專利名稱：協(xié)同多糖修飾的藥用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的制作方法
癌癥是世界上僅次于心血管系統(tǒng)疾病的第二大死亡性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1991年全世界癌癥新發(fā)病人約900萬，需要治療的新老病人超過2000萬，此數(shù)字還在逐年增加。在這些危難病人中，除少數(shù)可單純采用手術(shù)或放療這類局部治療之外，絕大多數(shù)病人——包括全身性腫瘤的病人，抗癌藥可以治愈的病人，手術(shù)或放療不能控制復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病人等，都需要首選或輔以抗癌藥進(jìn)行全身或局部治療。就大多數(shù)腫瘤來說，目前尚無有效根治的良藥，因此抗癌新藥的研制刻不容緩。
Oldham腫瘤生物學(xué)療法認(rèn)為，正常情況下腫瘤細(xì)胞與機(jī)體防御之間處于動(dòng)態(tài)平衡之中，腫瘤的發(fā)生乃至增殖與播散完全是這種動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)所致，即腫瘤是一種免疫失調(diào)綜合癥。如果將已失調(diào)的狀態(tài)人為地調(diào)到正常水平就可能控制腫瘤的生長(zhǎng)并使其消退。近年來的各種研究證實(shí)，宿主抗腫瘤作用主要通過免疫活性細(xì)胞或其釋放的免疫效應(yīng)分子來實(shí)現(xiàn)。換言之，宿主對(duì)腫瘤的生物學(xué)反應(yīng)主要是免疫反應(yīng)。因此，生物學(xué)療法主張通過從體外補(bǔ)充、誘導(dǎo)或活化體內(nèi)本來固有的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(Biological Response Modifiers，BRMS)系統(tǒng)的具有細(xì)胞毒活性的免疫活性細(xì)胞和(或)因子，來調(diào)整這種對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的生物應(yīng)答反應(yīng)。
BRMS是一類能改變宿主、腫瘤或二者生物學(xué)過程的，其結(jié)果卻改善了機(jī)體耐受或排斥細(xì)胞能力的高活性物質(zhì)〔J Clin Pharm.1992，32(1)2〕。具體講，BRMS是一類具有下列某種或幾種特性和用途的生物活性物質(zhì)1、通過刺激作用來增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的活性，或者提高其數(shù)量，或者提高可溶性介質(zhì)的產(chǎn)生，如淋巴因子和(或)單核因子等來直接增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)；2、通過減少和(或)解除荷瘤宿主的免疫抑制來間接提高機(jī)體對(duì)抗腫瘤的免疫應(yīng)答能力；3、能使機(jī)體成為一種天然的和(或)合成的效應(yīng)器或介體來提高機(jī)體的防御能力；4、能通過細(xì)胞毒性的方式來提高機(jī)體耐受損害的能力，如增加骨髓白細(xì)胞前體；5、能充分改變腫瘤細(xì)胞膜的特性以提高其免疫原性，改變其轉(zhuǎn)移方式，以使其更易被免疫機(jī)制或細(xì)胞毒性藥物所殺傷；6、能阻止或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡變，或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化和成熟，使其趨向正?；?。
宿主對(duì)腫瘤的生物學(xué)反應(yīng)主要是免疫反應(yīng)，除此之外還涉及各種與腫瘤增殖相關(guān)的調(diào)控基因和因子等。傳統(tǒng)的免疫療法只是生物療法中的一個(gè)重要組成部分。
BRMS在組成上主要分為兩大類，一是能夠刺激或改善機(jī)體抗腫瘤免疫防御系統(tǒng)機(jī)能的化學(xué)分子和生物分子；二是具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用的細(xì)胞產(chǎn)物和免疫活性細(xì)胞。目前在BRMS中進(jìn)展最活躍也是最重要的成員是各種細(xì)胞因子(Cytokines)。常見的有如干擾素系列(IFN-α、β、γ)，白細(xì)胞介素系列(IL-1-13)，腫瘤壞死因子系列(TNF-α、β)，集落刺激因子(G、M、GM-CSF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α、β)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。由此而發(fā)展起來的細(xì)胞因子療法(Cytokines Therapy)以輸注(補(bǔ)充)或阻斷(拮抗)細(xì)胞因子等為基本內(nèi)容。
做為一種較理想的藥物，高效、低毒是其兩大基本要求，缺一不可。然而許多抗癌藥物只注重了對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)力殺傷及抑制，卻未能有效地減少毒付作用。應(yīng)當(dāng)指出的是，減少抗癌藥物毒付作用對(duì)于腫瘤治療來說具有尤為重要的意義，這是因?yàn)榕c有些病癥患者相比，腫瘤患者的體質(zhì)及耐受力都相當(dāng)弱，一方面，體內(nèi)惡性增殖的腫瘤細(xì)胞通常以有氧酵解方式耗能，這種低效供能方式造成機(jī)體能量的大量耗竭；另一方面，宿主又以糖異生和負(fù)氮平衡來補(bǔ)充這種高能耗，因此導(dǎo)致患者日漸消瘦、惡病質(zhì)、免疫功能低下；另外再加上中晚期腫瘤出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移及各種并發(fā)癥，患者已全身心衰竭，此時(shí)的治療如果帶有較大毒付作用則必將使已經(jīng)嚴(yán)重衰竭的機(jī)體雪上加霜，此時(shí)既使藥物能發(fā)揮一定的抗癌效果也常會(huì)因患者無力承受毒付作用而使治療趨于失敗。這也是毒付作用較大的放療和化療常趨于失敗的主要原因。
