專利名稱：腫瘤壞死因子和白細胞介素-4的協(xié)同的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淋巴介素。更具體地說，它涉及TNF和IL-4對腫瘤細胞生長的抑制和對細胞毒性的協(xié)同作用。
細胞介素(激肽)是由一個細胞產(chǎn)生的多種類的分子，它可侵襲細胞本身或其它細胞。它有許多種類細胞介素作為一組對正常細胞與異常細胞都發(fā)揮出廣泛效應(yīng)。特定的細胞介素對特定細胞的效應(yīng)取決于特殊的細胞介素及靶細胞的種類。
腫瘤壞死因子(TNF)是細胞介素，它是活性單核細胞的初產(chǎn)物并且在自然界是多效性的(Ayier，et al.(1988)腫瘤壞死因子，溶細胞淋巴細胞和補體的CRC手冊免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子(E.R.Podack，ed.)，CRC，出版公司.，Boca Raton，F(xiàn)la.，105頁;Goeddel，et al.(1987)腫瘤壞死因子基因結(jié)構(gòu)和生物活性。在Cold Spring Harbor Symposia中的定量生物學(xué)，L1597)。它抑制了大量腫瘤細胞在孵育時的生長并刺激成纖維細胞、B-細胞和胸腺細胞的產(chǎn)生。TNF對腫瘤細胞的細胞毒性作用被干擾素所加強(Lee，等(1984)J.Immunol 1331003;Sugarman，等(1985(Science 230943;Aggarwal，et al.(1985)Nature 318.665;Vilcek，等(1986)腫瘤壞死因子和干擾素的相互作用，在干擾素系統(tǒng)的生物學(xué)中。H.Schellekenes和W.E.Stewart編輯，Elsevier Science Publishers，Amsterdam.，P.249;Fransen等(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22419-426;Campbell等(1988)J.Immunol.1412325-2329;Schiller，等(1987)Cancer Res.472809-2813).干擾素增長了TNF抗增殖效應(yīng)并同時使TNF受體向上調(diào)節(jié)(Aggarwal，等(1985)Nature 318665;Fransen，等(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22419-426)。但是，干擾素使TNF受體上向調(diào)節(jié)不是它們協(xié)同細胞毒性應(yīng)答的原始機制(Tsujimoto等(1986)J.Immunol.1372272-2276;Aggarwal和Eessalu(1987)J.Biol.Chem.26210000-10007)。
在美國專利第4，650，674中揭示了干擾素-g和TNF對腫瘤生長調(diào)節(jié)的協(xié)同作用，這里列出供參考。
白細胞介素-4(IL-4)是一種由活性T-淋巴細胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)的細胞介素。許多免疫系統(tǒng)調(diào)控代謝物中的一種最初被描述為B-細胞長生因子，因為它能共同刺激B-淋巴細胞的增殖(Howard等J.Exp.Med.155914(1982).IL-4也侵襲許多種類細胞，包括T-細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造血祖細胞(Paul等(1987)Ann.Rev.Immunol.5429;Yokota等(1988)Immunol.Rev.102137;Crabstein等(1986)J.Exp.Med.1631405).IL-4增加了包括T-細胞和肥大細胞的等一類的細胞生長(Fernandez-Botran等(1986)Proc.Natal.Acad.Sci.USA 839689;Spits等(1987)J.Immunol.1391142;Zlotnik等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843856;Mosmann，等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA 835654)，誘導(dǎo)MMC類Ⅱ抗原在B-細胞和單核細胞上表達(TeVelde等(1988)J.Immunol.1401548)，增加了抗原特定細胞毒性的T-細胞并增長了傳遞細胞毒性的巨噬細胞(Spits等(1988)J.Immunol.14129;Widmer，等(1987)J.Exp.Med.1661447;Crawford，等(1987)J.Immunol.139135).同時IL-4向下調(diào)節(jié)包括IL-1a、IL-b、IFN-g和TNF-a的一些細胞介素的產(chǎn)生，它也向上調(diào)節(jié)從B-細胞中產(chǎn)生IL-6(Essner等(1989)J.Immunol1423857;Lee等(1990)J.of Leukocyte Biol.47475-479;Pelman等(1989)J.Exp.Med.1701751).IL-2誘導(dǎo)的LAK及NK細胞活性被IL-4向下調(diào)節(jié)(Brooks等(1988)Clin.Exp.Immunol.74162;Nagler等.(1988)J.Immunol.1412349).此外，最近IL-4的增殖效應(yīng)也顯示出抑制人體淋巴和血漿細胞瘤的生長(Taylor等(1990)Blood 755)。
