專利名稱：改良的寡糖結(jié)合菌苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備寡糖結(jié)合菌苗的改良方法。本發(fā)明的另一方面是制備對莢膜多糖引起專一特異性和同種免疫反應(yīng)的寡糖菌苗。本發(fā)明的具體實施方案提供這樣的菌苗，它能誘導對肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)一些流行的血清型的免疫力，在兒科病人及老年人和因體弱或疾病而免疫力降低者(包括例如愛滋病人)上使用可能特別重要。
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)是革蘭氏陽性有莢膜球菌，常成對或成短鏈狀生長。在雙球形中，吡鄰的邊緣是圓形的，相對的兩端稍突出，使該有機體呈柳葉刀形。
根據(jù)形成莢膜的復雜多糖，可將肺炎球菌分成若干血清型。通過諾費爾德反應(yīng)(Neufeld quelling reaction)，暴露于型特異的抗血清中，可鑒別出84種血清型。它們對人類全都致病，而第1、3、4、7、8或12型在臨床實踐中最為多見。第6、14、19和23型常引起兒童肺炎和中耳炎，而在成人則不常見(Austrian，1983，in“Harrison's Principles of Internal Medicine”，Petersdorf et al.，eds.，10th Edition，McGraw Hill Book Co.，New York pp.918-922).值得注意的是，肺炎球菌是引起兒童肺炎、敗血癥和腦膜炎的三個主要致病原之一(McMillan，1982，in“Core Textbook of Pediatrics，Kaye et al.，eds.，Second Edition，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，p.498).
在發(fā)生肺炎球菌感染危險中處于高出平均水平的人包括有慢性全身性疾病的患者，如心臟病、慢性支氣管肺部疾患、肝病、腎功能不全和惡性腫瘤。建議這些人接種菌苗以抗肺炎球菌感染。為此目的，可采用23種菌苗，包括肺炎球菌1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F型(它包括在美國和世界其它地方與90%嚴重肺炎球菌性疾病的發(fā)生有關(guān)的血清型或群)的莢膜多糖(Pneumovax Merck，Sharpe & Dohme，and Pnu-Immune ，Lederle實驗室)。對于兒童，此菌苗的效能不可靠，因為小于6歲的兒童，對各種莢膜抗原的免疫反應(yīng)性在不同時間的發(fā)展是免疫系統(tǒng)成熟特征的結(jié)果。保護作用可比在成人中觀察到的時間短(Harrison等，同上)。雖然據(jù)信與大多數(shù)兒童肺炎球菌感染有關(guān)的肺炎球菌血清型較少(Gray et al.，1979，J.Infect.Disease 140979-983)，但它們包括了對用作菌苗的純化莢膜多糖起反應(yīng)的人類抗體成熟最慢的那些型(Anderson and Betts，1989，Pediatric Infec.Dis.J.8S50-S53;Borgono et al.，1978，Proc，Soc.Exp.Biol.Med.157148-154)。
通過將流感嗜血桿菌b(Haemophilus influenzae b)莢膜抗原偶聯(lián)到載體蛋白上產(chǎn)生“結(jié)合”菌苗，獲得了人嬰兒對流感嗜血桿菌的免疫反應(yīng)性，據(jù)信T淋巴細胞輔助效應(yīng)由載體蛋白誘導而來，并與免疫力的產(chǎn)生有關(guān)(Robbins et al.，1984，in“Bacterial Vaccines，“Germanier，ed.Academic Press，New York，pp.289-316)，又見Cruse & Lewis，1989 in“Conjugate Vaccines”eds.Cruse & Lewis，Karger，Basel，pp.1-10。同樣的手段被用來產(chǎn)生肺炎球菌菌苗。
許多研究者分離和提純了完整的莢膜聚合物，它們在菌苗方面或作為菌苗可能是有用的。例如，美國專利No.4，220，717介紹了從流感嗜血桿菌b(H.influenzae b)的莢膜聚合物分離和提純免疫活性磷酸多核糖基核糖酯(PRP)的方法。此外，美國專利No.4，210，641介紹了流感嗜血桿菌(H.influenzae)多糖提取物，其表觀分子量大于200，000道爾頓，主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，并含少量糖胺。
一些研究者將這些和其它完整莢膜聚合物用在制劑中以獲得較好的免疫學反應(yīng)。例如，美國專利No.4，196，192公開了含提純的完整PRP和全細胞百日咳桿菌(Bordetella Pertussis)菌苗制劑。增加免疫原性的這一方法導致年輕哺乳動物抗PRP和抗百日咳桿菌抗體的水平增高。
載體蛋白不僅可增強結(jié)合的莢膜聚合物的免疫原性，它們還可在免疫原性上幫助半抗原。半抗原定義為能特異性地結(jié)合抗體或淋巴細胞受體但本身不能誘導免疫反應(yīng)的分子(即它們是無免疫原性的)。為了引起免疫反應(yīng)，被稱作半抗原的小/低分子量或弱免疫原分子一般必須先偶聯(lián)到大分子或載體上，這種大分子通常是異種蛋白。將半抗原-載體復合物注射到動物體內(nèi)，使B淋巴細胞的抗體生成量提高，此中一些抗體可特異性地與未偶聯(lián)的游離半抗原分子結(jié)合。
最早被研究的半抗原有偶氮染料化合物，如苯胺和鄰-氨基苯甲酸。Landsteiner和Lampl(1918，Z.Immun.Forsch)26293)通過重氮化作用將這些化合物和血清蛋白結(jié)合。家兔注射這些人工制備的偶氮蛋白質(zhì)時，產(chǎn)生沉淀的抗體，該抗體對附著的化學基團有特異性。
半抗原化合物的其它例子為二硝基苯酚和麥角酸二乙酰胺。二硝基苯酚是以二硝基苯基(DNP)偶聯(lián)于牛血清白蛋白或牛γ-球蛋白(BGG)而成為免疫原的?，F(xiàn)已證明甚至甲醛也可作為半抗原，暴露于來自產(chǎn)品或?qū)嶒炇抑屑兹┱羝娜耍谒麄凅w內(nèi)的內(nèi)源性大分子甲?；?，就變得對該化合物“敏感”了。
半抗原行為不限于有機小分子，直至胰島素那樣大小的多肽激素，即使有免疫原性，也常常是很弱的。為了獲得對這些激素的高抗體滴度，必須將它們連接到載體分子上(或通過很多這種多肽分子交聯(lián)在一起而產(chǎn)生較大的分子)。
載體分子的介入特別有趣之處在于載體遠不止僅起轉(zhuǎn)運作用。Ovary和Benaceraff(1963，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.114723)通過給家兔注射二硝基苯基-卡介苗(DNP-BCG)而證明了這點。很多免疫原物質(zhì)注入動物，可產(chǎn)生對這種暴露的免疫“記憶”。當以后給予第二次注射時，即有強烈得多的免疫反應(yīng)。確實，當Ovary和Benaceraff再次注射DNP-BCG時，有一種強的繼發(fā)反應(yīng)，導致抗DNP和BCG的抗體水平均明顯地升高。但是，用DNP-蛋清蛋白代替進行第二次注射時，觀察到弱得多的抗DNP抗體反應(yīng)。反應(yīng)的這種差異是由于被稱作載體效應(yīng)的作用，并且似乎涉及輔助T淋巴細胞。
初步證據(jù)表明，所有蛋白對于某一半抗原來說可能不是等效的載體蛋白。Robbins等(Infect.Immun.40245-256)提出了實驗性蛋白-多糖結(jié)合疫苗的資料，在該資料中，相同的多糖半抗原被結(jié)合到不同的蛋白質(zhì)載體上，而且對半抗原的抗體應(yīng)答是定量的。在生成的抗半抗原抗體的量上注意到了明顯的差異，表明對載體的主要作用。
Lin和Lee(1982，Immunology 46333)特別就肺炎球菌菌苗，研究了暴露于6A型和19F型多糖及結(jié)合在蛋白上的19F型的成年和年輕小鼠的免疫應(yīng)答。在接受19F多糖-蛋白結(jié)合物的小鼠上誘導出比只接受19F多糖的對照組高得多的IgM和IgG2抗體滴度。