通常，許多原型藥物(Prototype Drug)都有各自的局限性，臨床應(yīng)用會(huì)有各種問題需要克服，BRMS也不例外。這些問題常見的有療效欠佳，適應(yīng)癥窄，半衰期短，免疫原性和嚴(yán)重毒付反應(yīng)等。例如在BRMS中占有重要地位的白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種分子量約1.5萬的小蛋白，由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能夠誘發(fā)細(xì)胞毒T細(xì)胞的成熟，誘生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)T、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等的增殖、分化和補(bǔ)充，介導(dǎo)IFN-γ啟動(dòng)的NK細(xì)胞殺傷活性和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)活力，提高機(jī)體識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，在腫瘤的生物治療中占居重要地位。1992年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)基因重組IL-2(rIL-2)投放市場(chǎng)，用于癌癥等疾病的治療。
然而IL-2的臨床使用并不理想，有不少問題需要克服，這些問題主要有(1)IL-2單藥使用有效率低，而且適應(yīng)癥較窄，如主要對(duì)腎細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤和結(jié)腸癌有效。(2)毒付作用較大，主要原因是大劑量用藥所致，而這又取決于IL-2血藥半衰期太短(只有約3-6分鐘)。為了維持IL-2在血液中的有效濃度和時(shí)間，臨床只好推薦采用大劑量和長(zhǎng)時(shí)間靜脈滴注，這不僅把給藥方式復(fù)雜化，而且亦往往造成嚴(yán)重的毒付反應(yīng)，常見的如毛細(xì)血管漏出綜合癥(Capillary Leak Syndrome，CLS)，主要表現(xiàn)有體液潴留和向心性水腫，多器官功能失調(diào)等，相關(guān)死亡率較高〔N Engl J Med.(1987)316，889〕。(3)過敏反應(yīng)原核細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的人IL-2未經(jīng)糖基化修飾，其免疫原性明顯高于天然的糖基化IL-2，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，這種免疫原性增強(qiáng)的原因可能與相關(guān)糖基化位點(diǎn)的暴露有關(guān)。(4)由于IL-2疏水性強(qiáng)，水溶性較差，而且有一定免疫原性，致使IL-2給藥方式通常采用靜脈滴注，不宜采用較簡(jiǎn)單的肌肉或皮下(大劑量)注射。IL-2的這些缺憾也或多或少地存在于其它BRMS中，尤其是rDNA技術(shù)生產(chǎn)的治療用細(xì)胞因子。
本發(fā)明旨在通過一種獨(dú)特的糖基化修飾作用對(duì)那些有應(yīng)用缺憾的BRMS進(jìn)行改造，以提高療效，拓寬適應(yīng)癥，降低毒付反應(yīng)。
糖基化(Glycosylation)是蛋白質(zhì)(天然)存在的一種普遍形式，即大多數(shù)蛋白質(zhì)都是糖蛋白，當(dāng)然蛋白類藥物也不例外。糖蛋白中的糖基(鏈)通常具有如下功能參與分子、細(xì)胞的識(shí)別與調(diào)控，增強(qiáng)蛋白分子的生物學(xué)和物理化學(xué)穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)溶解性等。一般來說，同一種蛋白質(zhì)糖基化的比未糖基化的要穩(wěn)定〔Pazur，J.H，eta 1，Biochem.Biophys.Res，Commun.1970，40110〕。rDNA技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)物中，真核細(xì)胞(如酵母菌)表達(dá)的蛋白質(zhì)是經(jīng)糖基化修飾的糖蛋白，然而不同的表達(dá)宿主修飾的糖鏈可能不同，人體使用可能有潛在的免疫原性；原核細(xì)胞(如E.Coli)則缺乏糖基化機(jī)制，生產(chǎn)的重組蛋白是未經(jīng)糖基化修飾的，因此造成某些蛋白質(zhì)糖基依賴的生物活性的丟失，或者由于某些敏感位點(diǎn)缺乏糖鏈的防護(hù)而呈現(xiàn)免疫原性或易被蛋白水解酶降解。
需要指出的是糖蛋白的糖鏈通常只是較小的寡糖鏈，雖然它仍然有著豐富的生物活性，但對(duì)于蛋白質(zhì)藥學(xué)性質(zhì)的貢獻(xiàn)可能是非常有限的。例如這種寡糖鏈不能較好地阻止蛋白水解酶對(duì)敏感部位的水解和阻斷免疫原性及抗體對(duì)它的中和反應(yīng)，也不能明顯增加蛋白質(zhì)的Stock’s流體半徑，降低腎臟對(duì)小分子量蛋白質(zhì)藥物的排出速度。甚至有的糖鏈由于易被某些代謝器官俘獲并降解而降低藥效，因此，又需要進(jìn)行脫糖基化(deglycosyhtion)或(再)糖基化〔(re)glycosylation〕。
