專利名稱:人工胰島素類似物的制作方法
本發(fā)明是關(guān)于一種以皮下注射后立即產(chǎn)生作用為特征的新型人類胰島素類似物，含有這種胰島素類似物的胰島素注射液和制備這種胰島素類似物的方法。
在治療糖尿病中，技術(shù)人員已提出許多種胰島素配制品，其中一些是速效的，而另外一些或多或少有延遲作用。
在急癥情況下，像高血糖昏迷，外科手術(shù)、懷孕期間和嚴(yán)重感染時可以使用速效胰島素制劑。此外，每天多次注射速效胰島素制劑可改進(jìn)那些已表明是難以用長效胰島素控制的糖尿病人的病情控制。
最近幾年，對一個用胰島素治療方法產(chǎn)生了愈來愈大的興趣，該方法研究了健康組織的β細(xì)胞中胰島素的分泌，即，與餐食相聯(lián)系地補(bǔ)充胰島素，並維持一個基本的胰島素水平。臨床觀察表明糖尿病患者借助于每天一次注射長效胰島素以滿足基本的需要，並在主餐之前補(bǔ)充注射少量的速效胰島素就能夠獲得接近于正常的胰島素和葡萄糖濃度。
在治療既需要中效和長效胰島素的推遲作用，又需要較強(qiáng)的起始效應(yīng)的糖尿病患者時，還可以將速效胰島素與中效和長效胰島素混合使用。
最后，速效胰島素可應(yīng)用在連續(xù)的胰島素輸送系統(tǒng)中。
皮下注射速效胰島素溶液，已觀察到吸收時有一個初始延遲(Binder，Diabetes Care 7.NO.2(1984)，188-199)，然而，當(dāng)目標(biāo)是嚴(yán)格的代謝控制時，這種由較慢開始作用引起的延遲吸收是不希望的。將速效胰島素溶液與長效胰島素制劑混合還會進(jìn)一步使速效胰島素的吸收速率降低。
因此，需要有一種皮下注射后較快發(fā)生作用的、並且改進(jìn)與長效胰島素制劑的混溶性的速效胰島素溶液。
已知的速效胰島素溶液的另一個缺點(diǎn)是在用于連續(xù)輸注胰島素的胰島素溶液中，胰島素有形成微纖維並從該溶液中沉淀出來的趨勢，因而阻塞了機(jī)械部件和輸送導(dǎo)管。
最后，還需要另一種治療對正常胰島素具有耐受性的病人用的胰島素制劑。
本發(fā)明的目的是提供一種具有以下一種或多種改進(jìn)特性的新型速效胰島素溶液。
1)通過皮下注射或其他給藥途徑，能較快發(fā)生作用。
2)改進(jìn)了與延遲胰島素配制品的混溶性。
3)降低了在用于可植入的輸送系統(tǒng)時產(chǎn)生微纖微的趨勢。
4)適用于耐藥性病人的治療(對先前存在的抗體具有低的親和性)。
用下文描述的新型可注射的人胰島素類似物的水溶液可達(dá)到本發(fā)明的目的。
過去已介紹過大量的胰島素類似物，Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem，360(1979)，1619-1632)介紹了人胰島素類似物的合成，這些胰島素類似物在A鏈的2，5，6，7，8和11位，和B鏈的5，7，13和16位中單氨基酸的取代上不同于人胰島素。從而對頗感興趣的胰島素的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系有了深入了解。其他研究改進(jìn)了胰島素(B(22)-β(26))內(nèi)主要受體的結(jié)合區(qū)域，以了解這種變異對受體結(jié)合活性的影響。然而，已知的人胰島素類似物不能呈現(xiàn)出本發(fā)明人所要求的這些性質(zhì)。
眾所周知，硫酸鹽化的胰島素形成微纖維的趨勢較低(Albisser等人，用于輸注泵的胰島素的理想特性，InGueriguian J.L等人，eds.US Pharmacopeial Convention，Rockwille，Maryland，Pp.84-95)並呈現(xiàn)一種抵抗原性。然而硫酸鹽化的胰島素是一種至少有幾種不同的、平均每個分子含有4.5個硫酸鹽酯基團(tuán)的胰島素衍生物的非均勻混合物。此外，硫酸鹽化的胰島素具有一個低的胰島素活性，大約是原來胰島素活性的20%，與原胰島素比較，硫酸鹽化胰島素的另一個缺點(diǎn)是它們不需要含有通過化學(xué)方法改進(jìn)的氨基酸殘基，即不是自然存在的氨基酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供同類的胰島素類似物，生物活性要高于硫酸鹽胰島素，最好只含有天然存在的氨基酸。
這里所用的“胰島素類似物”意思是指一種具有與人胰島素分子結(jié)構(gòu)類似的化合物，包括在A(7)Cys和B(7)Cys之間、A(20)Cys和B(19)Cys之間含有二硫化物橋，在A(6)Cys和A(11)Cys之間含有一個內(nèi)二硫化物橋，並具有胰島素活性。
本發(fā)明基于一個意外的情況，就是在某些胰島素類似物中至少有一個氨基酸殘基已被天然存在的氨基酸基所取代，而呈現(xiàn)出令人希望的速效活性。
廣義講，本發(fā)明通過用天然存在的氨基酸殘基取代人胰島素的一個或多個氨基酸基，提供了一種新型的速效人胰島素類似物，它降低了自身聯(lián)合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢，並在中性pH值將具有與人胰島素相同的或更大的負(fù)電荷。
為了降低自身聯(lián)合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢，最好在分子的相應(yīng)位置上用比天然氨基酸基親水性更強(qiáng)的其他氨基酸基取代人胰島素的某些殘基。也可以在胰島素分子的某些位置上用更龐大的氨基酸基取代，從而降低胰島素分子聯(lián)合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢。
更具體地說，本發(fā)明提供了一種具有如下通式Ⅰ的新型胰島素衍生物A鏈
其中X′是人胰島素的氨基酸殘基，它們的網(wǎng)格功能使分子在中性pH值時具有與人胰島素相同的電荷，或比人胰島素的電荷更大的負(fù)電荷，但條件是在胰島素分子中相應(yīng)的位置上至少有一個X與人胰島素的氨基酸殘基不同，並且在A(8)位的X是His或Phe，在A(21)位的X是Asp，在B(5)位的X是Ala，在B(9)位的X是Leu，在B(10)位的X是是Asn或Leu，在B(12)位的X是Asn或者在B(26)位的X是Ala，並在胰島素分子中相應(yīng)位置上至少一個剩余的X與人胰島素的氨基酸基不同。此外還需要一個或多個氨基酸殘基可以從A鏈和/或B鏈的N終端和/或C終端去除。
至少大部份的氨基酸殘基取代物的親水性要比人胰島素中相應(yīng)部位上氨基酸基強(qiáng)，最好所有氨基酸殘基取代物的親水性強(qiáng)于相應(yīng)的人胰島素的氨基酸殘基。
關(guān)于親水性，可參考C.Froemmel，J.Theor.Biol.111(1984)，247-260(表1)。
參照以上式Ⅰ，與人胰島素分子中相應(yīng)位置上的氨基酸基不同的X最好不要多于7個，最佳為2-4個取代物。
最好從Asp、Glu、Ser、Thr、His和Ile中選擇氨基酸取代基，特別是選擇帶有負(fù)電荷的氨基酸基，即Asp或/和Glu。
該新型人胰島素類似物最好含有Asp和/或Glu，而不是人胰島素的一個或多個羥基氨基酸，也不是人胰島素的一個或多個Glu和Asn。
該新型人胰島素類似物進(jìn)而最好含有Ser和/或Thr，或者Asp和/或Glu，而不是一個或多個具有脂肪性和/或芳香性側(cè)鏈的人胰島素氨基酸殘基。
該新型人胰島素類似物最好還含有His，而不是一個或多個具有脂肪性和/或芳香性側(cè)鏈的人胰島素氨基酸基，也不是一個或多個人胰島素的羥基氨基酸。
取代的最佳部位是在B9、B10、B12、B26和B27、尤其是B9、B12和B27，在這些位置上一個取代就足以能降低自身聯(lián)合的趨勢，並在給藥后可產(chǎn)生快速作用。
在B9位上的取代氨基酸殘基可以從下組中選擇Asp、pro、Glu、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Trp和Phe，從Asp、Glu、Gln、Asn和His中選取更好。
