專(zhuān)利名稱(chēng):Mcp蛋白質(zhì)的新型拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及通過(guò)適當(dāng)誘變MCP蛋白質(zhì)而產(chǎn)生MCP蛋白質(zhì)的新型拮抗劑,具體是人MCP-1蛋白質(zhì)的新型拮抗劑。
背景技術(shù):
趨化因子是小的分泌性促炎癥蛋白質(zhì),能介導(dǎo)白細(xì)胞從血液定向遷移到損傷部位。根據(jù)該蛋白質(zhì)家族特征性保守半胱氨酸的位置,趨化因子家族可依據(jù)其結(jié)構(gòu)分成C、C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子,它們存在著一系列對(duì)應(yīng)的膜受體(BaggioliniM等,1997;Fernandez EJ and Lolis E,2002)。趨化因子通常產(chǎn)生在損傷部位,引起白細(xì)胞移行和激活,在炎癥、免疫、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和血管生成過(guò)程中起著基礎(chǔ)作用。這些分子因此提供了治療干預(yù)這些過(guò)程相關(guān)疾病的可能性。具體是通過(guò)抑制特異性趨化因子和它們的受體,來(lái)預(yù)防白細(xì)胞的過(guò)度募集和激活(Baggiolini M等,2001;Loetscher P and Clark-Lewis I,2001;Godessart N and Kunkel SL,2001)。
單核細(xì)胞趨化吸引蛋白1(現(xiàn)稱(chēng)為MCP-1)是CC趨化因子家族的成員,也知道其有各種名稱(chēng),如CCL2、可誘導(dǎo)小細(xì)胞因子A2(SCYA2)、單核細(xì)胞趨化和活化因子(MCAF)、單核細(xì)胞分泌蛋白Je、單核細(xì)胞趨化因子和HC11。此趨化因子在各種炎癥疾病、不同類(lèi)型腫瘤、心臟同種移植、AIDS和結(jié)核病中,能促進(jìn)對(duì)損傷和感染信號(hào)反應(yīng)中單核細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的募集(Gu L等,1999)。
已鑒定到其結(jié)構(gòu)和功能同源性蛋白質(zhì),稱(chēng)為MCP-2(CCL7)、MCP-3(CCL8)、MCP-4(CCL13)和Eotaxin(CCL11)。C-C趨化因子的該亞族,與可能從共同祖先序列共進(jìn)化產(chǎn)生的其它C-C趨化因子,如RANTES或MIP-1α/β顯著不同。它們具有相似的受體,結(jié)合特定的CCR2(但也結(jié)合CCR1、CCR3和CCR5)。因此這些C-C趨化因子的許多免疫和炎癥激動(dòng)劑和拮抗劑活性是共同的(Hughes ALand Yeager M,1999;Berhkout TA等,1997;Luster AD and Rothenberg ME,1997;Proost P等,1996)。
已通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和其它動(dòng)物模型廣泛研究了MCP-1相關(guān)的生理活性,證明MCP-1在許多感染性、炎癥性和自身免疫性疾病中,以及與T輔助細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)中,控制著單核細(xì)胞和其它類(lèi)型細(xì)胞(如星狀細(xì)胞)的募集。表現(xiàn)出來(lái)由MCP-1誘導(dǎo)的其它疾病是血管性疾病(冠脈介入手術(shù)后的再狹窄、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、局部缺血梗塞、中風(fēng))和癌癥相關(guān)的新血管生成(Ikeda Y等,2002;Egashira K等,2002;Gu L等,2000;Salcedo R等,2000;Gosling J等,1999;Lu B等,1998;Rutledge BJ等,1995)。
由于認(rèn)為以MCP-1為靶子可作為一些疾病的潛在治療方法,文獻(xiàn)中已有不同類(lèi)型MCP-1拮抗劑的報(bào)導(dǎo),它們對(duì)MCP-1誘導(dǎo)的病理活動(dòng)獲得了或多或少的抑制作用(Dawson J,2003)。MCP-1拮抗劑的例子有N-端缺失的MCP-1突變體、天然或合成的缺失N-端2-10個(gè)氨基酸的MCP-1(Egashira K等,2000;Zhang Y andRollins BJ,1995;McQuibban GA等,2002)、抗MCP-1單克隆抗體(Ajuebor MN等,1998;Eghtesad M等,2001)、RNA aptamers(Rhodes A等,2001)、按MCP-1內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的肽(Reckless J and Grainger DJ,1999)、MCP-1拮抗肽模擬物(Kaji M等,2001)、反義寡核苷酸(WO 94/09128)、小分子(Mirzadegan T等,2000)、聚合物修飾的MCP-1(WO 02/04015)、或病毒性誘騙受體(Alexander JM等,2002;Beck CG等,2001)。
結(jié)構(gòu)上,MCP蛋白質(zhì)具有一個(gè)N-端環(huán)和C-端三個(gè)β折迭,上有一α螺旋(HandelTM等,1996;Lubkowski J等,1997;Blaszczyk J等,2000)。文獻(xiàn)提供了許多結(jié)構(gòu)-活性研究的例子(Gong JH and Clark-Lewis I.,1995;Zhang等,1996;Beall CJ等,1996;Steitz SA等,1998;Gu L等,1999;Hemmerich S等,1999;Seet BT等,2001),其中通過(guò)表達(dá)N-端截短物(如在許多其它趨化因子中那樣),或殘基3、8、10、13、15、18、19、24、28、30、37、38和39(按成熟的人MCP-1編號(hào))的單個(gè)突變物,已獲得了對(duì)受體或其它結(jié)合蛋白質(zhì)活性和/或親和力降低的MCP-1突變體。對(duì)Eotaxin也獲得了類(lèi)似結(jié)果(Mayer MR and Stone MJ,2001)。
趨化因子與蛋白聚糖(PGs)和氨醛聚糖(GAGs)的相互反應(yīng),是許多細(xì)胞信號(hào)傳遞可溶性分子(白介素,生長(zhǎng)因子)的共同特征。蛋白聚糖是陰電荷蛋白質(zhì),其經(jīng)過(guò)翻譯后修飾在絲氨酸殘基上加有氨醛聚糖側(cè)鏈。堿性殘基(主要是精氨酸和賴(lài)氨酸)的簇集使該蛋白能與GAGs相互反應(yīng),而GAGs是二糖重復(fù)單位如肝素、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和透明質(zhì)酸的共同特征。PGs和GAGs可以作為可溶性分子存在膜表面上,可保護(hù)該分子免受胞外環(huán)境的蛋白水解。也已提出GAGs可能有助于將細(xì)胞信號(hào)分子正確呈遞給它們的特異性受體,因而也可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的激活。就趨化因子而言,其在炎癥部位以固定梯度濃集,隨之與細(xì)胞受體的相互反應(yīng)和細(xì)胞的激活狀態(tài)似乎受特異性GAG的調(diào)節(jié)。已清楚證明許多趨化因子,包括MCP-1能與GAGs相互反應(yīng)并形成這些梯度,測(cè)定了它們的相對(duì)親和力。因此有人提出,調(diào)節(jié)這種相互反應(yīng)可提供治療炎癥疾病的方法(Hoogewerf AJ等,1997;Kuschert G等,1999;Ali S等,2001;Patel D等,2001;WO 02/28419;WO99/50246)。
然而,對(duì)GAG/MCP-1相互反應(yīng)的結(jié)構(gòu)要求和功能作用研究很少。已知GAGs能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MCP-1的活性和產(chǎn)生(Douglas MS等,1997)。也有人報(bào)告MCP-1的C-端賴(lài)氨酸58和組氨酸66用丙氨酸取代后,阻止了與GAG的結(jié)合,但不影響其受體結(jié)合、Ca2+流入或趨化活性(Chakravarty L等,1998),但本領(lǐng)域先前并未揭示哪些可能是MCP-1的其它GAG結(jié)合位點(diǎn),哪些可能是它們消除后的體內(nèi)效果。即使對(duì)某些趨化因子進(jìn)行了廣泛的研究,也不可能根據(jù)序列同源性預(yù)測(cè)哪些殘基經(jīng)非保守性取代修飾可影響到GAG結(jié)合,和可獲得哪些效果,因?yàn)橼吇蜃拥腉AG結(jié)合區(qū)域具有顯著的結(jié)構(gòu)多樣性(Lortat-Jacob H等,2002)。
發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)人MCP-1的N-端雙堿基位點(diǎn)(精氨酸18,賴(lài)氨酸19)負(fù)責(zé)MCP-1與GAGs的相互反應(yīng)。用非保守性取代(如用丙氨酸)消除此位點(diǎn)能產(chǎn)生MCP-1突變體,其不僅與GAG相互反應(yīng)力降低,而且令人驚奇地在體內(nèi)對(duì)MCP-1具有劑量相關(guān)的拮抗活性??衫么爽F(xiàn)象來(lái)開(kāi)發(fā)MCP-1和其它MCP蛋白的突變體,用作相應(yīng)MCP蛋白質(zhì)的拮抗劑。本發(fā)明制備的化合物可用于抑制表達(dá)MCP受體的白細(xì)胞的遷移和活化,從而為治療白細(xì)胞遷移過(guò)度或失控相關(guān)的疾病,如炎癥和自身免疫性疾病,提供了有用的治療組合物。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)說(shuō)明中得以明白。
圖1(A)如實(shí)施例中表達(dá)并測(cè)定的人和突變體MCP-1蛋白的氨基酸序列(下劃線(xiàn)表示突變的氨基酸)。純化過(guò)程中用氨基肽酶處理,除去MCP-1WT*和MCP-1WT*2A中N-端甲硫氨酸,以避免此附加殘基對(duì)該蛋白質(zhì)活性的任何干擾。