迄今為止，多糖用于蛋白質(zhì)體外修飾雖然已有部分成功報(bào)道，但與本發(fā)明有著明顯不同。首先，前者采用的多糖主要發(fā)揮的是一種防護(hù)劑或載體作用，采用的多糖是沒有顯著相關(guān)協(xié)同治療作用的“中性”分子，如臨床上常用的血容量擴(kuò)充劑右旋糖苷(Dextran)。而本發(fā)明則是在發(fā)揮多糖作為防護(hù)劑和(或)載體作用的同時(shí)，刻意發(fā)揮多糖的協(xié)同治療作用，一改單一藥劑的孤軍奮戰(zhàn)，具有多重協(xié)同促進(jìn)的功效，這對(duì)于腫瘤生物治療來說無論在戰(zhàn)略上亦或戰(zhàn)術(shù)上都其有重要意義；另外，目前尚沒有具有協(xié)同抗癌作用的多糖用于BRMS，尤其是重組細(xì)胞因子的共價(jià)修飾；而且，本發(fā)明還涉及提供一種新型的協(xié)同多糖修飾的氧化型或還原型BRMS結(jié)合物，以及一種體外共價(jià)修飾后的氧化復(fù)性及還原的方法。
本發(fā)明的主要特征在于(1)協(xié)同抗癌作用的多糖共價(jià)修飾BRMS，增強(qiáng)BRMS修飾物的抗癌效能；(2)拓寬適應(yīng)癥；(3)減少毒付作用；(4 )涉及一種協(xié)同多糖修飾的氧化型或還原型BRMS結(jié)合物；(5)涉及一種體外共價(jià)修飾后氧化復(fù)性或還原的方法。
具體來說協(xié)同多糖對(duì)BRMS共價(jià)修飾的意義在于1、協(xié)同調(diào)控機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)腫瘤是一種免疫失調(diào)綜合癥。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展同機(jī)體的免疫機(jī)能狀況直接相關(guān)，當(dāng)免疫功能低下或障礙時(shí)機(jī)體缺乏對(duì)異已和惡變的腫瘤細(xì)胞的有效清除使其乘機(jī)滋生繁延。另外對(duì)于那些亟需治療的中晚期腫瘤患者來說，腫瘤細(xì)胞分泌大量免疫抑制因子使機(jī)體的免疫監(jiān)管(Immuno Surveillance)機(jī)能陷入惡性循環(huán)。臨床研究表明，腫瘤患者體內(nèi)主要的免疫活性細(xì)胞，如外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、荷瘤組織區(qū)域淋巴結(jié)(PLNL)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、LAK及NK細(xì)胞的活性明顯降低，并與病程進(jìn)展正相關(guān)〔LeFever AV.etal，Cancer Res.1991，51(15)5596〕。在這種免疫抑制狀態(tài)下單獨(dú)使用多糖或BRMS的療效是非常有限的。因此提高療效首先應(yīng)解除免疫抑制。這方面協(xié)同多糖效果顯著。例如香菇多糖(Lentinan，LNT)是一種有效的廣譜免疫增強(qiáng)劑，能有效解除腫瘤患者的免疫抑制，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖率，恢復(fù)和提高機(jī)體非特異免疫機(jī)能。腫瘤患者血清中含有一種免疫抑制因子，是一種α-球旦白，可以抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活力。LNT能夠抑制這種免疫抑制因子的產(chǎn)生，并誘發(fā)產(chǎn)生一種新的β-球旦白，對(duì)上述三種免疫指標(biāo)均有活化刺激作用。
IL-2是一種內(nèi)源性淋巴因子，在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位。其抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)、TIL及LAK的細(xì)胞毒活性。這些細(xì)胞活性的誘導(dǎo)不僅需要較高的IL-2濃度，還需要良好的機(jī)體免疫狀態(tài)。在低下的免疫狀態(tài)下既使高劑量IL-2也難以形成較高的細(xì)胞毒活性，但如果有LNT的協(xié)同作用，既使低濃度IL-2也能獲得很高的殺傷活性。因此協(xié)同治療能起到事半功倍的效果；不僅用藥量相應(yīng)減少，毒付反應(yīng)減輕，而且療效更佳。然而本發(fā)明又不同于簡(jiǎn)單的聯(lián)合治療或復(fù)方制劑，而是建立在糖基化共價(jià)修飾基礎(chǔ)之上的，因此除了協(xié)同增強(qiáng)抗癌效能之外又賦予該修飾物許多優(yōu)點(diǎn)。
2、拓寬適應(yīng)癥。在機(jī)體的抗腫瘤免疫機(jī)制中細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位。其中特異殺傷腫瘤細(xì)胞的主要是CTL(在腫瘤間質(zhì)中是TIL)。CTL識(shí)別靶細(xì)胞過程需要腫瘤細(xì)胞同時(shí)提供兩種表面信息，一種是腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，另一種是主要組織相容性抗原復(fù)合體(MHC)，這即所謂的T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原的MHC約束性。然而，許多腫瘤(尤其是自發(fā)瘤)都沒有或很少有TAA表達(dá)，有的甚至MHC復(fù)合物表達(dá)還有缺陷，因此能誘發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞較少。所以IL-2的抗瘤譜較窄。
鑒于此，宿主的非特異性(天然)免疫機(jī)制在抗腫瘤反應(yīng)中占有非常重要的地位。例如NK細(xì)胞與T細(xì)胞不同，能對(duì)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞毒作用，無論其是否呈現(xiàn)免疫原性(TAA)，并且其識(shí)別及效應(yīng)不受MHC的約束。另外，巨噬細(xì)胞(M_ )的活化，體液免疫的加強(qiáng)等也可介導(dǎo)多種抗腫瘤反應(yīng)，例如抗腫瘤抗體激活補(bǔ)體系統(tǒng)或發(fā)揮M_的抗體依賴介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)效應(yīng)溶解腫瘤細(xì)胞。充分活化的免疫系統(tǒng)分泌的多種細(xì)胞因子對(duì)腫瘤細(xì)胞亦有直接或間接殺傷作用。而且還能協(xié)同促進(jìn)IL-2的治療作用。LNT作為一種典型的廣譜免疫增強(qiáng)劑能活化多種免疫活性細(xì)胞(如NK、M_)及補(bǔ)體的抗腫瘤反應(yīng)。用于修飾可以提高機(jī)體的非特異免疫反應(yīng)機(jī)能，對(duì)抗更多種腫瘤。