在B12位上的取代氨基酸基可以從Ile和Thr中選擇。B10位上的氨基酸取代基可由Asp、Arg、Glu、Asn和Gln中選取，B26位取代和B27位上的氨基酸取代基最好是Asp或Glu。
為了獲得改善的特性，在胰島素分子的剩余位置中，看來至少需要有兩個取代基(最好與以上所提位置結(jié)合起來)。在這些位置可進(jìn)行如下取代位置 最佳氨基酸取代基A8 His，Gly，Gln，Glu，Ser，Asn，Asp，ProA9 Gly，Asp，Glu，Thr，His，Gln，Asn，Ala，ProA10 Leu，Pro，Val，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Glu，AsnA13 Pro，Val，Arg，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Gly，Gln，Asn，AspA21 Asp，Glu，B1 Glu，Asp，Thr，Ser。
位置 最佳氨基酸取代基B2 Arg，His，Ala，Glu，Asp，Thr，Pro，Gly，Gln，Ser，AsnB5 Glu，Asp，Thr，Ser，Gln，AsnB14 Glu，Asp，Asn，Gln，Ser，Thr，GlyB16 Asp，Glu，Gln，Asn，Ser，Thr，His，ArgB17 Ser，Thr，Asn，Gln，Glu，Asp，HisB18 Ser，Thr，Asn，Gln，HisB20 Gln，Ser，Asn，Asp，Glu，ArgB28 Glu，Asp本發(fā)明的另一些最佳化合物是在如下位置上具有取代基的胰島素類似物B27，B12，B9，(B27+B9)，(B27+A21)，(B27+B12)，(B12+A21)，(B27+B17)，(B27+A13)，(B27+B16)，(B27+A10)，(B27+B28)，(B27+B26)，(B27+B10)，(B27+B1)，(B27+B2)，(B27+B5)，(B27+B14)，(B27+B18)，(B27+B20)，(B12+B17)，(B12+A10)，(B12+A13)，(B12+B16)，(B12+B1)，(B12+B2)，(B12+B5)，(B12+B10)，(B12+B26)，(B12+B28)，(B9+B17)，(B9+A13)，(B9+B16)，(B9+A8)，(B9+A9)，(B9+A10)，(B9+B1)，(B9+B2)，(B9+B5)，(B9+B10)，(B9+B12)，
(B9+B14)，(B9+B28)，(B9+B18)，(B9+B20)，(B9+B26)，(B27+B9+A21)，(B9+B27+A8)，(B27+B12+A21)，(B27+B12+B9)，(B9+B12+B27+B17)，(B9+B12，+B27+A13)，(B9+B12+B27+B16)、以及(B12+B16+B17+B27+A10+A13)。
以上式Ⅰ的最佳實(shí)施如下
其中X與上敘定義相同。
參照式Ⅰ，本發(fā)明的另一種最佳胰島素類似物是這樣的在B27位的X為Glu，B12位的X為Ile或Tyr，在A21位的X為Asp和B27位的X為Glu，B9位的Y是Asp，A21位和B9位的X是Asp和B27位的X是Glu，A8位的X是His，B9位的X是Asp和B27位的X是Glu，B10位的X是Asp，或B9位的X是Asp和B27位的X是Glu。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了具有胰島素活性的可注射溶液，本發(fā)明可注射的胰島素溶液含有以上描述的人胰島素類似物或者它的藥物學(xué)上可接受的鹽，最好是在中性pH值的水溶液中。含水介質(zhì)可以添加如氯化鈉和葡萄糖制成等滲的。也可以添加緩沖液，如醋酸鹽或檸檬酸鹽和防腐劑，如m-甲酚，酚或甲基4-羥基苯甲酸鹽。該胰島素溶液還可以含有鋅離子。
本發(fā)明的人胰島素類似物可以代替本領(lǐng)域中迄今已知的速效胰島素溶液中的人或豬的胰島素。
在重組DNA技術(shù)到來后，蛋白工程已變得很發(fā)達(dá)了。利用通常所謂的部位特異誘變技術(shù)，有可能用別的天然存在的氨基酸密碼子取代天然基因中的任何一個或多個密碼子從而改變天然蛋白的基因編碼?；蛘呖梢岳霉夹g(shù)通過化學(xué)合成總DNA序列來改進(jìn)基因。這種對天然蛋白基因控制的目的主要是在一個或另一個已確定的方向上改變天然蛋白的性質(zhì)。
可通過用具有所需氨基酸殘基取代基編碼的編碼子或者用合成具有所需人胰島素類似物編碼的整個DNA序列來取代天然人胰島素原基因中的適當(dāng)部位的編碼子而改變胰島素原的基因，來制備該新型胰島素類似物。然后將具有所需胰島素類似物編碼的新的被改進(jìn)了的或合成的基因插入到一個適宜的表達(dá)載體中，這種載體在轉(zhuǎn)移到一個適宜的宿主有機(jī)體，例如大腸桿菌或酵母中時，就生成所需要的產(chǎn)品，然后根據(jù)表達(dá)產(chǎn)品是否存在于細(xì)胞之中將表達(dá)產(chǎn)品從細(xì)胞或培養(yǎng)蕩中提取出來。
還可以利用類似于Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z Physiol，Chem，360(1979)，1619-1632)所描述的方法，通過化學(xué)合成制備該新型胰島素類似物，也可以分別在玻璃試管中制備含有適當(dāng)氨基酸基取代的A鏈和B鏈，然后按照已知方法(e.g.Chance等人，In.Rick DH.Gross E(eds)peptides合成-結(jié)構(gòu)-功能，第七集美國多肽論文集，伊利諾斯pp 721-728)建立二硫化物橋，將這種修改過的A鏈和B鏈連接在一起的制得。
制備該新型胰島素類似物最好通過使式Ⅱ的生物合成的前體在有胰蛋白酶或胰蛋白酶衍生物存在下與L-蘇氨酸酯反應(yīng)，隨后用已知方法將所獲得的人胰島素類似物的蘇氨酸酯轉(zhuǎn)變成人胰島素類似物。
式中Qn是一個具有n個天然存在的氨基酸殘基的肽鏈，R是Lys或Arg，n是一個0-33的整數(shù)，m是0或1，X定義與前相同，其條件是肽鏈-Qn-R-不含有兩個鄰近的堿性氨基酸殘基。在US4343898中描述了這種所謂的“轉(zhuǎn)肽作用”反應(yīng)(該專利的公開內(nèi)容通過這里的引用被結(jié)合到本申請中)。
根據(jù)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，將B鏈中氨基酸29和A鏈中氨基酸1之間的橋-(Qn-R)m-切除，並且將蘇氨酸酯基團(tuán)聯(lián)接到B29Lys的C終端。
用類似于歐洲專利NO.0163529A中所描述的方法可以制備上面式Ⅱ的前體(該專利的內(nèi)容通過這里的引用被結(jié)合到本申請中)，利用這種方法，將具有有前體編碼的DNA序列插入到一個適宜的表達(dá)載體中，該載體在轉(zhuǎn)移到酵母中后，能夠表達(dá)和分泌具有正確定位的二硫化物橋的所要求的化合物，然后從培養(yǎng)湯中提取出該表達(dá)的產(chǎn)品。
本發(fā)明的胰島素類似物也可以通過把式Ⅲ的生物合成前體在水溶液中與胰蛋白酶和羧肽酶B反應(yīng)，並從反應(yīng)液中回收人胰島素類似物來制取。
其中S和T分別是Lys或Arg，X定義如前。
利用類似于歐洲專利NO86302133.3中所描述的方法可以制備式Ⅲ的前體，該專利的公開內(nèi)容通過這里的引用被結(jié)合到本申請中。利用這種方法將一個具有前體編碼的DNA序列插到適宜的酵母表達(dá)載體中，該載體在轉(zhuǎn)移到酵母中去時，能夠表達(dá)並在培養(yǎng)介質(zhì)中分泌這種具有正確定位的二硫化物橋的表達(dá)產(chǎn)品。
