一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，屬于光學(xué)生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。基于聚合酶Klenow片段和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的共同催化作用，在microRNA存在時，將脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷排列和延伸成長度較長的聚胸腺嘧啶堿基序列，并以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板原位生成紅色熒光銅納米簇，銅納米簇的熒光強(qiáng)度與microRNA濃度的對數(shù)成正比，據(jù)此實現(xiàn)microRNA的低背景和高靈敏檢測。
【專利說明】
一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的mi croRNA檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種基于雙聚合酶延伸胸腺啼啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，屬于光學(xué)生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]成熟的microRNA是一類單鏈、非編碼蛋白、短的內(nèi)源性RNA(長度約19-23個核苷酸XMicroRNA作為重要的基因表達(dá)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)信使核糖核酸的分裂或翻譯抑制。MicroRNA在許多生物進(jìn)程中起著重要作用，這不僅包括癌癥的早期診斷和預(yù)后指標(biāo)，還包括介入治療以及癌癥藥物的發(fā)現(xiàn)。所以，開發(fā)靈敏度高且選擇性好的microRNA檢測方法非常必要。
[0003]體外聚合核苷酸因具有顯著的信號放大能力，作為一個強(qiáng)有力的工具廣泛應(yīng)用于生物分析中。在研究microRNA的檢測方法方面，體外聚合核苷酸顯示出其巨大的應(yīng)用潛能，如，聚合酶鏈反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)以及鏈置換反應(yīng)等。大多數(shù)傳感器基于熒光分析法，需使用熒光基團(tuán)或染料標(biāo)記的探針作為信號源。但是設(shè)計合成這些信號源通常操作復(fù)雜或昂貴或需要大量、多步、費時的實驗。更重要的是，這些信號源一般有較強(qiáng)的非特異性吸附，使得制備的傳感器對環(huán)境非常敏感，同時也降低了靈敏度。近年來，做為代替熒光基團(tuán)的理想的候選者，以DNA為模板合成的熒光銅納米粒子或銅納米簇(Cu NCs)引起人們越來越多的關(guān)注。由于納米簇具有非常小的尺寸，較弱的毒性，優(yōu)秀的光學(xué)性質(zhì)和良好的水溶性與生物相容性，在生物化學(xué)應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力。然而，迄今為止，利用體外聚合核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)和以單鏈DNA為模板合成Cu NCs相結(jié)合用于microRNA的檢測技術(shù)尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，該方法對microRNA的檢測具有背景低、靈敏和簡單快速的優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的mi croRNA檢測方法，其特征在于，向待測樣品中加入模板DNA，當(dāng)mi croRNA存在時，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復(fù)合物;加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復(fù)合物中引物的3 ’ -羥基末端，催化引物延伸反應(yīng)，生成與模板DNA互補(bǔ)的短DNA序列；加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，將脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷添加到新生成的短DNA序列的3’-羥基末端，催化脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷沿著短DNA序列的5’端向3’端延伸而形成聚胸腺嘧啶堿基序列;加入Cu(NO3)2和抗壞血酸鈉，以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板原位生成銅納米簇，銅納米簇的熒光強(qiáng)度隨microRNA濃度的增加而增強(qiáng)，據(jù)此實現(xiàn)對microRNA的低背景和尚靈敏檢測。
[0006]具體檢測步驟如下:向待測樣品中加入模板DNA，microRNA與模板DNA混合，80 °C退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧三磷酸胸腺啼啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列;將抗壞血酸鈉加入到聚胸腺嘧啶堿基序列溶液中，再加入Cu(NO3)2,室溫下反應(yīng)5 min，制成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇;測試銅納米簇的熒光強(qiáng)度，根據(jù)銅納米簇的熒光強(qiáng)度判斷microRNA濃度。
[0007]本發(fā)明中，還提供了一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的制備方法:
(1)雙聚合酶延伸胸腺嘧啶序列:將microRNA與模板DNA混合，80°(:退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列；
(2)合成熒光銅納米簇:將抗壞血酸鈉加入到步驟(I)的聚胸腺嘧啶堿基序列溶液中，再加入Cu(NO3)2,室溫下反應(yīng)5 min，制成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇。
[0008]上述方法中，所述的緩沖溶液為20 mM三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽，pH 7.9，含50 mMKAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