在借助所謂“載體效應(yīng)”來提高抗體生成的一項努力中，其他研究者研究了莢膜聚合物和載體蛋白的結(jié)合。例如Schneerson等(Journal of Experimental Medicine 152361-376(1980)描述了流感嗜血桿菌b(H.influenzae b)聚合物-蛋白結(jié)合物，此結(jié)合物被揭示可給予機體對流感嗜血桿菌b所致侵襲性疾病的免疫力。該文獻證明在嬰兒體內(nèi)與年令有關(guān)的莢膜聚合物的免疫行為，并尋求用完整莢膜聚合物與各種蛋白[包括血清白蛋白、鱟血蘭蛋白(Limuluspolyphemus hemocyanin)和白喉毒素]的結(jié)合來克服這種年令依賴性。結(jié)合的方法涉及使用偶聯(lián)劑，如己二酸二酰肼。
Geyer等(Med.Microbiol.Immunol.165171-288(1979))用還原胺化反應(yīng)制備了某些肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)莢膜多糖片斷與硝基苯基乙胺偶聯(lián)劑的結(jié)合物，然后用偶氮偶聯(lián)反應(yīng)將此衍生的糖附著在蛋白質(zhì)上。
McIntire 1974年5月9日申請的美國專利No.4，057，685介紹了通過和鹵?；u化物反應(yīng)而共價偶聯(lián)于蛋白質(zhì)抗原的減毒大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)脂多糖。
由Jennings等于1981年5月27日申請，1982年10月26日公告的美國專利No.4，356，170介紹了用還原胺化反應(yīng)制備多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物。
Anderson(1983，Infection and Immunity 39233-238)介紹了從流感嗜血桿菌b莢膜多糖而來的寡糖和CRM197(一種無毒而抗原性上鑒定的白喉毒素的變種)之間的結(jié)合物。
Snippe等(1983，Infection and Immunity 42842-844)介紹了對肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型的半合成菌苗，其中從莢膜多糖S3經(jīng)部分酸水解而分離得到的己糖通過還原胺化偶聯(lián)到硬脂酰胺上，然后摻入脂質(zhì)體。在小鼠上觀察到所得的結(jié)合物/脂質(zhì)體菌苗誘導對肺炎球菌(S.pneumoniae)3型的保護作用。
由Tsay等在1983年3月14日申請，于1987年5月5日公告的美國專利No.4，663，160涉及這樣的細菌，其中從革蘭氏陽性桿菌來的去毒多糖借助4-12碳基團共價地偶聯(lián)到從同種革蘭氏陰桿菌來的去毒蛋白質(zhì)。
由Gordon在1984年1月5日申請，于1986年10月28日公告的美國專利No.4，619，828涉及在致病菌[如流感嗜血桿菌b(Haemophilus influenzae b)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)和埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)]而來的多糖分子和T細胞依賴性抗原(如白喉毒素和破傷風毒素)之間的結(jié)合物。
由Anderson和Clements在1984年8月10日申請，于1989年2月28日公告的美國專利No.4，808，700和由Anderson在1986年3月28日申請，于1988年8月2日公告的美國專利No.4，761，283涉及莢膜聚合物片斷和細菌毒素、類毒素或結(jié)合亞單位借助還原胺化反應(yīng)發(fā)生的共價結(jié)合。
由Porro等在1986年7月2日申請，于1987年12月8日公告的美國專利No.4，711，779涉及糖蛋白結(jié)合物菌苗，它具有三價免疫原活性，包含從革蘭氏陽性桿菌和革蘭氏陰性桿菌而來的莢膜多糖，以及CRM197、破傷風類毒素或百日咳毒素。
莢膜多糖半抗原偶聯(lián)于載體蛋白的結(jié)合菌苗的制備必須包括以下步驟(ⅰ)必須制備莢膜多糖，(ⅱ)如果使用多糖片斷，必須從完整多糖中將其分離出來，(ⅲ)糖類必須被激活，或使其能經(jīng)受結(jié)合作用，即必須產(chǎn)生能共價地結(jié)合到蛋白質(zhì)上的基團，(ⅳ)將糖類結(jié)合到蛋白質(zhì)上。
已有技術(shù)中已知的完成這四個步驟的各種方法列于表1。
表1
表1(續(xù))
本發(fā)明涉及用新穎的方法將得自細菌莢膜多糖的寡糖共價結(jié)合到載體蛋白上。
本方法以明顯快于目前所用方法的生成速率高效地合成糖結(jié)合物。本發(fā)明的糖結(jié)合物可用于菌苗制劑，并證明是免疫原性的。
在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及摻入得自肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖的寡糖的糖結(jié)合物的制備。本發(fā)明的方法導致肺炎球菌(S.pneumoniae)糖結(jié)合物高收益的高效制備，此種糖結(jié)合可用于特別與兒童群體有關(guān)的菌苗制劑，在此群體中主要疾病的大部分是與肺炎球菌(S.pneumoniae)感染有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)免疫原結(jié)合物比莢膜聚合物本身較少年令依賴性，有助于激活很幼小的溫血哺乳動物對各自的有莢膜細菌的全身感染的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的進一層意義上，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的糖結(jié)合物引起專一特異性的和同種的免疫反應(yīng)，這可有助地避免自身免疫反應(yīng)和有關(guān)的菌苗接種后綜合癥。
重要的是，本發(fā)明的免疫結(jié)合物不含有潛在的毒性偶聯(lián)劑，如用于將糖類結(jié)合到蛋白質(zhì)上的丁二酸二酰肼或?qū)?硝基苯乙胺。
本發(fā)明中涉及的縮寫詞的定義如下CRM197與白喉毒素在抗原性上有交叉反應(yīng)的無毒蛋白DMSO 二甲亞砜DP 聚合度MIC 最小抑制濃度SD 取代程度SIDEA 己二酸的琥珀酰亞胺二酯SIDES 丁二酸的琥珀酰亞胺二酯

圖1.寡糖-蛋白結(jié)合物合成的一般方案A.將高分子量多糖酸解以得到平均分子量為2.5×103的寡糖。
B.將寡糖(1)在pH9的條件下，與二氨基乙烷[H2N(CH2)2NH2]反應(yīng)而使之激活，用氫硼化吡啶還原，(2)在二甲亞砜(DMSO)中與己二酸的琥珀酰亞胺二酯(SIDEA)反應(yīng)。
C.將激活的寡糖通過賴氨酸殘基連接到載體蛋白上。
圖2.在連接過程中“特定”間隔物的使用A.如Porro等(Mol.Immunol.22907-917，1985)描述的較早的方法所生成的糖結(jié)合物，該方法系在寡糖和己二酸四碳鏈之間形成酰胺鍵(如箭頭所示)。間隔物的總長度約為10.4 。
B.按本發(fā)明所生成的糖結(jié)合物，其中，在寡糖和由SIDES反應(yīng)形成的丁二酸二碳鏈之間存在一個二碳殘基(如箭頭所示，由二氨基乙烷所形成)和一個酰胺鍵。間隔物的總長度約為10 。
C.按本發(fā)明所生成的糖結(jié)合物，其中，在寡糖和由SIDES反應(yīng)形成的己二酸四碳殘基之間存在一個二碳殘基(如箭頭所示，由二氨基乙烷所形成)和一個酰胺鍵。間隔物的總長度約為14.5 。