(B)成熟形式的人MCP-1(CCL2;SWISSPROT Acc.No P13500)、MCP-2(CCL7;SWISSPROT Acc.N°P80075)、MCP-3(CCL8;SWISSPROT Acc.No P80098)、MCP-4(CCL8;SWISSPROT Acc.No Q99616)和Eotaxin(CCL11,SWISSPROT Acc.NoP51671)。本專(zhuān)利申請(qǐng)中,MCP-1內(nèi)相同的堿性殘基包括括弧內(nèi)能與GAGs(殘基18和19)結(jié)合及其它有更多的同源性人蛋白質(zhì)中相應(yīng)的保守殘基。所有人MCP蛋白中其它堿性的保守殘基用下劃線(xiàn)表示。
圖2此圖提供用[3H]-肝素和作為趨化因子的MCP-1*WT(○)或MCP-1WT*2A(●)進(jìn)行肝素結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。
圖3此圖提供了平衡性競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果,通過(guò)監(jiān)測(cè)加入hMCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●)作為趨化因子,取代表達(dá)CCR2的CHO(細(xì)胞膜)的[125I]-MCP-1后的效果。
圖4此圖提供用THP-1細(xì)胞和作為趨化因子的重組人MCP-1(□)、MCP-1WT*(○)或MCP-1WT*2A(●),進(jìn)行轉(zhuǎn)移孔趨化因子試驗(yàn)(transwell chemotaxis assay)的結(jié)果。
圖5此圖小結(jié)了用MCP-1WT*和/或MCP-1WT*2A在小鼠中進(jìn)行腹膜細(xì)胞募集試驗(yàn)的結(jié)果。圖中用*號(hào)表示對(duì)MCP-1WT*募集的細(xì)胞數(shù)抑制活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的MCP-1WT*2A濃度。
圖6此圖小結(jié)了遲發(fā)性接觸超敏試驗(yàn)的結(jié)果。小鼠用0.5mg/kg MCP-1WT*2A(■)或只用運(yùn)載體(□)處理。以處理期間每天耳腫脹程度評(píng)定其效果。
圖7此圖小結(jié)了對(duì)服用博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠體重的影響。將對(duì)照鼠(□)的平均體重與接受處理的鼠(腹腔內(nèi)注射0.25mg/kg MCP-1WT*2A(●))或只注射PBS(○)小鼠的平均體重作比較。所示體重是各組小鼠的平均體重值。
圖8此圖比較了未處理和用博來(lái)霉素處理,外加腹腔內(nèi)只注射PBS或0.25mg/kg MCP-1WT*2A的小鼠中的纖維化水平。纖維化水平用實(shí)施例中所述分光光度法(上)或組織學(xué)方法(下)測(cè)定。
圖9此圖比較了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物模型只用PBS(組1)、1μgMCP-1WT*2A/小鼠(組2)、或10μg MCP-1WT*2A/小鼠(組3)處理所測(cè)得的臨床評(píng)分。
圖10此圖比較了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)動(dòng)物模型只用PBS、或1μgMCP-1WT*2A/小鼠處理所測(cè)得的臨床評(píng)分。
圖11此圖比較了從只用PBS(組1)處理和攻擊、用PBS處理和用卵白蛋白攻擊(組2)、或用10μg/小鼠MCP-1WT*2A處理和用卵白蛋白攻擊(組3)動(dòng)物模型氣管分離所得的細(xì)胞量。
發(fā)明的具體描述鑒于上述文獻(xiàn)所述,尚不清楚人MCP-1的N-端特異性雙堿性(氨基酸)位點(diǎn)是否界定了的GAG的結(jié)合位點(diǎn),而此位點(diǎn)殘基的非保守性取代可導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)MCP-1具有拮抗活性的分子。然而,鑒于此雙堿性(氨基酸)位點(diǎn)在已知MCP蛋白中的保守性,以及其它堿性氨基酸和/或已知參與GAG結(jié)合的殘基的保守性,可推斷通過(guò)非保守性取代相應(yīng)的人MCP-1中功能特征性的殘基,可獲得MCP蛋白的拮抗劑。
本發(fā)明的主要目的是提供由MCP蛋白突變體組成的MCP蛋白質(zhì)的新穎拮抗劑,這些突變體是將人成熟的MCP-1序列中以下編號(hào)的殘基組合被替代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19;b)18和/或19,加上58;c)18和/或19,加上66;d)18和/或19,加上58和66;e)18和/或19,加上以下24、44、49、75中的一個(gè)或多個(gè)。
本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┥鲜鼋M合的具體實(shí)施例,即精氨酸18和賴(lài)氨酸19用丙酸取代的新穎重組MCP-1突變體獲得的令人吃驚的體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)。這些結(jié)果,與其它高度保守MCP蛋白的序列和結(jié)構(gòu)知識(shí)相結(jié)合,提示此雙堿性(氨基酸)位點(diǎn)不僅在MCP蛋白質(zhì)生物活性中起著主要作用,而且可在這些同源性蛋白質(zhì)中進(jìn)行相應(yīng)的修飾以獲得拮抗分子。
為獲得具有拮抗性能的分子,以非保守性方式突變MCP蛋白質(zhì)中的堿性殘基必須是18和19位的二個(gè)殘基、至少18和19位堿性殘基之一加上已知參與GAG結(jié)合的殘基如58和66(Chakravarty L等,1999)中至少一個(gè)、或至少18和19位堿性殘基之一加上在所有的人MCP蛋白中保守的其它堿性殘基(圖1B;berhkoutTA等,1997)中至少一個(gè)。取代該堿性殘基的氨基酸宜為非極性小氨基酸,如丙氨酸或甘氨酸,但其它氨基酸也適合,只要它們帶有電荷,而且大小幾乎不會(huì)干擾該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),同時(shí)與GAG結(jié)合不相容,如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺。
因此,本發(fā)明的主要目的是提供含有上述突變組合,和可作為MCP蛋白拮抗劑的MCP蛋白質(zhì)突變體。
術(shù)語(yǔ)“MCP蛋白的拮抗劑”指可作為相應(yīng)的成熟性全長(zhǎng)天然產(chǎn)生的(野生型)MCP蛋白質(zhì)的拮抗劑的任何份子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道MCP-1拮抗劑包含有(序列)修飾。
本申請(qǐng)的含義中,術(shù)語(yǔ)MCP蛋白質(zhì)包括人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4和人Eotaxin(圖1B;此圖顯示了相應(yīng)的SWISSPROT登錄號(hào)),以及具有與人成熟的MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、或Eotaxin至少70%,優(yōu)選80%和更優(yōu)選90%同源性,并在所有上述位置中含有堿性陽(yáng)電荷的氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸或組氨酸)的任何其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一主題是選自以下的MCP蛋白質(zhì)的拮抗劑a)上述MCP蛋白質(zhì)突變體中有一個(gè)或多個(gè)加入、缺失或取代的氨基酸殘基而不干擾其拮抗活性的活性突變體;b)根據(jù)(a)所述多肽或肽的序列和/或結(jié)構(gòu)所設(shè)計(jì)的肽模擬物;c)多肽或肽,其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和屬于相應(yīng)MCP蛋白質(zhì)以外的某一蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列;d)上述(a)、(b)或(c)的活性組分、前體、鹽或衍生物。
上述MCP突變體的拮抗性質(zhì),在本專(zhuān)利申請(qǐng)中以MCP-1WT*2A為例作為MCP-1的拮抗劑,可以活性突變體(形式)保持或甚至加強(qiáng)。該分子的類(lèi)型包括所述序列的天然或人造同類(lèi)物,其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的加入、缺失或取代,只要它們用本領(lǐng)域已知的和下述實(shí)施例說(shuō)明的方法測(cè)定時(shí)能顯示本發(fā)明特征性的同樣生物活性,水平相當(dāng)或更高。
例如,可接受的取代應(yīng)針對(duì)于不參與GAG結(jié)合的殘基,如實(shí)施例中所示,用異亮氨酸取代64位的甲硫氨酸(MCP-1WT*2A;SEQ ID NO3)可改進(jìn)純化而不會(huì)改變?nèi)薓CP-1的基本性能。本發(fā)明的另一目的因此是具有MCP-1WT*2A相應(yīng)序列(SEQ ID NO3)的MCP-1拮抗劑?;蛘?,除了取代針對(duì)參與GAG結(jié)合的該殘基外,MCP-1拮抗劑可如已知的MCP-1 N-端缺失突變體(Egashira K等,2000;Zhang Y and Rollins BJ,1995;McQuibban GA等,2002)那樣,短少2-10個(gè)N-端氨基酸,而可能獲得改進(jìn)的拮抗性能。
天然同類(lèi)物,指人或其它生物中認(rèn)定的MCP蛋白質(zhì)的相應(yīng)序列,如小鼠MCP-1(SWISSPROT Acc.No P10148)。人造同類(lèi)物,指用已知的化學(xué)合成和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)或任何其他已知的合適技術(shù)制備的肽,它們提供了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可用本領(lǐng)域先前報(bào)導(dǎo)的和本專(zhuān)利申請(qǐng)實(shí)施例中提供的方法,能常規(guī)地獲得并測(cè)定的一組有限數(shù)量的基本上相對(duì)應(yīng)的突變或截短的肽,或多肽。
根據(jù)本發(fā)明,這些活性突變中優(yōu)選的變化是眾所周知的“保守性”或“安全性”取代,涉及非堿性殘基。保守性氨基酸取代是用具有充分相似化學(xué)性能的氨基酸的取代,以保存該分子的結(jié)構(gòu)和生物功能。已知可在上述序列中進(jìn)行氨基酸插入和缺失而不會(huì)改變它們的功能,特別是如果這種插入或缺失僅涉及少數(shù)氨基酸,如10個(gè)以下,優(yōu)選3個(gè)以下,并且不去除或置換蛋白質(zhì)或肽功能構(gòu)象的關(guān)鍵性氨基酸。