[0009]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明利用聚合酶Klenow片段和脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶對脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷在microRNA-DNA復(fù)合物上的延伸作用，形成聚胸腺嘧啶堿基序列，加入Cu(NO3)2和抗壞血酸鈉后原位生成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的銅納米簇，銅納米簇的焚光強(qiáng)度與mi croRNA濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實現(xiàn)對microRNA的檢測，該方法具有背景低、靈敏和簡單快速的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0010]圖1是基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶堿基序列原位合成CuNCs的microRNA檢測方法示意圖。
[0011]圖2是(A)熒光發(fā)射和激發(fā)光譜，(a)含和(b)不含microRNA-21的發(fā)射光譜，(C)含microRNA-21的最大激發(fā)光譜。內(nèi)插圖:凝膠電泳圖。條帶M: ladder marker;條帶O和I分別是(0)不含和(I)含microRNA-21的樣品。(B)紫外-可見吸收光譜，內(nèi)插圖為(I)不含和(2)含m i croRNA-21的樣品在紫外燈照射下的照片。
[0012]圖3是CuNCs的(A)透射電子顯微鏡圖和(B)原子力顯微鏡圖。
[0013]圖4是(A)不同濃度microRNA-21(O，I，2，5，10，20，50，100，200，500，1000 pM)存在時的熒光光譜圖。(B)熒光強(qiáng)度與microRNA-21濃度的關(guān)系曲線，內(nèi)插圖為熒光強(qiáng)度與m i croRNA-21濃度的對數(shù)關(guān)系曲線。
[0014]圖5是(A)分析方法的特異性。(B)實際樣品檢測，內(nèi)插圖為紫外燈下得到的相對應(yīng)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的照片。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，本發(fā)明并不限于此。
[0016]實施例1
(I)雙聚合酶延伸胸腺嘧啶序列:將microRNA與模板DNA(pDNA)混合，80 °(:退火雜交5min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段(KFexcT)、脫氧三磷酸胸腺啼啶核苷(dTTPs)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdTase)的緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列。
[0017](2)合成焚光銅納米簇:將抗壞血酸鹽(ascorbate)加入到步驟(I)的聚胸腺啼啶堿基序列溶液中，再加入Cu(NO3)2,室溫下反應(yīng)5 min，制成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇。檢測原理如圖1所示。
[0018]由圖2A可見，當(dāng)存在microRNA-21時，以雙聚合酶延伸胸腺嘧啶形成的聚胸腺嘧啶堿基序列為模板原位合成的Cu NCs在600 nm處有強(qiáng)的焚光發(fā)射峰(曲線a)，最佳激發(fā)波長為340 nm(曲線c )。然而，在沒有mi croRNA-21存在時，則沒有明顯的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)(曲線b)，表明，在沒有生成Cu NCs。采用瓊脂糖凝膠電泳對雙聚合酶延伸胸腺嘧啶的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析(內(nèi)插圖)，當(dāng)存在microRNA-21時，反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的長拖尾現(xiàn)象(條帶I)，表明反應(yīng)合成了高分子量的聚胸腺嘧啶堿基結(jié)構(gòu);而當(dāng)沒有microRNA-21存在時，則未獲得高分子量的產(chǎn)物(如條帶O所示XCu NCs的紫外-可見特征吸收峰(圖2B)與其最佳激發(fā)波長(圖2A曲線c)的位置一致，均為340 nm。在紫外燈照射下，含有microRNA-21的樣品呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光，而未含有microRNA-21的樣品則無色(圖2B內(nèi)插圖)。由以上結(jié)果可見，mi croRNA-21與Cu NCs能否生成直接相關(guān)，據(jù)此可建立基于Cu NCs熒光的microRNA-21定量分析方法。
[0019]實施例2
采用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡對制備Cu NCs進(jìn)行形貌表征。由圖3A可見，原位生成的Cu NCs是球形，平均粒徑約3 nm。該結(jié)果與原子力顯微鏡中的Cu NCs的高度相符合，由圖3B可見，Cu NCs周圍緊緊地包裹著聚胸腺嘧啶堿基序列，Cu NCs順著胸腺嘧啶延伸的方向生長。
[0020]實施例3
我們考察了熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度隨著microRNA-21濃度的變化規(guī)律。由圖4A可見，Cu NCs的熒光強(qiáng)度隨microRNA-21濃度的增加而增強(qiáng)，在microRNA-21濃度為I pM到I nM范圍內(nèi)，Cu NCs的熒光強(qiáng)度與microRNA-21濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系(圖4B)，對microRNA-21的檢測限為100 fMo