圖3.CRM197與激活的寡糖(含己二酸對丁二酸衍生物間隔物)的結(jié)合效能，結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(銀染色法)A.帶1分子量標準品(92.5K，66.2K，45.0K，31.0K，21.5K)帶2CRM197(1μg)參比物帶3帶有丁二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖6A-CRM197(1∶1比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶4帶有丁二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖6A-CRM197(1∶2比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶5帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖6A-CRM197(1∶2比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶6帶有丁二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖14-CRM197(1∶4比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)
帶7帶有丁二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖19F-CRM197(1∶4比例一元酯/CRM197的總氨基，無50%DMSO)帶8帶有丁二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖23F-CRM197(1∶2比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶9CRM197(1μg)參比物B.帶1CRM197(1μg)參比物帶2CRM197參比物(1μg，與帶1相比，不是同批的)帶3帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖23F-CRM197(1∶2比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶4分子量標準品(92.5K，66.2K，45.0K，31.0K，21.5K)帶5帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖23F-CRM197(1∶2比例一元酯/CRM197的總氨基，在50%DMSO中)帶6CRM197(1μg)參比物CRM197參比物(1μg，與帶1相比，不是同批的)帶7帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖6A-CRM197C.帶1分子量標準品(92.5K，66.2K，45.0K，31.0K，21.5K)帶2CRM197(1μg)參比物帶3帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖6A-CRM197帶4帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖14-CRM197帶5帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖19F-CRM197帶6帶有己二酸間隔物(2μg)的結(jié)合的寡糖23F-CRM197帶7分子量標示(92.5K，66.2K，45.0K，31.0K，21.5K)圖4.家兔免疫球蛋白G與肺炎球菌(S.pneumoniae)寡糖6A-CRM197結(jié)合物的反應(yīng)，誘導的對莢膜多糖同型IgG的親和力數(shù)值的抑制性酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析。
A.6A型莢膜多糖B.游離型或結(jié)合到CRM197上的6A型寡糖(DP10)C.被分子間隔物或結(jié)合到CRM197上而激活的14型寡糖(DP＝12)本發(fā)明涉及來自細菌莢膜多糖的寡糖共價連接到載體蛋白上，本發(fā)明的方法系經(jīng)新的步驟產(chǎn)生新的糖結(jié)合物。
為了揭示清晰而又不借助于限制手段，本發(fā)明的詳述分為以下幾部分(ⅰ)寡糖的制備(ⅱ)寡糖的激活(ⅲ)寡糖的與蛋白質(zhì)的結(jié)合(ⅳ)糖結(jié)合物的免疫化學特性(ⅴ)菌苗配制和用法(ⅵ)肺炎球菌寡糖結(jié)合菌苗的應(yīng)用(ⅰ)寡糖的制備高分子量莢膜多糖可購買成品(美國型培養(yǎng)收集物(ATCC)(Rockville，MD))或采用Porro等(1983，J.Biol.Stand.1165-71.)描述的方法而獲得，可以使用包括(但不限于)以下細菌的莢膜上發(fā)現(xiàn)的任一多糖，這些細菌為肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、Streptococcus mutans，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
可用各種方法(由特定莢膜聚合物的結(jié)構(gòu)特征決定)，從莢膜聚合物得到至少帶有一個還原端的抗原片斷。用過碘酸鹽(或相應(yīng)試劑)進行限制性氧化裂解可留下醛基末端，這一手段限于在非環(huán)狀殘基上具有鄰近的二羥基的聚合物。糖甙鍵的水解產(chǎn)生還原糖末端。這一水解過程可由糖甙酶的酶促反應(yīng)而最特異性地完成，但本申請將限于相對少的莢膜聚合物上，如肺炎球菌8((Streptococcus pneumoniae 8)，用于此類莢膜聚合物的糖甙酶是已知的。糖甙鍵的水解常用酸性水解。如果聚合物含對酸敏感的非糖甙鍵或如果聚合物含有在抗原特異性上重要的對酸敏感的側(cè)鏈，這一方法的應(yīng)用就受到限制了。
在本發(fā)明的具體實施方案中，肺炎球菌(S.pneumoniae)6A型莢膜多糖可在約10-2M乙酸中，在約100℃下水解約30小時;肺炎球菌14型莢膜多糖可在約0.5M三氟乙酸中在約70℃下水解約7小時;肺炎球菌19F型多糖可在約10-2M乙酸中在約50℃下水解約48小時;肺炎球菌23F型多糖可在約0.25M三氟乙酸中在約70℃下水解約3小時。
按照本發(fā)明，被結(jié)合到蛋白質(zhì)上的寡糖較佳地由3和6之間的重復單位(或約10和30之間的單糖殘基)所組成，更佳地由3和4之間的重復單位(或約15個單糖殘基)所組成，由于這一長度的寡糖摻入糖結(jié)合物中，已被證明是最適免疫原性的。
(ⅱ)寡糖的激活通過還原胺化方法，接著與二官能團分子(例如，但不限于，二酯)反應(yīng)，可使寡糖激活。圖1和表Ⅱ提出了本發(fā)明方法的概述，此概述將本發(fā)明的方法和Porro等(1985.Mol.Immunol.22907-919)描述的方法進行比較，請注意，用前一方法的激活時間是7-14天，而按本發(fā)明則縮短到15分鐘。還請注意，用前一方法的還原時間為7-14天，而按本發(fā)明則縮短到48小時。因此，本發(fā)明的完成所需要的時間比前一方法少12-26天。這是一個重要的優(yōu)點，因為糖類暴露在升高的溫度(例如50℃)中可導致降解。
表Ⅱ 肺炎球菌(S.pneumoniae)寡糖末端還原單位的化學激活參數(shù) 以前的方法 本方法導入基團 NH2NH(CH2)2NH2試劑(pH) 銨鹽緩沖液(9) 二氨基乙烷(9)激活溫度 50℃ 100℃激活時間 7-14天 15分鐘還原劑 氰基氫硼化鈉 甲硼烷吡啶還原溫度 50℃ 50℃還原時間 7-14天 48小時生成產(chǎn)物低聚-NH2低聚-NH(CH2)2NH2激活二官能團 SIDEA(己二酸的琥珀 SIDES或SIDEA(丁二間隔物 酰亞胺二酯) 酸或己二酸的琥珀酰亞胺二酯)反應(yīng)溫度 25℃ 4℃反應(yīng)時間 4小時 2小時生成產(chǎn)物低聚-NH-單酯低聚-NH(CH2)2NH-單酯反應(yīng)效率 25-30% 70%按照本發(fā)明的方法，寡糖末端還原單位是用含兩個氨基的分子進行還原胺化的。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，在約25-100℃溫度(以100℃為佳)下，在約pH9的0.2M KH2PO4緩沖液中，用10倍摩爾的過量二氨基乙烷溶液與一定摩爾量的寡糖反應(yīng)約1-60分鐘(以約15分鐘為佳)而完成還原胺化反應(yīng)之后，可加入相當于制劑中寡糖的摩爾濃度25倍的1摩爾量的甲硼烷吡啶，在約25-100℃之間(以約25℃為佳)，反應(yīng)進行約1-72小時(以約48小時為佳)。