本發(fā)明的第三個方面，提供了一種生產(chǎn)該新型胰島素類似物的方法，根據(jù)這種方法，將含有一個可復(fù)制的表達(dá)載體的酵母菌株在適宜的營養(yǎng)介質(zhì)中培育，這種表達(dá)載體包含具有胰島素類似物前體編碼的DNA序列，從培養(yǎng)介質(zhì)中回收前體，並在玻璃試管中，利用酶和化學(xué)轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)變成新型胰島素類似物。
本發(fā)明也涉及到該新型胰島素類似物的新型前體，具有這種新型前體編碼的DNA序列，含有這種DNA序列的表達(dá)載體和用這種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的酵母菌株。
改進(jìn)的胰島素類似物本發(fā)明打算包括胰島素類似物的某些衍生物或者其他取代物，只要這些衍生物或其他取代物對上面所描述的發(fā)明目標(biāo)沒有顯著的影響。因此可以相應(yīng)地在氨基酸殘基中衍生出一個或多個官能團(tuán)，這種衍生物的例子本身只是已知的變換。如把胰島素分子中的酸基轉(zhuǎn)變成酯或酰胺基團(tuán)，醇基團(tuán)轉(zhuǎn)變成烷氧基團(tuán)或反之，以及選擇性地脫去氨基。作為一個例子，A21ASn可以在酸性介質(zhì)中水解脫去氨基成為A21Asp，或使B3Asn在中性介質(zhì)中脫去氨基成為B3Asp。
在N-終端或C-終端，添加或去除氨基酸基也能夠修正本發(fā)明胰島素類似物，本發(fā)明的胰島素類似物可以在B鏈的N-端至多缺少4個氨基酸基，在B鏈的C一端可至多缺少5個氨基酸基，而對胰島素類似物的總體特性沒有明顯的影響。這種修正的胰島素類似物是缺少B1 Phe或B30 Thr氨基酸殘基的胰島素類似物。
也可以把天然的氨基酸基添加到多肽鏈的一個或幾個終端上，只要這樣做對以上所述的目標(biāo)沒有明顯的影響。
本發(fā)明胰島素類似物的多肽鏈終端上的這種刪除或添加，可根據(jù)本發(fā)明在玻璃試管中，在具有氨基酸取代物的胰島素類似物上進(jìn)行。或者，本發(fā)明新型胰島素類似物的基團(tuán)，可以分別通過在多肽鏈終端上添加或去除相應(yīng)的多余或缺少氨基酸殘基的密碼子被修正。
術(shù)語用于氨基酸的縮寫是如在J.Biol.Chem.243(1968)3558中所表示的那些。這些氨基酸呈現(xiàn)L構(gòu)形。
下文所用的B(1-29)是指人胰島素B1 Phe到B29 Lys縮短的B鏈，A(1-21)是指人胰島素的A鏈。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)際，在人胰島素分子中的取代物是用參照于人胰島素的詞頭表示的。例如，B27 Glu人胰島素指一個在B鏈27位上Thr被Glu所取代的人胰島素類似物。B27 Glu，B9 Asp人胰島素指一個在B鏈27位上的Thr被Glu所取代和B鏈9位上的Ser被Asp所取代的人胰島素類似物。B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素是指縮短B鏈(參看上文)27位上的Thr被Glu所取代，並由肽片段Ala-Ala-Lys將B(1-29)鏈和A鏈〔A(1-21)〕聯(lián)在一起的胰島素類似物的前體(參看式Ⅱ)，除非另外加以說明。要明白，與人胰島素一樣，B(1-29)鏈和A(1-21)鏈?zhǔn)怯葾(7)Cys和B(7)Cys之間的二硫代物橋和A(20)Cys和B(19)Cys之間的二硫化物橋聯(lián)結(jié)起來的。同時還必須理解為A鏈含有A(6)Cys和A(11)Cys間的內(nèi)二硫化物橋。
正如已指出的那樣，本發(fā)明的目的是提供速效可注射的胰島素溶液。在努力達(dá)到這個目的中，發(fā)明人首先認(rèn)識到在貯存中的或大丸劑中的胰島素和在循環(huán)中的胰島素之間存在著很大差別，尤其是在胰島素濃度上存在著完全不可避免的差別。具體地講，血流中的胰島素相當(dāng)稀，為10-11-10-18M，是單體形式，可能具有一些二聚物形式的胰島素，貯存在胰腺的β-細(xì)肥顆粒中的，以及在通常施用人體的溶液中的濃度大得多的胰島素大多(即使不是大體上)是非活性六聚物形式，例如眾所周知的二鋅六聚物。
大家都知道溶液中的人胰島素以多種分子形式存在，即單聚物、二聚物、四聚物和六聚物(Blundell等人，蛋白質(zhì)化學(xué)的進(jìn)度，Academic Press，New York and London，Vol.26，PP 279-330，1972)，在高濃度胰島素時，寡聚物形式有利，而單聚體是胰島素的活性形式。四聚物和六聚物是非活性形式，甚至二聚物也不是活性的，本發(fā)明的基本概念是發(fā)明人相信技術(shù)人員所承認(rèn)的延遲吸收現(xiàn)象(Binder，Diabetes Care7.Na2(1984)188-199)主要是由于胰島素從六聚物、四聚物和二聚物離解成單體(活性的)需要時間的緣故。
本發(fā)明的人胰島素類似物是通過不容易形成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的分子結(jié)構(gòu)而得到速效作用。即，不管鋅離子是否存在，都會降低自身聯(lián)合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趨勢。
根據(jù)胰島素中的氨基酸序列，有相當(dāng)不同類型的差別。長期以來就認(rèn)識到，並不是胰島素分子中的所有氨基酸殘基都對胰島素的活性是關(guān)鍵的，並認(rèn)識到，對胰島素活性不起關(guān)鍵作用的某些氨基酸基對于胰島素分子的物理性質(zhì)都是重要的。事實(shí)上，人們都知道豚鼠胰島素是不能二聚的，硫酸鹽化的胰島素和四硝基酪氨酸胰島素不能二聚。因此，人胰島素分子中的很多氨基酸基可被改變而基本上並不降低胰島素活性。這里所考慮的人胰島素分子中的氨基酸取代是為了在不破壞胰島素活性情況下，防止二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的形成。
在式Ⅰ的A鏈和B鏈中，可以進(jìn)行替代的那些位置的氨基酸基，對于胰島素活性不是關(guān)鍵，但對于人類胰島素聚集成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的能力，或者對人胰島素的溶解性都是很重要的。現(xiàn)在這些氨基酸取代基干擾了促使聚合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的相信胰島素分子之間的原子與原子的接觸。
對于取代來說，正如能預(yù)料到的那樣，人胰島素分子中的某些位置上的變化比其他地方更為有效。一般說來，在B鏈中進(jìn)行單獨(dú)一個取代可以有效地降低自聯(lián)的趨勢，同時，至少需要改變兩個其他殘基。A鏈中的取代主要起改進(jìn)游離分子溶解性的作用。氨基酸殘基取代的最佳位置是B9、B12、B10、B26和B27，可以單獨(dú)地，彼此組合地或與胰島素分子中如式Ⅰ所指出的其他位一起取代。
很明顯，用一個或多個帶有負(fù)電荷的氨基酸基取代不帶電荷或帶有正電荷的氨基酸殘基是為了在中性pH值下，使人胰島素類似物的電荷更加負(fù)性，並且，與人胰島素相比較降低其等電點(diǎn)。就其特征而言，本發(fā)明的人胰島素類似物與人胰島素相比，具有相同或更負(fù)的電荷(在中性pH值)和更低的等電點(diǎn)。
一般來講，本發(fā)明直接的目標(biāo)是獲得從1至3個的取代，即，提供一個更快速作用的胰島素，這樣確定構(gòu)成了本發(fā)明的最佳模式。用2-3個取代可改進(jìn)與被保護(hù)的胰島素制劑的混溶性。然而，我們相信。還能通過數(shù)目大于3的取代更有效地完成本發(fā)明的直接目標(biāo)，因?yàn)樗Ｍ囊恍┹o助目標(biāo)也會因此而實(shí)現(xiàn)。
具體地說，一個額外的取代程度，如有4或5個取代的氨基酸取代時，可產(chǎn)生這樣一種人胰島素類似物，這種類似物不易形成微纖微或內(nèi)聚，這是一個想把胰島素溶液制成連續(xù)輸注劑時特別需要的特性。一般講，對于本發(fā)明的人胰島素類似物，設(shè)想在胰島素分子中的取代不多于7，最好是2-4個取代。
