專利名稱：醫(yī)藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水蛭素的含水配制品，特別是涉及貯存配制品。
水蛭素，作為一種天然存在于水蛭(Hjrudo medicinalis)中的抗凝血劑，并不是單一的多肽，而是一類至少由四種肽組成的有等同作用的多肽，它們分別稱為水蛭素變異體1(HV1)、水蛭素變異體2(HV2)(參見歐洲專利申請No.158 564)、水蛭素變異體3(PA)(參見PCT申請No.86/03493)和“脫-(Val)2-水蛭素”(參見歐洲專利申請No.158 986)。這些變異體在結(jié)構(gòu)上彼此差異在于氨基酸數(shù)目不同(具體的說，HVI的N末端是Val-Val-Tyr，HV2和HV3的N末端是Thr-Tyr)，但它們的共有特征是在N末端有疏水氨基酸積聚，在C末端有極性氨基酸積聚，酷氨酸殘基(Tyr63)作為硫酸單酯存在、有三個二硫橋鍵以及都有抗凝血活性。
在過去的幾年里，已克隆并在微生物宿主中表達(dá)了編碼水蛭素變異體的CDNA和合成基因。雖然表達(dá)產(chǎn)物在Tyr63位缺少硫酸單酯基團(tuán)并因此被稱為“脫硫酸水蛭素”，但已證明它們表現(xiàn)有與天然硫酸化水蛭素差不多相同的生物學(xué)活性。已在大腸桿菌中(歐洲專利申請No.158 564和168 342)和啤酒酵母中(歐洲專利申請No.168 342、200 655、225 633、252 854和341 215)表達(dá)了脫磷酸水蛭素變異體HV1。同樣，已在大腸桿菌中(歐洲專利申請No.158 564)和啤酒酵母中(歐洲專利申請No.200 655，PCT申請No.86/01224)表達(dá)了脫硫酸水蛭素HV2，并在大腸桿菌中(歐洲專利申請No.158 986)表達(dá)了脫-(Val)2-脫硫酸水蛭素。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“水蛭素”意欲包括分別在文獻(xiàn)中描述的水蛭素、脫硫酸水蛭素、水蛭素變異體或脫硫酸水蛭素變異體或其突變體，且特別是可從含有編碼脫硫酸水蛭素或其突變體之DNA的被轉(zhuǎn)化的微生物菌株得到的脫硫酸水蛭素或其突變體。例如，這些脫硫酸水蛭素是脫磷酸水蛭素變異體HV1、HV1修飾的( a、b)、HV2、HV2修飾的(a、b、c)、HV3和脫-(Val)2-脫硫酸水蛭素的變異體。
優(yōu)選的脫硫酸水蛭素具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO1) 其中
a)27、36和47位的Xaa各自是Lys，51位的Xaa是His且62位的Xaa是肽殘基Glu-Tyr-Leu-Gln(MV1)，或b)27位的Xaa是Ile或Glu，36、47、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修飾的a)，或c)36位的Xaa是Ile或Glu，且27、47、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修飾的a)，或d)47位的Xaa是Ile或Glu，且27、36、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修飾的a)，或e)51位的Xaa是Ieu或Asp，且27、36、47和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修飾的a)，或f)62位的Xaa選自Glu-Tyr、Glu-Tyr-Leu、Glu-Asp-Leu-Gln、Glu-Glu-Leu-Gln、Glu-Tyr-Lys-Arg、Glu-Asp-Lys-Arg、Glu-Lys-Leu-Gln、Ser-Phe-Arg-Tys、Trp-Glu-Leu-Arg、Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro和Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg，且27、36、47和51位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修飾的b)，或具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO2)