然后可將還原胺化反應(yīng)所得的產(chǎn)物和二官能分子反應(yīng)，該分子的每個官能團均能與激活的寡糖的末端氨基和載體蛋白結(jié)構(gòu)上存在的氨基起反應(yīng)，這樣，二官能團分子就可起到連接寡糖和載體蛋白的作用。在本發(fā)明的一個最佳實施例中，二官能團為二酯(更特殊地為己二酸二酯)，它已被證明與蛋白質(zhì)更有效的糖基化作用有關(guān)。在本發(fā)明的一個最佳具體實施例中，經(jīng)歷了如上所述的還原胺化作用的寡糖再進一步與丁二酸(或更佳地為己二酸)的琥珀酰亞胺二酯進行反應(yīng);最好是在約0-25℃之間(優(yōu)選4℃)，在二甲亞砜(DMSO)溶液中，與摩爾濃度(按氨基計)相當于SIDEA(或SIDES)摩爾濃度1/5的胺化的寡糖進行約0.5-5小時之間(優(yōu)選約2小時)的反應(yīng)。然后可用1.4二噁烷(80% v/v)沉淀來收集激活的寡糖，上清液中還留下SIDEA(或SIDES)。
(ⅲ)寡糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合按照本發(fā)明，可被利用的蛋白質(zhì)包括可安全地給予年幼哺乳動物并可充當免疫學上有效的載體蛋白的任何蛋白質(zhì)。在特定的實施例中，細胞表面蛋白、膜蛋白、毒素和類毒素均可使用。安全性的標準包括無原有的毒性和最小的變態(tài)反應(yīng)危險。白喉和破傷風類毒素滿足這些標準，即經(jīng)合適的制備后，它們是無毒的，變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生率是可接受地低。盡管對成人，變態(tài)反應(yīng)的危險可以是明顯的，但對嬰兒，這種危險為最小。按照本發(fā)明的附加的特例，合適的載體蛋白包括(但不限于)沙門氏菌(Salmonella)鞭毛蛋白、嗜血桿菌(Hemophilus)纖毛、嗜血桿菌15KDa、28-30KDa和40KDa膜蛋白、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)熱不穩(wěn)定腸毒素LTB、霍亂毒素，以及包括輪狀病毒VP7和呼吸道合胞病毒F和G蛋白的病毒蛋白質(zhì)。
在“載體效應(yīng)”中，弱的抗原吸附到作為載體的較強的抗原(即異種蛋白)上，就變得比它單獨使用更具免疫原性。如動物先前被載體單獨免疫過，動物可處于“待發(fā)狀態(tài)”，不僅對載體抗原而且對附著的半抗原基團產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。常規(guī)地用破傷風和白喉類毒素對嬰兒進行免疫。從而，他們對以后給予的結(jié)合于這兩種類毒素中任一種的莢膜聚合物抗原將是“待發(fā)”的。
通常，任何異種蛋白均可作載體抗原。但是某些細菌毒素，如破傷風和白喉類毒素，在它們由兩部分組成這點上可能具有額外的優(yōu)勢，這兩部分之一(“結(jié)合”亞單位)對于哺乳動物細胞表面結(jié)合具有強的親和力?？梢韵胂?，結(jié)合在這樣一種“結(jié)合”蛋白上將使載體抗原更有效地引發(fā)免疫系統(tǒng)細胞的反應(yīng)。
有莢膜聚合物結(jié)合的載體蛋白可為天然毒素或去毒的毒素(類毒素)。又，借助比較新的突變技術(shù)，可產(chǎn)生遺傳學上改變的蛋白質(zhì)，它們在抗原性上與毒素相同而無毒性，被稱作“交叉反應(yīng)物質(zhì)”即CRMS。CRM197是值得注意的，因為它有一個從天然白喉毒素改變而來的單個氨基酸，并與之在免疫學上難以區(qū)分。
莢膜聚合物與天然毒素結(jié)合可降低毒性，但仍可保留明顯的毒性。因此，用甲醛水溶液和蛋白質(zhì)的游離氨基起反應(yīng)，進行蛋白質(zhì)毒素的進一步解毒。殘余毒性仍然受到關(guān)注。此外，任何特別大量的菌苗均能自發(fā)解毒，對這一處理仍有爭論。
另一可供選擇的方法是，在與莢膜聚合物結(jié)合之前，可用甲醛水溶液對天然毒素進行解毒，以產(chǎn)生常規(guī)的類毒素。但是，在前的甲醛水溶液處理可減少在與莢膜聚合物片斷反應(yīng)時可利用的游離氨基的數(shù)目。因此，CRMS在無固有毒性，其氨基也無一被甲醛水占據(jù)這些方面具有明顯的優(yōu)點。更大的優(yōu)點是，在用CRMS操作時無生物毒害存在。
對于免疫學上和天然毒素相同的CRM197，用甲醛水處理(盡管無須解毒)大大增強免疫反應(yīng)。據(jù)認為，這是由于該分子對機體降解機制的穩(wěn)定，和/或交聯(lián)聚集之故(顆粒的免疫原性隨體積增大而增加)。
由于上述全部理由，破傷風和白喉毒素為載體蛋白的首選者，還有其它毒素可能也是適合的。雖然這些其它毒素可能沒有在白喉和破傷風上所見的安全史，但可能有其它強有力的理由來使用它們。例如，它們作為載體甚至可能更有效，或生產(chǎn)經(jīng)濟性可能更為明顯。載體的其它候選者包括假單胞菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、百日咳和埃希氏大腸桿菌的毒素。
在本發(fā)明的一個具體實例中，被激活的寡糖可被偶聯(lián)于CRM197蛋白，后者可按如下所述進行純化白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)株產(chǎn)生的CRM197可按下文實例所述，將細菌培養(yǎng)物通過微孔濾膜而從培養(yǎng)基中分離出來，從濾液中沉淀出蛋白質(zhì)，并用離子交換層析法提純CRM197?；蛘?，可用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法獲得實質(zhì)純的CRM197。
在有機溶劑存在下，和可選擇地在便于促進激活的寡糖的末端官能團聯(lián)結(jié)到蛋白質(zhì)上的任何其它試劑(如縮合劑)的存在下，可將激活的寡糖共價地聯(lián)結(jié)到載體蛋白上。在本發(fā)明的一個具體的最佳實例中，其按如下步驟，將帶有末端酯基的寡糖共價地聯(lián)結(jié)到載體蛋白上存在的游離氨基上可將激活的寡糖溶解于二甲亞砜，然后加到載體蛋白水溶液中(例如，但不限于CRM197，濃度為約2mg/ml)，以致單酯-激活的寡糖/載體蛋白總氨基的摩爾比例為約1∶2，DMSO的終濃度為約50%v/v。結(jié)合反應(yīng)在4℃下進行，雖然在約2小時中反應(yīng)近于完成，但為了增加反應(yīng)的產(chǎn)量，對每一型具體的糖結(jié)合物來說都在最高值，合適的是將反應(yīng)物放置過夜。然后用凝膠層析法純化來得到該糖結(jié)合物。
為了合成單價菌苗，可將從單一細菌血清型而來的寡糖結(jié)合到蛋白質(zhì)上。為了合成多價菌苗，可將來自不同種或不同血清型細菌的寡糖混合物聯(lián)結(jié)到載體蛋白上來制備糖結(jié)合物;或者，將不同的單一型寡糖和載體蛋白各自進行反應(yīng)制備出糖結(jié)合物，然后混合在一起。多價菌苗可包括帶有同種或異種聯(lián)結(jié)的寡糖的載體蛋白。
(ⅳ)糖結(jié)合物的免疫化學特性在給人使用前，可在合適的動物系統(tǒng)，包括(但不限于)家兔、豬、豚鼠、小鼠、大鼠或山羊上驗證用上述方法制備的糖結(jié)合物的免疫原性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，可給家兔(約重2kg)皮下接種有或無磷酸鋁或氫氧化鋁存在的糖蛋白結(jié)合物。2kg家兔的合適劑量為約2.5μg寡糖。然后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或其它任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法評估抗體滴度。因為針對本發(fā)明的糖結(jié)合物產(chǎn)生的抗體無免疫沉淀抗原作用，因此不推薦依賴免疫沉淀反應(yīng)的抗體檢測試驗來測定滴度。
