專利名稱：神經(jīng)肽y拮抗劑的制法的制作方法
本申請是編號為237，599的專利申請(申請日1988年8月26日)的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明是關(guān)于新的肽衍生物及其制法;這些衍生物是神經(jīng)肽Y的拮抗劑。
豬的神經(jīng)肽Y(pNRY)是有36個氨基酸殘基的肽，它屬于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布的唯一的一類肽。人們發(fā)現(xiàn)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中存在神經(jīng)肽Y(NPY)的受體。在腦中，NPY是食物攝取的有效刺激質(zhì)，它刺激促黃體激素、生長激素和催乳激素，并且產(chǎn)生心血管抑制作用。NPY也是有效的外周血管收縮劑，還有報道認(rèn)為它可引起患者暫時的心肌缺血并伴有心絞痛。預(yù)計對上述現(xiàn)象的拮抗作用可導(dǎo)致血壓降低，因此預(yù)計對NPY的拮抗劑可用于治療高血壓、血管痙攣和絞痛，也可以用于抑制食欲。已經(jīng)表明，NPY是有效的支氣管收縮劑，并且與其余氣管節(jié)的調(diào)整有一定的關(guān)系。NPY拮抗劑將阻止NPY引起的收縮，并將導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張。
式1的新肽衍生物及其可藥用鹽是神經(jīng)肽Y的拮抗劑，
其中X2為S或A;
X3為S或A;
X4為L、I、M、Nle或V;
X5為L、I、M、Nle或V;
Tc為OR′或NHR′，其中R′為氫或(C1～C4)烷基;
θ為具有下式結(jié)構(gòu)式的基團(tuán)-NH-(CH2)n-CO2-，其中n為整數(shù)1-11。
上述肽衍生物可以抑制由NPY引起的小白鼠脾的收縮。
本申請說明書中應(yīng)用了下列氨基酸以及氨基和羧基末端基團(tuán)的通用縮寫符號Ala(或A)-丙氨酸Val(或V)-纈氨酸Leu(或L)-亮氨酸Ile(或I)-異亮氨酸Pro(或P)-脯氨酸Met(或M)-蛋氨酸Ser(或S)-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸Cys(或C)-半胱氨酸cys(或c)-D-半胱氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸Asn(或N)-天冬酰胺
Asp(或D)-天冬氨酸Lys(或K)-賴氨酸Arg(或R)-精氨酸His(或H)-組氨酸Nle-正亮氨酸Aoc-8-氨基辛酸＃-NH2烷基包括直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環(huán)戊基、己基、異己基、環(huán)己基和環(huán)戊甲基。2-10個碳原子的酰基包括每個基團(tuán)中有1或2個羰基的直鏈、支鏈、環(huán)狀、飽和以及不飽和的酰基，例如乙?；?、苯甲?；㈢牾；?、馬來?；臀於；?。其中氨基末端氨基酸的氨基用兩個烷基或?；〈纳鲜鲭?，也被認(rèn)為在本發(fā)明的肽的范圍內(nèi)。
除了甘氨酸以外，上述天然氨基酸均含有手性碳原子。除非另有說明，這里所指的有旋光性的氨基酸都是L-構(gòu)型的。
式1的多肽可以與任何無毒的有機(jī)酸或無機(jī)酸形成藥用鹽。可形成適用鹽的無機(jī)酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及酸性金屬鹽，例如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀?？尚纬蛇m用鹽的有機(jī)酸包括一元、二元或三元羧酸，其實例有乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸，以及磺酸，例如甲磺酸和2-羥基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的鹽包括與合適的無機(jī)堿或有機(jī)堿形成的無毒羧酸鹽。舉例來說，這些鹽包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽;堿土金屬鹽，例如鈣鹽或鎂鹽;包括鋁在內(nèi)的ⅢA族輕金屬鹽;有機(jī)伯胺鹽、仲胺鹽和叔胺鹽，例如三烷基胺鹽，包括三乙胺鹽、普魯卡因鹽、二芐基胺鹽、1-乙烯胺(1-ethenamine)鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽、二氫樅胺鹽、N-(低級)烷基哌啶鹽以及其他合適的胺鹽。