本發(fā)明涉及IL-4對TNF抗增殖活性的協(xié)同作用。IL-4-加強了TNF對種種腫瘤細胞，包括(但不局限于)乳腺腫瘤細胞、瘤細胞和淋巴瘤細胞細胞毒性作用。這些協(xié)同效應(yīng)視TNF和IL-4的劑量而定。將IL-4使TNF細胞毒性的增長與以前報道的干擾素gamma相比較。
本發(fā)明涉及T-細胞產(chǎn)生的細胞介素，IL-4對TNF在腫瘤細胞內(nèi)細胞毒性作用的協(xié)同作用。在一個實例中，本發(fā)明提供了一種基本包括純化的TNF和IL-4的組合物。在另一個實例中，提供了一種基本包括純化的TNF、IL-4和干擾素-gamma(IFN-g)。在再一個實例中提供了該種組合物用來抑制腫瘤細胞生長的用途。在另一個實例中提供了用該組合物殺死腫瘤細胞的用途。
TNF對許多不同細胞系的抗增殖作用被IL-4所加強。單獨的IL-4對這些細胞系無生長抑制作用，或者有時稍微刺激其生長。將被IL-4所增加的細胞毒性作用程度與被IFN-g增加的相比較;但是，IL-4和IFN-g加強TNF和淋巴因子(Lt)的抗增殖作用或細胞毒性作用的機制是不同的。
給患腫瘤的動物使用無細胞的、適合治療腫瘤細胞的包括TNF和IL-4的組合物將導(dǎo)致腫瘤生長降低。較好的是，腫瘤壞死因子是人體腫瘤壞死因子。腫瘤壞死因子可從任何來源中得到。這類來源是該技術(shù)領(lǐng)域中公知的。較好的是，腫瘤壞死因子是重組體產(chǎn)生的。
較好的是，IL-4是人體IL-4，IL-4可從任何來源處得到，這類來源是該技術(shù)領(lǐng)域中公知的。最好IL-4是重組體產(chǎn)生的。
本發(fā)明也提供了一種治療腫瘤的方法，它包括給患腫瘤的動物使用包括治療腫瘤有效量的TNF和IL-4的組合物。
另外，本發(fā)明提供了一種包括TNF、IL-4和IFN-g的組合物。當給患腫瘤的動物使用本發(fā)明組合物時則減少了腫瘤的生長并對腫瘤細胞有選擇性的細胞毒性。
讀了下面的實施例詳細闡述并結(jié)合附圖、綜述，將使本發(fā)明的目的、特征及改進成為顯而易見的了。


圖1顯示不同濃度的TNF和IL-4(100ng/ml)對人體乳腺腫瘤細胞系(MDA-MB-330)的細胞存活性的作用。
圖2表明不同濃度的TNF和IL-4(100ng/ml)對人體上皮癌細胞系(A-431;上名冊)及組織細胞淋巴瘤細胞系(U-937，下名冊)的細胞存活性的作用。
圖3表明不同濃度的IL-4對依賴TNF的對A-431(上名冊)和MDA-MB-330(下名冊)細胞系細胞毒性的作用。
圖4表明將IL-4和IFN-g對TNF依賴的對MDA-MB-330細胞的細胞毒性作用進行比較。
圖5表明將IL-4對TNF和Lt依賴的對MDA-MB-330細胞得細胞毒性作用進行比較。
本發(fā)明詳細提供了一種通過給腫瘤細胞使用共存TNF的IL-4而增加TNF的增殖活性的方法。IL-4加強了TNF對種種腫瘤細胞，包括乳腺腫瘤細胞(MDA-MD-330)、外陰癌細胞(A431)和組織細胞淋巴瘤細胞(11-937)的細胞毒性作用。協(xié)同作用視TNF和IL-4的劑量而定。當單獨使用IL-4時，它對這些細胞系的作用最小。事實上，對一些細胞系而言，單獨使用IL-4展示出有效的增殖活性。將被IL-4所增加的TNF毒性與以前報告的干擾素gamma(IFN-g)進行比較。
本發(fā)明提供了一種包括T-細胞產(chǎn)生的細胞介素、IL-4和TNF的協(xié)同組合物。該組合物對腫瘤細胞的細胞毒性大于只使用TNF所產(chǎn)生的細胞毒性。在一個實例中，由本發(fā)明提供了包括基本純化的TNF和IL-4的組合物。這些細胞介素可從任何來源得到，包括從天然蛋白質(zhì)和重組體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中得到，在另一實例中提供了一種包括基本純化的TNF、IL-4和干擾素-gamma(IFN-g)的組合物。在再一個實例中提供了該組合物用來抑制腫瘤細胞生長的用途。在另一個實例中提供了用本發(fā)明組合物殺死腫瘤細胞的用途。
此“個體”意指包括任何動物，較好的是哺乳動物，最好是嚙齒動物、貓、狗、母?；蛉恕?br> 這里所用的術(shù)語“腫瘤壞死因子”指除了淋巴因子外而能產(chǎn)生適宜的細胞毒性活性，并有一區(qū)帶顯示出與成熟腫瘤壞死因子的氨基酸順序、其片段或這類多肽或片段的衍生物同源的官能性的氨基酸的多肽。美國專利第4，650，674中揭示了用于本發(fā)明的腫瘤壞死因子，在此列出供參考。
適宜的細胞毒性活性與相同條件下正常的細胞相比，其對腫瘤細胞的適宜的殺滅作用或生長抑制作用，通過多肽對在體內(nèi)或體外腫瘤細胞的影響并與正常細胞或組織相比較來檢測適宜的細胞毒性活性。細胞溶解一般是體外的診斷指征，而腫瘤壞死則在體內(nèi)實驗中檢查，但是，細胞毒性活性作用白細胞郁積或抗增殖活性是顯而易見的。合適的分析系統(tǒng)是公知的，例如，用來檢測如下所述的腫瘤壞死因子的特異活性的溶細胞分析是可接受的，如B.Aggarwal等在“胸腺激素和淋巴因子”中所述的分析(A.Goldslein編輯，關(guān)于健康衛(wèi)生的春天座談會，喬治·華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)(在此文獻中A 549細胞系是可從ATCC中得到的CCL185)。
TNF的特異活性是靶細胞溶解而不是白細胞郁滯。1單位的腫瘤壞死因子被定義為使50%靶細胞溶解所需的量。但是，這并不排除其它測量特異活性的分析，例如，根據(jù)靶細胞生長率為基礎(chǔ)的方法。
