專利名稱：噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有廣譜制菌作用的生態(tài)制劑，特別涉及噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑。
在細(xì)菌的微生態(tài)環(huán)境中，各種菌群之間相互制約、相互依賴、共同生存達(dá)到菌群之間的平衡，這種平衡對(duì)環(huán)境，如水、土壤、食物等，對(duì)宿主，如人、動(dòng)物、植物等，都是至關(guān)重要的。一旦這種平衡被破壞，環(huán)境將被污染，宿主就將患病。
目前，由于大量使用化學(xué)消毒劑，雖然可殺死致病菌，但卻造成環(huán)境的二次污染，因而給人、動(dòng)物和植物等帶來極大的危害，另外，抗生素在治療人、畜的細(xì)菌性疾病方面有顯著的積極效果，但卻帶來了不容忽視的負(fù)面效應(yīng)。例如擾亂了正常微生物菌群的生態(tài)平衡，使一些疾病久治不愈或二重感染；還會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，新的耐藥性菌株的不斷出現(xiàn)直接影響預(yù)防、治療效果；并且在畜、禽中大量使用抗生素，使畜、禽制品中藥物含量超標(biāo)，直接影響食用者的健康。
本發(fā)明的目的就在于要克服上述缺陷，研制生態(tài)制劑，即以噬菌蛭弧菌為主的生態(tài)活菌制劑。噬菌蛭弧菌是一種專門以捕食細(xì)菌為生的寄生性細(xì)菌，它廣泛存在于自然水體、土壤中，以及人類與動(dòng)物的糞便中，并可分離。它具有寄生和裂解不同科屬的多種細(xì)菌，如沙門氏菌、不凝集弧菌、大腸桿菌、水稻白葉枯病菌等等。它通過酶和自身運(yùn)動(dòng)，侵入宿主菌細(xì)胞核內(nèi)，利用核內(nèi)營養(yǎng)生長、增殖，致使宿主菌細(xì)胞破裂，再進(jìn)入其它宿主菌細(xì)胞核內(nèi)如此反復(fù)。本發(fā)明的生態(tài)制劑正是利用噬菌蛭弧菌的這一特性和其它生物特性，進(jìn)行細(xì)菌性疾病和環(huán)境污染的生物防治，從而避免抗生素和化學(xué)消毒劑的弊病。
采用本發(fā)明生產(chǎn)出來的噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于防治環(huán)境污染、人畜疾病等方面，通過對(duì)試驗(yàn)用河水的檢測，大腸桿菌群數(shù)大幅度下降。通過對(duì)防治雛雞白痢的效果檢測，發(fā)病率大大下降，取得了預(yù)料效果。
實(shí)施例1；1、宿主菌濃縮液的制備取大腸桿菌C600，或取噬蛭弧菌敏感裂解譜中的其它標(biāo)準(zhǔn)菌株為宿主菌菌種。
(1—1—1)肉浸液培養(yǎng)基取新鮮牛肉(去除脂肪、肌膜、肌腱)切成小塊并絞碎，放人器皿中，加蒸餾水1000ml，混合后置于冰箱中36小時(shí)，取出煮沸20分鐘，加壓過濾，繼續(xù)煮沸至原量2/3，再加入蛋白胨10克、氯化鈉5克，并以蒸餾水補(bǔ)足蒸發(fā)掉的水分，加熱.加15％氫氧化鈉溶液5ml，繼續(xù)煮沸，矯正PH值7.4至7.6，過濾后放入器皿中，置高壓滅菌器經(jīng)15磅20分鐘滅菌。
(1—1—2)營養(yǎng)瓊脂取蛋白胨20克、牛內(nèi)膏5克、氯化鈉5克、瓊脂20克、蒸餾水1000ml放入器皿中混合，加熱溶解，加15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值7.4至7.6，煮沸，并置于高壓滅菌器內(nèi)經(jīng)15磅15分鐘滅菌，置于45C恒溫水浴箱中30分鐘，分裝于滅菌9cm平皿中。
(1—1—3)s·s瓊脂取瓊脂18克、牛肉膏5克、蒸餾水1000ml放入器皿中混合，加熱溶解并過濾，再將蛋白胨5克、乳糖10克、膽鹽10克、枸櫞酸鈉10克、硫代硫酸鈉10克、枸櫞酸鐵0.5克混合后加入到已過濾的瓊脂內(nèi)，搖勻溶解稍加熱，矯正PH值至7.1，然后加入0.5％中性紅水溶液及0.1％煌綠溶液搖勻，煮沸并置45C恒溫水浴箱30分鐘后，分裝于滅菌9cm平皿中。
(1—1—4)取大腸桿菌C600劃線接種于(1—1—2)步驟經(jīng)干燥2小時(shí)的營養(yǎng)瓊脂平皿上，置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑取單個(gè)光滑菌落，劃線接種于(1—1—3)步驟經(jīng)干燥2小時(shí)的s·s瓊脂平皿中，置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，再挑取典型單個(gè)菌落，接種于(1—1—1)步驟的500ml肉浸液培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6至8小時(shí)，培養(yǎng)基呈微混濁狀；在克氏瓶中加入150ml(1—1—2)步驟的營養(yǎng)瓊脂，封口后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘滅菌后