3、提高藥效、降低毒付反應(yīng)。本發(fā)明是一種獨(dú)特的糖基化修飾，與BRMS共價(jià)結(jié)合的多糖除了發(fā)揮上述協(xié)同作用之外，還能起到“防護(hù)劑”(Protectants)的作用，即由于多糖的空間位阻關(guān)系使BRMS逃逸某些不利的識(shí)別反應(yīng)，降低免疫原性，增強(qiáng)抗蛋白水解酶及抗體中和的能力；另外也可以發(fā)揮多糖的“載體”(Carriers)作用，增強(qiáng)BRMS分子的Stock’s流體半徑，延緩腎臟對(duì)它的排出。因此可以延長(zhǎng)BRMS的血藥半衰期，提高藥效、減少用藥量，降低毒付作用，簡(jiǎn)化治療程式，提高患者生存質(zhì)量。
4、結(jié)合物的氧化復(fù)性及還原。蛋白質(zhì)的氧化復(fù)性主要指分子內(nèi)二硫鍵(-S-S-)的形成，二硫鍵是否形成以及配位是否準(zhǔn)確對(duì)其活性有重要影響。正確的二硫鍵有助于形成正確的分子構(gòu)象，因此活性就高；反之錯(cuò)誤配位的復(fù)性活性就低甚至沒有活性。例如IL-2在還原態(tài)時(shí)有3個(gè)游離的巰基，分別位于第58、105、125位半胱氨酸側(cè)鏈上，正確的氧化復(fù)性是第58和105位巰基形成二硫鍵。目前，許多rDNA技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白或多肽是以不溶性(無活性)的包涵體形式在宿主體內(nèi)表達(dá)，因此這些產(chǎn)物的后處理均涉及包涵體的還原變性溶解及氧化復(fù)性的問題。變性溶解通常要加入還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇(β-Me)，還要加入高濃度變性劑如脲素、鹽酸胍、SDS等。復(fù)性過程通常以低溫、低濃度較為有利于正確復(fù)性，但低濃度由于體積稀釋較大給生產(chǎn)制備帶來許多問題和不便，因此提高正確復(fù)性時(shí)的濃度具有重要意義。本發(fā)明涉及的修飾作用能有效減弱BRMS分子間的相互作用，尤其對(duì)于疏水性較強(qiáng)的分子(如IL-2)能防止形成聚合體甚至凝集，為分子的正確折疊及復(fù)性創(chuàng)造了良好的環(huán)境，復(fù)性濃度可以提高到1mg/ml水平，可以簡(jiǎn)化工藝流程。
有的BRMS制品還原態(tài)仍然具有良好的生物活性(如IL-2)，當(dāng)然這種還原態(tài)只是外在產(chǎn)品階段，在使用過程中由于在體內(nèi)或體外均有極大稀釋，而且機(jī)體的內(nèi)環(huán)境有利于二硫鍵的形成，因此使用中不可避免地會(huì)高效復(fù)性并呈現(xiàn)良好的生物活性。事實(shí)上，人體自己合成的IL-2開始也是還原態(tài)的，也是在體內(nèi)完成氧化復(fù)性的。因此給患者使用二硫鍵構(gòu)成并不復(fù)雜的還原型BRMS或其結(jié)合物是可行的?？梢允÷訠RMS制備工藝中常規(guī)的氧化復(fù)性步驟。
本發(fā)明涉及的協(xié)同多糖修飾的BRMS結(jié)合物包括氧化型和還原型。由于巰基在低于PH6的情況下氧化極慢，因此還原型的該結(jié)合物通常應(yīng)保持在PH6以下的弱酸性環(huán)境中。
本發(fā)明涉及的BRMS是BRMS武庫(kù)中那些有必要及可能采用本發(fā)明提高治療效能、降低毒付反應(yīng)的部分。例如細(xì)胞因子中的白細(xì)胞介素系列(IL-1～13)，干擾素系列(IFN-α、β、γ及其亞型)，腫瘤壞死因子系列(TNF-α、β)，集落刺激因子系列(G，M，GM-CSF)等。這些BRMS成員可以是原型藥物(Prototype Drug)，亦可以是其類似物或衍生物。
對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽這類一級(jí)產(chǎn)物來說基因的突變、插入、刪除、融合及雜交是獲取其類似物或衍生物的常用方法。例如IL-2突變類似物基本上是基于原始IL-2的氨基酸(aa)順序的變異得到的。所說的變異包括aa的加入，結(jié)構(gòu)aa的缺失或被不同的aa取代。其衍生物包括IL-2與其它蛋白質(zhì)或多肽的基因融合表達(dá)的雜交蛋白。
所說的aa加入包括至少加入一個(gè)aa。
結(jié)構(gòu)aa的缺失包括至少缺失一個(gè)IL-2結(jié)構(gòu)aa。
結(jié)構(gòu)aa被不同的aa取代包括至少一個(gè)IL-2結(jié)構(gòu)aa被至少一個(gè)不同的aa取代。
在加入了至少一個(gè)aa的IL-2變異蛋白質(zhì)中，所說的至少一個(gè)aa不包括衍生于用于多然表達(dá)的起始密碼子和信號(hào)肽的Met。
被加入的aa的數(shù)目也可以是一個(gè)，但只要不喪失IL-2的基本特性，也可以是任何數(shù)目。更可取的是這些aa包括蛋白質(zhì)的某些或所有aa順序。這些順序與IL-2有同源性，并表現(xiàn)具有與IL-2的aa順序相似的活性。
結(jié)構(gòu)aa的缺失的數(shù)目，只要不喪失IL-2的基本特性，可以是任何數(shù)目。
取代前結(jié)構(gòu)aa的例子包括CySH和Cys，但較好是CySH。另外，取代前的結(jié)構(gòu)aa還包括Asp、Arg、Gly和Val。當(dāng)取代前的結(jié)構(gòu)aa為CySH時(shí)，以中性aa作為取代aa較好。中性aa包括Gly、Val、Ile、Tyr、Phe、His、Trp、Ser、Thr和Met。特別常用Ser、Thr和Ala，如CySH125＞Ser125，CySH125＞Thr125，和CySH125＞Ala125等。