文獻(xiàn)中提供了關(guān)于以天然蛋白質(zhì)序列和/或結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)學(xué)和理化研究為基礎(chǔ),進(jìn)行保守性氨基酸取代選擇的許多模型(Rogov SI and Nekrasov AN,2001)。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)已證明,采用特異性的氨基酸亞組可產(chǎn)生可折迭的活性蛋白質(zhì),有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可能更易容納的氨基酸“同義”取代的分類(lèi),該氨基酸“同義”取代可被用于檢測(cè)功能和結(jié)構(gòu)同類(lèi)物和共生同源物(Murphy LR等,2000)。同義氨基酸分組和更優(yōu)選的同義組見(jiàn)表1。
基于這些技術(shù)進(jìn)行取代而產(chǎn)生的活性突變體,以及消除或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸產(chǎn)生的活性突變體,均在本發(fā)明的目的之內(nèi),即新穎的MCP蛋白突變體與GAG結(jié)合能力差,對(duì)相應(yīng)的MCP蛋白的拮抗活性與最初選出的突變體相當(dāng),或如可能甚至更好。
上述替代化合物,指包括上述MCP蛋白質(zhì)突變體的序列有所改變但不影響本專(zhuān)利申請(qǐng)所述基本特征,特別是所關(guān)注的它的作為拮抗劑的活性能力。類(lèi)似的化合物可得自常規(guī)誘變編碼DNA的技術(shù),編碼DNA序列水平上的組合技術(shù)(如DNA改組、噬菌體展示/選擇),或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)研究,然后如本領(lǐng)域先前所述和下述實(shí)施例所示進(jìn)行所需活性的驗(yàn)證。
可獲得上述MCP突變體的肽模擬物(也稱(chēng)為模擬肽)形式的特異性拮抗劑,其中所述肽或多肽的性質(zhì)已在氨基酸側(cè)鏈水平上、氨基酸手性和/或肽骨架水平上作了化學(xué)修飾。這些替代物目的是提供具有類(lèi)似的或改進(jìn)的治療、診斷和/或藥物學(xué)動(dòng)力性能的MCP拮抗劑。
例如,當(dāng)所述肽對(duì)肽酶的切割敏感時(shí),將其注入患者可產(chǎn)生問(wèn)題;用不可切割的肽模擬物代替特別敏感的肽鍵可提供更穩(wěn)定因而治療上更有用的肽。與此相似,取代L-氨基酸殘基是賦予肽對(duì)蛋白酶水解不敏感的標(biāo)準(zhǔn)方法,最終的產(chǎn)物更類(lèi)似于有機(jī)化合物而不是肽。其它有用的是氨基未端封閉基團(tuán),如叔丁氧基羰基、乙基、乙酰基、琥珀?;⒓籽趸牾;h(huán)庚基、己二?;⑷啥;?、1-二甲胺基萘-5-磺?;⑵S氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基-壬二?;?、甲氧基己二?;?、甲氧基環(huán)庚基和2,4,-二硝基苯基。其它許多修飾可提供的效能提高,活性延長(zhǎng),純化容易和/或半衰期增長(zhǎng),這已為本領(lǐng)域所知(WO 02/10195;Villain M等,2001)。肽模擬物中所含的優(yōu)選替代“同義性”氨基酸分組見(jiàn)表2中所述的那些。
合成和開(kāi)發(fā)肽模擬物及非肽模擬物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(Sawyer TK,1997;Hruby VJ and Balse PM,2000;Golebiowski A等,2001)。采用體內(nèi)和體外翻譯系統(tǒng)在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸,以探索和/或改進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的各種方法文獻(xiàn)中也有說(shuō)明(Dougherty DA,2000)。文獻(xiàn)中報(bào)告的MCP-1拮抗性肽模擬物與MCP-1無(wú)高度同源性(Kaji M等,2001)。
本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了具有MCP拮抗性的多肽或肽,其含有上述氨基酸序列,和屬于相應(yīng)MCP蛋白質(zhì)以外的某一蛋白質(zhì)序列的氨基酸序列的多肽或肽。后一異源性序列應(yīng)可提供額外的性能但不明顯損傷其拮抗活性,或提供GAG結(jié)合性能。這些額外的性能的例子是較易純化過(guò)程,在體液中半衰期持續(xù)更長(zhǎng),或可胞外定位。這后一特性對(duì)上述定義所包括的融合或嵌合性蛋白質(zhì)的特異性基團(tuán)是特別重要的,因?yàn)樗軐⒆鳛楸緦?zhuān)利申請(qǐng)的MCP拮抗劑的分子,定位在不僅有利于這些肽的分離和純化,而且有利于MCP蛋白與它們的天然受體相互反應(yīng)的部位。
可用于產(chǎn)生(c)中所述多肽或肽的其它蛋白質(zhì)序列,是膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的恒定區(qū)、多聚化功能域、胞外蛋白質(zhì)、含信號(hào)肽的蛋白質(zhì)、含輸出信號(hào)的蛋白質(zhì)。選擇一個(gè)或多個(gè)這些序列,與MCP蛋白的突變體融合,對(duì)所述制劑的具體應(yīng)用也起著功能作用。作為一個(gè)通用方法,這些融合蛋白可用常規(guī)基因工程技術(shù)產(chǎn)生編碼它們的核酸區(qū)段,將其克隆入可復(fù)制性病毒載體或質(zhì)粒中,采用游離體形式或非同源性/同源性整合載體,以及轉(zhuǎn)化、傳染或轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的技術(shù),用于修飾原核或真核宿主細(xì)胞。這些載體應(yīng)能在它們自己的轉(zhuǎn)錄起始/終止調(diào)節(jié)序列(選擇它們是因其在所述細(xì)胞中有組成性活性或可誘導(dǎo)活性)控制下,在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)含有MCP拮抗劑的融合蛋白。然后可分離實(shí)質(zhì)上富含此類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞系來(lái)提供穩(wěn)定的細(xì)胞系。
當(dāng)該加入的蛋白質(zhì)序列,如果是胞外蛋白質(zhì)、含輸出信號(hào)的蛋白質(zhì)或含信號(hào)肽的蛋白質(zhì)的序列時(shí),可使MCP拮抗劑分泌到胞外間隙中,因而更易從培養(yǎng)的細(xì)胞中收集和純化所述物質(zhì)用于進(jìn)一步加工,或者,可直接采用或給予所述細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽或肽可采取其它替代形式,根據(jù)所希望的應(yīng)用和/或生產(chǎn)方法優(yōu)化,例如活性組分、前體、鹽、衍生物、偶聯(lián)物或復(fù)合物形式。
術(shù)語(yǔ)“活性”指應(yīng)能保持本發(fā)明MCP突變體的功能特征,并為藥學(xué)上可接受和使用的那些替代化合物。
術(shù)語(yǔ)“組分”指所述化合物本身的多肽鏈的任一片段,單獨(dú)或與其結(jié)合的相關(guān)分子或殘基,例如糖殘基或磷酸基的聯(lián)合,或最初的多肽或肽的凝聚物。這類(lèi)分子也可產(chǎn)生自通常不會(huì)改變一級(jí)序列的其它修飾,如體內(nèi)或體外的肽化學(xué)衍生(乙?;螋驶?,通過(guò)在肽合成和加工過(guò)程中或進(jìn)一步加工步驟中,修飾其磷酸化(導(dǎo)入磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基)或糖基化(使肽接觸能影響糖基化的酶,如哺乳動(dòng)物糖基化酶或脫糖基化酶)模式。
“前體”是在給予細(xì)胞或機(jī)體前或后,通過(guò)代謝和酶加工可轉(zhuǎn)變成本發(fā)明化合物的化合物。
術(shù)語(yǔ)“鹽”本文指本發(fā)明的肽、多肽或其同類(lèi)物的羧基鹽和氨基的酸加成鹽??赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法形成羧基鹽,包括無(wú)機(jī)鹽,如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等,含有機(jī)堿的鹽是例如,含胺基如三乙醇胺、精氨酸或賴(lài)氨酸、哌啶、普魯卡因等的那些鹽。酸加成鹽包括,例如,含無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸的鹽,含有機(jī)酸如乙酸或草酸的鹽。任何一種這類(lèi)鹽應(yīng)具有與本發(fā)明的肽或多肽或它們的同類(lèi)物基本相似的活性。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”本文用于指可按照已知方法從氨基酸組成的兩側(cè)鏈上的功能基團(tuán),或N-/C-末端基團(tuán)制備的衍生物。這類(lèi)衍生物包含有,例如酯或羧基的脂肪簇酰胺,和游離氨基的N-?;苌铮蛴坞x羥基與?;绱减;蚍减;纬傻腛-酰基衍生物。
本發(fā)明MCP拮抗劑的有用的偶聯(lián)物或復(fù)合物可用本領(lǐng)域已知的分子和方法,與受體或其它蛋白質(zhì)(放射活性標(biāo)記或熒光標(biāo)記、生物素)相互反應(yīng)而產(chǎn)生,為改進(jìn)其治療效果(細(xì)胞毒性劑),或改進(jìn)制劑的藥物輸送效果,可采用例如聚乙二醇和其它天然或或合成的聚合物(Pillai O and Panchagnula R,2001)。
本發(fā)明的化合物可用本領(lǐng)域熟知的方法制備,包括上述重組DNA相關(guān)技術(shù),和化學(xué)合成技術(shù)。