，平置于桌面待瓊脂凝固，放入暖房中干燥2至3小時(shí)，再將干燥好的克氏瓶取出，去除封口，加入上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6至8小時(shí)的20ml微混濁狀的肉浸液，充分混勻后吸出多余液體后封口，放入37C暖房中培養(yǎng)24小時(shí)，再將直徑0.5mc玻璃珠分裝于試管中，每支試管放入100粒，加蓋置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘滅菌，然后將培養(yǎng)24小時(shí)的克氏瓶取出，加入生理鹽水20ml，并將試管中的玻璃珠倒入克氏瓶中，左右輕搖克氏瓶，使瓶中瓊脂表面長滿灰白色的菌膜充分洗滌下來，再有10ml吸管吸出洗滌下來的菌液，裝入消毒滅菌好的離心鋼瓶中，用天平配平后放入離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)30分鐘，取出棄去上清液，加入適量生理鹽水，用10ml吸管充分吸洗后再離心、棄去上清液、洗滌，反復(fù)三次，將三次離心洗滌好的濃縮菌液緩緩加入適量生理鹽水搖勻，用細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管比濁，使?jié)岫冗_(dá)10個(gè)/ml，裝入滅菌瓶中，再將瓶放入不銹鋼鍋中隔水煮沸15分鐘滅活，得宿主菌濃縮菌液。
(1—2—1)平皿底層培養(yǎng)基取瓊脂粉20克加入到1000ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水容器中，再加入15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值7.5±2，然后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘，取出后放入45C恒溫水浴箱中30分鐘，分裝于滅菌9cm平皿中，每塊平皿約5ml。
(1—2—2)平皿上層培養(yǎng)基取瓊脂粉5克加入到1000ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水容器中，再加入15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值至7.5±2，然后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘，再放入45C恒溫水浴箱中30分鐘后，分裝于2ml滅菌試管中。
(1—2—3)噬菌蛭弧菌母液取(1—2—2)步驟的平皿上層培養(yǎng)基放入燒杯中隔水煮沸至試管中瓊脂完全溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘，用1ml吸管取(1—1—4)步驟的宿主菌濃縮菌液(充分搖勻)0.1ml，加入到置于45C恒溫水浴箱中的平皿上層培養(yǎng)基試管中，充分搖勻，再用1ml吸管吸取噬菌蛭弧菌—81菌液0.3ml，加入到同一試管中混合搖勻，迅速將試管中的混合液瓊脂倒入經(jīng)干燥2小時(shí)的平皿底層培養(yǎng)基中，搖勻并平置，待平皿中瓊脂凝固后，將平皿反轉(zhuǎn)平置于28C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24至72小時(shí)，待噬斑形成并逐漸擴(kuò)大相互融合后，每塊9cm平皿倒入滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水5ml，洗下上層瓊脂，浸泡15分鐘，用10ml吸管吸出洗下的菌液，置于滅菌三角燒杯中，得噬菌蛭弧菌母液。
(1—3)固體培養(yǎng)法；將(1—2—1)步驟的平皿底層培養(yǎng)基煮沸溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘后取出，倒入15cm滅菌平皿中，每塊15—20ml，待瓊脂凝固后反轉(zhuǎn)干燥2小時(shí)，再將(1—2—2)步驟的平皿上層培養(yǎng)基煮沸溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘取出，分裝于10ml滅菌試管中，并置于45C恒溫水浴箱中，用10ml吸管吸取1ml宿主菌濃縮菌液(充分搖勻)加入到上述置于45C恒溫水浴箱中的試管中，再用10ml吸管吸取噬菌蛭弧菌母液3ml，加入到上述同一試管中，充分搖勻并速將試管中的混合液瓊脂倒入經(jīng)干燥2小時(shí)的平皿底層上，搖勻并平置，待瓊脂完全凝固后，將平皿反轉(zhuǎn)平置于28C培養(yǎng)暖房中24至72小時(shí)，待噬斑形成并逐漸擴(kuò)大、相互融合后取出，在每塊平皿上倒入15—20ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水，洗下上層瓊脂并浸泡15分鐘，再用吸管將平皿中的菌液吸入10000ml放水瓶中，當(dāng)效價(jià)達(dá)10—10/ml時(shí)，得到噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑，這是采用固體培養(yǎng)法得到的。
