至少一種維生素以及至少一種選自腺嘌呤、2-脫氧-D-核糖、D-甘露糖、D-葡糖胺、蘋果酸、草乙酸、三磷酸腺苷的化合物。本發(fā)明組合物可無毒作用地用于預(yù)防癌性疾病、抑制AIDS和移植時(shí)腫瘤的形成，阻止轉(zhuǎn)移瘤的形成以及直接、輔助或結(jié)合治療和治愈癌性疾病。
文檔編號(hào)A61K31/385GK1116406SQ9419090
公開日1996年2月7日 申請日期1994年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月9日
發(fā)明者G·庫爾卡薩 申請人:伊梅穆爾有限協(xié)會(huì)