(ⅴ)菌苗配制和用法配制菌苗的合適載體基質(zhì)包括磷酸鈉緩沖鹽水(pH7.4)或懸浮于磷酸鈉緩沖鹽水(pH6)的0.125M磷酸鋁凝膠和其它合適的基質(zhì)。
一般來說，含從約5至約100μg(較佳地為約10至約50μg)寡糖的菌苗適合于在年輕溫血哺乳動物上誘發(fā)有效水平的抗莢膜聚合物抗體。當然，確切的劑量由常規(guī)的劑量/反應(yīng)實驗確定。用于制備兒童用菌苗的糖蛋白結(jié)合物的濃度包含在約25至200μg寡糖的范圍內(nèi)。根據(jù)體重可給予較大的劑量。連續(xù)給予幾個小劑量可被認為優(yōu)于一次注射給予等量的結(jié)合物。
本發(fā)明的菌苗可被用于任何年令的溫血哺乳動物，并特別適用于誘導抗下列致病原在年幼哺乳動物上引起的全身感染的主動免疫，這些致病原為流感嗜血桿菌b型、埃希氏大腸桿菌、肺炎球菌、奈瑟氏腦膜炎雙球菌和綠膿假單胞菌。
按照本發(fā)明，可經(jīng)皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、口腔或鼻腔內(nèi)接種菌苗。菌苗可包括以溶解形式或微粒形式存在的或嵌入微粒或微囊(包括脂質(zhì)體)的糖結(jié)合物。
(ⅵ)寡糖結(jié)合菌苗的應(yīng)用在本發(fā)明的最佳實例中，將針對有莢膜病原菌的糖結(jié)合物用于保護易感個體，使其不發(fā)生這些菌所引起的感染。易感個體包括免疫系統(tǒng)不成熟的幼兒，無脾者，及患有免疫系統(tǒng)缺陷或慢性疾病(特別是獲得性免疫缺陷綜合征，A.I.D.S.)、造血系統(tǒng)惡性腫瘤、糖尿病、慢性心臟病、慢性肺部疾患、鐮形紅細胞貧血的任何個體。本發(fā)明的糖結(jié)合物，借助于結(jié)合到載體蛋白上而增強它們所攜帶的寡糖的免疫原性。
因此，本發(fā)明的糖結(jié)合物可用于接種，以對任何具有多糖莢膜的細菌感染提供保護，這些細菌包括肺炎球菌、流感嗜血桿菌、埃希氏大腸桿菌、奈瑟氏腦膜雙球菌、傷寒沙門氏菌、Streptococcus mutans、新型隱球菌、肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌。對兒童致病性特別強而特別為本發(fā)明提供的肺炎球菌株包括1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23，和33F型。
在特定的實例中，本發(fā)明的菌苗可用來誘發(fā)專一特異的和同種的免疫反應(yīng)。專一特異的免疫反應(yīng)和很多優(yōu)點聯(lián)系在一起，包括提供具有如下特點的抗體(ⅰ)同種特異性，其中實質(zhì)上全部抗體都是針對一個特定表位型，并且以相同的親和力常數(shù)為其特征;(ⅱ)高親和力并有高度抗菌活性;(ⅲ)靶特異性增高而無與宿主相關(guān)抗原的交叉反應(yīng)性，從而產(chǎn)生較安全的菌苗;(ⅳ)由于專一特異性抗體的沉淀活性降低而引起補體激活降低，也導致較安全的菌苗。
在另外的實例中，本發(fā)明可用來制備能識別用本發(fā)明方法聯(lián)結(jié)到載體蛋白質(zhì)上的肽類、脂寡糖或其它表面寡糖半抗原的菌苗。這樣的菌苗可被用在，例如，對腫瘤細胞的免疫誘導上，或結(jié)合于化療或生物活性劑的抗腫瘤抗體的制備上。用本發(fā)明的方法，將腫瘤特異性抗原或其表位型聯(lián)結(jié)于載體蛋白，可誘導這樣的抗腫瘤活性。
實例1.多糖的制備從美國類型培養(yǎng)收集物得到肺炎球菌6A型莢膜多糖、肺炎球菌14型莢膜多糖、肺炎球菌19F型莢膜多糖和肺炎球菌23F型莢膜多糖。
實例2.肺炎球菌6A型多糖的水解將2mg 6A型肺炎球菌莢膜多糖溶于1ml含10mM乙酸(pH＝3.4)的水溶液，然后放在密閉的安瓿中，浸在100℃油浴中水解30小時。再經(jīng)葡聚糖凝膠G15(Pharmacia，Uppsala)層析，在4℃下用15mM NaCl溶液(pH7.0)洗脫，從反應(yīng)混合物中分離出生成的寡糖。
然后，按Kabat，(1964 in“Experimental Immunochemistry”，Ed.E.A.Rabat and Mayer，pp.538-541)，Chen et al.(1956，Anal.Chem.281756-1758)和Porro et al(1981，Anal.Biochem.118301-306)報告的方法分析層析洗脫液，以證實甲基戊糖、含磷化合物和還原基團的醛基的存在。分析結(jié)果揭示了甲基戊糖/乙醛為3.96，甲基戊糖/含磷化合物為0.96，含磷化合物/乙醛為4.12。
使用緩沖液洗脫的葡聚糖G-50超細級(Pharmacia)凝膠層析揭示，分布常數(shù)(Kd)為0.538(用己糖)，相應(yīng)于分子量為約2，500。
核磁共振，氣相色譜和化學計算分析表明，寡糖由約3-4個基本重復單位組成，在這些基本復重單位中發(fā)現(xiàn)免疫顯性糖-半乳糖。
實例3.肺炎球菌14型多糖的水解將2mg 14S型肺炎球菌莢膜多糖溶于1ml含0.5M三氟乙酸的水溶液，然后放在密閉的安瓿中，浸在70℃溫度的油浴中水解7小時。再經(jīng)葡聚糖凝膠G15(Pharmacia，Uppsala)層析，在4℃下用15mM NaCl溶液(pH7.0)洗脫，從反應(yīng)混合物中分離出生成的寡糖。
然后對層析洗脫液作己胺和乙醛含量分析，發(fā)現(xiàn)己胺與乙醛之比為3.17。氣相色譜和化學計算分析表明，分子大小相當于3-4個基本重復單位。如氣相色譜所測定的那樣，半乳糖的脫支鏈化在10%以內(nèi)。
使用15mM NaCl(pH7.0)洗脫的葡聚糖G-50(超細級)(Pharmacia)凝膠層析揭示，對于寡糖，按總己糖測得的分布常數(shù)(Kd)為0.30。
實例4.肺炎球菌19F型多糖的水解將2mg19F型肺炎球菌莢膜多糖溶于1ml含10mM乙酸(pH＝3.4)的水溶液，然后放在密閉的安瓿中，浸在50℃溫度的油浴中水解48小時。再經(jīng)葡聚糖G-15(Pharmacia，Uppsala)層析，在4℃下用15mM NaCl溶液(pH7.0)洗脫，從反應(yīng)混合物中分離出生成的寡糖。
然后，按Kabat(1964，in“Experimental Immunochemistry，”Ed.E.A.Rabat and Mayer，pp.538-541)，Chen et al.(1956，Anal.Chem.281756-1758)和Porro et al.(1981，Anal.Biochem.118301-306)報告的方法，分析層析洗脫液，以證實甲基戊糖、含磷化合物和還原基團如醛基的存在。分析結(jié)果揭示了甲基戊糖/還原性甲基戊糖為3.5，甲基戊糖/含磷化合物為3.2。
葡聚糖G-50(超細級)(Pharmacia)凝膠層析揭示，對于寡糖，Kd＝0.46(按總己糖計);氣相色譜和化學計算的結(jié)合分析表明，分子大小對應(yīng)于3-4個基本重復單位。
實例5.肺炎球菌23F型多糖的水解將2mg 23F型肺炎球菌莢膜多糖溶于1ml 0.25M三氟乙酸的水溶液，然后放在密閉的安瓿中，浸在70℃溫度的油浴中水解3小時。再經(jīng)葡聚糖凝膠G15(Pharmacia，Uppsala)層析，在4℃下用15mM NaCl溶液(pH＝7.0)洗脫，從反應(yīng)混合物中分離出生成的寡糖。
然后，按Kabat(1964，in“Experimental Immunochemistry，”Ed.E.A.Rabat and Mayer，pp.538-541)，Chen et al.(1956，Anal.Chem.281756-1758)和Porro et al.(1981，Anal.Biochem.118301-306)報告的方法，分析層析洗脫液，以證實甲基戊糖、含磷化合物和還原基團如醛基的存在。分析結(jié)果揭示了己糖/乙醛為4.5，己糖/甲基戊糖為2.3，含磷化合物/乙醛為2.9。
氣相色譜和化學計算分析表明，存在3.5-4.5之間的基本重復單位。如氣相色譜所測定的那樣，鼠李糖的脫支鏈化為低于8%。
葡聚糖G-50(超細級)(Pharmacia)凝膠層析揭示分布常數(shù)(Kd)為0.38(按己糖計)。