本發(fā)明另一主題是含有編碼本發(fā)明MCP突變體DNA序列的DNA分子,它們含有基本上相同的核苷酸序列?!盎旧舷嗤暮塑账嵝蛄小卑ń柚谶z傳密碼子的簡(jiǎn)并性編碼上述給定氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本發(fā)明還包括含有上述DNA的表達(dá)載體、用此類(lèi)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,和通過(guò)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞并收集表達(dá)的蛋白質(zhì)制備本發(fā)明MCP拮抗劑的方法。
可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列插入和連接入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中。一旦形成表達(dá)載體,可將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞,表達(dá)該載體來(lái)產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
采用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體,上述本發(fā)明的任何重組蛋白質(zhì)可在真核細(xì)胞(如酵母菌、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或原核細(xì)胞中有效表達(dá)??刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法。
例如,可用本領(lǐng)域熟知技術(shù),將上述任一方法獲得的編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子插入到適當(dāng)構(gòu)成的表達(dá)載體中。用同聚物尾接或限制性連接將雙鏈cDNA連接于質(zhì)粒載體,涉及采用合成的DNA接頭或平端連接技術(shù)利用DNA連接酶連接該DNA分子,并用堿性磷酸酶處理來(lái)避免不需要的連接。
為了能表達(dá)所需蛋白質(zhì),表達(dá)載體還應(yīng)含有特定的核苷酸序列,此序列含有與編碼所需蛋白質(zhì)DNA相連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息,以此種方式可使基因表達(dá)和產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。為了轉(zhuǎn)錄該基因,必須先由RNA聚合酶鑒定啟動(dòng)子,RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子后啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。有各種各樣的此類(lèi)啟動(dòng)子可用,它們的工作效率不同(強(qiáng)和弱啟動(dòng)子)。
對(duì)于真核細(xì)胞宿主,可采用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列,取決于該宿主的性質(zhì)。它們可來(lái)源于病毒,如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等,其中調(diào)控信號(hào)與具有高表達(dá)水平的特定基因相連。例子是皰疹病毒的TK啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、酵母菌的gal4基因啟動(dòng)子等??蛇x擇轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)調(diào)控信號(hào)以便抑制和活化,從而調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)。
將含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列的DNA分子插入已操作性連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào),因而能將所需基因序列整合入宿主細(xì)胞的載體中。
也可通過(guò)導(dǎo)入能夠選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)志,以選擇受該導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這類(lèi)標(biāo)志還可向營(yíng)養(yǎng)缺陷性宿主提供光營(yíng)養(yǎng)、抗微生物抗性,如抗生素或重金屬如銅等的抗性。可將該選擇性標(biāo)志基因直接連接于待表達(dá)的DNA基因序列,或通過(guò)共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同一細(xì)胞中。
也可采用該載體的附加元件來(lái)獲得本發(fā)明蛋白質(zhì)的最佳產(chǎn)量,特別是用于選擇含有質(zhì)?;虿《据d體的特定細(xì)胞;借助該元件可易于識(shí)別含有該載體的受體細(xì)胞并從不含該載體的受體細(xì)胞中選出它們;在特定宿主中產(chǎn)生該載體所需的拷貝數(shù);以及是否需要能使該質(zhì)?!按┧蟆庇诓煌N宿主細(xì)胞之間。
一旦制備好用于表達(dá)的含所述構(gòu)建物的載體或DNA序列后,可用各種合適的方法轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、偶聯(lián)、原生質(zhì)融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等中的任一種,將該DNA構(gòu)建物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中。
宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。優(yōu)選為真核宿主,例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如人、猴、小鼠和中國(guó)侖鼠卵巢(CHO)細(xì)胞,因它們能向蛋白質(zhì)分子提供翻譯后修飾,包括正確折迭或在正確位點(diǎn)糖基化。酵母菌也能進(jìn)行翻譯后肽的修飾包括糖基化。已有許多利用強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)質(zhì)粒的重組DNA策略,可用于在酵母菌中生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)。酵母菌可識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物上的前導(dǎo)序列,并分泌帶有前導(dǎo)序列的肽(即前肽)。
導(dǎo)入所述載體后,在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)宿主細(xì)胞,該培養(yǎng)基的選擇是能使含有載體的細(xì)胞生長(zhǎng)??寺』蛐蛄械谋磉_(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的這些目的可通過(guò)將本專(zhuān)利申請(qǐng)所提供的的關(guān)于MCP蛋白質(zhì)拮抗劑的內(nèi)容,與常用的分子生物學(xué)技術(shù)知識(shí)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。許多綜述(Makrides SC,1999)和書(shū)籍提供了怎樣采用載體和原核或真核宿主細(xì)胞來(lái)克隆和產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的技術(shù),如以下系列化書(shū)籍的一些題目“A Practical Approach”牛津大學(xué)出版社出版(“DNA Cloning2Expression Systems”,1995;“DNA Cloning 4MammalianSystems”,1996;“Protein Expression”,1999;“Protein Purification Techniques”,2001)。
化學(xué)合成技術(shù)的例子是固相合成和液相合成。當(dāng)固相合成時(shí),例如,將待合成的肽的C-末端相應(yīng)氨基酸固定在一種有機(jī)溶劑不溶的支持物上,通過(guò)交替重復(fù)反應(yīng),將含氨基和受相應(yīng)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的側(cè)鏈功能基團(tuán)的氨基酸,從C-末端一個(gè)接一個(gè)地縮合連接至N-末端,并使該肽結(jié)合于樹(shù)脂的氨基酸或氨基的保護(hù)基團(tuán)釋放,以此種方式延伸肽鏈。固相合成方法主要分成tBoc法和Fmoc法,取決于所用的保護(hù)基團(tuán)類(lèi)型。通常采用的氨基保護(hù)基團(tuán)包括tBoc(叔丁氧基羰基),Cl-Z(2-氯芐氧羰基),Br-Z(2-溴芐氧羰基),Bzl(芐基),F(xiàn)moc(9-芴基甲氧羰基),Mbh(4,4’-二甲氧基二苯甲基),Mtr(4-甲氧基2,3,6-三甲基苯磺?;?,Trt(三苯甲基),Tos(甲苯磺?;?,Z(芐氧基羰基)和Cl2-Bzl(2,6-二氯芐基);胍基保護(hù)基團(tuán)為NO2(硝基)和Pmc(2,2,5,7,8-五甲基苯丙二氫吡喃-6-磺?;?;羥基保護(hù)基團(tuán)為tBu(叔丁基)。合成所需肽后,使其經(jīng)歷脫保護(hù)反應(yīng)從固相支持物上切下。這種肽切除反應(yīng)對(duì)Boc法可用氟化氫或硫酸三氟甲烷進(jìn)行,對(duì)Fmoc法用TFA進(jìn)行。全合成性MCP蛋白質(zhì)見(jiàn)文獻(xiàn)(BrownA等,1996)。
本發(fā)明的天然、合成或重組的MCP拮抗物的純化,可采用用于此目的的任何一種已知方法進(jìn)行,即任何常規(guī)方法包括抽提、沉淀、層析、電泳等。可用于優(yōu)先純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的另一種純化方法是親和層析法,該方法使用單克隆抗體或親和基團(tuán),其能結(jié)合靶蛋白并生產(chǎn)和固定在柱中所含凝膠基質(zhì)上。使含有所述蛋白的不純制品通過(guò)此柱。所述蛋白質(zhì)通過(guò)肝素或特異性抗體結(jié)合于該柱上,雜質(zhì)則流穿而過(guò)。洗滌后,通過(guò)改變pH或離子強(qiáng)度從凝膠上洗脫所述蛋白質(zhì)。或者,可采用HPLC(高效液相層析)??刹捎贸S糜诘鞍踪|(zhì)純化的水乙腈溶劑進(jìn)行洗脫。本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的純化制品。本文所用的純化制品指含有本發(fā)明化合物干重至少1%,優(yōu)選至少5%的制品。