來自正常生物來源的天然腫瘤壞死因子在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上的計算分子量約17，000，異電點約5.3，在多個位點易于進行胰蛋白水解，用反相HPLC來純化天然腫瘤壞死因子。
一般定義為腫瘤壞死因子的多肽將含有與美國專利第4，650，674號所述的腫瘤壞死因子蛋白基本同源的區(qū)帶或與其有20-100氨基酸殘基的持續(xù)區(qū)帶的片段，特別包含殘基35-66和110-133的區(qū)帶的片段基本同源的區(qū)帶。
在建立作為腫瘤壞死因子的多肽的同一性中最充分的因素是成熟腫瘤壞死因子的溶細胞活性，以便基本中和正在討論的多肽的溶細胞活性。應(yīng)當認識到免疫同一性和細胞毒性同一性不需要共存。由于中和抗體正好不定向特異地連接到其細胞毒性活性為臨界的腫瘤壞死因子上，故對于腫瘤壞死因子的中和抗體可能不與候補蛋白結(jié)合?？商娲氖强贵w可結(jié)合在無害區(qū)域并通過空間障礙發(fā)揮其抑制中和作用。因此，在此無害區(qū)域突變的候補蛋白可能不再與中和抗體結(jié)合，但就其基本同源和生物活性而言它是INF。
觀察從外周淋巴細胞所得的或?qū)τ谔烊活惸[瘤壞死因子建立細胞系培養(yǎng)所得的天然或野生型成熟人體腫瘤壞死因子的諸如分子量、異電點之類的特征是很重要的。前面所指TNF也包括也顯示的天然腫瘤壞死因子的所有特征的其它種類。既然這里所定義的腫瘤壞死因子包括天然腫瘤壞死因子，那么其它相關(guān)的細胞毒性的多肽也屬于此范圍中。例如，像插入突變體、刪除突變體或熔合蛋白的TNF衍生物使腫瘤壞死因子超越了為天然腫瘤壞死因子所建立的分子量(帶有成熟腫瘤壞死因子的熔合蛋白或前TNF本身及插入突變體的分子量大于天然成熟的腫瘤壞死因子，而天然成熟腫瘤壞死因子刪除突變體的分子量較低)。相似地，可以操縱腫瘤壞死因子以減少或消除被胰蛋白或其它蛋白酶水解的易變性。最終，從非靈長目哺乳動物中派生出來的細胞系中，人體前TNF的后衍化過程可在氨基末端區(qū)域產(chǎn)生出微異質(zhì)性，結(jié)果纈氨酸不再是氨基末端的氨基酸。
注意“能產(chǎn)生細胞毒性活性”或體內(nèi)腫瘤壞死的語言意味著腫瘤壞死因子一詞包括如通過酶水解使多肽從非活性狀態(tài)源轉(zhuǎn)化至酶原再至有所需生物活性的多肽片段。典型的，非活性前體是熔合蛋白，其中成熟腫瘤壞死因子在多肽的骨架羧基末端處與人體蛋白或其片段相連。選擇該肽骨架或肽骨架附近的順序以使其在體內(nèi)或在人工制造部分的體外易于進行蛋白水解以釋放出腫瘤壞死因子。這樣產(chǎn)生的腫瘤壞死因子就顯示出特定所需的細胞毒性活性。
既然腫瘤壞死因子通常意指人體腫瘤壞死因子，那么來源于鼠、豬、馬或牛的腫瘤壞死因子也稱為腫瘤壞死因子，只要它能同樣滿足上述同源區(qū)帶及細胞毒性活性的標準。TNF不是種族特異的，例如人的TNF對鼠腫瘤是活性的。因此，來自一個種族的TNF可用于另一個種族治療中。
腫瘤壞死因子也包含多種形式。腫瘤壞死因子的衍生物包括在腫瘤壞死因子的范疇內(nèi)。腫瘤壞死因子分子在35-66和110-133殘基的區(qū)域顯示出與淋巴因子基本同源(50%)。兩分子的疏水羧基末端(腫瘤壞死因子殘基150至157)也可被有效保存。由于兩種蛋白顯示出細胞活性或體內(nèi)腫瘤壞死，據(jù)信這些區(qū)域在表現(xiàn)出淋巴因子活性及腫瘤壞死因子活性方面是重要的，因此，在實踐本發(fā)明中，本發(fā)明組合物中的淋巴介素可用TNF取代。
這里所用的術(shù)語“白細胞介質(zhì)-4”或“IL-4”指一種多肽，它是最初由EL-4胸腺細胞產(chǎn)生的因子，然后通過TPA活化，它誘導(dǎo)被亞有絲分裂素量抗-Ig活化的鼠B-細胞的增殖。IL-4也稱為B-細胞生長因子(BOGF)，B-細胞刺激因子(BSF-17)，T-細胞生長因子Ⅱ(TCGF-Ⅱ)及肥大細胞生長因子-Ⅱ(MCFG-Ⅱ)(Houard等(1982)J.Exp.Med.155914-923;Yokota等(1988)J.Immunol.Rev102137。由種種T-細胞/淋巴細胞群產(chǎn)生的IL-4可通過免疫分析(ELISAS)和Northern污漬分析(Paliard等1988)。典型地，在諸如Spits等(1987)J.Immunol.1391142-1147中所揭示的亞細胞生長促進活性的生物分析中來檢測IL-4活性。但是，用來分析IL-4活性并部別IL-4的其它方法是該技術(shù)領(lǐng)域人員公知的。例如，通過使外周單核血細胞用PHA在37℃下活化72小時，用PHA一細胞洗滌并在96-井的金屬平板上鋪5000細胞/0.1ml/井的平板而進行典型的生物分析，將IL-4試驗樣品作一系列稀釋并在37℃下與細胞培養(yǎng)72小時。將研磨的胸腺密啶核甙并通過測量摻入細胞中的研磨的胸腺嘧啶核甙來測定IL-4活性，一單位IL-4被定義為得到最大增殖一半的細胞分裂量的量。
在Le等(1988)J.Biol Chem.26310817-10823中闡述了來自含有培養(yǎng)液上清液的血清中天然產(chǎn)生IL-4的純化，簡言之，在S-瓊脂糖上經(jīng)陽離子層析后，含組份的IL-4用0-0.5M的NaCl梯度在50mM HEPES，pH7.0中洗脫，然后部分在Sepkadex G-100上過濾。IL-4部分進一步用反相HPLC純化，用20-70%(v/v)乙腈的梯度在0.1%(v/v)三氟乙酸中洗脫。