具有本發(fā)明胰島素類似物前體編碼的基因可通過修飾具有式Ⅱ(或式Ⅲ)的上述胰島素前體編碼的基因而制備;式中所有的X是人胰島素的氨基酸殘基。修飾借助于用具有所希望的突變編碼的密碼子插入或取代產(chǎn)生的部位特異突變而完成的。具有該胰島素類似物前體編碼的DNA序列也可以由全部或部份與該胰島素類似物前體的基因相對應(yīng)的寡聚核苷酸通過酶合成來制造。
然后，把包含具有所需要的胰島素基因突變的基因的DNA序列與具有TpI促進(jìn)子(IPIp)(T.Alber和G.Kawasasi，酒酵母丙糖磷酸鹽同分異構(gòu)酶的核苷酸序列，J.Mol.Applied Genet(1982)419-434)、MFα1先導(dǎo)序列(J.Kurzan和I.Herskowitz，酵母信息素基團(tuán)MFα1的結(jié)構(gòu)一種公認(rèn)的α-因子前體含有4個串聯(lián)的成熟α因子的復(fù)制體。Cell 30(1982)933-943)、和從酒酵母(TPIT)來的TPI轉(zhuǎn)錄終止序列編碼的片段相結(jié)合。這些片段提供了一些能保證具有基因編碼的前體高速度轉(zhuǎn)錄的序列，並且還提供一個能影響前體在分泌途徑中的位置及其它向培養(yǎng)介質(zhì)最終分泌的預(yù)序列。此外，表達(dá)單位具備復(fù)制的酵母2u源以及可選擇的標(biāo)示，LEU2。
在酵母α-因子體內(nèi)成熟期，MFα1先導(dǎo)肽(Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)的最后(C終端)六個氨基酸，通過一個識別Lys-Arg序列的肽鏈內(nèi)切酶和能去除Glu-Ala殘基(Julius，D.等人，Cell32(1983)839-852)的氨基二肽酶的依次作用而從α-因子先體上除去。為了消除對酵母氨基二肽酶的需要，具有MFα1先導(dǎo)物的C終端Glu-Ala-Glu-Ala編碼的序列通過體外突變而從MFα1先導(dǎo)序列上被除去。下文中，“MFα1先導(dǎo)物”(MFα1 leader)是指整個先導(dǎo)物序列。而MFα1先導(dǎo)物(負(fù)Glu-Ala-Glu-Ala)是指已除去C終端Glu-Ala-Glu-Ala序列的先導(dǎo)序列。
例1具有B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
人胰島素編碼的基因之構(gòu)建B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的酵母密碼子最佳結(jié)構(gòu)基因如下構(gòu)建可以在可控制的微孔玻璃載體上利用氨基磷酸酯化學(xué)的自動DNA合成器里合成以下10種寡聚核苷酸(B.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)Tetrahydron Letters 22，1859-1869)ⅠAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC35-merⅡAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA36-merⅢTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT43-merⅣGTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC42-merⅤTCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC32-merⅥATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT34-merⅦGAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT37-merⅧTTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC37-merⅨTGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT36-merⅩCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG33-mer
由上述10個寡聚核苷酸制成如圖1所示的5個雙股螺旋A-E。
將相應(yīng)的5′-磷酸化低聚核苷酸Ⅰ-X在90℃下加熱5分鐘，再冷卻到室溫並保持75分鐘，每個雙股螺旋A-E形成20個Pmole。為了避免連結(jié)時圍繞自互補(bǔ)的XbaI單鏈末端發(fā)生二聚作用。雙股螺旋的33聚物不被5′-磷酸化。將這5個雙股螺旋混合，並用T4連結(jié)酶處理。這種連結(jié)混合物于2%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳后，在182/183bp帶處分離該合成基因。
所獲得的合成基因示于圖1。
把該合成基因連結(jié)到4kb Kpn1-EcoR1段、PMT644的8kb Kbal-Kpn1段和pKFN9的0.3kb EcoR1-Hga1段上，從而得到下列結(jié)構(gòu)的IPIp-MFα1先導(dǎo)物-13(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT。
質(zhì)粒pMT644含有DNA-序列TPIp-MFα1先導(dǎo)物-B(1-29)-A(1-21)-TPIT，其構(gòu)建在丹麥書1293/85號中有說明。質(zhì)粒pKFN9的構(gòu)建于以下進(jìn)行說明。
這種連結(jié)混合物用來轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌株(r-，m+)(MT172)。30個抗氨芐青霉素克隆被轉(zhuǎn)移到能產(chǎn)生8Leu+克隆的含有基本培養(yǎng)基M9的培養(yǎng)板上(T.Maniatis等人，分子營養(yǎng)系，Cold Spring Harbor室驗(yàn)室，1982，P.68)。32P-Xba1-ECoR1片段的Maxan-Gilbert定序顯示出三個質(zhì)粒含有所需序列的基因。為進(jìn)一步的使用，選擇了一質(zhì)粒pKFN27。
于圖2舉例說明3pKFN27的構(gòu)建。
質(zhì)粒pKFN9的構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒pKFN9的目的是為了獲得一個緊接著MFα1先導(dǎo)序列后有一Hga1部位的質(zhì)粒。用Xba1切割質(zhì)粒pMT544，(其構(gòu)建于丹麥書278/85號中有說明)，再用ExoⅢ核酸酶處理，從3′末端除去大約250個堿基，把含有Hga1序列的合成32聚物插入引物GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC退火成為部份單股DNA。雙股環(huán)形DNA的制造是通過Klenow聚合酶的填補(bǔ)和T4連結(jié)酶的連結(jié)，在大腸桿菌(r-，m+)(MT172)轉(zhuǎn)化以后，通過用5′-32P-標(biāo)記的32聚插入引物的克隆雜化來檢驗(yàn)含有突變質(zhì)粒的克隆。新的Hga1部位的出現(xiàn)用限制性酶切割(EcoR1+Hga1，Hind3+Hga1)來證明。在再轉(zhuǎn)化之后挑選出一個“純”的突變種pKFN9作進(jìn)一步使用。
pKFN9的構(gòu)建于圖3舉例說明。