當(dāng)被取代的前結(jié)構(gòu)aa為CySH以外的其它aa時(shí)，常選擇其親水性、疏水性和電荷不同于被取代aa的aa。例如取代前的aa為Asp時(shí)，取代aa常用Asn、Thr、Val、Phe、、Arg，尤其選擇Asn和Arg。
用定點(diǎn)誘變方法產(chǎn)生突變蛋白的技術(shù)是已知的，如參見R.F.Lather and J.p.lecoq.Genetic Engineering(1983)PP31-50，Academic Press；M.Smith and S.Gillam，Genetic EngineeringPrinciples and Methods(1981)3，PP1-32.Plenum Press。
本發(fā)明所謂“協(xié)同多糖”中的“協(xié)同”是指用于修飾的多糖對(duì)于被修飾的BRMS的治療作用具有促進(jìn)和(或)增強(qiáng)作用，它可以在發(fā)揮多糖自身的抗癌和(或)免疫調(diào)節(jié)作用的同時(shí)直接和(或)通過其效應(yīng)間接刺激BRMS作用的發(fā)揮，可以為BRMS功效的發(fā)揮清除障礙。
本發(fā)明涉及的協(xié)同多糖(修飾劑)是一族具有抗癌和(或)免疫增強(qiáng)活性的多糖及其衍生物。所述多糖主要包括一些由同種單糖組成的同聚糖，如β/α-glucan(葡聚糖)或β/α-mannan(甘露聚糖)；由數(shù)種單糖組成的雜聚糖；以及含有這些成分和功能的糖肽或糖脂。
多糖的抗癌及免疫增強(qiáng)活性依賴于分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)〔Phytochemistry 1989.28(11)2877〕。以β-(1，3)-glucan為例，β-構(gòu)型有利于形成螺旋構(gòu)象，具有較強(qiáng)的抗癌及免疫增強(qiáng)活性，而α-(1，3)-glucan的α-構(gòu)型卻有利于形成沿纖維軸伸展的帶狀構(gòu)象，抗癌活性較弱，但仍有一定的免疫增強(qiáng)活性。在β-(1，3)或β-(1，6 )為主鍵的glucan中，前者通常比后者具有更強(qiáng)的抗癌活性；在β-(1，3)-glucan中常帶有不同數(shù)量的β-(1，6)分枝，支鏈越多活性愈強(qiáng)。常見的以β-(1，3)為主鍵的glucan，如LNT，豬苓多糖(Grifolan，GRN)，裂褶多糖(Schizophyllan，SP)，酵母多糖(Zymosan)等；那些以β-(1，4)或(1，2)為主鍵的glucan，如茯苓多糖(Pachyman)，云芝多糖(Krestin，PSK)等。有證據(jù)表明，單核細(xì)胞(MNC)、巨噬細(xì)胞(M_)膜上有β-glucan受體〔J.Immunol.1985.1342588；1989，142959；1990，1442712)。在一定劑量條件下β-glucan與受體的結(jié)合導(dǎo)致MNC.M_的活化增殖。所分泌的多種細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α.IFN-α又可激活Th、NK等細(xì)胞從而放大出多種抗癌抗病毒等外來微生物的活性。
從粗略劃分來看，真菌來源的多糖通常具有抗腫瘤及免疫增強(qiáng)活性；高等植物來源的多糖多呈現(xiàn)免疫增強(qiáng)活性；而從藻類分離出的多糖通常含有硫酸酯，是良好的抗凝劑。
多糖的抗腫瘤及免疫增強(qiáng)活性亦依賴于分子的大小(分子量)，因?yàn)檫@是形成一定高級(jí)結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的必要條件。在一定范圍內(nèi)分子量愈大活性愈強(qiáng)，但在達(dá)到一定限度之后這種關(guān)系就不夠明顯了。例如對(duì)于LNT、SP、GRN來說，分子量小于10kd時(shí)分子愈小活性愈弱。當(dāng)分子量在10-40kd水平時(shí)可基本保留原大分子的活性，分子量再增加抑瘤活性增強(qiáng)已不夠明顯了，但補(bǔ)體激活活性有所增強(qiáng)〔Gann，1976，67191；Cancer Res.1978，37379〕。大分子多糖(如500-1000kd)的水溶性往往較差，用做修飾劑時(shí)應(yīng)設(shè)法改進(jìn)其水溶性。
多糖的衍生化是增強(qiáng)其活性改進(jìn)性能的重要手段，方法主要有水解、甲基化、羧(甲)基化、羥乙(丙)基化、硫酸化、硬脂?；傲柞ヵ；?。以LNT為例，水解法制備LNT中小分子衍生物可采用高溫水解(如150℃)、甲酸水解，亦可以用強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解，或用酶法水解(如葡萄糖苷酶)。通過控制反應(yīng)的濃度、溫度、時(shí)間來獲得適宜大小的反應(yīng)混合物。由于分子量愈大的多糖在乙醇溶液中溶解度愈小，因此通過控制乙醇的濃度即可將所需大小的多糖(衍生物)分級(jí)分離出來。當(dāng)然亦可以用排阻層析法獲得。有的衍生化還可以為交聯(lián)反應(yīng)提供適宜的反應(yīng)基因。
本發(fā)明涉及的多糖或其衍生物修飾BRMS的方法有多種。首先，多糖或其衍生物用于修飾時(shí)均應(yīng)具備或需引入一定數(shù)量的活性基團(tuán)，該基團(tuán)的選擇視不同的交聯(lián)機(jī)制或方法而異。蛋白質(zhì)中常用于偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)主要有游離的氨基、羧基和巰基等；相應(yīng)地可以在多糖或其衍生物中引入適宜與蛋白多肽中待交聯(lián)基團(tuán)匹配的基團(tuán)，如醛基、羧基、氨基等，或制備其活性中間體復(fù)合物。
活潑酯法是用于交聯(lián)反應(yīng)的重要方法之一。本發(fā)明可以采用活潑酯法實(shí)現(xiàn)多糖與BRMS的共價(jià)結(jié)合。首先應(yīng)在LNTd分子中引入羧基(LNTd-COOH)，然后在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)形成活潑酯衍生物，其活潑酯鍵與BRMS中的氨基相遇可以轉(zhuǎn)化形成穩(wěn)定的酰胺鍵連接。