這些過程導(dǎo)致約60%和3000一倍純化的發(fā)現(xiàn)(特異活性2.6×107u/mg)。從無培養(yǎng)上清液的血清中純化IL-4只要求在CM-瓊脂糖上的一個色譜層析步驟，結(jié)果得到40%和100一倍純化(特異活性3×107u/mg)。
在本發(fā)明中任何有IL-4活性并具有顯示出與成熟IL-4氨基酸順序同源的氨基酸官能團的區(qū)域的多肽，或這類多肽或其片段的衍生物是有用的。
盡管IL-4用于本發(fā)明是加強TNF細胞毒性，但IL-4的特定活性被認為是使細胞增殖。但是，這并不意味著排除其它測量特定活性的分析，例如基于對靶細胞的其它生物作用的方法。
Yokota等(1988)Immunol.Rev102137和Le等(1988)J.Biol.Chem.26310817-10823闡述了IL-4的物化性質(zhì)，來源于正常生物源的天然IL-4的由凝膠過濾測得的，計算分子量為約20，000-22，000Da，除去糖基時異電點約為6.7，帶有糖基的異電點為10.53，它易于被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。IL-4蛋白順序有129個氨基酸，其理論分子量為15，000道爾頓，該理論分子量接近于由SDS-PAGE測定的分子量15，000、18，000和19，000。凝膠過濾測得的分子量與SDS-PAGE所測得分子量不同之處是通過碳水化合物部分計算。
重組體IL-4的計算分子量由凝膠過濾測得的約22，000道爾頓，由SDS-Page測得的約15，000，其異電點為約10.53，它易于被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。
它在4℃下可在多于3個月內(nèi)穩(wěn)定，在室溫下于1個多月內(nèi)穩(wěn)定，在56℃下約穩(wěn)定10分鐘。IL-4在寬的pH范圍(2-10)穩(wěn)定。由于人IL-4可作用于鼠細胞上，故IL-4無種族特異性，但鼠IL-4是種族特異性的。
使多肽屬于IL-4定義范圍里的同源氨基酸程度視候補蛋白和IL-4屬于或不屬于IL-4對細胞毒性活性應(yīng)答的區(qū)域是否是同源而定。細胞毒性活性的臨界區(qū)域應(yīng)當有高度的同源性以符合定義，然而順序與保持IL-4構(gòu)象無關(guān)或不影響相對低同源性的受體。另外，若含功能相似的氨基酸付鏈被取代，臨界區(qū)域可存在溶細胞活性且仍保持這里所定義的同源性。功能相似是指副鏈的顯性特征，如堿性、中性或酸性，或是否有空間體積存在。
在建立多肽作為IL-4的最充分的因素是抗血清的能力，它能基本中和IL-4的生物活性，也就是基本中和所討論的多肽的生物活性。但是，據(jù)認為免疫同一性和細胞毒性同一性不一定要共存。由于中和抗體正好不與在其臨界生物活性的IL-4特定點上定向結(jié)合，故對于IL-4的中和抗體不與候補蛋白結(jié)合?？纱娴氖?，抗體可結(jié)合至無害區(qū)域并通過空間障礙發(fā)揮作用。因此，在此無害區(qū)域突變的候補蛋白可能不再與中和抗體結(jié)合，但就其基本同源性和生物活性而言它是IL-4。
觀察從外周淋巴細胞所得的或?qū)τ谔烊活怚L-4建立細胞系培養(yǎng)所得的天然或野生型成熟IL-4的諸如分子量、異電點之類的特征是很重要的，前面所定義的IL-4也包括未顯示的天然IL-4的所有特征的其它種類。既然這里所定義的IL-4包括天然IL-4，那么其它相關(guān)的細胞毒性的多肽也屬于定義范圍中。例如，像插入突變體，刪除突變體或熔合蛋白的TNF衍生物使IL-4超越了為天然IL-4所建立的分子量(帶有成熟IL-4的熔合蛋白及插入突變體的分子量大于天然成熟的IL-4，而天然成熟IL-4刪除突變體的分子量較低)。相似地，可以操縱IL-4以減少或消除被胰蛋白或其它蛋白酶水解的易變性。
本發(fā)明的組合物可用一種或多種多肽以非活性的形式而被使用，通過酶水解可從非活性狀態(tài)源轉(zhuǎn)化成酶原再成為有所需生物活性的多肽片段。典型的，非活性前體是熔合蛋白，其中一種或多種IL-4、TNF和/或IFN-g通過肽骨架在其羧基末端連接人體蛋白或其片段，或者直接或間接地連接至本發(fā)明中的另一種多肽上。選骨架羧基末端處與人體蛋白或其片段相連。選擇該肽骨架或肽骨架附近的順序以使其在體內(nèi)或有人工制造部分的體外易于進行蛋白水解以釋放出IL-4、腫瘤壞死因子及IFN-g。這樣形成的組合物表現(xiàn)出特定所需的細胞毒性活性。
既然IL-4通常意指人體IL-4，那么來源于鼠、豬、馬或牛的IL-4也包括于IL-4的定義中，只要它能同樣滿足上述同源區(qū)帶及細胞毒性活性的標準即可。
IL-4的多種形式也可用于本發(fā)明中。
IL-4的衍生物包括于術(shù)語IL-4的范圍中。衍生物包括氨基酸順序突變體、糖基化變體及與其它化學(xué)部分共價或聚合配對物。用已知方法將官能團連接至在IL-4氨基酸的側(cè)鏈上的基團上或在N-或C-末端的基團上從而制得共價衍生物。
與TNF相比，突變體IL-4衍生物包括可用于本發(fā)明的預(yù)定的(即位點特定)的IL-4突變或其片段。突變體IL-4被定義為對IL-4同樣定義同源的多肽，但其氨基酸順序與是否經(jīng)過刪除、取代或插入的IL-4順序不同。在已知順序的DNA預(yù)定位點上進行取代突變的技術(shù)也是已知的，例如M13初級誘變。