或具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO3) 其中a)47位的Xaa是Asn，且63位的Xaa是Tyr(HV2)，或b)47位的Xaa是Lys、Arg或His，且63位的Xaa是Tyr(HV2修飾的a)，或c)63位的Xaa是Glu或Asp且47位的Xaa是Asn(HV2修飾的b)，或具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ IN NO4)
或具有下列結(jié)構(gòu)式(SEQ ID NO5)的脫硫酸水蛭素。
(Ⅴ)
HV3和所說HV3之變異體的特征是使一級結(jié)構(gòu)在N末端縮短1或2個氨基酸，或在C末端縮短18、10、9、6、4或2個氨基酸。
特別優(yōu)選的脫硫酸水蛭素化合物是其中Xaa基團(tuán)為a)所限定之基團(tuán)的式I化合物，或是其中47位Xaa為Lys且63位Xaa為Tyr的化合物。
最優(yōu)選的水蛭素是具有其中27、36和47位Xaa各自為Lys、51位Xaa為His且62位Xaa為肽殘基Glu-Tyr-Leu-Gln之式I結(jié)構(gòu)的脫硫酸水蛭素HV1。
可合成，如用化學(xué)法或較好用重組技術(shù)，或者從水蛭中分離制得用于本發(fā)明的水蛭素。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“突變體”是指基于簡單的或多點突變而不同于天然水蛭素或脫硫酸水蛭素又表現(xiàn)有抗凝血活性的蛋白質(zhì)(突變蛋白)(參見歐洲專利申請No.352 227和No.352 228)。已克隆并在微生物宿主如大腸桿菌和啤酒酵母中表達(dá)了可用本領(lǐng)域已知方法如定點誘變技術(shù)制得的編碼所說突變體的DNA。
用于本發(fā)明的水蛭素化合物可以是游離形式的，但也可以是其鹽形式的。因為它們在幾個氨基酸殘基含有游離氨基基團(tuán)，所以這些化合物可以是酸加成鹽形式的。適用的酸加成鹽是與常規(guī)治療上可接受的鹽結(jié)合形式的特定的醫(yī)藥上可接受的鹽。有代表性的無機酸是氫鹵酸(如鹽酸)，以及硫酸、磷酸和焦磷酸。有代表性的有機酸具體是芳基磺酸(如苯磺酸或?qū)ξ患妆交撬?，或低級烷基磺酸(如甲磺酸)，以及羧酸如乙酸、乳酸、棕櫚酸、硬脂酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸和檸檬酸。但因為用于本發(fā)明的化合物也在幾個氨基酸殘基中含有游離羧基，而這些羧基基團(tuán)賦予整個肽以酸性性質(zhì)，所以它們也可以是與無機或有機堿形成的鹽，如鈉、鉚、鈣或鎂鹽，或者也可以是由氨或醫(yī)藥上可接受的有機含氮堿衍生的銨鹽。但因為它們同時含有游離羧基和游離氨基基團(tuán)，所以它們也可以是惰性鹽形式的。最好選用藥理學(xué)上可接受的鹽。
在開發(fā)含水蛭素之劑型中的一個問題是它在水溶液中的穩(wěn)定性差。這就是開發(fā)預(yù)裝注射器配制品，即一種具有更易被病人接受且降低了生產(chǎn)成本等優(yōu)點劑型中的主要障礙。
當(dāng)用色譜法分析水蛭素時即可看到這種不良穩(wěn)定性。
Mono-Q方法使用Mono-Q柱(顆粒大小10μm，5.0×50mm，購自Pharmacia)，以FPLC(游離蛋白質(zhì)液相層析)方法分析水蛭素的穩(wěn)定性。該方法是由Ciba-Geigy，Basel建立的。溶劑A是溶于水中的50mMHCOONH4(PH4.5)，溶劑B是加在水中的50mMHCOONH4(PH3.5)。洗脫是使用1.4ml/分鐘的流速在室溫下完成的。前5分鐘的二元洗脫液是以20%B的恒定流完成的，然后是歷時10分鐘的20%B至75%B的線性梯度，并以100%B洗脫2分鐘，其后以20%B的起始條件將柱平衡2分鐘。
Prcpac方法也可使用最近公開的水蛭素分析方法[Tuong，A.，Maftouh，M.，Ponthus，C.，Whitechurch，O.，Roitsch，C.，and Picard，C.(1992)“Characterisation of the Deamidated Forms of Recombinant Hirudin"，Biochemistry 31，8291-8299]。該方法中使購自Dionex的Pro Pac PAl陰離子交換柱(內(nèi)徑250×4mm)。溶劑A是20mM Tris-HCl，PH7.0，且溶劑B是加在A中的0.5M NaCl以28%常液洗脫5分鐘，然后是流速為1.3ml/分鐘，歷時60分鐘的從28%B至54%的線性梯度洗脫。


圖1中顯示了使用Mono Q和Propac方法分析溶于水中(20mg/ml水蛭素)之重組水蛭素(CGP39393)的典型層析圖譜?？梢钥闯?，這些方法獲得了相似的檢測結(jié)果。