碳二亞胺(carbodiimide)是一類化學(xué)性質(zhì)很活潑的脫水劑，可使羧基同氨基脫水縮合形成酰胺鍵，但要在有機(jī)溶劑中使用，因此應(yīng)用受到一定限制。然而其水溶性衍生物，如1-乙基-3-〔3-(二甲胺基)丙基〕碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺對(duì)甲磺酸(CMC)等，較適宜于水溶性的生物大分子的修飾。例如香菇多糖衍生物(LNTd)經(jīng)引入羧基后(LNTd-COOH)，EDC在水溶液中能夠與LNTd-COOH的羧基形成活性中間體復(fù)合物，然后該復(fù)合物再與IL-2分子中的氨基縮合形成酰胺鍵偶聯(lián)的結(jié)合物。
多糖分子中如果含有一定量的鄰二醇結(jié)構(gòu)，可以采用高碘酸鈉(NaIO4)或四醋酸鉛〔Pb(Ac)4〕氧化法引入醛基。1分子IO4-可將1個(gè)鄰二醇結(jié)構(gòu)氧化斷裂成兩個(gè)醛基，兩分子IO4-可將1個(gè)鄰三醇結(jié)構(gòu)氧化斷裂成兩個(gè)醛基和一個(gè)甲酸分子。Pb(Ac)4亦具有類似的氧化特性，但需要在有機(jī)溶劑中完成，而NaIO4則適于水溶液中。在多糖中引入的醛基可以同蛋白多肽分子中游離的氨基縮合形成不夠穩(wěn)定的西佛堿(Schiff’s Base)，再經(jīng)還原劑(如NaBH4)還原即可形成穩(wěn)定的C-N共價(jià)鍵。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)多糖或其衍生物與BRMS共價(jià)結(jié)合的方法涉及活潑酯法，碳二亞胺法，混合酸酐法，高碘酸(鹽)或四醋酸鉛(鹽)氧化法，以及溴化氰、氯化氰尿、表氯醇、三氯三嗪法等。亦包括采用諸如N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)等同型或異型雙功能偶聯(lián)劑或其衍生物的方法實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。
IL-2被LNTd修飾的程度(每分子IL-2結(jié)合LNTd的數(shù)目)，一方面取決于LNTd活化的程度(含活性基團(tuán)的數(shù)目)，另一方面又取決于兩者在反應(yīng)中的分子比。以NaIO4氧化法在多糖中引入醛基來說，β-13-glucan具有的鄰二醇結(jié)構(gòu)比較有限，主要分布于末端葡萄糖單元上，因此所含的支鏈愈豐富鄰二醇結(jié)構(gòu)愈多。而β-(1，2)/(1，4)/(1，6)-glucan則在主鏈結(jié)構(gòu)中即含有豐富的鄰二醇結(jié)構(gòu)，因此可能引入的醛基就愈多，但也不宜過度氧化，否則主鏈結(jié)構(gòu)將受到嚴(yán)重破壞。因此活化程度要根據(jù)多糖的結(jié)構(gòu)具體分析?？傊浣Y(jié)果應(yīng)既有利于偶聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，又能較好地保留其原結(jié)構(gòu)及活性。
為了使結(jié)合物具有較好的治療活性及藥學(xué)性質(zhì)，根據(jù)不同情況結(jié)合物中多糖與BRMS的摩爾比例可以有所不同。如果設(shè)計(jì)目的側(cè)重于減弱BRMS較強(qiáng)的免疫原性，逃逸代謝器官對(duì)其不利的分子識(shí)別及降解，以及抑制物對(duì)它的滅活作用，多糖的分子量可以適當(dāng)減小并相應(yīng)增加每分子BRMS結(jié)合多糖的分子數(shù)；如果主要側(cè)重于降低腎臟對(duì)BRMS的排泄速度，可以適當(dāng)增加多糖的分子量并相應(yīng)增加每分子多糖結(jié)合BRMS的個(gè)數(shù)。盡管以上設(shè)計(jì)時(shí)的側(cè)重點(diǎn)有所差異但均應(yīng)以不嚴(yán)重影響多糖或BRMS的活性為原則。修飾作用可能會(huì)使BRMS的活性(比活)有所降低，一般應(yīng)把活性保留控制在50％以上；如果復(fù)性控制得好該糖基化還有可能不減或提高BRMS的比活。
本發(fā)明涉及的多糖或其衍生物平均聚合度主要介于20-10000范圍；更優(yōu)的選擇通常介于40-1000范圍，即分子量多處于約6-160kd區(qū)間。
本發(fā)明涉及的用途不限于腫瘤的治療，利用其免疫調(diào)節(jié)作用還可以治療許多疾病，例如感染、免疫缺陷、造血功能障礙等。另外，亦可用作細(xì)胞培養(yǎng)及活化的試劑。用于治療時(shí)可以單獨(dú)用藥，也可以同其它藥物一起聯(lián)合治療，或者用于輔助治療。
當(dāng)用于體內(nèi)治療時(shí)，給患者使用治療有效量的協(xié)同多糖修飾的BRMS結(jié)合物(治療有效量即消除或減少病人病癥所需的量)。治療途徑通常是非腸道給藥，如經(jīng)靜脈、肌肉、皮下、腹膜、胸膜給藥，也可以病灶局部給藥。劑量及療程視病癥的性質(zhì)(如腫瘤的初期或轉(zhuǎn)移性的)及其種類、藥物的特征(如治療指數(shù))、病人及其病史而定。通常可以作為長(zhǎng)效藥物使用，如給藥程式可能是2-4天一次，亦可能間隔更長(zhǎng)時(shí)間。
非腸道使用的本發(fā)明修飾物可以輔以藥學(xué)上可接受的非腸道賦形劑和(或)穩(wěn)定劑而配制成單位劑量的注射劑(凍干粉、溶液、懸浮液、乳劑)。這類輔劑本身無毒無療效，例子如水、鹽水、Ringer’s溶液、葡萄糖、甘露糖(醇)、右旋糖酐、人血清白蛋白等。也可使用諸如不揮發(fā)油和油酸乙酯的非水性賦形劑，磷脂可用作載體。另外也可含有微量的諸如提高溶解度，增加等滲性和穩(wěn)定性的添加物，如表面活性劑、緩沖劑和防腐劑等。
本發(fā)明所需的BRMS、多糖應(yīng)為高度純化的臨床級(jí)制品，其生產(chǎn)和制備按有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。