基本同型的IL-4或腫瘤壞死因子表示來源的天然蛋白已被分離掉的基本無其它天然蛋白的IL-4或腫瘤壞死因子。這表示同型IL-4和/或腫瘤壞死因子基本上無血漿蛋白，諸如白蛋白、纖維蛋白原、血清蛋白酶、α-球蛋白、諸如淋巴毒素或干擾素的非腫瘤壞死因子細胞毒性多肽，或其它作為合成多肽原料的其它細胞或器官的蛋白質(zhì)，包括全細胞及部分細胞碎片。但是，基本純的多肽可以包括下述作為穩(wěn)定劑和賦形劑的物質(zhì)，預(yù)定量的作為合成原料的來自細胞或器官的蛋白質(zhì)，來自除原始多肽源外的細胞或器官的蛋白質(zhì)以及諸如聚-L-賴氨酸的合成多肽。
在異基團，例如細菌、宿主細胞中表達的重組體或腫瘤壞死因子完全不表達基因源蛋白質(zhì)。
用于本發(fā)明的IL-4和TNF較好地通過該領(lǐng)域已知的方法在重組體生物的培養(yǎng)中合成。
通過使腫瘤壞死因子及有所需純度的IL-4與生理學(xué)上可接受的載體，即在使用的劑量與濃度時無毒的載體相混合而制得本發(fā)明的組合物。一般來說，這必須將IL-4和TNF的本發(fā)明組合物與緩沖液、諸如抗血壞酸的抗氧劑、低分子量多肽(少于10個殘基)、蛋白質(zhì)、氨基酸、包括葡萄糖或右旋糖的碳水化合物，諸如EDTA的螯合劑以及其它穩(wěn)定劑和賦型劑相混合。配制載體以穩(wěn)定組合物。用作治療的組合物必須進行消毒。這通過消毒過濾膜過濾而容易地進行。組合物一般以凍干形式貯存。
另外，由于干擾素與IL-4和腫瘤壞死因子起協(xié)同作用，故α-、β-或γ-干擾素可與TNF/IL-4組合物或IL-4TNF和含淋巴毒素的組合物相合并。TNF的特定活性為約100U/ng。IL-4和IFN-g的特定活性為約10U/ng。典型的配方包括IL-4和或IFN以及腫瘤壞死因子和/或淋巴毒素，其單位活性比例為0.11-2001，一般為10-1，它可含有淋巴毒素來代替部分或全部的腫瘤壞死因子，當然，這些比例在治療時要進行改變。
給患腫瘤的動物使用IL-4/TNF。根據(jù)已知方法進行使用，例如，靜注、腹腔內(nèi)注射、肌注、患處浸或注入消毒的IL-4/TNF溶液，或通過下面所注出的定時釋放系統(tǒng)。IL-4/TNF可在患處給藥，即直接注入固體腫瘤中。對于諸如白血病的擴散腫瘤，較好地通過靜脈或淋巴系統(tǒng)給藥。諸如胰腺癌的腹部器官的腫瘤有利地用腹膜滲析設(shè)備及腹膜相容的溶液通過腹腔內(nèi)浸注進行治療。但是一般來說，雖然大量注射是允許的，但IL-4/TNF通過浸注而被連續(xù)給藥。
IL-4/TNF從可植入的定時釋放物品中給藥。適用于分子量為腫瘤壞死因子二聚體或三聚體蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的例子包括L-谷氨酸和α-乙基-L-谷氨酸酯(U.Sidman，等1983，“Biopolymers”22(1)547-556)，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer，等，1981，“J.Biomed.Matter.Res.”15167-277和R.Langer，1982，“Chem.Tech.”1298-105)或乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等，同上)。該物品插入腫瘤處的開刀處。可替換的是，將IL-4/TNF裝入半滲透性的微膠囊內(nèi)或脂質(zhì)體內(nèi)以注射到腫瘤內(nèi)。這種給藥模式對于不可手術(shù)切除的腫瘤，如腦腫瘤尤為有用。
通過給患腫瘤的個體使用TNF和IL-4的本發(fā)明治療腫瘤細胞的方法是將這些多肽協(xié)同使用并按順序給藥。該技術(shù)領(lǐng)域人員已知通過給個體使用任何一種多肽然后再使用第二種多肽來模擬協(xié)同給藥的效果。這類按順序給藥的時間選擇對該技術(shù)領(lǐng)域人員來說是顯而易見的，它只視第一次服用的多肽在體內(nèi)的降介率而定。
使用IL-4/TNF組合物的量要根據(jù)，例如使用途徑、腫瘤情況及病人情況而定?；继巸?nèi)注射IL-4/TNF的用量少于靜脈輸液所需的量，而一些腫瘤類型，如固體腫瘤對TNF的耐藥性比其它腫瘤，如白血病的耐藥性大。因此，必須對治療者微調(diào)劑量并按需要改進給藥途徑以得到對靶腫瘤的最佳細胞毒性活性，如通過腫瘤的活組織檢查或用諸如癌胚胎抗原的推定的腫瘤標記的診斷分析來檢測，根據(jù)重組體的毒性來評算其劑量。一般來說，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在鼠體內(nèi)的腫瘤壞死因子劑量(靜脈注射直至約120mg/kg體重/天)基本是無毒并有效的。已發(fā)現(xiàn)IL-4的劑量(靜脈注射直至約120ng/kg體重/天)在鼠體內(nèi)基本無毒并有效的。
據(jù)信腫瘤壞死因子在其細胞毒性活性上無種族特異性，結(jié)果非人體腫瘤壞死因子的腫瘤壞死因子，如來自?；蜇i的腫瘤壞死因子可用于本發(fā)明組合物中以治療人體腫瘤。但是，需要用來自同種的腫瘤壞死因子以避免產(chǎn)生潛在的自身抗體。
這里列出所有的引用文獻供作參考。
對本發(fā)明作出總的闡述后，下面通過特定的實施例以作出更徹底的理解。這些實施例僅供闡述之用，除非作同樣說明外它們不用于限定本發(fā)明。
實施例1細胞的培養(yǎng)過程將所有的細胞系嚴格保持在匯合的培養(yǎng)基下，將細胞放在0.3-1.3×106細胞/25mm佩特里細菌培養(yǎng)器的DMEM培養(yǎng)基中，它用谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)及胎牛血清(10%)作營養(yǎng)物，在5%CO2的空氣下于潮濕孵化器中培養(yǎng)。