實(shí)施例2與上述實(shí)施例1(1—1)、(1—2)步驟相同，不同的是(1—3)步驟，本例中的(1—3)步驟描述如下(1—3)液體培養(yǎng)法在10000ml放水瓶中加入滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水5000ml，再加入(1—1—4)步驟的宿主菌濃縮菌液5ml，同時(shí)加入(1—2—3)步驟的噬菌蛭弧菌母液15ml，搖勻并封口，置于28C培養(yǎng)暖房中培養(yǎng)5—7天，當(dāng)效價(jià)達(dá)105—108/ml時(shí)，得到噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑，這是采用液體培養(yǎng)法得到的。
權(quán)利要求
1.噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的制備方法.取大腸桿菌C600，或取噬菌蛭弧菌敏感裂解菌譜中的其它標(biāo)準(zhǔn)菌株作為宿主菌菌種，再取噬菌蛭弧菌—81，其特征在于；(1—1—1)取新鮮牛肉(卻除脂肪、肌膜、肌腱)切成小塊并絞碎，放入器皿中，加蒸餾水1000ml，混合并置于冰箱中至少36小時(shí)，再將牛肉浸液取出煮沸20分鐘，加壓過濾，繼續(xù)煮沸至原量2/3，再加入蛋白胨10克、氯化鈉5克，并以蒸餾水補(bǔ)足其蒸發(fā)掉的水分，加熱并加入15％氫氧化鈉溶液5ml，繼續(xù)煮沸，矯正PH值7.4至7.6，過濾后放入器皿中，置高壓滅菌器內(nèi)經(jīng)15磅20分鐘滅菌，這是肉浸液培養(yǎng)基；(1—1—2)取蛋白胨20克、牛肉膏5克、氯化鈉5克、瓊脂20克、蒸餾水1000ml放入器皿中混合，加熱溶解，加15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值7.4至7.6，煮沸，并置于高壓滅菌器內(nèi)經(jīng)15磅15分鐘滅菌，置于45C恒溫水浴箱中30分鐘，分裝于滅菌9cm平皿中，這是營養(yǎng)瓊脂；(1—1—3)取瓊脂18克，牛內(nèi)膏5克、蒸餾水1000ml放入器皿中混合，加熱溶解并過濾，再將蛋白胨5克、乳糖10克、膽鹽10克、枸櫞酸鈉10克、硫代硫酸鈉10克、枸櫞酸鐵0.5克混合后加入到已過濾的瓊脂內(nèi)，搖勻溶解稍加熱，矯正PH值至7.1，然后加入0.5％中性紅水溶液及0.1％煌綠溶液搖勻，煮沸并置45C恒溫水浴箱30分鐘后，分裝于滅菌9cm平皿中，這是s·s瓊脂；(1—1—4)取大腸桿菌C600劃線接種于(1—1—1)步驟經(jīng)干燥2小時(shí)的營養(yǎng)瓊脂平皿上，置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑取單個(gè)光滑菌落，劃線接種于(1—1—3)步驟經(jīng)干燥2小時(shí)的S·S瓊脂平皿中，置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，再挑取典型單個(gè)菌落，接種于(1—1—1)步驟的500ml肉浸液培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6至8小時(shí)，培養(yǎng)基呈微混濁狀；在克氏瓶中加入150ml(1—1—2)步驟的營養(yǎng)瓊脂，封口后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘滅菌后，平置于桌面待瓊脂凝固，放入暖房中干燥2—3小時(shí)，再將干燥好的克氏瓶取出，去除封口，加入上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6至8小時(shí)的20ml微混濁狀的肉浸液，充分混勻后，吸出多余液體后封口，放入37C暖房中培養(yǎng)24小時(shí)，再將直徑0.5cm玻璃珠分裝于試管中，每支試管放入100粒，加蓋置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘滅菌，然后將培養(yǎng)24小時(shí)的克氏瓶取出，加入生理鹽水20ml，并將試管中的玻璃珠倒入克氏瓶中，左右輕搖克氏瓶，使瓶中瓊脂表面長滿灰白色的菌膜充分洗滌下來，再用10ml吸管吸出洗滌下來的菌液，裝入消毒滅菌好的離心鋼瓶中，用天平配平后，放入離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)30分鐘，取出棄去上清液，加入適量生理鹽水，用10ml吸管充分吸洗后再離心、并去上清液、洗滌，反復(fù)三次，將三次離心洗滌好的濃縮菌液緩緩加入適量生理鹽水搖勻，用細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管比濁，使?jié)岫冗_(dá)10個(gè)/ml，裝入滅菌瓶中，再將瓶放入不銹鋼鍋中隔水煮沸15分鐘滅活，得到宿主菌濃縮菌液。