對于任何一大類化合物來說，其中都有一組是比較好的。申請人優(yōu)選X2為丙氨酸(A)的上述式1肽衍生物。申請人還優(yōu)選下述式1肽衍生物其中X3為絲氨酸;其中X4或X5為異亮酸(Ⅰ);其中Tc＝NH2;以及其中θ＝Aoc。最優(yōu)選的式1肽衍生物是以下式2的肽衍生物
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用易為本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知的各種方法制備。這些方法包括固相順序法，該方法可以應(yīng)用已建立的自動方法進(jìn)行，例如應(yīng)用自動的肽合成器來進(jìn)行。
應(yīng)用的樹脂載體可以是本技術(shù)領(lǐng)域中常用于以固相法制備多肽的任何適用的樹脂，最好是與0.5%-約3%二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯，它已被轉(zhuǎn)變?yōu)閷谆郊谆坊蚨郊谆费苌?對于C-末端酰胺)，或者已被氯甲基化或羥甲基化以提供與最初引入的α-氨基受保護(hù)的氨基酸(為了得到C-末端烷基酰胺)和酯形成酯的位點。
Bodanszky等敘述了羥甲基樹脂的實例[Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)]。氯甲基化樹脂可從BioRadLaboratories(加利福尼亞，里士滿)買到;這種樹脂的制備方法已由Stewart等敘述[“SolidPhasePeptideSynthesis”(Freemanandco.，舊金山1969)，第1章，p.1-6]。可以用Gisin的方法將受保護(hù)的氨基酸連到樹脂上[Helv.Chem.Acta，56，1476(1973)]。許多連接在樹脂上的受保護(hù)氨基酸都是可以買到的。例如，為了制備羧基末端為Thr殘基的本發(fā)明的多肽，可以應(yīng)用連接在芐基化、羥甲基化的苯乙酰胺基甲基(PAM)樹脂上的叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)的Thr，它是可以買到的。
將α-氨基受保護(hù)的氨基酸連接到載體樹脂上之后，應(yīng)用合適的方法(例如應(yīng)用三氟乙酸的二氯甲烷溶液，單獨用三氟乙酸或HCl的二噁烷溶液)脫去保護(hù)基。去保護(hù)是在0℃和室溫之間的溫度下進(jìn)行。也可以采用其它用于脫去特定α-氨基保護(hù)基的普通裂解試劑和條件。脫去α-氨基保護(hù)基之后，按所需的順序逐一連結(jié)其它氨基受保護(hù)的氨基酸。另外一種方法是，在用掛有氨基酸序列的樹脂進(jìn)行連結(jié)之前，多個氨基酸基團(tuán)可以用溶液法連結(jié)起來。
引入多肽序列的各個氨基酸所應(yīng)用的α-氨基保護(hù)基可以是本技術(shù)領(lǐng)域已知的保護(hù)基。在所考慮的各類α-氨基保護(hù)基中有(1)?；愋偷谋Ｗo(hù)基，例如甲?；?、三氟乙?；?、鄰苯二甲?；⒓妆交酋；?tosyl)、苯磺?；?、硝基苯亞磺?；?、三苯甲基亞磺酰基、鄰硝基苯氧乙?；挺?氯代丁?；?(2)氨基甲酸芳香族酯類型保護(hù)基，例如芐氧羰基和取代的芐氧羰基，如對氯芐氧羰基、對硝基芐氧羰基、對溴芐氧羰基、對甲氧基芐氧羰基、1-(對聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基和二苯甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基(Fmoc);(3)氨基甲酸脂肪族酯類型保護(hù)基，例如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)氨基甲酸環(huán)烷基酯類型保護(hù)基，例如環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧羰基和環(huán)己氧羰基;(5)硫代氨基甲酸酯類型保護(hù)基，例如苯基硫代羰基;(6)烷基類型保護(hù)基，例如三苯基甲基(trityl)和芐基;以及(7)三烷基硅烷類保護(hù)基，例如三甲基硅烷。較好的α-氨基保護(hù)基是叔丁氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。