下列實(shí)施例以香菇多糖共價(jià)修飾IL-2為例詳細(xì)敘述了有關(guān)制備、分析及測(cè)定方法。制備中所用的水、試劑、原料及容器等均應(yīng)達(dá)到必要的純凈及無熱源要求。這些實(shí)例不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1甲酸水解法制備LNTd1gLNT同50ml80％甲酸混合、密封，置85℃水浴水解20分鐘并不斷激烈振蕩。冷卻至室溫后減壓除去甲酸，然后加入100mlH2O，沸煮5小時(shí)，以抽提可溶性多糖并除去水解產(chǎn)物上的甲酰基團(tuán)。此混合物經(jīng)離心收取上清，加入30％的乙醇劃分，離心取上清再加入40％的乙醇劃分，離心收集沉淀物，加入等體積的水將混懸液移入透析袋(10kd)中對(duì)水充分透析。離心棄不溶物，上清上水平衡的DEAE-Sephadex及CM-Sephadex(2.6×15cm)離子交換層析柱，流速0.7ml/min，收集流出的LNTd液，定量分裝，凍干備用。
實(shí)施例2LNTd中引入羧基300mgLNT溶于10ml 0.4N NaOH中，攪拌下加入1.0ml10％Br(CH2)5COOH，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，對(duì)水充分透析(10kd)至無Br-檢出。收集比羧化LNTd(LNTd-COOH)，定量、分裝凍干待用。
實(shí)施例3LNTd中引入醛基300mgLNTd溶于10ml水中，攪拌下加入2ml 6％NaIO4/0.2MNaAc(PH4.0)，室溫暗處攪拌反應(yīng)2小時(shí)，加入過量乙二醇消耗剩余IO4-1小時(shí)，然后經(jīng)水平衡的Sephadex G-25柱(2.6×40cm)脫鹽及小分子，收集醛化多糖(LNTd-CHO)，定量、分裝凍干待用。
實(shí)施例4LNTd-rIL-2結(jié)合物制備1、活潑酯法100mg LNTd-COOH干粉溶于5ml DMSO中，分別加入20mg NHS和35mg DCC，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，離心棄沉淀物，上清加1∶2無水乙醇(V/V)沉淀，然后將沉淀物用10ml DMSO溶解，反復(fù)同上洗滌數(shù)次，最后把沉淀物用于5mlDMSO溶解，按1∶2摩爾比同20mg/mlrIL-2/0.1M NaHCO3(PH9.5)混合，攪拌反應(yīng)6小時(shí)(RT)，然后用HAC調(diào)PH5終止反應(yīng)。
2、西佛堿(Schiff’s Base)法100mg NaIO4氧化法制備的醛化多糖(LNTd-CHO)與20mg/mlrIL-2/0.1M NaHCO3(PH9.5)按1∶2摩爾比混合，室溫暗處攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后加入50mg NaBH4，混勻避光反應(yīng)1小時(shí)，再同上加入50mg NaBH4反應(yīng)1小時(shí)即可。
實(shí)施例5氧化型結(jié)合物的純化交聯(lián)反應(yīng)混合液對(duì)50mMPB(PH6.8)/0.1％SDS透析平衡，離心棄不溶物，上清液進(jìn)行SephacrylS200柱層析〔50mMPB(6.8)/0.1％SDS〕，380nm檢測(cè)洗脫液的光吸收。待洗脫液體積超過V。后開始分管收集組分。結(jié)合物的洗脫位置因結(jié)合物的大小而異，但均先于rIL-2洗脫峰位出現(xiàn)。一般修飾度愈高結(jié)合物的分子量(流體半徑)愈大，洗脫位置愈靠前。收集預(yù)期大小的結(jié)合物組分，經(jīng)25mMPB(PH6.8)平衡的Sephadex G-25脫鹽及SDS，-20℃凍存?zhèn)溆?。必要時(shí)亦可輔以沉淀、離子交換、疏水親和層析等方法純化。
實(shí)施例6復(fù)性如果被修飾的rIL-2是未經(jīng)氧化復(fù)性的或有待修飾后復(fù)性的，則修飾反應(yīng)后可將反應(yīng)混合物充分還原，如對(duì)50mMPB(PH6.8)/10mMβ-Me/1mMEDTA/1％SDS平衡后，再進(jìn)行SephacrylS-200〔50mMPB(PH6.8)/0.1％SDS)層析純化，收集結(jié)合物組分，加入10μM CuSO4，置空氣中自發(fā)氧化復(fù)性(4℃過夜)。次日加入1mMEDTA，混勻放置2小時(shí)，然后經(jīng)50mMPB(PH6.3)平衡的SephadexG-25柱脫SDS及復(fù)性添加物。該純化及復(fù)性的結(jié)合物可凍存或定量分析后分裝。
實(shí)施例7還原型結(jié)合物的制備及純化待氧化復(fù)性的還原型rIL-2交聯(lián)反應(yīng)后對(duì)50mM NaAc(PH5.0)/10mMβ-Me/1mMEDTA透析平衡，然后上該緩沖液平衡的Sephacryl S200柱層析，OD280nm檢測(cè)洗脫組分，收集所需大小的結(jié)合物組分，留小樣分析測(cè)活，其余-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例8結(jié)合物分子量(大小)測(cè)定(1)SDS-PAGE法采用2.5％濃縮膠和12.5％分離膠制板，樣品溶解液為還原型(β -Me)。以3％考馬斯亮蘭R250染色。結(jié)合物的分子量以蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定。常規(guī)操作參見〔Nature，(1970)227，680〕。