在主峰前洗脫的二個峰(圖1)分別稱為Q4和Q5峰。圖2顯示水蛭素存在于水中將隨著時間而導(dǎo)致Q4和Q5峰增大，并在主水蛭素峰后而出現(xiàn)另外的峰。尚不知道產(chǎn)生那些額外峰產(chǎn)物的額外性質(zhì)。
為了在不同的指征例如在防止深靜脈血栓形成中使用水蛭素，如將水蛭素制成貯存配制品應(yīng)是有利的。這樣的配制品可允許每天用一次，從而減少病人順從的問題。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可使用鈣、鎂或鋅制成貯存配制品。這些配制品緩慢地釋放水蛭素，并且還具有長期的化學(xué)穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明提供了含有水、水蛭素和鈣、鈣或鋅離子的非水溶性鹽形式的含水貯存配制品。
非水溶性鹽較好是磷酸鹽，因為它們很難溶于水。
貯存配制品的PH可為4至11，較好為5至9。
金屬鹽的濃度可從100mM到600mM，較好從100mM到300mM，最好約150mM。如果濃度高于通常的生理濃度，則可在使用前將貯存配制品稀釋到生理濃度。
水蛭素的濃度可從1到600mg/ml，較好從20到80mg/ml。如果濃度較高，可在使用前將其稀釋到例如20-80mg/ml。
非水溶性鹽的顆粒大小可從10至30μm(直徑)，較好從10到20μm(直徑)。
可在水蛭素水溶液中原位沉淀其非水溶性鹽來制備貯存配制品。例如可將所選金屬(Ca、Mg或Zn)的氯化物與堿金屬磷酸鹽混合。然后適當(dāng)情況下可使用例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)整所得配制品的PH。
沉淀后貯存配制品具有牛奶樣外觀并最終沉淀下來。但振蕩后配制品又再次呈現(xiàn)牛奶樣。
用于制備貯存配制品的優(yōu)選金屬是鋅。
本發(fā)明的配制品還可含有糖如蔗糖、海藻糖或較好是甘露醇。
存在于貯存配制品中的水蛭素很純并且在至少幾個月的長時間內(nèi)是穩(wěn)定的。該配制品可貯存于室溫或更低溫度如4℃下。它們在低溫下可長時間穩(wěn)定。已在室溫下將配制品至少貯存了三個月并已證明沒有降解。
本發(fā)明的配制品可通過注射或皮下等胃腸道外途徑給藥。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)水蛭素作為本發(fā)明的貯存配制品給藥時，要比作為簡單的溶液給藥時注射部位出血少。
下列實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例1溶液A含有加在水中的2.43M ZnCl2和0.455M NaHPO4，用HCl將PH調(diào)到2.5。溶液B由0.6M NaOH、0.25M NaCl組成。將2份水蛭素在水中的貯備溶液(80mg/ml)與1.05份溶液A混合[比例2∶1.05(V/V)]制成溶液C。以分別為0.66∶0.183∶0.4的比例混合水、溶液B和溶液C即得到此貯存配制品。
使用CaCl2或MgCl2代替ZnCl2制得相似的混合物。
實施例2離心實施例1中制得的貯存配制品。除去并分析上清，向殘留物中加入水。發(fā)現(xiàn)在第二次離心后所形成沉淀餅中有85-95%的水蛭素。
然后振蕩、離心并重復(fù)上述處理。
表1顯示在第一、第二和第三次離心后對貯存配制品上清液所作MonoQ分析的結(jié)果表1 樣品為150mMPH7.4
表1中的數(shù)據(jù)顯示，上清液中含有很純的水蛭素。每次離心后水蛭素的相對量有所減少(數(shù)據(jù)未示出)。表1中的數(shù)據(jù)還顯示，各配制品均可用作貯存配制品每次離心后向殘留物中加入水可導(dǎo)致更多的水蛭素釋放。
實施例3將用實施例1方法制得的貯存配制品在4℃下貯存5個月，然后使用Propac方法分析水蛭素。結(jié)果在表Ⅱ中給出。
表Ⅱ?qū)A存5個月之配制品的ProPac分析
從表Ⅱ看出，PH范圍為6-7的Zn和Ca貯存配制品沒有因Propac方法處理而顯出過份的不穩(wěn)定性。
實施例4溶液A1含有165mM ZnCl2、2.11mM Ha2HPO4和37.8mM HCl。溶液B1含有0.6N NaOH。將水蛭素粉末加到31.7份(體積)溶液A1中，然后加入55份(體積)甘露醇溶液(198mM)，再加入13.3份(體積)溶液B1。因形成沉積物而使溶液變得混濁。所用水蛭素的量為每毫升水中含20mg。不需調(diào)整PH。