(1—2—1)取瓊脂粉20克加入到1000ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水容器中，再加入15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值至7.5±2，然后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘，取出后放入45C恒溫水浴箱中30分鐘，分裝于滅菌9cm平皿中，每塊平皿約5ml，得到平皿底層培養(yǎng)基；(1—2—2)取瓊脂粉5克加入到1000ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水容器中，再加入15％氫氧化鈉2ml，矯正PH值至7.5±2，然后置于高壓消毒鍋中15磅15分鐘，再放入45C恒溫水浴箱中30分鐘后，分裝于滅菌試管中，每支試管2ml，得到平皿上層培養(yǎng)基。(1—2—3)取(1—2—2)步驟得到的平四上層培養(yǎng)基放入燒杯中隔水煮沸至試管中瓊脂完全溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘，用1ml吸管吸取(1—1—4)步驟的宿主菌濃縮菌液(充分搖勻)0.1ml，加入到置于45C恒溫水浴箱中的平皿上層培養(yǎng)基試管中，充分搖勻，再用1ml吸管吸取噬菌蛭弧菌—81菌液0.3ml，加入到同一試管中混合搖勻，迅速將試管中的混合菌液瓊脂倒入經(jīng)干燥2小時(shí)的平皿底層培養(yǎng)基中，搖勻并平置，待平皿中瓊脂凝固后，將平皿反轉(zhuǎn)平置于28C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24至72小時(shí)，待噬斑形成并逐漸擴(kuò)大相互融合后，每塊9cm平皿倒入滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水5ml，洗下上層瓊脂，浸泡15分鐘，用10ml吸管吸出洗下的菌液，置于滅菌三角燒瓶中，得到噬菌蛭弧菌母液。(1—3—1)固體培養(yǎng)法將(1—2—1)步驟的平皿底層培養(yǎng)基煮沸溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘后取出，倒入15cm滅菌平皿中，每塊15—20ml，待瓊脂凝固后反轉(zhuǎn)干燥2小時(shí)，再將(1—2—2)步驟的平皿上層培養(yǎng)基煮沸溶解，置于45C恒溫水浴箱中20分鐘后取出，分裝于滅菌試管中，每支試管10ml，并將試管置于45C恒溫水浴箱中；用10ml吸管吸取1ml宿主菌濃縮菌液(充分搖勻)加入到上述置于45C恒溫水浴箱中的試管中，再用10ml吸管吸取噬菌蛭弧菌母液3ml，加入到上述同一試管中，充分混合搖勻，并迅速將試管中的混合菌液瓊脂倒入經(jīng)干燥2小時(shí)的平皿底層上，搖勻并平置，待瓊脂完全凝固后，將平皿反轉(zhuǎn)平置于28C培養(yǎng)暖房中24至72小時(shí)，待噬斑形成并逐漸擴(kuò)大、相互融合后取出，在每塊平皿上倒入15至20ml滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水，洗下上層瓊脂并浸泡15分鐘，再用吸管將平皿中的菌液吸入1000ml放水瓶中，當(dāng)效價(jià)達(dá)105—108/ml時(shí)，得到噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑。(1—3—2)液體培養(yǎng)法在10000ml放水瓶中加入滅菌標(biāo)準(zhǔn)自來水5000ml，再加入(1—1—4)步驟的宿主菌濃縮菌液5ml，同時(shí)加入(1—2—3)步驟噬菌蛭弧菌母液15ml，搖勻并封口，置于28C培養(yǎng)暖房中培養(yǎng)5—7天，當(dāng)效價(jià)達(dá)105-108/ml時(shí)，得到噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有廣譜制菌作用的生態(tài)制劑，特別涉及噬菌蛭弧菌生態(tài)活性制劑。本發(fā)明采用從自然水體、土壤，及人類、動(dòng)物的糞便等分離出來的噬菌蛭弧菌，進(jìn)行純化、培養(yǎng)，制備成菌母液，再將其裂解譜中的一種宿生菌進(jìn)行純化、培養(yǎng)，制備成濃縮菌液，按一定比例將二者混合，通過固體或液體培養(yǎng)法，制成生態(tài)活性制劑。本發(fā)明的生態(tài)制劑避免了化學(xué)消毒劑對(duì)生態(tài)環(huán)境平衡的破壞，也避免了抗生素在防治人、動(dòng)物細(xì)菌性疾病方面的諸多弊病。
文檔編號(hào)A61K39/106GK1125619SQ9411431
公開日1996年7月3日 申請(qǐng)日期1994年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月30日
發(fā)明者馮曉英, 解桂如, 張春元, 嚴(yán)旭玲 申請(qǐng)人:江蘇省衛(wèi)生防疫站