本發(fā)明另一目的是將上述MCP拮抗劑用作藥物,特別是用作藥物組合物中的活性成分(與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑、穩(wěn)定劑或稀釋劑組合配制),以治療或預(yù)防因MCP蛋白質(zhì)不良活性致使表達(dá)其受體的白細(xì)胞過(guò)度遷移和激活所致的相關(guān)疾病,如自身免疫病和炎癥疾病及細(xì)菌和病毒感染。這些疾病的非限制性例子有以下關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、骨關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、全身性硬化癥、硬皮病、多肌炎、腎小球腎炎、纖維化、肺纖維化、變態(tài)性或過(guò)敏性疾病、皮炎、IV型過(guò)敏也稱(chēng)為遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)或DTH、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎癥性腸病(IBD)、Crohn’s病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、敗血性休克、HIV感染、移植、移植物抗宿主疾病(GVHD)、子宮內(nèi)膜移位癥、胰腺炎、甲狀腺炎、腦病。
回顧關(guān)于本主題的文獻(xiàn),MCP蛋白質(zhì)拮抗劑可作為藥物組合物的活性成分,用于治療或預(yù)防MCP蛋白不良活性相關(guān)的其它疾病,如血管疾病(冠脈介入手術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、局部缺血、中風(fēng))或癌癥。
因此,本發(fā)明的另一主題是治療或預(yù)防上述疾病的方法,該方法包括給予有效量的本發(fā)明MCP蛋白拮抗劑。
所述藥物組合物除MCP拮抗劑外,可含適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的運(yùn)載體、生物相容性運(yùn)載體和適合給予動(dòng)物的添加劑(如生理鹽水),甚至可含有促進(jìn)該活性化合物加工成為藥學(xué)上可用的制品的輔助劑(如賦形劑、穩(wěn)定劑或稀釋劑)。這類(lèi)組合物實(shí)際上可與具有協(xié)同作用的其它治療組合物合用,或與本發(fā)明MCP突變體以協(xié)同方式合用。例如,已證明CC-趨化因子拮抗劑與環(huán)胞菌素合用有類(lèi)似的協(xié)同性能(WO 00/16796)。另外,可采用其它已知具有治療作用的組合物來(lái)治療特定的疾病(如IFN-β治療多發(fā)性硬化癥,可溶性腫瘤壞死因子(TNF)受體治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)。
可按符合給藥方式需要的可接受方法配制藥物組合物。例如,文獻(xiàn)中已報(bào)導(dǎo)了采用生物材料和其它聚合物遞送藥物,及不同的技術(shù)和方法驗(yàn)證給藥的具體方式(Luo B and Prestwich GD,2001;Cleland JL等,2001)。
“有效量”指所述活性成分的給藥量足以影響疾病進(jìn)程和嚴(yán)重程度,導(dǎo)致病理過(guò)程減輕或緩和。有效量取決于給藥途徑和病人狀況。
“藥學(xué)上可接受的”指包含不會(huì)干擾所述活性成分生物活性作用,并對(duì)給予的宿主無(wú)毒性的任何運(yùn)載體。例如,腸胃道外給藥時(shí),上述活性成分以單位劑量形式配制在運(yùn)載體,如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中,供注射用。
為建立所述活性成分理想的血液水平,本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用并確定給藥的可接受方式。例如,可通過(guò)各種腸胃道外途徑給藥,如皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、透皮、直腸內(nèi)、口服或口頰途徑。腸胃道外給藥可以是藥團(tuán)注射或長(zhǎng)時(shí)間逐步灌輸。非腸胃道給藥的制劑包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液,可含有本領(lǐng)域已知的輔助劑或賦形劑,可按常規(guī)方法制備。此外,所述活性化合物的懸浮液可作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙航o予。合適的親脂性溶劑或運(yùn)載體包括脂肪油類(lèi),例如芝麻油或合成的脂肪酸酯,例如油酸乙酯或甘油。水性注射用懸浮液可含有能增加懸液粘度的物質(zhì),如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地,該懸浮液也可含穩(wěn)定劑。藥物組合物包含適合注射給藥的溶液,含有約0.01-99%,宜含約20-75%的活性化合物和賦形劑。可以直腸給藥的組合物包括栓劑。
可理解,給藥劑量取決于接受者的年齡、姓別、健康狀況和體重、同時(shí)也取決于并行治療(如果有的話(huà))、治療的頻率和所需效果的性質(zhì)。劑量應(yīng)視各個(gè)對(duì)象而定,這是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道和可確定的。對(duì)于每一治療所需的總劑量可以是按分次劑量方式或以一次劑量方式給予。本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)給藥或與其它針對(duì)該疾病或針對(duì)該病其它癥狀的治療劑聯(lián)合給藥。通?;钚猿煞值拿咳談┝吭诿抗矬w重0.01-100毫克。通常每天每公斤1-40毫克分成幾次給予或以緩釋形式給予,有效地獲得所需結(jié)果。再次或后續(xù)給藥的劑量可與初次或原先給予個(gè)體的劑量相同、較少或較高。
本發(fā)明通過(guò)參考具體實(shí)施例進(jìn)行描述,但描述的內(nèi)容包括本領(lǐng)域技術(shù)人員可執(zhí)行的所有修飾和替代,這些均不超出本文權(quán)利要求所述的內(nèi)容和目的。
現(xiàn)在本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行描述,這些實(shí)施例不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例將參考附圖進(jìn)行以下說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1非肝素結(jié)合MCP-1突變體MCP-1WT*2A的體外特征材料和方法MCP-1突變體MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的表達(dá)MCP-1突變體通過(guò)體外PCR誘變編碼人MCP-1(hMCP-1;圖1;SEQ ID NO1),特別是成熟形式的人MCP-1的DNA序列而產(chǎn)生,其相應(yīng)于該前體分子的24--99區(qū)段(SWISSPROT Acc No P135OO)。
首先產(chǎn)生編碼稱(chēng)為MCP-1WT*的活性突變體MCP-1蛋白的質(zhì)粒。其中在編碼人MCP-1序列的N-端(24-99)加上一個(gè)甲硫氨酸起始密碼子,一個(gè)內(nèi)部甲硫氨酸(前體蛋白的87位氨基酸和成熟蛋白的64位氨基酸)用異亮氨酸替代。當(dāng)該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),此種替代可避免形成含甲硫氨酸亞砜的不良MCP-1種類(lèi),而不影響MCP-1的典型性能(Paavola CD等,1998)。將得到的序列,稱(chēng)為MCP-1WT*,通過(guò)采用以pET3質(zhì)粒為基礎(chǔ)的質(zhì)??寺∪氪竽c桿菌中并在其中表達(dá)(Paavola CD等,1998),產(chǎn)生含77個(gè)殘基的蛋白質(zhì)(圖1A;SEQ ID NO2)。
然而該表達(dá)MPC-1WT*的質(zhì)粒進(jìn)一步由一PCR片段的克隆所誘變,所述PCR片段編碼在人MCP前體中41和42位(在成熟蛋白的18和19位)上取代精氨酸和賴(lài)氨酸的2個(gè)丙氨酸,此種誘變產(chǎn)生與MCP-1WT*有相同長(zhǎng)度和純化性能的MCP-1突變體MCP-1WT*2A(圖1,SEQ ID NO.3)。
獲得的所有構(gòu)建物用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)控制(PCR誘變和擴(kuò)增、DNA測(cè)序、限制性酶消化),克隆過(guò)程維持在大腸桿菌DH5α菌株中進(jìn)行。選擇的編碼序列具有可用于在大腸桿菌中表達(dá)的最適密碼子(Kane JF,1995)。
將編碼MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的pTE3質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21(pLYs)衍生菌株TAP302中,所得菌株用于上述MCP-1突變體的重組表達(dá)(Paavola CD等,1998)。此方案包括采用氨基肽酶去除N-端甲硫氨酸,如此獲得的重組MCP-1突變體具有與天然成熟形式相同的長(zhǎng)度(76個(gè)氨基酸;圖1B)。通過(guò)質(zhì)譜驗(yàn)證此重組蛋白的同一性。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的層析法試驗(yàn)將MCP-1WT*和MCP-1WT*2A加載到肝素Sepharose柱上或SP Sepharose陽(yáng)離子交換柱上。兩柱均用10mM磷酸鉀(PH7.5)平衡,用同一緩沖液配的0到1MNaCl以線(xiàn)性梯度洗脫該蛋白質(zhì)。