例2B27Glu人胰島素的制備用Thr-OBut進(jìn)行B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的轉(zhuǎn)肽作用，再用三氟乙酸酸解得到的蘇氨酸酯來制備B27 Glu人胰島素。制備包括以下步驟Ⅰ.具有B27 Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)胰島素編碼的基因的構(gòu)建在合成的胰島素前體基因下游、唯一Xba1部位上質(zhì)粒pKFN27被線性化。為了不因填補(bǔ)步驟而引起對Xba1位置的破壞，把下述19-聚物Hind3-Xba1雙股鏈。
Xba1 Hind3CTAGAAGAGCCCAAGACTATTCTCGGGTTCTGATTCGA連結(jié)到被線性化質(zhì)粒的每一末端。該鏈?zhǔn)窃赬ba1單股末端被5′-磷酸化的，而在Hind3末端保持未磷酸化，因而能避免在連結(jié)步驟期間鏈的聚合和DNA的環(huán)化，見圖4。
借助用ExoⅢ核酸酶處理，將5′-單核苷酸從所獲得的線性雙鏈DNA的3′-末端上除去。ExoⅢ核酸酶的處理是在23℃下進(jìn)行的，大約有250個核苷酸從DNA的每個3′-末端被除去(L.Guo和R.Wu(1983)酶學(xué)方法100，60-96)。
5′-磷酸化的25-聚突變引物d(GTTTCTTCTACGAACC TAAGGCTGC)退火到突變部位。在T4連結(jié)酶存在下，用Klenow聚合酶填補(bǔ)后，雙鏈DNA因Xba1而溶解。借助T4連結(jié)酶在單鏈中形成具有突變作用的異源雙螺旋環(huán)狀DNA。
把該連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化到精選抗氨芐青霉素的大腸桿菌(r-，m+)(MT172)。
通過用5′-32P-標(biāo)記的25-聚突變引物的克隆雜交來鑒定突變體。在再轉(zhuǎn)化以后，來自于所得到的一個克隆的質(zhì)粒pKFN37通過0.5kb Xba1-EcoR1片段的DNA定序被證明含有所需的突變(A.Maxam和W.Gilbert(1980)酶學(xué)方法65，499-560)。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化在YPGaL培養(yǎng)基(1% Bacto酵母膏，2% Bacto蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸)上培養(yǎng)酒酵母株MT663(E2-7B×E11-3C 2/α，△tpi/△tpi，Pep 4-3/Pep4-3)至OD600nm為0.6。
通過離心采集100ml的培養(yǎng)物，用10ml水洗滌，再離心並重新懸浮于10ml的1.2M山梨醇、pH＝8.0的25mM Na2EDTA、6.7mg/ml二硫蘇糖醇的溶液中。懸浮液置于30℃下保溫15分鐘，離心后再將細(xì)胞懸浮于10ml的1.2M山梨醇、10mM Na2EDTA、pH＝5.8的0.1M檸檬酸鈉、2mg Novozym
234溶液中。懸浮物置于30℃下保溫30分鐘，通過離心收集細(xì)胞，用10ml的1.2M山梨醇和10ml的CAS〔1.2M山梨醇、10mM CaCl2、10mM Tris(Tris＝三(羥甲基)-氨基甲烷)pH＝7.5〕的溶液洗滌，並再懸浮于2ml的CAS溶液內(nèi)。為了轉(zhuǎn)化，使0.1ml CAS-懸浮的細(xì)胞與近1μg的pKEN37質(zhì)?；旌?，在室溫下保持15分鐘。加入1ml20%聚乙醇4000，10mM CaCl2，pH＝7.5的10mM Tris溶液，將該混合物置室溫下保持30分鐘。該混合物被離心，所得到的小片物再懸浮于0.1ml的SOS(1.2M山梨醇、33%V/V YPGaL，6.7mM Cacl2，14ug/ml亮氨酸)中，並于30℃下保溫2小時。懸浮液然后再離心，所得小片物重懸浮于0.5ml的1.2M山梨醇中。于52℃下加入6ml的頂瓊脂〔Sherman等人的SC培養(yǎng)基，(酵母屬方法，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室，1981)，省略亮氨酸而含1.2M山梨醇，加2.5%的瓊脂〕，懸浮液傾倒于含相同瓊脂一固化的，含培養(yǎng)基的山梨醇培養(yǎng)板的頂端。轉(zhuǎn)化的克隆于30℃下3天后挑出，再分離並用作為起始液培養(yǎng)物。挑選這樣一個轉(zhuǎn)化株KFN40(＝MT663/pKFN37)以便進(jìn)一步說明。
Ⅲ.B27 Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)胰島素前體的表達(dá)酵母株KFN40在YPD培養(yǎng)基(1%酵母膏，2%蛋白胨(兩者均來自Difco實(shí)驗(yàn)室)，和2%葡萄糖)上培養(yǎng)生長。10ml的這種菌株培養(yǎng)物于30℃下?lián)u蕩至OD600為26。離心之后上清液用反相HPLC分析，得到13.5mg/L前體。
上清液中的這種類似物于低pH值下在陽離子交換柱上濃縮，繼之用合適的緩沖溶液解吸。用醇化的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行結(jié)晶。
Ⅳ.轉(zhuǎn)肽作用把0.2mole(47.1g)Thr-OBut，HOAC溶解于DMF，得到100ml溶液，加入50ml 76.5%V/V的DMF水溶液，並將10克B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素粗制品溶解于該混合溶液中，並于12℃下保溫。然后加入含1克胰蛋白酶的25ml 0.05M醋酸鈣溶液，于12℃下經(jīng)24小時后，將該混合物加到2升丙酮中，然后將沉淀的肽通過離心分離再真空干燥。用硅膠-C18作柱填料的制備HPLL柱上提純B27 Glu，B30 Thr-OBut人胰島素。
Ⅴ.轉(zhuǎn)變成B27人胰島素將B27Glu，B30Thr-OBut人胰島素溶解于100ml的三氟乙酸中，室溫下2小時后該溶液被冷凍干燥。將冷凍干燥后的粉末溶解于400ml pH為7的47.5mM檸檬酸鈉中。肽在加入2.4ml 1MZnCl2后，pH5.5的條件下沉淀，通過離心分離再真空干燥，產(chǎn)品用陰離子交換層析提純，再用凝膠過濾脫鹽。產(chǎn)率B27Glu人胰島素1.7克。
例3B9Asp人胰島素的制備用Thr-OBut對B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，然后用三氟乙酸酸解所獲得的蘇氨酸酯而制得B9Asp人胰島素。
Ⅰ.具有B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼基因的構(gòu)建構(gòu)建這種基因的方法與對具有B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因所述的通過用23-聚突變引物d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG)引導(dǎo)的pKFN27部位特異突變的方法相同。質(zhì)粒pKFN38被證明含有要求的突變。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化采用與例2，Ⅱ相同的步驟將質(zhì)粒pKFN38轉(zhuǎn)化到酒酵母株MT663中，並分離出轉(zhuǎn)化株KFN41。
Ⅲ.B9Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的表達(dá)用與例2、Ⅲ相同的方法，在YPO培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母株KFN41。在上清液中得到2.5mg/l的胰島素類似物的前體。
Ⅳ.轉(zhuǎn)肽作用按例2，Ⅳ所述那樣將7.4克B9 Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素粗制品進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用而得到B9Asp，B30Thr-OBut人胰島素。