合適縮合試劑的選擇是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的技能問題。如果需要加入的氨基酸是Gln、Asn或Arg，那么特別合適的縮合試劑是N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基苯并三唑。應(yīng)用上述試劑可以避免形成腈和內(nèi)酰胺。其他的縮合試劑有(1)碳化二亞胺(例如N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺和N-乙基-N′-(γ-二甲氨基丙基碳化二亞胺);(2)氨腈(例如N，N-二芐基氨基氰;(3)酮亞胺(Ketenimines);(4)異噁唑鎓鹽(例如N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3′-磺酸鹽);(5)環(huán)中含1-4個氮原子的具有芳香族性質(zhì)的含氮單雜環(huán)酰胺，例如咪唑酰胺、吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺。可用的具體雜環(huán)酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化的乙炔(例如乙氧基乙炔);(7)與氨基酸的羧基部分形成混合酸酐的試劑(例如氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯)，或需縮合氨基酸的對稱酸酐[例如(Boc-Ala)-O)];以及(8)在一個環(huán)中氮原子上有羥基的含氮雜環(huán)化合物(例如N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和1-羥基苯并三唑)。其它活化試劑及其在肽縮合中的應(yīng)用已由Kapoor敘述[J.pharm.sci.，59，p.1-27(1970)]。申請人優(yōu)先選用對稱的酸酐作為除Arg、Asn和Gln之外的所有氨基酸的縮合試劑。
將每個已保護(hù)的氨基酸或氨基酸序列以約過量4倍的量引入到固相反應(yīng)器中，并且在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)介質(zhì)中，或只在二甲基甲酰胺介質(zhì)中，或者最好只在二氯甲烷介質(zhì)中進(jìn)行縮合。在發(fā)生不完全縮合的情況下，則在于固相反應(yīng)器中縮合另一氨基酸之前，在脫去α-氨基保護(hù)基之前重復(fù)縮合操作。按照E.Kaiser等(Analyt.Biochem.34，595(1970))所述方法，用茚三酮反應(yīng)檢測各個合成階段的縮合反應(yīng)是否完成。
在得到所需要的氨基酸序列之后，將肽從樹脂上切落。切落肽可以通過水解來完成，例如將連接在樹脂上的多肽用甲硫醚、對甲酚和硫代甲酚在液體氫氟酸中的溶液進(jìn)行處理。
正如在固相肽合成技術(shù)中已知的那樣，許多氨基酸都帶有在鏈制備過程中需要保護(hù)起來的官能團(tuán)。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員都能夠選用合適的保護(hù)基，這取決于要保護(hù)的氨基酸和在肽上存在的其他受保護(hù)的氨基酸殘基。這種側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的選擇是很關(guān)鍵的，因為在裂解α-氨基上的保護(hù)基時該側(cè)鏈保護(hù)基必須不會被脫去。例如賴氨酸的合適側(cè)鏈保護(hù)基是芐氧羰基和取代的芐氧羰基，其中的取代基系選自鹵素(例如氯、溴、氟)和硝基(例如2-氯芐氧羰基、對硝基芐氧羰基、3，4-二氯芐氧羰基)，甲苯磺?；?、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二異丙基甲氧羰基。蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可以用乙?；?、苯甲?；⑹宥』?、三苯甲基、芐基、2，6-二氯芐基或芐氧羰基保護(hù)。天冬氨酸和谷氨酸的羧基可以用芐基或環(huán)己基保護(hù)。較好的保護(hù)基是芐基。
上述基團(tuán)可以用本技術(shù)領(lǐng)域中人們熟知的方法脫去。通常在肽鏈合成結(jié)束之后脫去保護(hù)基，但是保護(hù)基也可以在任何其它合適的時間脫去。
因此，制備本發(fā)明式1肽衍生物及其可藥用鹽的優(yōu)選方法包括將適當(dāng)保護(hù)的酪氨酸連接到活性樹脂載體上，然后將從脯氨酸到羧基末端的酪氨酸的其它α-氨基受保護(hù)的氨基酸連結(jié)到生長中的肽鏈上的已同時通過脫去其氨基保護(hù)基而暴露出來的末端氨基上，從樹脂上切下受保護(hù)的肽，脫去所有保護(hù)基，使直鏈肽氧化縮合，最后分離環(huán)化的肽。