MCP-1WT*和MCP-1WT*2A的肝素結(jié)合試驗(yàn)將包括0.02-30μM范圍的MCP-1WT*突變體以磷酸緩沖鹽水(PBS)配成系列稀釋液,與170nM的[3H]-肝素37℃培育1小時(shí)。將每份樣品20微升一式三份轉(zhuǎn)移到配有硝酸纖維濾膜的96孔P81 Unifilter板(Whatman Inc)中。用200微升PBS,真空泵洗滌該板三次去除未結(jié)合的標(biāo)記肝素。各孔加入閃爍液(50微升),在β計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)放射活性(每孔一分鐘)。用Prism程序分析數(shù)據(jù)(GraphPad Software)。
平衡競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合試驗(yàn)此試驗(yàn)在穩(wěn)定表達(dá)MCP-1受體(CCR2)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的膜上進(jìn)行,采用閃爍親近測(cè)定法(SPA),以[125I]-MCP-1作為示蹤劑。按[125I]供應(yīng)商(Amersham)說(shuō)明書(shū),從重組的成熟MCP-1產(chǎn)生放射標(biāo)記的趨化因子(比活性2200mCi/mole)。用結(jié)合緩沖液(50mM HEPES pH7.2,1mM CaCl2,5mM MgCl2,0.15M NaCl0.5%BSA)配制未標(biāo)記MCP-1突變體的系列稀釋液(范圍10-6~10-12M)制備競(jìng)爭(zhēng)劑。
在PBS中重懸麥胚SPA珠(Amersham)至50mg/ml,以結(jié)合緩沖液稀釋至10mg/ml,此試驗(yàn)的最終濃度為0.25mg/孔。將表達(dá)CCR2的細(xì)胞膜-80℃保存,以結(jié)合緩沖液稀釋至80μg/ml。最終的膜濃度為2μg/孔,[125I]-MCP-1為0.1nM。室溫震搖培育此板4小時(shí)。在β計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)放射活性(每孔一分鐘)。用Grafit程序分析一式三份樣品(Erithacus Software)。
結(jié)果文獻(xiàn)顯示測(cè)定MCP-1的肝素/GAG結(jié)合性能有不同方法(Hoogewerf AJ等,1997;Kuschert G等,1999;Ali S等,2001;Patel D等,2001;Chakravarty L等,1998)。
在大腸桿菌中表達(dá)兩種MCP-1突變體,其序列基于成熟形式的人MCP-1(圖1)。第一種為MCP-1WT*,對(duì)應(yīng)于成熟的人MCP-1前體,具有已知能消除甲硫氨酸氧化可能性而不會(huì)干擾MCP-1經(jīng)典的結(jié)合性能和活性的突變(Paavola CD等,1998)。第二種突變體為MCP-1WT*2A,基于此“活性”突變體的序列表達(dá),其中N-端雙堿性氨基酸位點(diǎn)已用丙氨酸殘基取代。
先通過(guò)肝素層析測(cè)定了后一取代對(duì)MCP-1性能的影響。加載在此層析柱上后,此二突變體的洗脫圖形顯著不同,這是因?yàn)橄疵揗CP-1WT*所需的NaCl濃度為0.54M NaCl,而MCP-1 WT*2A使用的洗脫液為0.24M NaCl。在SP Sepharose柱上利用陽(yáng)離子交換層析測(cè)得的差異較小(0.55M NaCl對(duì)0.27M NaCl)。
該層析介質(zhì)上的洗脫圖形比較,提供了因堿性氨基酸的非特異性靜電作用對(duì)肝素結(jié)合性能的貢獻(xiàn)的定量指標(biāo)(ProudfootA等,2001)。陽(yáng)離子交換層析獲得的NaCl濃度之差,是減去從肝素層析獲得的濃度而得到的。按照此方法,當(dāng)所得數(shù)字為正時(shí)(此例為0.02M),可得到的結(jié)論是鑒定到的與肝素的特異性相互反應(yīng)與MCP-1WT*2A中的雙堿性氨基酸位點(diǎn)突變相關(guān)。
然后用氚化肝素和表達(dá)MCP-1突變體的大腸桿菌系列稀釋液,直接測(cè)定與肝素的結(jié)合(圖2)。將該稀釋液加到硝酸纖維濾膜上分離得到蛋白質(zhì)-肝素復(fù)合物。硝酸纖維支持物能有效保留蛋白質(zhì),因而能評(píng)價(jià)結(jié)合于該蛋白質(zhì)的放射標(biāo)記的肝素量。此方法證實(shí)與MCP-1WT*相比,MCP-1WT*2A的肝素結(jié)合性能顯著降低。
最后,進(jìn)行平衡競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合試驗(yàn)以證明MCP-1WT*2A的肝素結(jié)合性能降低對(duì)特異性受體CCR2結(jié)合的影響(圖3)。將含有放射標(biāo)記的MCP-1樣品與兩種突變體之一或MCP-1的系列稀釋液混合,與由穩(wěn)定表達(dá)CCR2的CHO細(xì)胞制備的膜一起培育。雖然MCP-1WT*和MCP-1蛋白顯示了幾乎相同的結(jié)合圖形,但MCP-1WT*2A突變體顯示對(duì)CCR2的親和力降低20倍,因?yàn)樗腎C50為1.73±0.6nM,相比較其它兩種測(cè)試蛋白為0.08±0.045nM,顯示該肝素結(jié)合缺陷性MCP-1突變體維持了高親和力。
實(shí)施例2非肝素結(jié)合性MCP-1突變體在細(xì)胞募集模型中的特征分析材料和方法趨化作用試驗(yàn)此試驗(yàn)在配有5μm孔徑膜(Neuroprobe)的24孔transwell趨化小室(Costar)中用人前單核細(xì)胞系(THP-1)進(jìn)行。重組MCP-1蛋白質(zhì)用600微升含5%滅活胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和25mM HEPES(Ph7.2)的RPMI培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋(范圍10-6-10-12M),這些樣品放在孔下部,而將TPH-1細(xì)胞(以同一培養(yǎng)液配成10×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液100微升)置于插片中。在5%CO2下37℃培育小室3小時(shí)。然后取出樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml試管,200g離心5分鐘。將沉淀細(xì)胞重懸于100ml PBS中并用Coulter計(jì)數(shù)儀(Beckman)計(jì)數(shù)。用Prism程序分析數(shù)據(jù)(GraphPad Software)。
腹膜細(xì)胞募集試驗(yàn)給8-12周齡雌性BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射10微克/0.2ml用無(wú)菌無(wú)脂多糖的PBS稀釋的重組MCP-1WT*或MCP-1WT*2A蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)細(xì)胞募集。當(dāng)測(cè)定MCP-1WT*2A的拮抗性能時(shí),在給予激動(dòng)劑(MCP-1WT*)前30分鐘,給予用0.2ml相同無(wú)菌液稀釋的所示量的該蛋白質(zhì)。給予激動(dòng)劑后16小時(shí)吸入CO2處死小鼠,用5毫升PBS進(jìn)行腹腔灌洗三次。合并灌洗液,600g離心10分鐘,重懸沉淀細(xì)胞至最終體積1ml,用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)誘引出的白細(xì)胞總數(shù)。
結(jié)果已采用細(xì)胞募集試驗(yàn)對(duì)與MCP-1相關(guān)的不同的蛋白質(zhì)的性能作特征鑒定(Ajuebor MN等,1998;Reckless J and Grainger DJ,1999;Kaji M等,2001)。
在人單核細(xì)胞(THP-1細(xì)胞系)趨化試驗(yàn)中,MCP-1WT*2A獲得的結(jié)果與實(shí)施例1所述受體-結(jié)合試驗(yàn)獲得的結(jié)果極其相符。MCP-1WT*2A能誘導(dǎo)THP-1趨化的強(qiáng)應(yīng)答(超過(guò)基線(xiàn)6倍),雖然最大活性見(jiàn)于10nM,而與之相比,1nM野生型蛋白誘導(dǎo)了超過(guò)基線(xiàn)9倍的增加(圖4)。
也用腹膜細(xì)胞募集試驗(yàn)評(píng)價(jià)了作為MCP-1拮抗劑或激動(dòng)劑的MCP-1WT*2A的活性(圖5)。當(dāng)給予MCP-1WT*和MCP-1WT*2A時(shí),該肝素結(jié)合缺陷性突變體在MCP-1WT*能引起大量募集的劑量(10μg/小鼠)時(shí),不能誘導(dǎo)細(xì)胞募集到腹腔中。另外,如果在給予MCP-1WT*前30分鐘給予MCP-1WT*2A,MCP-1WT*誘導(dǎo)的細(xì)胞募集以劑量依賴(lài)方式受到顯著拮抗。因此,廢除MCP-1中的GAG結(jié)合位點(diǎn)可產(chǎn)生能在體內(nèi)抑制MCP-1誘導(dǎo)的細(xì)胞募集的MCP-1拮抗劑。
實(shí)施例3;非肝素結(jié)合性MCP-1突變體在動(dòng)物模型中的特征鑒定材料和方法遲發(fā)性接觸過(guò)敏模型如前人所述進(jìn)行了小鼠耳腫脹試驗(yàn)以測(cè)定接觸性過(guò)敏反應(yīng)(Garrigue JL等,1994)。簡(jiǎn)言之,在小鼠剃毛的腹部皮膚局部施加25微升丙酮/橄欖油(4∶1)中含有0.5%的2,4-二硝基氟苯(DNFB;Sigma Chemical Co)的溶液到使其預(yù)致敏。五天后在右耳施加20微升用同一載體配的0.2%DNFB,左耳只施加該載體。從第5天到第9天每日腹腔給予0.5mg/kg(10μg/小鼠)的MCP-1WT*治療小鼠,或?qū)φ战M只給PBS。在DNFB攻擊前1小時(shí)給予第一次治療。用可調(diào)厚度儀(MitutoyoCorp)測(cè)量耳朵的厚度,從攻擊后的值減去攻擊前值,再減去單用載體攻擊的對(duì)側(cè)耳朵測(cè)得的腫脹值,估計(jì)耳朵腫脹。