Ⅴ.轉(zhuǎn)變按例2，Ⅴ所述那樣將B9Asp，B30Thr-OBut人胰島素轉(zhuǎn)變成B9Asp人胰島素。產(chǎn)率B9Asp人胰島素0.83克。
例4B9Asp，B27Glu人胰島素的制備是用Thr-OBut對B9Asp，B27Glu B(1-21)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用，再用三氟乙酸酸解所獲得的蘇氨酸酯。
Ⅰ.具有B9Asp，B27Glu，B(1-29)Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼基菌的構(gòu)建pKFN38(見例3)的一個367bp EcoR1-Hind 3片段和pKFN37(見例2)的一個140bp Hind3-Xba1片段被連結(jié)到質(zhì)粒PUC13的大Xba1-EcoR1片段上(質(zhì)粒PUC13是根據(jù)Vieira等人(1982)對pUC8和pUC9所述那樣構(gòu)建的，Gene19，259-268)。該連結(jié)混合物被轉(zhuǎn)化到選擇抗氨芐青霉素的大腸桿菌(MT172)上。質(zhì)粒是由一些轉(zhuǎn)化來制備的，並通過用Pst1和Hind3的溶解加以分析。顯示出正確抑制酶圖形的一種質(zhì)粒的0.5kb Xba1-EocR1片段，被連結(jié)到都由pMT644得到的7.8kb Xba1-Kpn1和4.3kb Kpn1-EcoR1兩種片段上(申請?zhí)枮?293/84的丹麥專利已述)。該連結(jié)混合物被轉(zhuǎn)化到選擇到的抗氨芐青霉素的大腸桿菌(MT172)上。由所得到的一個克隆而來的質(zhì)粒pKFN43通過0.5kb Xba1-EcoR1片段的DNA定序被證明含有所要求的胰島素衍生物前體的基因。圖5舉例說明了pKFN43的構(gòu)建。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化用與例2、Ⅱ相同的工藝將質(zhì)粒pKFN38轉(zhuǎn)化成酒酵母株MT633，並分離出轉(zhuǎn)化株KFN44。
Ⅲ.B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的表達(dá)像例2，Ⅲ所述那樣，在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母株KFN44。在上清液中得到7.3mg/l的這種胰島素類似物前體。
Ⅳ.轉(zhuǎn)肽作用按例2，Ⅳ所述，對12.7克B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素粗制品進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用，得到B9Asp，B27Glu，B30Thr-OBut人胰島素。
Ⅴ.轉(zhuǎn)變按例2、Ⅴ所述那樣，把B9Asp，B27Glu，B30 Thr-OBut人胰島素轉(zhuǎn)變成B9Asp，B27Glu，B30Thr人胰島素並提純。產(chǎn)率1.0克的B9Asp，B27Glu人胰島素。
例5A8His，B9Asp，B27Glu人胰島素的制備通過用Thr-OBut將A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用，並按例2所述用三氟乙酸酸解所獲得的蘇氨酸酯來制備A8His，B9Asp，B27Glu人胰島素。
Ⅰ.具有A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因的構(gòu)建這種基因是通過用有缺口的雙螺旋方法(Y.Morinaga，T.Franceschini，S.Inouye，和Inouye(1984)，Biotechnology2，636-638)進(jìn)行寡聚核苷酸的引導(dǎo)突變而構(gòu)成的。具有MFα1先導(dǎo)序列編碼的pUC13衍生質(zhì)粒和B9Asp，B27Glu人胰島素前體(圖5)用HpaI和Xba1切割，其大片段和用NdeI線性化的質(zhì)?；旌稀Ｔ诩訜嶙冃院屠鋮s后該混合物含有在相應(yīng)于胰島素前體基因(HpaI-XbaI)的范圍內(nèi)有一個單鏈“孔”的帶缺口的雙螺旋。37-聚突變失配引物d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT)借助于填充Klenow聚合酶和連結(jié)，被雜交到帶缺口的雙螺旋上。該混合物用于轉(zhuǎn)化抗氨芐青霉素的大腸桿菌(MT172)。突變體用18-聚物5′-32P-標(biāo)記的探查物d(AATGCTGTCACTCCATCT)來檢驗(yàn)。在再轉(zhuǎn)化之后，來自所得到的一個菌落中的質(zhì)粒通過0.5kb XbaI-EcoR1片段的DNA定序被證明含有所需的突變。按例4中對pKFN43所述的那樣，這種質(zhì)粒用于構(gòu)建酵母質(zhì)粒pKFN102。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化按例2、Ⅱ相同的方法將質(zhì)粒pKFN102轉(zhuǎn)化到酒酵母株MT663上，並分離出轉(zhuǎn)化株KFN109。
Ⅲ.A8His，B9Asp，B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的表達(dá)按例2、Ⅲ，所述，在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母株KFN109。在上清液中發(fā)現(xiàn)了21.5mg/l的胰島素類似物的前體。
Ⅳ.-Ⅴ.轉(zhuǎn)肽作用和轉(zhuǎn)變按例2、Ⅳ-Ⅴ所述，將22.0克的A8His，B9Asp，B29Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變和純化。產(chǎn)率4.0克的A8His B29AspB27Glu人胰島素。
例6B12Ile人胰島素的制備B12Ile人胰島素是通過如例2所述，用Thr-OBut對B12 Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽作用，再用三氟乙酸酸解所獲得的蘇氨酸酯而制得的。
Ⅰ.具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因的構(gòu)建具有MFα1引物(負(fù)Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)編碼的pMT598(申請?zhí)枮?163529A的歐洲專利中說明了質(zhì)粒pMT5 98的構(gòu)建)的0.5kb EcoR1-Xba1片段被插入到用Xba1-EcoR1切割的M13mp10RF噬菌體中，并從M13mp10重組噬菌體中提純相應(yīng)的單股DNA，這種單股模板DNA被雜交到一個突變的27-聚引物NOR-92d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC)和一個M13全定序引物d(TCCCAGTCACGACGT)上。這些引物用dNTps和Klenow聚合酶延伸並用T4DNA連接酶連結(jié)。突變引物KFN92被選得破壞了BstN1部位(在Xba1-EcoR1片段中唯一的)。因此，為了在未突變的EcoR1-Xba1片段中進(jìn)行選擇，先用BstN1，接著用EcoR1和Xba1切割該混合物，再連結(jié)到切割了pUC13媒介的EcoR1和Xba1上。從所獲得的一株轉(zhuǎn)化株中，挑選胰島素編碼順序中缺少BstN1部位的質(zhì)粒，pMT760。所需的突變序列除了在B12(Val-Ile)處的突變外，含有相當(dāng)于pMT598(見上)同一片段的0.5kb EcoR1-Xba1序列。該突變序列再通過將pMT760的0.5kb EcoR1-Xba1片段連結(jié)到pMT644的7.8kb Xba1-Kpn1和4.3kb Kpn1-EcoR1片段上面被轉(zhuǎn)移到酵母表達(dá)質(zhì)粒以得到pMTA。