式1的肽衍生物作為神經(jīng)肽Y拮抗劑的能力，可以按照Lundberg等的方法[Eur.J.Pcol.14521-9(1988)]，由該肽與碘化神經(jīng)肽Y競爭受體的能力來驗證。將125碘-Bolton-Hunter-神經(jīng)肽Y(BHNPY;Amersham)結(jié)合在豬脾粗膜中。按以前速激肽結(jié)合試驗所述的方法(Buck等，1984)，用冷凍的脾制備膜。將一等分試樣的膜制品(約15mg組織)在含有該肽類似物、130mM NaCl、2.7mM KCl、2mMMgCl2、1.8mM CaCl2、20mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸(HEPES)、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、40μg/ml枯單桿菌肽、4μg/ml亮肽素和4μg/mol抑糜蛋白酶素的緩沖液(pH7.4)中，于室溫下保溫2小時。BHNPY的濃度為0.1nM，用1μM pNPY測定非特異性結(jié)合。樣品迅速地在用0.5%組蛋白(Ⅱ-As型;Sigma公司)預(yù)浸過夜的WhatmanGF/C濾器上過濾，并且用冰冷卻的普通的HEPES-鹽緩沖液(pH7.4)洗滌二次。由6-10點競爭曲線計算試驗肽的IC50值。應(yīng)用該方法，實例1肽衍生物的IC50小于300nM。
由于本發(fā)明的肽衍生物具有神經(jīng)肽Y拮抗劑的作用，因此該類化合物具有有價值的藥理作用，例如抗血壓過低、抗血管痙攣、血管舒張和抗高血壓作用，以及降低食物攝取要求和減少促黃體激素分泌。本發(fā)明的NPY拮抗劑的重要醫(yī)學(xué)用途是作為抗高血壓劑、抗絞痛劑、抗血管痙攣劑和減少食欲劑。
本發(fā)明的肽衍生物拮抗神經(jīng)肽Y，并因此而產(chǎn)生抗血壓過低、抗高血壓、血管舒張或其他藥理學(xué)或醫(yī)學(xué)作用所需的劑量為每天0.2mg/kg(患者體重)-250mg/kg(患者體重)，劑量根據(jù)患者的情況、需治療的血栓形成的嚴(yán)重程度以及選用的肽衍生物而定?？梢匀菀椎卮_定具體患者的合適劑量。最好每天服用1-4次，通常每次劑量為5mg-100mg有效化合物。
抗血壓過低、抗高血壓和血管舒張類治療是指治療和預(yù)防多種病癥，特別是冠狀動脈和腦血管的疾病(例如高血壓和絞痛)。在這方面有經(jīng)驗的人員容易判斷出需要這種治療的情況。這里應(yīng)用的術(shù)語“患者”是指哺乳動物，例如靈長類(包括人)、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。
雖然一些肽衍生物在口服之后還能在腸道中殘存，但申請人還是優(yōu)選非口服給藥，例如最好是經(jīng)皮下、靜脈、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥;或以下列方式給藥長效注射;植入制劑;或者例如將盛放在氣溶膠罐里的本發(fā)明肽衍生物以噴霧或噴粉形式應(yīng)用在粘膜上，例如應(yīng)用在鼻、喉和支氣管的粘膜上。
對于非經(jīng)胃腸道給藥，可以將化合物以可注射藥劑形式注射。可注藥劑的配制方法是將本發(fā)明化合物在生理上適用的稀釋劑中的溶液或混懸液與藥用載體混合;藥用載體可以是無菌液體，例如水或油;可以加或不加表面活性劑或其他藥用輔助劑?？梢詰?yīng)用在上述制劑中的油，其實例有石油產(chǎn)品，動物油，植物油或合成油，例如花生油、豆油和礦物油。一般說來，水、鹽水、葡萄糖水溶液以及有關(guān)的糖溶液、乙醇、二元醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是優(yōu)選的液體載體，尤其對于注射溶液劑更是如此。
本發(fā)明的化合物可以按長效注射劑或植入制劑的形式給藥，長效注射劑或植入制劑可以按能使有效成分緩釋的方式配制?？梢詫⒂行С煞謮撼尚⊥锠罨蛐〉闹w狀，并且以長效注射劑或植入制劑的形式植入皮下或肌內(nèi)。植入物可以應(yīng)用惰性材料，例如可生物降解的混合物或合成的硅氧烷類，例如Dow-Corning公司制造的硅橡膠、硅氧橡膠。
實例通過下述非限制性實例說明本發(fā)明。
實例1