博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型第0天氣管內(nèi)給予C57BL/6雌性小鼠博來(lái)霉素(3.75U/kg,在25微升PBS中)。吸入博來(lái)霉素1小時(shí)后,測(cè)試動(dòng)物腹腔內(nèi)給予0.2ml PBS中的0.25mg/kg的MCP-1WT*2A;或只給予0.2ml PBS。每日給予這種治療,持續(xù)10天。每日記錄體重減輕情況和死亡百分?jǐn)?shù)。第10天所有小鼠用CO2窒息處死,將4個(gè)肺葉置于-80℃測(cè)定羥脯氨酸水平,作為膠原沉積的指標(biāo),并加工1個(gè)肺葉作肺纖維化的組織學(xué)測(cè)定。通過(guò)分析羥脯氨酸確定肺膠原總水平。簡(jiǎn)言之,用組織撕裂器和Tris-HCl(pH7.6)將肺葉做成勻槳,然后與琥石樹(shù)脂115℃培育過(guò)夜。將檸檬酸/醋酸緩沖液、異丙醇、氯胺-T和DAB溶液加入樣品中,60℃放置30分鐘。樣品冷卻至室溫,保持10分鐘,在分光光度計(jì)上讀取560nm的值。還將右肺葉固定在10%福爾馬林中,然后石蠟包埋、切片和用Masson’s三色溶液染色,以組織學(xué)方法測(cè)定肺纖維化。在光顯微鏡下測(cè)定組織學(xué)變化。采用半定量評(píng)分法,計(jì)算纖維化面積百分率,進(jìn)行博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺炎癥和纖維化的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型第0天注射0.2ml含MOG35-55肽(200μg)和結(jié)核分枝桿菌(500μg)的弗氏完全佐劑(CFA;Difco Lab)乳液,左腹側(cè)皮下免疫雌性小鼠(8周齡;C57BL/6NCrIBR品系;體重18-22克)。立即腹腔內(nèi)給予百日咳毒素(400微升含0.5MNaCl,15mM Tris(pH7.5),0.017% Triton X-100的緩沖液中含500納克毒素)。第二天給動(dòng)物第二次腹腔內(nèi)注射含百日咳毒素的相同溶液。第7天小鼠右側(cè)腹部皮下注射給予第二劑含MOG35-55肽(200μg)的CFA。此程序?qū)е略诖蠹s第18-20天時(shí)發(fā)病,呈現(xiàn)進(jìn)行性麻痹,從尾部開(kāi)始進(jìn)行性上升到前肢。
實(shí)驗(yàn)第7天(大約在通常發(fā)生疾病前的1-3天)開(kāi)始每只動(dòng)物的治療持續(xù)連續(xù)21天。從第7天開(kāi)始,通過(guò)臨床評(píng)分檢查各個(gè)小鼠是否存在麻痹,評(píng)分如下0=無(wú)疾病癥狀0.5=尾部分麻痹1=尾麻痹1.5=尾麻痹+單側(cè)后肢部分麻痹2=尾麻痹+后肢力弱或后肢部分麻痹2.5=尾麻痹+后肢部分麻痹(骨盆以下)3=尾麻痹+后肢完全麻痹3.5=尾麻痹+后肢完全麻痹+失禁4=尾麻痹+后肢麻痹+前肢力弱或部分麻痹5=垂死或死亡如下所示用三組動(dòng)物,每組10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。組1用PBS治療作為陽(yáng)性對(duì)照。組2每日用腹腔注射0.05mg/kg的MCP-1WT*2A治療。組3每日用腹腔注射0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治療。將MCP-1WT*2A突變體蛋白溶于無(wú)菌水中,然后以無(wú)菌PBS稀釋(200微升/小鼠)獲得所需濃度。
膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型第0天在雄性小鼠(8-12周齡;DBA/1品系;18-22克體重)的尾根部皮內(nèi)注射0.2ml含牛II型膠原(100微克;Morwell Diagnostics)和結(jié)核分枝桿菌(400μg)的弗氏完全佐劑(CFA;Difco Lab)乳液使其免疫。
大約從第16-20天開(kāi)始出現(xiàn)炎癥癥狀,影響一個(gè)或多個(gè)肢體。根據(jù)觀察到的前爪和后爪的指(趾)存在的炎癥作臨床評(píng)分,給動(dòng)物疾病的嚴(yán)重程度分等級(jí)如下0=無(wú)疾病癥狀0.5=1-5個(gè)指/趾有炎癥癥狀1=6-10個(gè)指/趾有炎癥癥狀1.5=11-15個(gè)指/趾有炎癥癥狀2=16-20個(gè)指/趾有炎癥癥狀臨床總評(píng)分>0.5的二組(n=10小鼠)每日治療連續(xù)7天,腹腔注射PBS(對(duì)照組)或0.05mg/kg的MCP-1WT*2A。末次治療后24小時(shí)處死所有動(dòng)物。
卵白蛋白誘導(dǎo)的肺炎癥(OVA)模型研究使用雌性小鼠(8-10周齡;Balb/c品系)。腹腔內(nèi)注射在總體積200微升中以2毫克2%氫氧化鋁(Serva)沉淀的10微克卵白蛋白(Sigma)致敏小鼠。在725微升無(wú)LPS的0.9%NaCl中混合25微升卵白蛋白(2mg/ml)、250微升氫氧化鋁,4℃沉淀3-4小時(shí),制備氫氧化鋁2%/卵白蛋白溶液。致敏后15天,治療和攻擊小鼠,每組6只,分組如下組1用無(wú)LPS的0.9%NaCl攻擊并用PBS治療(基線(xiàn))組2用卵白蛋白攻擊并用PBS治療(陰性對(duì)照)組3用卵白蛋白攻擊并用0.5mg/kg的MCP-1WT*2A治療在連續(xù)5天每次攻擊前30分鐘腹腔內(nèi)注射(200微升)給予PBS或MCP-1WT*2A。在用異氟烷吸入麻醉下,用卵白蛋白(15微克沉淀的卵白蛋白重懸在50微升無(wú)LPS的0.9%NaCl中)鼻內(nèi)攻擊小鼠。攻擊后72小時(shí),致死性腹腔注射300微升以0.9%NaCl配的14%烏拉坦(v∶v)處死小鼠。修剪除去氣管的結(jié)締組織,制造一小切口,將直徑75mm的導(dǎo)管插入氣管中。用一縫線(xiàn)栓住導(dǎo)管使其附著于1毫升針筒。原位用0.4ml PBS充滿(mǎn)肺。輕輕按摩脫落細(xì)胞,抽出肺中的液體,收集到置于冰上的塑料試管中。重復(fù)此過(guò)程4次,將每只動(dòng)物收集的細(xì)胞懸液在冰上合并得到最終體積約1.4ml。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)2倍倍比稀釋的細(xì)胞懸液臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。
結(jié)果在許多文章中,特別是采用轉(zhuǎn)基因小鼠的文章中,已特征分析了MCP-1的體內(nèi)特性(Lu B等,1998;Rutledge BJ等,1995)。采用人類(lèi)炎癥和疾病的動(dòng)物模型測(cè)定MCP-1WT*2A,證實(shí)了用腹腔細(xì)胞募集模型獲得的此MCP-1肝素結(jié)合缺陷性突變體的拮抗活性。
遲發(fā)性接觸過(guò)敏反應(yīng)是一種動(dòng)物模型,其中T細(xì)胞介導(dǎo)的半抗原-特異性皮膚炎癥可用耳朵腫脹試驗(yàn)測(cè)定。已在能組成性產(chǎn)生高水平血清MCP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠中顯示了增強(qiáng)的接觸性過(guò)敏反應(yīng)(Mizumoto N等,2001)。采用接觸致敏劑2,4-二硝基氟苯(DNFB)作半抗原攻擊正常小鼠的耳朵皮膚。整個(gè)治療期限間,當(dāng)與只用運(yùn)載體治療的小鼠所觀察到的效果相比,腹腔給予MCP-1WT*2A(在用DNFB攻擊時(shí)開(kāi)始治療)治療的小鼠耳朵持續(xù)腫脹顯著較低(圖6)。
在肺部炎癥/纖維化模型中測(cè)定了MCP-1WT*2A的性能,因?yàn)橐阎狹CP-1在肺或皮膚炎癥過(guò)程中誘導(dǎo)了前膠原的沉積(Hogaboam CM等,1999)。
小鼠氣管內(nèi)灌注博來(lái)霉素后分別在7-10天導(dǎo)致肺炎癥和纖維化、膠原在肺中顯著積累及體重快速下降(Chen ES等,2001)。記錄小鼠腹腔給予MCP-1WT*2A或只給予PBS治療1小時(shí)后再接觸博來(lái)霉素后整10天中的體重,進(jìn)一步與不用博來(lái)霉素處理的對(duì)照組比較。如清楚顯示的那樣,從第二天起,PBS治療的對(duì)照小鼠與MCP-1WT*2A治療小鼠相比,體重?fù)p失量高得多(圖7)。第10天用二種不同方法處死小鼠后評(píng)價(jià)了肺纖維化和炎癥。已知博來(lái)霉素能提高肺羥脯氨酸的合成(此合成與膠原合成和纖維化成比例)(Madtes DK等,1999)。只用PBS治療小鼠測(cè)到的羥脯氨酸水平顯著高于接受腹腔注射MCP-1WT*2A的小鼠組測(cè)到的水平。確實(shí),后一組的水平相當(dāng)于非博來(lái)霉素處理小鼠。另一半定量組織學(xué)評(píng)估證實(shí),MCP-1WT*2A治療組與對(duì)照組相比纖維化總水平顯著降低(圖8)。
抗MCP-1抗體和缺乏功能性MCP-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠證明,MCP-1對(duì)例如與單純皰疹病毒誘導(dǎo)的腦脊髓炎(HSM)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、多發(fā)性硬皮病動(dòng)物模型中相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞募集和炎癥起著關(guān)鍵作用(Nakajima H等,2001;Huang DR等;2001)。給予MCP-1WT*2A后,兩種測(cè)試劑量都顯著提高了EAE動(dòng)物模型的臨床評(píng)分(圖9)。
如上所述,MCP-1具有很強(qiáng)的纖維化作用。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中測(cè)定了MCP-1WT*2A拮抗此MCP-1活性的能力。此時(shí)MCP-1WT*2A也顯著改進(jìn)了治療小鼠的臨床評(píng)分(圖10)。
由于肺中不同白細(xì)胞亞組的積累和激活而產(chǎn)生了哮喘特征性的肺過(guò)敏性炎癥和支氣管過(guò)敏反應(yīng)(BHR)。用抗體阻斷MCP-1,顯著減輕了BHR和炎癥(GonzaloJA等,1998)。在卵白蛋白誘導(dǎo)的肺炎癥(OVA)模型中,就減少細(xì)胞募集而言,MCP-1WT*2A獲得了顯著的改進(jìn)(圖11)。
鑒于本發(fā)明實(shí)施例中的雙堿性氨基酸位點(diǎn)的突變,加上已知參與MCP-1和GAG結(jié)合的其它殘基,如組氨酸66和賴(lài)氨酸58(Chakravarty L等,1999),在所有MCP中都是保守的(圖1B),可根據(jù)本專(zhuān)利申請(qǐng)的發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)出具有拮抗活性的其它MCP突變體。
具體說(shuō),MCP拮抗劑可以是人成熟的MCP-1(SEQ ID NO4)、MCP-2(SEQID NO5)、MCP-3(SEQ ID NO6)、MCP-4(SEQ ID NO;7)或Eotaxin(SEQID NO8)的位點(diǎn)18和19、18和58(或66)、19和58(或66)的雙突變體,以及位點(diǎn)18、19和58(或66;此序號(hào)對(duì)應(yīng)于人成熟的MCP-1的序號(hào))的三突變體。除位點(diǎn)18和19外其它可突變的殘基是經(jīng)鑒定在所有人MCP蛋白質(zhì)中高度保守的其它堿性殘基(殘基24、44、49、75;圖1B)。