Ⅱ-Ⅴ.轉(zhuǎn)化、表達(dá)、轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變按例2、Ⅱ所述，將質(zhì)粒pMTA轉(zhuǎn)化成酵母株MT663，按例2、Ⅲ所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株MTA。在上清液中發(fā)現(xiàn)有10.4mg/l的胰島素類似物的前體。將10克這種類似物前體的粗制品按例2，W-V所述進(jìn)行轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變和提純。產(chǎn)率B12 Ile人胰島素1.3克。
例7B12Tyr人胰島素的制備B12Tyr人胰島素能通過如例2所述一樣，用Thr-OBut對B12Tyr，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，再用三氯乙酸酸解所得到的蘇氨酸酯來制備。
Ⅰ.具有B12Tyr，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼基因的構(gòu)建除了以引物KFN93d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC)代替KFN92外，其余均采用與制備具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因相類似方法構(gòu)建基因。
Ⅱ-Ⅳ.轉(zhuǎn)化、表達(dá)、轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變?nèi)缋?所述那樣執(zhí)行步驟Ⅱ-Ⅲ，在上清液中得到1.7毫克/升的胰島素類似物前體。將該類似物前體粗品，如實(shí)施例2Ⅵ-Ⅴ所述那樣，可被轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變和純化，給出B12酪氨酸人胰島素。
實(shí)施例8B10Asp人胰島素的制備如實(shí)施例2所述的方法，將B10Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素，通過用蘇氨酸OBut轉(zhuǎn)肽，然后用三氟乙酸酸解所得到的蘇氨酸酯來制備B10Asp人胰島素。
Ⅰ.具有B10Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因之構(gòu)建該基因通過類似于用以制備具有B12Ile，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼基因的方法來構(gòu)建，不同之處僅在于用引物KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG)來代替引物KFN92。
Ⅱ-Ⅴ.轉(zhuǎn)化、表達(dá)、轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變?nèi)缋?所述的那樣執(zhí)行步驟Ⅱ-Ⅲ，在上清液中得到36毫克/升的人胰島素類似物前體。如例2Ⅳ-Ⅴ中所述的那樣，對該類似物前體粗品進(jìn)行轉(zhuǎn)肽、轉(zhuǎn)變和純化。產(chǎn)率B10Asp人胰島素7.6克。
實(shí)施例9B28Asp人胰島素的制備將B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素，通過用Thr-OMe基轉(zhuǎn)肽，然后在pH值大約為8至12時水解所得的蘇氨酸酯來制備B28Asp人胰島素。
Ⅰ.具有B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素編碼的基因之構(gòu)建具有MFα1前導(dǎo)物(負(fù)Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A編碼的PMT462(質(zhì)粒PMT462的構(gòu)建在丹麥專利申請?zhí)朜o 1257/86中已被描述)的0.5kb EcoR1-Xba1片段，即修飾過的Mbα1前導(dǎo)物之前的人胰島素原的基因，插入到用Xba1-EcoR1切割的M13mp10RF噬菌體中，然后從M13mp10重組噬菌體中純化相應(yīng)的單股DNA。把該單股模板DNA雜交到突變的41聚引物NOR205d(TTCCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC)和M13通用定序引物d(TCCCAGTCACGACGT)上，這些引物通過dNTPs和Klenow聚合酶伸展，再由T4DNA連接酶連接。
在酚提取，乙醇沉淀和再懸浮之后，用限制性內(nèi)切酶Apa1，Xba1和EcoR1切割該DNA，再一次的酚提取，乙醇沉淀和再懸浮之后，將DNA與EcoR1-Xba1切割的pUC13連接。將該連接混合物轉(zhuǎn)化到一種大腸桿菌(r-，m+)株中，然后由一些轉(zhuǎn)化株來制備質(zhì)粒。用EcoR1和Xba1切割質(zhì)粒制品，同時在0.5和0.6千堿基顯示區(qū)帶的制品轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。從再轉(zhuǎn)化中只選擇具有0.5插入物的PU13的轉(zhuǎn)化株。
從所得的轉(zhuǎn)化株之一中選擇一個在B28(Pro→Asp)處具有所需突變的質(zhì)粒pMT881。該突變序列由Maxam-Gilbert DNA定序來鑒定。然后通過將pMT881的0.5千堿基的EcoR1-Xba1片段連接到由pMT644得到的7.8千堿基和4.3千堿基的片段上，把該突變序列轉(zhuǎn)移到酵母表達(dá)質(zhì)粒上，以得到PMTAI。
Ⅱ.轉(zhuǎn)化從例2、Ⅱ相同的工藝，將質(zhì)粒PMTAI轉(zhuǎn)化到酒酵母株MT663中，然后分離轉(zhuǎn)化株MTAI。
Ⅲ.B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)人胰島素的表達(dá)如例2、Ⅲ所述的方法那樣，把酵母株MTAI在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，在上清液中得到7.2毫克/升的胰島素類似物前體。
Ⅳ.轉(zhuǎn)肽如例2、Ⅳ所述的方法，通過用Thre-OMe代替Thr-OBut將B28Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)的粗品轉(zhuǎn)肽，給出B28Asp，B30Thr-OMe胰島素。
Ⅴ.轉(zhuǎn)變將B28Asp，B30Thr-OMe人胰島素在水中分散到1%(W/V)，再加入1當(dāng)量NeoH到pH值為10.0而被溶解。在25℃下將該pH值保持恒定24小時。所形成的B28Asp人胰島素，通過加入氯化鈉至大約8%(W/V)，加乙酸鹽三水合物至大約1.4%(W/V)，以及加乙酸鋅二水合物至大約0.01%(W/V)再加上1當(dāng)量的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.5之后使之沉淀。通過離心法分離該沉淀物，並通過陰離子交換層折純化，用凝膠過濾法脫鹽。產(chǎn)率B28Asp人胰島素0.2克。
例10A21Asp，B9Asp，B27Glu人胰島素的制備從B9Asp，B27Glu人胰島素，通過選擇性脫酰氨基作用(在37℃，pH2.5下水解5%的溶液14天)制備A21Asp，B9Asp，B27Glu人胰島素。通過陰離子交換層析分離出此脫酰氨基的產(chǎn)物。