實施例2細胞毒性分析作為細胞毒性分析，將在0.1ml培養(yǎng)基中的5×103細胞放在96井的石板上。在5%CO2的空氣中的潮濕大氣壓下于37℃下孵化過夜，除去培養(yǎng)基，在0.1ml培養(yǎng)基中作出一系列的試驗樣品稀釋。在37℃下孵化72小時后，除去培養(yǎng)基，用如Sigarman等(1985)Science230943中所述的結(jié)晶紫色染色來監(jiān)測存活細胞。將試驗樣品存在下的光密度除去無試驗樣品存在時(培養(yǎng)基)的光密度乘100可計算出相關(guān)細胞的存活百分率。
實施例3放射受體分析如Aggarwal等(1985)Nature 318665所述進行受體結(jié)合分析。簡言之，將0.25×106細胞放大含0.2×106Cpm125I-TNF的0.2ml新鮮冰冷培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)的12×75mm聚丙烯試管中于100-倍過量的不能標記TNF存在下(非特定結(jié)合)?；蛩鼈儾淮嬖跁r(總結(jié)合)進行孵化。在4℃下孵化60分鐘后，除去培養(yǎng)基，細胞通過離心洗滌三次，測定細胞結(jié)合的放射活性。所有測定重復(fù)三次。
實施例4IL-4增加TNF的抗增殖作用當對不同腫瘤細胞類型進行試驗時，IL-4增加了TNF的抗增殖作用。對乳腺腫瘤細胞系、MDA-MB330檢查只用種種濃度的TNF或與固定濃度IL-4(100ng/ml)合并的種種濃度TNF的作用。結(jié)果如圖1所示。如實施例1所述來檢測5×103細胞在含指定量細胞分裂來的0.1ml培養(yǎng)基中接著孵化72小時后細胞的存活性。所有測定重復(fù)三次。
只用TNF，即使其濃度高達10，000U/ml對這些細胞僅有極少影響。但當IL-4加至含有TNF的培養(yǎng)基中時，這些細胞的生長以劑量依賴的方法而被抑制了。如圖1所示。在10，000U/ml濃度下僅觀察到10%細胞生長抑制。但是，當再加入100ng/ml IL-4時，腫瘤細胞生長抑制增加至近60%。在諸如外陰癌細胞(A431)和組織淋巴細胞(N-937)的其它細胞類型中也可觀察到TNF的細胞毒性作用被IL-4所加強。圖2表示不同濃度的TNF和IL-4(100ng/ml)對人體上皮癌細胞系(A-431;上冊)及人體組織淋巴細胞系(U-937，下冊)的相關(guān)細胞存活性的影響。將0.5×103細胞放在含有指定量的細胞分裂素的0.1ml培養(yǎng)基中孵化72小時，然后根據(jù)實施例1所述來檢測細胞存活性。
圖2表明在低達0.01U/ml細胞分裂素濃度下可觀察到IL-4對A431細胞(上冊)的TNF-依賴的生長修飾的充分影響。
在高濃度(1000U/ml)下甚至對U-937細胞(下冊)IL-4可增加TNF的細胞毒性影響。
種種濃度的IL-4對固定濃度TNF(1000U/ml)的作用也被研究了。將5×103細胞與指定濃度的細胞分裂素在0.1ml培養(yǎng)基中孵育72小時，然后如實施例1所指出的那樣測定細胞存活性。所有測定重復(fù)三次。圖3表明種種濃度IL-4對1000單位/ml TNF時A-431(上冊)和MDA-MB-330(下冊)細胞系的作用。也顯示了只用單劑量IL-4(1μg/ml)的作用。A-431細胞(下冊)在IL-4和TNF兩者的存在下以劑量依賴方法受到抑制，只用IL-4即使在1μg/ml濃度下也是無效的。用乳腺腫瘤細胞(低部位觀察到IL-4相似的劑量依賴應(yīng)答)。
實施例5IL-4和IFN-g加強TNF細胞毒性的比較前面已表明干擾素-g也增加TNF的細胞毒性作用。(美國專利第4，650，674，Lee(1984)J.Immunol.1331003;Sugarman(1985)Science 230943;Aggarwal等(1985)Nature 318665;Vilcek等(1986)腫瘤壞死因子和干擾素之間的相互作用。干擾素系統(tǒng)的生物學(xué)，Schellekenes和W.E.Steware編輯.Elsevier科學(xué)出版社，Amsterdam.，第249頁;Fransen等.(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22419-426;Campbell等(1988)J.Immunol.1412325-2329;Scgukker(1987)Cancer Res.472809-2813;Tsujimoto.(1986)J.Immunol.1372272-2276).圖4表明IL-4和IFN-g對TNF依賴的對MDA-MB-330細胞的作用比較。使5×103細胞在含不同濃度TNF和IL-4(100ng/ml)或IFN-g(100ng/ml)的0.1ml培養(yǎng)基中孵化72小時，然后如實施例1所述檢測細胞的存活性。所有的測定重復(fù)三次。
為了決定IL-4和IFN-g是否是通過相似的機理來加強TNF的細胞毒性作用，比較IL-4和干擾素-g對TNF抗增殖應(yīng)答的加強，結(jié)果如圖4所示，它表明對乳腺腫瘤細胞同樣濃度(100ng/ml)的IL-4和IFN-g以相似的程度增加TNF的生長抑制作用。觀察到約60-70%細胞的生長抑制。用A-431和N-937細胞可觀察到相似的結(jié)果(表Ⅰ)。
表Ⅰ白細胞介質(zhì)-4和干擾素γ對依賴TNF的對種種人體腫瘤細胞系抗增殖作用的影響相關(guān)的細胞存活率(%)細胞介素 MDA-MB- A-431 U-937330無 100 100 100TNF 80 71 89IL-4 103 86 104IFN-g 82 69 104