這些替代分子的性能可用上述任一方法及本領(lǐng)域已知的其它驗(yàn)證方法測(cè)定。許多其它有用的趨化因子相關(guān)技術(shù)(重組表達(dá)、體外試驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)可見(jiàn)文獻(xiàn)綜述(“Chemokine Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.138,HumanaPress,2000;”Chemokine Receptors”,Methods in Enzymology vol.288,AcademicPress,1997)。
表1
表2
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序列表<110>應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS控股(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)<120>MCP蛋白質(zhì)的新型拮抗劑<130>WO512<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>99<212>PRT<213>智人<400>1Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr1 5 10 15Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val20 25 30Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu35 40 45Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln65 70 75 80
Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr85 90 95Pro Lys Thr<210>2<211>77<212>PRT<213>合成性構(gòu)建物<400>2Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>3<211>77<212>PRT<213>合成性構(gòu)建物<400>3
Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe1 5 10 15Thr Asn Ala Ala Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile20 25 30Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val35 40 45Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser50 55 60Ile Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>4<211>76<212>PRT<213>智人<400>4Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60
Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>5<211>76<212>PRT<213>智人<400>5Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr20 25 30Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly35 40 45Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met50 55 60Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>智人<400>6
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>75<212>PRT<213>智人<400>7Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser1 5 10 15Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr20 25 30Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys35 40 45Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys50 55 60
His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr65 70 75<210>8<211>74<212>PRT<213>智人<400>8Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Glu35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70
權(quán)利要求
1.由MCP蛋白的突變體組成的MCP蛋白質(zhì)的拮抗劑,其特征在于,其中人類(lèi)成熟的MCP-1序列中以下編號(hào)的殘基組合被替代為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺a)18和19;b)18和/或19,加上58;c)18和/或19,加上66;d)18和/或19,加上58和66;e)18和/或19,加上以下24、44、49、75的一個(gè)或多個(gè)。
2.如權(quán)利要求1所述的拮抗劑,其中殘基18和19被丙氨酸所替代。
3.如權(quán)利要求1或2所述的拮抗劑,其中MCP蛋白是人MCP-1、人MCP-2、人MCP-3、人MCP-4或人Eotaxin。
4.如權(quán)利要求1或2所述的拮抗劑,其中MCP蛋白是與人類(lèi)成熟MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4或Eotaxin具有至少70%同源性的蛋白質(zhì)。
5.MCP蛋白質(zhì)拮抗劑選自a)如權(quán)利要求1至5所述MCP蛋白質(zhì)拮抗劑的活性突變體,其中已加入、缺失、或替代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不干擾其拮抗活性;b)根據(jù)(a)所述多肽或肽的序列和/或結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的肽模擬物;c)多肽或肽,其含有(a)或(b)所述氨基酸序列和屬于相應(yīng)MCP蛋白質(zhì)以外的某一蛋白質(zhì)序列序列的氨基酸序列;d)上述(a)、(b)、或(c)的活性組分、前體、鹽或衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的MCP拮抗劑,其中(a)所述的多肽或肽具有SEQ IDNO3相應(yīng)的序列。
7.如權(quán)利要求5所述的MCP拮抗劑,其中(c)所述的多肽或肽含有屬于一個(gè)或多個(gè)以下這些蛋白質(zhì)序列膜結(jié)合蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域,免疫球蛋白恒定區(qū),多聚體結(jié)構(gòu)域,胞外蛋白質(zhì),含信號(hào)肽的蛋白質(zhì),含輸出信號(hào)的蛋白質(zhì),的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求5或7所述的MCP拮抗劑,其中所述的拮抗劑是與選自放射活性標(biāo)記、生物素、熒光標(biāo)記、細(xì)胞毒性劑、藥物輸送劑的分子相偶聯(lián)或復(fù)合的活性形式。
9.含有編碼如權(quán)利要求1至7所述MCP拮抗劑的DNA序列的DNA分子,其特征在于,該DNA分子包含基本上相同的核苷酸序列。
10.含有如權(quán)利要求9所述DNA分子的表達(dá)載體。
11.用權(quán)利要求10所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
12.如權(quán)利要1至8所述的MCP拮抗劑的制備方法,該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并收集表達(dá)的蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1至8所述MCP拮抗劑的純化制品。
14.所述MCP拮抗劑作為藥物的用途。
15.如權(quán)利要求1至8所述MCP拮抗劑用作治療或預(yù)防白細(xì)胞過(guò)度遷移和活化相關(guān)疾病的藥物組合物中活性成分的用途。
16.如權(quán)利要求15所述的用途,其中所述疾病是炎癥性疾病、自身免疫性疾病或感染。
17.如權(quán)利要求1至8所述MCP拮抗劑用作治療或預(yù)防血管性疾病或癌癥的藥物組合物中活性成分的用途。
18.含有如權(quán)利要求1至8所述MCP拮抗劑作為活性成分的藥物組合物。
19.白細(xì)胞過(guò)度遷移和活化相關(guān)疾病的治療或預(yù)防方法,其特征在于,該方法包括給予有效量的權(quán)利要求1至8所述的MCP拮抗劑。
20.如權(quán)利要求19所述的方法,其中所述疾病是炎癥性疾病、自身免疫性疾病或感染。
21.血管性疾病或癌癥的治療或預(yù)防方法,其特征在于,該方法包括給予有效量的權(quán)利要求1至8所述的MCP拮抗劑。
全文摘要
通過(guò)在MGP蛋白質(zhì)N-末端進(jìn)行非保守性取代消除其GAG結(jié)合位點(diǎn)制造MCP突變,可獲得MCP蛋白,特別是MCP-1蛋白質(zhì)的新型拮抗劑。本發(fā)明制備的化合物可用于治療或預(yù)防MCP蛋白不良活性相關(guān)疾病,如炎癥疾病、自身免疫性疾病、血管性疾病和癌癥。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1665839SQ03813007
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月10日
發(fā)明者A·普羅德富特, M·科斯科-維爾博伊斯, T·亨德?tīng)?申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司