實例6.肺炎球菌寡糖半抗原的免疫化學特性按Porro等(1985，Mol.Immunol.22907-919)描述的方法，測定肺炎球菌6A、14、19F和23F型寡糖與針對完整的莢膜多糖的抗體之間相互作用的能力，即采用測定半抗原(如寡糖)抑制同型的抗原(莢膜多糖)對抗體的免疫沉淀反應(yīng)的技術(shù)(低分子量的半抗原，當與同型抗體測試時，不產(chǎn)生沉淀反應(yīng))。
稱作“鑒別免疫電泳”的方法操作如下作免疫電泳用的塑料板上有3個1%(w/v)瓊脂糖間隔(瓊脂糖M-LKB，Bromma，Sweden)、第一個間隔加有0.05%(v/v)抗莢膜多糖的參比抗血清。第二個間隔加有0.05%(v/v)抗莢膜多糖的參比抗血清，該抗血清已預先在37℃與一已知量的參比莢膜多糖孵育了15分鐘。第三個間隔加有抗莢膜多糖的參比抗血清，該抗血清預先已與已知量的寡糖半抗原進行了孵育。然后進行4次連續(xù)對倍稀釋的莢膜多糖電泳分離，電泳分離在70v/cm，20mM Tris-巴比妥緩沖液，pH8.8的條件下，進行90分鐘。在電泳后，瓊脂糖板經(jīng)銀染色，干燥和定量。由寡糖分子造成的抑制則由顯示在含預先與半抗原孵育的參比抗血清的間隔中的較高的火箭狀免疫沉淀來證實。半抗原的最小抑制濃度計算為MICHa(hAg)/(hHa)此處，CHa在凝膠中被測半抗原的濃度hAg當凝膠中有參比抗原時，由所得的火箭狀免疫沉淀的高度來確定的直線截距，hHa當凝膠中有受試半抗原時，由所得的火箭狀免疫沉淀的高度來確定的直線截距，類似的，MICAg＝CAg·hAg特異性＝ (MICAg)/(MICHa)不同大小的寡糖半抗原均被測定。
用特異抗體進行的寡糖阻斷莢膜多糖免疫沉淀的能力也用放射免疫擴散的非電泳方法進行了測定。按照本方法，寡糖分子的抑制可由在含有預先與一定量抑制因子(寡糖)孵育過的特異抗體的1%(w/v)瓊脂糖中抗原(莢膜多糖)擴散所形成的免疫沉淀范圍來證實。一旦對所給半抗原的最小結(jié)合濃度(MCC)在實驗中被發(fā)現(xiàn)，則特異性即可按前面已提到的公式來計算特異性＝ (MCCAg(Pa))/(MCCHa(Oligo))
表Ⅲ肺炎球菌寡糖半抗原的免疫學特性寡糖類型DPMW(MICPs(MCCPs/MICHp) /MCCHp)DIEP法 IRID法2 1.5K 10-36A型 3.5 2.5K 10-310-310 7.0K 10-114型 5 3.5 n.t. 10-115 10.4K n.t. 10-119F型 3.5 2.5K 10-310-423F CH3COOH 3 2.3K 10-310-2(水解) 6 4.5K 10-110-1TFA(水解) 4.5 3.4K 10-45×10-39.5 7.2K 10-110-1n.t不能測定DIEP鑒別免疫電泳IRID放射免疫擴散抑制MIC最小抑制濃度MCC最小結(jié)合濃度實例7.肺炎球菌寡糖末端還原單位的激活將按上文實例2-5所述得到的寡糖半抗原溶于水至終濃度為約5mg/ml。向每一溶液中，按每ml溶液加0.1ml 0.2M KH2PO4，并加入需要量的二氨基甲烷使pH升至9.2-9.4(一般說來，每ml溶液需體積為2μl的二氨基甲烷)。將混合物于100℃下保持15分鐘，然后每ml溶液加入約4μl吡啶甲硼烷。用1N NaOH將pH調(diào)節(jié)在9.2。然后將混合物裝在密閉的安瓿中，移到50℃油浴中再保持48小時。此后，用1N HCl將此氨基被激活的寡糖溶液中和，在葡聚糖G-15(超細級)柱上純化(15mM NaCl，pH7.01)。匯集所收集到的層析流分并冷凍干燥。然后，將凍干的殘渣按10mg/ml溶于DMSO，并加到1摩爾量的SIDEA(或SIDES)中，后者相當于對應(yīng)凍干化合物中存在的氨基量5∶1摩爾/摩爾的比例。反應(yīng)在室溫下進行4小時，然后向溶液中加入4倍體積的1，4-二噁烷(在1，4-二噁烷中終濃度為80%)，以便沉淀出酯激活的寡糖。離心收集沉淀物，用1，4-二噁烷洗滌三次，于-20℃或更低溫度下保持到在結(jié)合過程中加以使用。四種寡糖中每一種在激活過程中的收率見表Ⅳ所示。
表Ⅳ肺炎球菌寡糖的激活過程的收率(% w/w)血清型寡-NH(CH2)2NH2寡-NH(CH2)2NH-酯總值6A型 75 93 7014型 73 90 6619F型 100 100 10023F型 50 90 45Xg(±SD) 74.5(±20) 93.3(±4.7) 70(±23)
實例8.CRM197蛋白的制備用微孔XM-50(NMWL5×10-4膜通過分子過濾，從培養(yǎng)基中分離出由白喉棒狀桿菌C7(Btx-197產(chǎn)生的CRM197。然后向濾液中加入硫酸銨飽和溶液(至65% w/v)來沉淀蛋白。離心收集沉淀了的蛋白質(zhì)，再溶解于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2)。
通過離子交換層析獲得CRM197的進一步純化，使用以0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.2)處理的2.5×100cm DEAE-瓊脂糖6B/CL柱(Pharmacia Uppsala)，用含0.09M NaCl的0.01M磷酸鹽緩沖液作洗脫劑。在還原條件下的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Pappenheimer等.，1972，Immunochem.9891-906)表明，所獲得的CRM197的80%以其天然分子的形式存在。蛋白純度被發(fā)現(xiàn)為每mg約400絮狀反應(yīng)限量(Lf)。
實例9.激活的寡糖的結(jié)合結(jié)合過程包括琥珀酰亞胺單酯激活的寡糖半抗原偶聯(lián)到載體蛋白CRM197的賴氨酸殘基的ε-氨基上。
然后將含己二酸的琥珀酰亞胺酯激活的肺炎球菌6A、14、19F和23F型莢膜多糖的寡糖的二甲亞砜加到含2mg/ml CRM197的0.1M碳酸氫鹽溶液(pH＝8.0)中，以得到一種溶液，它在水中占50%，其中酯激活的寡糖與載體蛋白總氨基之摩爾比為1∶2。
在輕微攪拌下，將這樣得到的混合物在4℃中保持15小時。從四種血清型的每一種得來的寡糖在各自的反應(yīng)中被結(jié)合到蛋白上。所得到的糖結(jié)合物的物理化學特性總結(jié)列于表Ⅴ。
表Ⅴ糖結(jié)合物的特性
實例10.用作偶聯(lián)劑的己二酸的琥珀酰亞胺二酯對丁二酸的琥珀酰亞胺二酯的結(jié)合效能比較和丁二酸的琥珀酰亞胺二酯(SIDES)反應(yīng)所形成的激活寡糖為如下結(jié)構(gòu)
而和己二酸的琥珀酰亞胺二酯(SIDEA)反應(yīng)所形成的激活寡糖為如下結(jié)構(gòu)
因此，在寡糖和結(jié)合的蛋白之間產(chǎn)生不同大小的偶聯(lián)劑(見圖2)。用SIDES對SIDEA激活的寡糖，進行結(jié)合效能的評價。如圖3A、B和C所示，只有當偶聯(lián)劑來自SIDEA時，蛋白質(zhì)顯示出完全的糖基化形式(在此情況下極少或沒有游離的CRM197帶可被檢出)。
實例11.肺炎球菌糖結(jié)合物的免疫原性4種糖結(jié)合物抗原的幾種制劑被制備，并在家兔中進行測定(參照表4描述的計劃表)型特異的糖結(jié)合物以單價制劑(2.5或5.0μg寡糖/劑)或多價制劑(每一寡糖2.5μg/劑)，加或不加氫氧化鋁[Al(OH)3]作為無機佐劑(僅在多價制劑中按每劑1mg加入)。4種糖結(jié)合物對氫氧化鋁的完全吸附僅出現(xiàn)在合適的狀況下，因為無論用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，還是火箭免疫電泳，處理多價制劑的上清液，均不能分出任何可測定量的游離蛋白。每一糖結(jié)合物的平均劑量含大約2.5μg寡糖和13μg載體蛋白CRM197(比得上白喉類毒素的平均人菌苗劑量)。免疫計劃包括一次初次免疫劑量和2次間隔4周的加強免疫劑量。放血在0周、4、6和10周進行。
表Ⅵ家兔與小鼠的免疫計劃及菌苗劑量免疫在0，4，8周放血在0，4，6，10周A.可溶性單價(單型)制劑1劑(0.5ml)2.5μg寡糖和13μg(5Lf)CRM1971劑(0.5ml)5.0μg寡糖和26μg(10Lf)CRM197B.可溶性多價(4型混合)制劑1劑(0.5ml)2.5μg型特異寡糖(總量10μg寡糖)和總量為52μg(20Lf)的CRM197C.氫氧化鋁吸附的多價(4型混合)制劑1劑(0.5ml)2.5μg型特異寡糖(總量為10μg寡糖)和總量為52μg(20Lf)的CRM197，含1mg氫氧化鋁表Ⅶ顯示型特異抗體的放免測定(FARR法)估測量，和反應(yīng)動物數(shù)/被免疫動物數(shù)。率(R)表明，在每一免疫劑量后達到倍增。