TNF+IFN-g 42 33 50TNF+IL-4 51 45 64TNF-g+IL-4 60 48 89TNF+IFN-g+IL-4 38 20 41將5×103細胞放在含有TNF(200ng/ml)或IL-4(100ng/ml)或IFN-g(100ng/ml)或如上所指出的與細胞分裂素合并的0.1ml體積培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。對于A-431細胞而言，除了IFN-g為(1hg/ml)外所有細胞分裂素的濃度相同。與細胞分裂素一起孵育72小時后，如實施例1所指出的通過結(jié)晶紫染色來檢測細胞的存活性。
雖然IL-4的增長程序與TNF的不同，但IL-4也明顯地增加IFN-g的抗增殖作用。此外，所有三種細胞分裂素合并在一起可達到最大效能。例如，當對A431細胞試驗時，用TNF只觀察到30%細胞生長抑制，當IL-4和TNF加在一起時55%細胞生長抑制，當三種細胞分裂素一起存在時IFN-g、IL-4和TNF存在時，80%細胞生長抑制(表Ⅰ)。
這些結(jié)果表明IFN-g增加TNF的細胞毒素應(yīng)答的機制與IL-4是不同的。為了進一步表明IL-4和IFN-g對TNF的加強機理是不同的，測定兩種細胞介素對TNF受體誘導(dǎo)作用。已知IFN-g可誘導(dǎo)TNF受體，表Ⅱ所示的結(jié)果明確指出將U-937細胞對IL-4預(yù)暴露過夜不增加TNF的特定結(jié)合，它揭示對新受體不增加協(xié)同作用。因此，IL-4加強TNF與IFN-g的機理是不同的。
表Ⅱ白細胞介質(zhì)-4對腫瘤壞死因子結(jié)合至U.937細胞上的影響處理 總結(jié)合 非特異性結(jié)合 特異結(jié)合(每分鐘計數(shù))無 1271+20 264+43 1007IL-4 1203+50 277+25 926將U937細胞用IL-4(1μg/ml)在37℃下處理24小時。然后用培養(yǎng)基洗滌。在4℃下將250，000細胞在含0.2×106Cpm的125I-TNF的0.2ml培養(yǎng)基中在100nm未標記TNF存在或無其存在下的孵化。此后，洗滌細胞并如實施例2所述來測定細胞結(jié)合放射活性。所有測定重復(fù)三次。
當只加入IL-4時會引起某些細胞增殖。如表Ⅲ所示，IL-4對乳腺腫瘤細胞系ZR-75-1比對照增加了40%的生長。用其它細胞系也可觀察到細胞增殖作用，但其程度較小。通過IL-4可稍微抑制A-431細胞的生長(表Ⅱ)。這些IL-4生長刺激作用被發(fā)現(xiàn)是劑量依賴性的。
表Ⅲ通過白細胞介質(zhì)-4來調(diào)節(jié)種種人體腫瘤細胞的生長細胞類型 相關(guān)的細胞存活(%)ZR-75-1(乳腺腫瘤) 140MDA-MB-4GS(乳腺腫瘤) 130HS-OS7ST(乳腺腫瘤) 132BT-20(乳腺腫瘤) 110MCF-7(乳腺腫瘤) 125A-375(黑色瘤) 120
MDA-MB-330(乳腺腫瘤) 110A-431(外陰癌) 86U-937(組織細胞淋巴癌) 110將5×103細胞與白細胞介素-4(1μg/ml)一起孵化72小時，然后根據(jù)實施例1通過結(jié)晶紫染色測定相關(guān)的細胞存活性，所有的測定重復(fù)三次。
實施例6通過IL-4增加淋巴因子的抗增殖作用當用細胞介素-4對腫瘤細胞進行試驗時它可增加淋巴因子(Lt)的抗增殖作用。將單獨使用比(1000U/ml)或與IL-4(1μg/ml)結(jié)合使用的對乳腺腫瘤細胞素，MDA-MB330抗增殖作用與單獨用TNF(1000U/ml)或與IL-4(1μg/ml)結(jié)合使用的抗增殖作用相比較。接著將5×103細胞于含指定量細胞毒素的0.1ml培養(yǎng)基中孵化72小時，如實施例1所述來檢測細胞的存活性，所有測定重復(fù)三次。結(jié)果如圖5所示。
單獨使用TNF對這些細胞僅有最小的影響，只抑制5%的細胞生長，單獨使用Lt對這些細胞稍有增殖作用，只有IL-4存在時細胞的存活率達95-98%。但是，將IL-4加至帶有TNF或Lt的培養(yǎng)物中，明顯抑制了這些細胞的生長。如圖5所示，在IL-4和TNF存在下，對腫瘤細胞的抑制增長為約60%，在IL-4和Lt存在下，其上升為40%。
尚不了解IFN-g加強TNF應(yīng)答的機理。已知IFN-g對TNF細胞毒性作用上調(diào)伴隨著TNF受體上調(diào)(Aggarwal等(1985)Zature 318665;Vilcek等(1986)The Biology of the Interferon System，等249頁)。但是，我們的研究顯示IL-4不能上調(diào)被作用細胞上的TNF受體。即使這些觀察指通過已知IL-4增加TNF應(yīng)答的機制與IFN-g的不同，業(yè)已報道即使IFN-g上調(diào)TNF受體也不是協(xié)同細胞毒性應(yīng)答的充分理由(Tsujimoto，等(1986)J.Immunol.13722722276;Aggarwal等(1987)J.Biol.Chem.26210000-10007)。我們的觀察也表明IFN-g加強IFN-g加強TNF和IL-4的應(yīng)答。因此，可能這兩種試劑通過各自的機理發(fā)揮作用。已知IL-1也可增強TNF的細胞毒性作用(Ruggiero and Baglioni(1987)J.Immunol.1380661-0663;Holtmann和Wallach(1987)J.Immunol.1391161-1167)。因此，IL-4加強TNF作用的機理也是不清楚的。與IFN-g相反，IL-1已表明對TNF受體有向下調(diào)節(jié)作用。