的制備用固相合成方法，在對甲基二苯甲基胺樹脂(0.40mmol/g;Pestides Intl.)上，使用Applied Biosystems 430-A型肽合成儀在0.5mmol刻度下制備標(biāo)題肽衍生物。除Arg和Asn是用DCC/HOBT方法進(jìn)行二次縮合(double couple)外，所有的其他殘基都是以Nα-t-Boc-保護(hù)的氨基酸的對稱酸酐的形式進(jìn)行二次縮合的。側(cè)鏈保護(hù)如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMe Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-Brz)，Lys(2-Clz)，Thr(Bzl)。肽(理論量0.25mmol)從載體樹脂上切下，并且用含5%苯甲醚的液體氟化氫于-5℃反應(yīng)40分鐘脫去保護(hù)。真空除去氟化氫之后，用30%乙酸和水從樹脂中提取肽。將提取液稀釋至1升，用氫氧化銨調(diào)節(jié)pH到8和9之間，加入0.01N鐵氰化鉀，直至黃色持續(xù)存在(約需25ml)。攪拌30分鐘之后，用冰醋酸使pH降至＜5，將該溶液與25ml穩(wěn)定的AG3×4A樹脂(Bio-Rad)一起攪拌2小時。溶液過濾除去所用樹脂，再冷凍干燥。留下的肽物質(zhì)在Dynamax C-18柱(41.4×250mm;Rainin)上用制備性高壓液相色譜法純化，以乙腈在0.1%三氟乙酸(TFA)中的溶液作為洗脫劑。用分析高壓液相色譜(Vydac 218 TP54柱，4.6×250mm，2.0ml/分鐘，tc-1.9分鐘，線性梯度15-40%的乙腈在0.1%TFA中的溶液，25分鐘)、氨基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6N HCl;106℃;20和40小時)和快速原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)(M-Scan公司)檢驗肽的純度和對其定性。
AAAaB-1.96;T-1.03;S-1.62，P-1.88;A-1.96，I-2.84;L-2.14，Y-4.04，H-1.09，R-4.06。
a6N HCl，24小時，106℃。
快速原子轟擊質(zhì)譜(M+H)+3311.2±1mu。
權(quán)利要求
1.制備下式肽衍生物或其可藥用鹽的方法，Y-P-S-K-P-D
-Y-X3-A-L-R-H-Y-X4-N-L-X5-T-R-I-R-Y-Tc其中X2為S或A；X3為S或A；X4為L、I、M、Nle或V；X5為L、I、M、Nle或V；Tc為OR′或NHR′，其中R′為氫或(C1～C4)烷基；θ為下式結(jié)構(gòu)的基團(tuán)，-NH-(CH2)n-CO2-，其中n為整數(shù)1-11，該方法包括將適當(dāng)保護(hù)的酪氨酸連接到活性樹脂載體上，然后將從脯氨酸到羧基末端的酪氨酸的其它α-氨基受保護(hù)的氨基酸連結(jié)到生長中的肽鏈上的已同時通過脫去其氨基保護(hù)基而暴露出來的末端氨基上，從樹脂上切下受保護(hù)的肽，脫去所有保護(hù)基，使直鏈肽氧化縮合，最后分離環(huán)化的肽。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中X2為A。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中X3為S。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中X4為I。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中X5為I。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中θ為Aoc。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中Tc為NH2。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中的肽衍生物是
全文摘要
本文敘述了NPY的拮抗劑(它是天然存在的NPY的衍生物)及其制法。該拮抗作用可用傳統(tǒng)的競爭結(jié)合以及生物化學(xué)試驗來確證，本文還敘述了上述衍生物在涉及神經(jīng)肽Y的許多情況下的應(yīng)用。
文檔編號A61P9/12GK1040594SQ8910652
公開日1990年3月21日 申請日期1989年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月26日
發(fā)明者約翰·L·克拉提娜斯基 申請人:默里爾多藥物公司