實施例5將水蛭素溶解于13.5份(體積)甘露醇溶液(198mM)和27.75份(體積)水中。向此溶液中加入10份(體積)溶液B1(見實施例4)，然后再加入23.75份(體積)溶液A1(見實施例4)。因形成沉積物而使溶液變得混濁。所用水蛭素的量為每毫升水中含20mg。
實施例6將水蛭素溶解在1份(體積)CaCl2溶液、(120mM)和其后的1份(體積)K2HPO4溶液中。因形成沉積物而使溶液變得混濁。所用水蛭素的量為每毫升水含20mg。加入1M NaOH溶液將PH調(diào)整到7.4。
實施例7為了舉例說明貯存效果，將水蛭素作為鹽溶液(水蛭素/鹽)或以鋅貯存配制品(Zn/水蛭素)的形式對大鼠(n＝6)皮下給藥。
給藥后1、3、5和8小時檢測大鼠血漿中水蛭素濃度。用夾心ELISA法檢測肝素化的血漿。結(jié)果示于圖3中。
給藥后1、3、5和8小時檢測活化的顆粒組織促凝血酶原激酶(APTT)。結(jié)果示于圖4中。
貯存效果通過較長時間地延長水蛭素的作用而得以顯示。
序列一覽表SEQ ID NO1(1)序列特征(A)長度63-66氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定無(ⅳ)反意義無
SEQ ID NO2(1)序列特征(A)長度65氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定無(ⅳ)反意義無
SEQ ID NO3(1)序列特征(A)長度65氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定無(ⅳ)反意義無
SEQ ID NO4(1)序列特征(A)長度65氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定無(ⅳ)反意義無
SEQ ID NO5(1)序列特征(A)長度66氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假定無(ⅳ)反意義無
權(quán)利要求
1.非水溶性鹽形式的含有水、水蛭素和鈣、鎂或鋅離子的含水貯存配制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的配制品，其中非水性鹽是磷酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的配制品，其PH為4至11。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的配制品，其PH為6至8。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的配制品，其中金屬鹽的濃度為100mM至600mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的配制品，其中金屬鹽的嘗試約為150mM。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的配制品，其中水蛭素的濃度為1至600mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的配制品，其中水蛭素的濃度為20至80mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求之任一項的配制品，其中水蛭素是脫硫酸水蛭素變異體或其突變體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的配制品，其中水蛭素是脫硫酸水蛭素HVI。
11.根據(jù)權(quán)利要求之任一項的配制品，其中非水溶性鹽的顆粒大小為10至30μm直徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求12的配制品，其中非水溶性鹽的顆粒大小為10至20μm直徑。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的配制品，其還含有糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的配制品，其中糖是甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了非水溶性鹽形式的含有水、水蛭素和鈣、鎂或鋅離子的含水貯存配制品。
文檔編號A61K47/36GK1108137SQ9410139
公開日1995年9月13日 申請日期1994年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月18日
發(fā)明者T·阿文特 申請人:希巴-蓋吉股份公司