除細胞介素外，諸如蛋白合成抑制劑的其它試劑及溫度升高都能增加TNF依賴的細胞毒性(Watanabe，等(1988)Cancer Res.48650-653;Niitsu，等(1988)Cancer Res.48654-657)。用蛋白質(zhì)合成抑制劑試驗意指TNF誘導(dǎo)某些可以保護細胞不受TNF細胞毒性作用影響的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。(Himeno等(1990)Cancer Res.504941-4945;Watanabe，等(1988)Immunopharmacol.Immunotoxicol.10479-499).已知上皮生長因子和轉(zhuǎn)移生長因子都可抑制TNF對一些細胞類型的抗增殖作用。(Sugarman等(1987)Cancer Res.47780-786)已知這些生長因子由種種腫瘤細胞所產(chǎn)生。因此，可能IL-4通過抑制這些生長因子和合成而發(fā)揮作用。也可能IL-4通過向下調(diào)節(jié)已知與細胞增殖的C-fos和C-myc致癌基因的表達而發(fā)揮作用。
對于TNF、IFN-g和IL-4的受體的cDNA最近已被克隆(Idzerda等(1990)J.Exp.Mde.171861-873;Schall等，(1990)Cell 61361-370;Loetscher等(1990)Cell61351-359;Smith等，(1990)Science 2481019-1023;Auget等，(1988)Cell 55273-280)但是，這些受體的結(jié)構(gòu)表明受體本身不足以進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已知IL-4可向下調(diào)節(jié)巨噬細胞形成TNF(Essner等(1989)J.Immunol.1423857;Hamilton，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863803)。但也報道IL-4可增加巨噬細胞調(diào)節(jié)細胞活性Somers和Erickson(1989)Cell Immunol.122178-187)。后者已顯示出TNF的初步應(yīng)得物(Feinman等(1987)J.Immunol.138635-640)。因此，尚不清楚TNF的產(chǎn)生抑制如何伴隨著IL-4增加巨噬細胞的細胞毒性?？赡躀L-4增加巨噬細胞對腫瘤細胞的毒性是通過這里所述的TNF和IL-4的共同協(xié)同作用，現(xiàn)已顯示IL-4形成腫瘤細胞在體內(nèi)對其它腫瘤有抗腫瘤活性(Tepper等(1989)Cell 57503-512)。由于只用IL-4對在培養(yǎng)基中的腫瘤細胞不直接產(chǎn)生抗增殖作用，現(xiàn)尚不了解IL-4作為體內(nèi)抗腫瘤劑的機理?？赡苁峭ㄟ^活化巨噬細胞及加強TNF的抗腫瘤作用而使IL-4作為抗腫瘤劑。
該技術(shù)領(lǐng)域人員應(yīng)懂得，本發(fā)明極適合完成上述目的并得到上述的優(yōu)良結(jié)果。這里所述的組份、方法、過程及技術(shù)僅代表較好的實例，僅供例舉用而不能用來限定本發(fā)明的范圍。該技術(shù)領(lǐng)域人員對其作出的改進及其它用途也包括于本發(fā)明的精神及附上的權(quán)利要求書所定義的范圍。
權(quán)利要求
1.一種適合治療腫瘤細胞的無細胞組合物，其特征在于它包括腫瘤壞死因子和白細胞介質(zhì)-4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其中所述的腫瘤壞死因子是人體腫瘤壞死因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于其中所述的IL-4是人體白細胞介質(zhì)-4。
4.一種適合治療腫瘤細胞的無細胞組合物，其特征在于它包括腫瘤壞死因子、白細胞介質(zhì)-4及干擾素。
5.一種適合治療腫瘤細胞的無細胞組合物，其特征在于它包括淋巴因子和白細胞介質(zhì)-4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于其中所述的白細胞介質(zhì)-4是人體白細胞介質(zhì)-4。
7.一種適合治療腫瘤細胞的無細胞組合物，其特征在于它包括淋巴因子、白細胞介質(zhì)-4及干擾素。
8.一種治療腫瘤細胞的方法，其特征在于它包括使用權(quán)利要求1-7中的任一種組合物，包括給患腫瘤動物使用治療腫瘤有效量的組合物。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種包括腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介質(zhì)-4(IL-4)的組合物，該組合物以依賴劑量的方式抑制人體乳腺腫瘤細胞、人體外陰癌細胞及人體組織淋巴瘤細胞的生長。當人體乳腺癌細胞只露于TNF或IL-4時，很少能影響其生長特性。但是，將這兩種細胞介素合并在一起，它們就可按劑量依賴方式抑制這些細胞的生長，另外，干擾素-gamma(IFN-g)進一步可加強TNF和IL-4組合物的抗增殖作用。
文檔編號A61K38/21GK1060788SQ9110942
公開日1992年5月6日 申請日期1991年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月1日
發(fā)明者巴萊特·阿加瓦爾 申請人:研究發(fā)展基金會