(2)凝膠過濾法采用Sephacryl S-200或Superose-12(1.6×85cm)層析柱，平衡液為10mMPBS(PH7.0)。樣品的有效分配系數(shù)Kav=Ve-VoVt-Vo,]]>其中Ve為樣品的洗脫體積，Vo為柱床外水體積，Vt為柱床體積。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品(Gel Filtration kit，pharmacia)的Kav求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可以標(biāo)定出結(jié)合物樣品的分子量及Stock’s(流體)半徑。有關(guān)常規(guī)操作參見〔張龍翔等編《生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》，1981年，P124，高等教育出版社〕。多糖及其衍生物的分子量(大小)測(cè)定亦可采用此法，只是分子量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用Dextran standards T10-T2000(pharmacia)。
有關(guān)蛋白質(zhì)及其結(jié)合物的測(cè)定可用紫外吸收法(280nm)，亦可用“Lowry”法〔J.Biol.Chem.(1951)193，265〕等。多糖及其衍生物的測(cè)定可采用“酚/硫酸”法〔Anal.chem.(1956)28.3〕或“蒽酮”法〔Anal.chem.(1953).25.1656〕等。結(jié)合物的修飾度(氨基參與的修飾)可采用三硝基苯磺酸(TNBS)法等測(cè)定游離的氨基數(shù)，以Gly為標(biāo)準(zhǔn)〔J.Biochem.(1960)47.654〕。IL-2及其結(jié)合物的生物學(xué)活性分析采用已知常規(guī)方法，如〔J.Immunol.(1978)120.2027〕。本專利涉及的其它生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑及其修飾物的活性及特異測(cè)定以其未修飾的原型化合物為基礎(chǔ)，方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
該技術(shù)領(lǐng)域的內(nèi)行將欣然認(rèn)為本發(fā)明可以很好地執(zhí)行上述目的，并得到結(jié)果及其利益。這里所述的化合物、方法、過程和技術(shù)是優(yōu)選出的代表實(shí)例，只是例舉而不是來限制本發(fā)明的范圍。該技術(shù)領(lǐng)域人員所作出的改變及其它使用也包括本發(fā)明的精神中并被權(quán)利要求書所定義。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合物，其特征在于生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRMS)被具有抗癌和(或)免疫增強(qiáng)活性的多糖共價(jià)交聯(lián)形成結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其中所述的BRMS部分包括其氧化態(tài)和還原態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其中所述的BRMS部分包括其類似物或衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其特征在于其中所述的多糖部分具有抗癌和(或)免疫增強(qiáng)的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述結(jié)合物，其特征在于其中所述多糖部分可以取自抗癌和(或)免疫增強(qiáng)活性的多糖或其衍生物，亦可以被具有上述活性的糖肽、糖脂或其衍生物所替代。
6.一種增強(qiáng)BRMS抗癌效能，拓寬適應(yīng)癥，減輕毒付作用并簡(jiǎn)化治療程式的方法，其特征在于(1)多糖與BRMS同時(shí)使用能協(xié)同促進(jìn)和提高抗癌效能，拓寬適應(yīng)癥；(2)多槽對(duì)BRMS的共價(jià)修飾能減少代謝器官對(duì)BRMS的不利識(shí)別與消耗，降低排泄器官對(duì)它的排出速度，從而延長(zhǎng)BRMS的循環(huán)半衰期，提高藥效，減少用藥量和毒付反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中包括一種提高BRMS溶解性和穩(wěn)定性的方法，其特征在于多糖對(duì)BRMS的共價(jià)結(jié)合減弱了疏水性較強(qiáng)的BRMS分子間的相互作用和聚集趨向，使其隨多糖分子溶解并穩(wěn)定分散于水相。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征亦包括結(jié)合物中BRMS的氧化復(fù)性在修飾反應(yīng)之后，或保留其還原狀態(tài)。
9.一種用于預(yù)防和治療腫瘤、感染、免疫缺陷等疾病的用途，其特征在于它包括給需要使用和治療的病人使用權(quán)利要求1所述結(jié)合物，亦包括用作細(xì)胞培養(yǎng)及活化的試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述用途，其中包括給病人使用由權(quán)利要求1所述結(jié)合物進(jìn)一步制成的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRMS)體外糖基化修飾。該修飾是用與BRMS有協(xié)同抗癌和(或)免疫增強(qiáng)作用的多糖或其衍生物同BRMS共價(jià)結(jié)合，使其藥用價(jià)值獲得如下改善(1)抗癌及免疫調(diào)節(jié)效能增強(qiáng)；(2)適應(yīng)癥拓寬；(3)體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，免疫原性降低，抗蛋白水解酶水解能力提高。從而起到提高抗癌和免疫調(diào)節(jié)效能，減少用藥量、降低毒副作用，簡(jiǎn)化治療程式的作用。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1124656SQ94114208
公開日1996年6月19日 申請(qǐng)日期1994年12月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月12日
發(fā)明者王京杭 申請(qǐng)人:王京杭