表Ⅷ顯示稱為IgG同型抗體的ELISA滴度，和反應(yīng)動物數(shù)/被免疫動物數(shù)。率-R1、-R2和-R3表明，在每一免疫劑量后滴度有倍增;而率-R′1，R′2和R′3表明，就前滴度而言，對一給予的免疫劑量，在滴度上有倍增。
表Ⅸ報告在活的鏈球菌上多糖莢膜的識別中誘導產(chǎn)生的IgG抗體的功能方面的定量結(jié)果(腫脹反應(yīng)或中和試驗)。
表Ⅹ顯示，用非洲綠猴腎細胞試驗來估價的，用載體蛋白CRM197在家兔中誘導產(chǎn)生的白喉毒素中和滴度。因為使用參考的FDA抗血清作對照，以μ/ml表示的滴度也被包括在內(nèi)。
表Ⅶ以共價結(jié)合于載體蛋白CRM197的肺炎球菌6A，14，19F，23F型寡糖＊＊＊免疫＊＊兔的放射免疫法測定的滴度＊
＊資料顯示以ngNAb/ml表示的幾何平均值，應(yīng)答者/被免疫動物總數(shù)在括號內(nèi)。
＊＊由4種糖結(jié)合物以可溶型和氫氧化鋁吸附型(1mg/劑)組成的多價制劑，每一糖結(jié)合物含有平均2.5μg的寡糖和平均13μg的蛋白CRM197，于0周，4周，和9周免疫，在0周，4周，6周，11周放血。
＊＊＊6A與19F型寡糖有平均DP＝3;14與23F型寡糖有DP均值為5。
＊＊＊＊6A型糖結(jié)合物中每單位載體蛋白寡糖(mol/mol)的平均置換度(SD)為7，SD在14型糖結(jié)合物是6，19F型是4，23F型是5。
表Ⅷ由多價菌苗，包括DP為3-6的肺炎球菌6A，14，19F，23F型莢膜寡糖吸附到無機佐劑氫氧化鋁上形成的糖結(jié)合物，誘導的IgG型同型抗體滴度＊的ELISA結(jié)果
＊以最高血清稀釋度的倒數(shù)的幾何均值表示的滴度，用反應(yīng)背景2倍的吸光度(ABS)值為顯示，括號內(nèi)報告的是動物數(shù)(反應(yīng)動物/總注射動物)＊＊該值包括一異乎尋常高反應(yīng)家兔的滴度，在5只受免疫兔中2只被摒棄，即最好和最差反應(yīng)動物，在此列出留下的3只家兔對23F血清型的結(jié)果。
(0周) (4周) (6周) (11周)＜50(0/5) 667(3/3) 1，333(3/3) 2，667(3/3)R1＞13.3 R2＝2.0(α＜0.01) R3＝2.0(α＜0.01)R2′＞26.7 R3′＞53.3表Ⅸ家兔血清抗體對結(jié)合于CRM197的DP＝3-6寡糖的免疫學功能定性分析(對莢膜識別的腫脹反應(yīng)＊)肺炎球菌6A型陽性反應(yīng)肺炎球菌14型陽性反應(yīng)肺炎球菌19F型陽性反應(yīng)肺炎球菌23F型陽性反應(yīng)＊按Austrian(1976)的方法進行，(Mt.Sinai J.Med.43699-709)。
表Ⅹ
以共價聯(lián)結(jié)于載體蛋白CRM197的肺炎球菌寡糖所合線的多價糖結(jié)合物免疫的家兔中，引入非洲綠猴腎細胞試驗來測定抗白喉滴度＊前滴度 初次免疫 第一次加強免疫 第二次加強免疫(0周) (4周) (6周) (11周)溶解形式 ＜10 ＜10 25(0.019μ/ml) 1，920(1.4μ/ml)R＝2.5 R＝77.0氫氧化鋁 ＜10 20(0.015 1，280(0.96 3，840(2.9吸附形式 μ/ml) μ/ml) μ/ml)R＝64.0 R＝3.0FDA參比抗血清含量6μ/ml，在1/8，000稀釋時可提供50%保護。
＊滴度以稀釋度的倒數(shù)表示，在該稀釋度時抗血清混合物可對暴露于白喉毒素的細胞，按3H-亮氨酸標記物評估，有50%保護。
括號中數(shù)字表示用FDA參比抗血清作對照，測得的以μ/ml表示的滴度實例12.鏈長DP＝10-20的寡糖是亞理想的免疫原按照以上所述的合成方案，但用有二種不同的鏈長“范圍值”，即DP＝3-5和DP＝10-20的肺炎球菌6A，14，19F和23F型的糖類，合成了二組糖結(jié)合物菌苗。問題然而變成，無論是鏈長DP＝20或更長的寡糖也均成合適的免疫原(依據(jù)對選擇的載體蛋白CRM197的結(jié)合)，與短得多的鏈長，諸如DP＝3的寡糖相比較，在初次免疫或加強免疫能力上均如此。
用列于表Ⅺ中的草案來免疫家兔。表Ⅻ和ⅩⅢ是關(guān)于DP＝10-14和DP＝3-6的肺炎球菌可溶性寡糖分別誘導的IgG同型抗體滴度的ELISA測定結(jié)果，表ⅩⅣ與ⅩⅤ是關(guān)于吸附在氫氧化鋁上的，DP＝10-14和DP＝3-6的肺炎球菌寡糖分別誘導產(chǎn)生的IgG同型抗體滴度的ELISA測定結(jié)果，表Ⅻ、ⅩⅢ的比較結(jié)果和表ⅩⅣ、表ⅩⅤ的比較結(jié)果均表明，DP＝10-14與提高免疫原性無關(guān)。事實上，DP＝3-5的寡糖結(jié)合物的IgG初次與加強激活，較之用DP＝10-14寡糖結(jié)合物觀察到的激活遠為強。并非偶然，被研究的所有4個糖結(jié)構(gòu)均有類似結(jié)果。更進一步，以DP＝10-14的糖結(jié)合物中和白喉毒素，較之用DP＝3-6的糖結(jié)合物所達到的中和效果差(表ⅩⅥ)。因此，鏈長DP＝10-20的寡糖在本發(fā)明的結(jié)合物中是有功能的，雖然DP＝3-6的寡糖可激發(fā)更高的抗體滴度。
表Ⅺ家兔免疫計劃表按每劑2.5μg糖進行糖結(jié)合物模式的注射。
由于受試的模式差異僅在于共價連接于寡糖上的鏈長度，所以載體蛋白的相應(yīng)量為糖劑量(μg) 載體蛋白劑量(μg) 重量比(w/w)DP＝3-6 2.5 12.5 0.2寡-CRM197DP＝10-14 2.5 2.5 1.0寡-CRM197在0、4和8周免疫，在0、4和10周放血表Ⅻ由包含有可溶形式的肺炎球菌6A，14，19F，23FDP＝10-14莢膜寡糖的糖結(jié)合物的多價菌苗誘導產(chǎn)生的IgG同型抗價滴度的ELISA測定結(jié)果前滴度 初次免疫 第1次加強免疫 第2次加強免疫(0周) (4周) (6周) (10周)6A型 ＜100 ＜100 ＜100 500(2/5)14型 ＜100 300 2，400(3/5) 4，600(3/5)19F型 ＜100 ＜100 ＜100 ＜10023F型 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100表ⅩⅢ由包含有可溶形式的肺炎球菌6A，14，19F，23FDP＝3-6莢膜寡糖的糖結(jié)合物的多價菌苗誘導產(chǎn)生的IgG同型抗價滴度的ELISA測定結(jié)果前滴度 初次免疫 第1次加強免疫 第2次加強免疫(0周) (4周) (6周) (11周)6A型 ＜50 ＜200 967(6/6) 8，500(6/6)R3＝8.8(α＜0.01)14型 ＜50 1，800 3，266(3/6) 3，650(4/6)19F型 ＜50 ＜50 675(4/6) 1，750(6/6)23F型 ＜50 ＜50 ＜50 ＜50表ⅩⅣ由包含有吸附在無機佐劑氫氧化鋁上的肺炎球菌6A，14，19F，23F型DP＝10-14莢膜寡糖的糖結(jié)合物的多價菌苗誘導產(chǎn)生的IgG同型抗體滴度的ELISA測定結(jié)果前滴度 初次免疫 第1次加強免疫 第2次加強免疫(0周) (4周) (6周) (11周)6A型 ＜100 240(5/5) 900(5/5) 500(5/5)R1＞2.4 R2＝3.8(α＜0.01)R2′＞9.0＜100 300(5/5) 1，040(5/5) 8，480(5/5)14型 R1＞3.0 R2＝3.5(α＜0.01) R3＝8.2(α＜0.01)R2′＞10.4 R3′＞84.919F型 ＜100 ＜100 400(1/5) 800(1/5)23F型 ＜100 ＜100 ＜100 200(1/5)表ⅩⅤ由包含有吸附在無機佐劑氫氧化鋁上的肺炎球菌6A，14，19F，23F型，DP＝3-6莢膜寡糖的糖結(jié)合物的多價菌苗誘導產(chǎn)生的IgG同型抗體滴度的ELISA測定結(jié)果