[0021 ]為了評估本方法對mi croRNA-21檢測的特異性，我們開展了一系列對照實驗，包括米用兩種microRNA(mi croRNA-210和microRNA-141)和單喊基錯配(SM)mi croRNA-21為陰性對照，以及不含m i cr οRNA- 21的樣品為空白對照(b I ank )，結(jié)果如圖5 A所示。結(jié)果表明，microRNA-210和microRNA-141存在時的熒光強(qiáng)度與空白對照的熒光強(qiáng)度相比沒有顯著增加;單堿基錯配mi croRNA-21存在時的熒光強(qiáng)度與空白對照的熒光強(qiáng)度相比有較小增強(qiáng);然而，完全互補(bǔ)(PM)microRNA-21存在時的熒光強(qiáng)度與空白對照的熒光強(qiáng)度相比顯著增強(qiáng)。由此可見，本方法可以區(qū)別完全互補(bǔ)和非互補(bǔ)的microRNA，即使它們只有一個堿基的差異也能區(qū)別出來，具有良好的特異性。
[0022]為了探討本方法在復(fù)雜生物基質(zhì)中定量檢測microRNA的可行性，我們將本方法應(yīng)用于定量檢測從人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人類肺癌表皮細(xì)胞(A549)提取的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中mi croRNA-21的表達(dá)含量。由圖5B可見，A549細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度比空白對照的熒光強(qiáng)度有所增加，表明在A549肺癌細(xì)胞中含有少量mi croRNA-21。而MCF-7細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度與空白對照的熒光強(qiáng)度相比顯著增強(qiáng)，表明MCF-7乳腺癌細(xì)胞中mi croRNA-21的含量比較高。由紫外燈下MCF-7和A549細(xì)胞溶解產(chǎn)物的照片可見，在紫外燈的照射下，反應(yīng)后，MCF-7細(xì)胞溶解產(chǎn)物中發(fā)出很強(qiáng)的紅色熒光，而A549細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的紅色熒光卻很輕微。以上結(jié)果表明，本方法可用于細(xì)胞溶解產(chǎn)物等復(fù)雜生物樣品中microRNA的定量分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1.一種基于雙聚合酶延伸胸腺啼啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，其特征在于，向待測樣品中加入模板DNA，當(dāng)microRNA存在時，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復(fù)合物;加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復(fù)合物中引物的3’-羥基末端，催化引物延伸反應(yīng)，生成與模板DNA互補(bǔ)的短DNA序列；加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，將脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷添加到新生成的短DNA序列的3’-羥基末端，催化脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷沿著短DNA序列的5’端向3’端延伸而形成聚胸腺嘧啶堿基序列;加入Cu(NO3)2和抗壞血酸鈉，以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板原位生成銅納米簇，銅納米簇的熒光強(qiáng)度隨microRNA濃度的增加而增強(qiáng)，根據(jù)銅納米簇的焚光強(qiáng)度判斷待測樣品中m i cr oRNA濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，其特征在于，具體步驟如下:向待測樣品中加入模板DNA，microRNA與模板DNA混合，80℃退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧三磷酸胸腺啼啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在37 ° C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列；將抗壞血酸鈉加入到聚胸腺嘧啶堿基序列溶液中，再加入Cu(NO3)2,室溫下反應(yīng)5 min，制成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇;測試銅納米簇的熒光強(qiáng)度，根據(jù)銅納米簇的熒光強(qiáng)度判斷microRNA濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的microRNA檢測方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為20 mM三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽，pH 7.9，含50 mMKAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o4.一種基于雙聚合酶延伸胸腺啼啶原位生成銅納米簇的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)雙聚合酶延伸胸腺嘧啶序列:將microRNA與模板DNA混合，80°(:退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列； (2)合成熒光銅納米簇:將抗壞血酸鈉加入到步驟(I)的聚胸腺嘧啶堿基序列溶液中，再加入Cu(NO3)2,室溫下反應(yīng)5 min，制成以聚胸腺嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇。5.如權(quán)利要求4所述的一種基于雙聚合酶延伸胸腺嘧啶原位生成銅納米簇的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述的緩沖溶液為20 mM三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽，pH 7.9，含.50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
【文檔編號】C12Q1/68GK105886610SQ201610167371
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月23日
【發(fā)明人】梁汝萍, 遲寶珠, 邱建丁
【申請人】南昌大學(xué)