以最高血清稀釋度的倒數(shù)幾何均值表示的滴度，顯示2倍于反應(yīng)背景的吸光度(ABS)值，括號內(nèi)報告的是動物數(shù)(反應(yīng)動物/總注射動物)表ⅩⅥ用從由肺炎球菌寡糖-CRM197糖結(jié)合物免疫兔中分離得的血清在體外對白喉毒素行中和試驗＊前滴度 初次免疫 第1次加強免疫 第2次加強免疫(0周) (4周) (6周) (10周)DP＝3-6寡-CRM197可溶性 ＜1/10 ＜1/10 1.20 1/1，280(0.03φ/ml) (2.05φ/ml)氫氧化鋁吸附 ＜1/10 1/10 1/640 1/2，560(0.016φ/ml) (1.02φ/ml) (4.10φ/ml)DP＝10-14寡-CRM197可溶性 ＜1/10 ＜1/10 ＜1/10 1/10(0.016φ/ml)氫氧化鋁吸附＜1/10 ＜1/10 1/40 1/80(0.06φ/ml) (0.13φ/ml)＊滴度以稀釋度的倒數(shù)表示，在該稀釋度時抗血清混合物可對暴露于白喉毒素的細胞，按3H-亮氨酸標記物評估，有50%保護括號中數(shù)字表示用FDA參比抗血清作對照，測定的以μ/ml
表示的滴度在人中測得MPL為0.01μg/ml實例13.對于糖結(jié)合物的免疫反應(yīng)是專一特異的和同種的對列于表Ⅶ和Ⅷ中的結(jié)果進行比較，即比較由放射免疫法(RIA)測定的抗體滴度和用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定的抗體滴度，表明，RIA測定的滴度始終低于ELISA測定的滴度。這個觀察，以及用于抗糖結(jié)合物抗血清的放射免疫擴散和火箭電泳分析的瓊脂糖凝膠中，免疫沉淀物的缺乏，證明家兔抗肺炎球菌寡糖-CRM197結(jié)合物的抗血清含有高特異的IgG同型抗體，該抗體不能沉淀各自的用于產(chǎn)生寡糖的純化糖聚合物。
在抗血清中沉淀性抗體的缺乏是專一特異性的標志，也即對所給的分子的抗原性的全部組成部分中，僅一個表位有抗體識別(Berzofsky-Schechter，1981，Molecular Immunol.18751-763)、抗原抗體復合物的沉淀要求晶格形成，以產(chǎn)生連接抗原和抗體分子的三維支鏈網(wǎng)。要產(chǎn)生此現(xiàn)象，抗原和抗體二者都要求是多價的，因為必須有一個以上抗體分子能同時結(jié)合到一個抗原分子上。從而，在家免對肺炎球菌寡糖-CRM197結(jié)合物的抗血清和同種純化的高分子量莢膜多糖之間缺乏可觀察到的沉淀反應(yīng)，這有力地表示，抗血清含有對糖聚合物特異性的抗體(如ELISA和ELISA抑制分析所顯示的)，但只針對多糖的一個抗原決定簇(表位型)。
除了顯示免疫沉淀活性物，異種抗體一般還伴有下面的性質(zhì)用于誘發(fā)抗體反應(yīng)的抗原的一個表位型不能完全抑制抗體的整個種群與完全抗原的結(jié)合，而只能抑制結(jié)合于該一表位型的抗體，其它抗體則游離，以與完全抗原上存在的其余表位型結(jié)合。用ELISA-抑制試驗可評估抗體總?cè)旱漠惙N性。在此試驗中，可在抗原/抗體結(jié)合抑制因子(如分離出來的抗原表位型)的存在下，測定抗體總?cè)号c完全抗原結(jié)合的能力。用圖解表示在未標記完全抗原增加濃度的情況下測定抗體與標記的完全抗原的結(jié)合，產(chǎn)生S形曲線，可將其用作抗體/抗原結(jié)合的標準曲線。如果抗體總?cè)菏钱惙N的，抗體和完全抗原之間的結(jié)合不能被加入單一抗原表位型而完全抑制，抗體/抗原結(jié)合的標準曲線象其它抗原/抗體之間反應(yīng)那樣，只是部分取代(部分重迭或部分平行)，有別于那些與表位型有關(guān)的，被測試的，占優(yōu)勢的抗原抗體間反應(yīng)。相反，因種群抗體與抗原的結(jié)合可以完全被加入的分離的抗原之表位型所抑制，對同種群抗體來說，標準的S型抗原抗體結(jié)合曲線是與加入與種群特異性相應(yīng)的被分離的表位型所產(chǎn)生的曲線重疊與平行。在實驗時，以這種方式測定肺炎球菌菌糖結(jié)合物誘導產(chǎn)生的象兔IgG，觀察到密切相關(guān)的模式，即預示有同種群抗體(圖4)。肺炎球菌6A型寡糖(無論是非結(jié)合的或結(jié)合的)均與結(jié)合的抑制性S型曲線有關(guān)，且與用血清型6A高分子量莢膜多糖所得的曲線大致平行?？深A計，異種的(14型)寡糖，無論是游離型(偶聯(lián)激活)或結(jié)合型，不能抑制對6A型抗原特異的IgG表位型群。
權(quán)利要求
1.制備寡糖和載體蛋白共價結(jié)合物的方法，其特征在于，包括以下步驟(ⅰ)在甲硼烷吡啶存在下，將帶有末端還原基團的寡糖與二氨基乙烷反應(yīng)以發(fā)生還原胺化；(ⅱ)將(ⅰ)的氨化的寡糖產(chǎn)物和含兩個官能團的分子反應(yīng)，兩個官能團中一個能和激活的寡糖的末端基團反應(yīng)，另一個能和所述的載體蛋白反應(yīng)；(ⅲ)將(ⅱ)的激活的寡糖產(chǎn)物和所述載體蛋白反應(yīng)，以發(fā)生結(jié)合。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中還原胺化是在約100℃的溫度下進行的。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，和甲硼烷吡啶的反應(yīng)是在約50℃的溫度下進行的。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(ⅱ)的含兩個官能團的分子為二酯。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ⅱ)的含二個官能團的分子為己二酸的二酯或丁二酸的二酯。
6.按權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其特征在于，其中寡糖來自于肺炎球菌(streptococcus pneumoniae)莢膜多糖。
7.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，其中寡糖來自具有從1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F型所組成的一組中選出的精選的血清型的肺炎球菌(streptococcus pneumoniae)。
8.按權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其特征在于，其中寡糖來自從流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)、Streptococus mutans、新型隱球菌(Cryptococus neuformans)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)所組成的一組中選出的細菌的莢膜多糖。
9.按權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的方法，其特征在于，其中載體蛋白為CRM197。
10.按權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的方法，其特征在于，其中載體蛋白選自沙門氏菌屬(Salmonella)鞭毛蛋白、嗜血桿菌(Hemophilus)纖毛、嗜血桿菌15KDa、28-30KDa或40KDa膜蛋白、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)熱不穩(wěn)定腸毒素LTB、白喉毒素、破傷風毒素，霍亂毒素、輪狀病毒VP7蛋白和呼吸道合胞病毒F或G蛋白組成的一組。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備寡糖結(jié)合菌苗的改良方法。本發(fā)明的另一方面是制備對莢膜多糖引起的專一特異性和同種免疫反應(yīng)的寡糖菌苗。本發(fā)明的具體實施方案提供這樣的菌苗，它能誘導對肺炎球菌(streptococcus pneumoniae)一些流行的血清型的免疫力。
文檔編號A61K31/715GK1060294SQ9110942
公開日1992年4月15日 申請日期1991年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月28日
發(fā)明者馬西莫·波羅 申請人:美國氰胺公司