例11B27Glu，A21Asp人胰島素的制備用例2所述的方法，將B27，A21Asp，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)通過用蘇氨酸OBut轉(zhuǎn)肽，然后用三氟乙酸酸解所得的蘇氨酸酯來制備B27Glu，A21Asp人胰島素。
如例10所述方法那樣，通過脫酰氨基作用，由B27Glu，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(見例2)制備B27Glu，A21AspB(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)本發(fā)明的人胰島素類似物的特性分子量的確定(GutfreundH·生物化學(xué)雜志，42(544)1948)方法Knauer膜滲壓計型號1.00膜Schleicher和Schull膜膜型號R52溶劑0.05M Nacl pH7.5濕度21℃結(jié)果所有類型的胰島素在4毫克/毫升的濃度下被測定。
表1胰島素的類型 分子量千道爾頓人的2鋅胰島素 36±2人的無鋅胰島素 29±1無鋅B27Glu人胰島素 22±1″″B12Ile人胰島素 17±1″″B27Glu，A21Asp人胰島素 8±1″″B9Asp，B27Glu人胰島素 6±1″″B9Asp人胰島素 6±1″″B9Asp，B27Glu，A21Asp人胰島素 6±1″″B9Asp，B27Glu，A8His人胰島素 9±3由表1可見，人胰島素類似物的分子量與人胰島素比較顯著的降低。這表明其自身聯(lián)結(jié)形成二聚物、四聚物和六聚物很少，或者在一些場合下甚至沒有。
半衰期和生物效力人胰島素類似物 T1/2＊人胰島素的生物效力＊＊(人胰島素的%) (95%Conf.間隔)B27Glu人胰島素 78 101(83-123)B9Asp，B27Glu 54 110(90-139)人胰島素B12Ile人胰島素 78 91(80-103)B27Glu，A21Asp 56 64(58-71)人胰島素B9Asp人胰島素 52 80(72-90)A21Asp，B9Asp 56 75(66-85)B27Glu人胰島素A8His，B9Asp， 68 116(101-135)B27Glu人胰島素＊從豬的注射部位(皮下)消失50%的時間。根據(jù)Binder 1969(Acta pharmacol.Toxiccl(Suppl 2)27∶1-87)的方法。
＊＊根據(jù)歐洲藥典中小鼠血液葡萄糖測定法。
從表2可見，與人胰島素相比，胰島素類似物從注射部位消失50%的時間顯著下降。
該胰島素類似物的生物效應(yīng)類似于人胰島素，或者只低一些。
權(quán)利要求
1.速效的人胰島素類似物，其特征在于它們具有這樣的形式(式1)
其中X是人胰島素的氨基酸殘基或者是相同或不同的氨基酸殘基取代基，其基本作用是使該分子在PH值為中性的時候，具有與人胰島素相同或者更大的負(fù)電荷，但須在胰島素分子的相應(yīng)位置上，至少要有一個X與人胰島素的氨基酸殘基不同，並且在A(8)位上的X是His，或Phe；在A(21)位上的X為Asp，在B(5)位上的X為Ala，在B(9)位上的X為Leu，在B(10)位上的X為Asu或Leu，在B(12)位上的X為Asn或者在B(26)位上的X為Ala，此外，其余的X中至少有一個X不同于胰島素分子相應(yīng)位置上的人胰島素的氨基酸殘基，并且還須有一個或多個氨基酸殘基可以從A和/或B鏈的N和/或C端上除去。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的胰島素類似物，其中的氨基酸殘基取代基比胰島素分子中相應(yīng)位置上的人胰島素氨基酸殘基更加親水。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物，其中大約少于7個的X不同于人胰島素中相應(yīng)位置的氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物，其中的氨基酸取代基從Asp、Glu、Sen、Thr、His、Ile組成的組中選擇。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物，其中的氨基酸殘基取代基是Asp和/或Glu。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的胰島素類似物，其中在B(9)，B(12)或B(27)位上的X至少有一個不同于人胰島素分子中相應(yīng)位置上的氨基酸殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物，其中B27位上的X為Glu，B12位上的X為Ile或Tyr，A21位上的X為Asp和B27位上的X為Glu，B9位上的X為Asp，A21位和B9位上的X為Asp而B27位上的X為Glu，A8位上的X為His，B9位上的X為Asp和B27位上的X為Glu，B10位上的X為Asp或B9位上的X是為Asp而B27位上的X是Glu，或B28位的X為Asp。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物，其特征在于在B鏈和N末端缺少直至4個氨基酸殘基和/或在B鏈的C末端缺少直至5個氨基酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求
9的人胰島素類似物，其特征在于它們?nèi)鄙貰(1)-氨基酸殘基和/或B(30)氨基酸殘基。
10.一種制備權(quán)利要求
1的人胰島素的方法其中的酵母株包含一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體含有一個具有胰島素類似物前體編碼的DNA序列，將該酵母株在一個穩(wěn)定的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從培養(yǎng)介質(zhì)中回收此前體，然后在試管內(nèi)通過酶和化學(xué)變換轉(zhuǎn)變成新的胰島素類似物。
11.制備權(quán)利要求
1的人胰島素類似物的一種方法，其中生物合成的凝膠體為通式Ⅱ
其中Qn為具有n個天然存在的氨基酸殘基的肽鏈，R為Lys或Arg，n為從0到33的一個整數(shù)，m為0或者1，而X與前面規(guī)定的一樣，但以該肽鏈-Qn-R-不含有二個鄰接的基本氨基酸殘基為條件，該生物合成前體在胰蛋白酶或者胰蛋白酶衍生物存在下，與L-蘇氨酸酯反應(yīng)，然后用已知的方法將所得的人胰島素類似物的蘇氨酸酯轉(zhuǎn)變成人胰島素類似物。
12.一個生產(chǎn)權(quán)利要求
1的人胰島素類似物的方法，其中生物合成前體的通式為Ⅲ
其中S和T各為Lys或Arg，X為前面規(guī)定的一樣，該生物合成前體在水溶液中與肽和羧肽酶反應(yīng)，然后從該反應(yīng)混合物中回收人胰島素類似物。
13.一個制備權(quán)利要求
1的人胰島素類似物的方法，其中含有所需的氨基酸取代基的胰島素類似物是根據(jù)已知方法化學(xué)合成的，或者根據(jù)已知的方法化學(xué)合成含有所需的氨基酸取代基的A鏈和B鏈，然后建立二硫橋，把該修飾過的A鏈和B鏈，在A(7)Cys和B(7)Cys之間，與A(20)Cys和B(19)Cys之間，A鏈內(nèi)的A(6)Cys和A(11)Cys之間連接起來。
14.具有胰島素活性的注射液，其特征在于它們含有權(quán)利要求
1的人胰島素類似物或最好在PH中性時在親水溶液中它的藥學(xué)上可接受的鹽。
專利摘要
本發(fā)明提供了新的速效人胰島素類似物，其自身結(jié)合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的傾向較小。該新的人胰島素類似物是通過用天然存在的氨基酸殘基取代人胰島素中的一個或多個氨基酸殘基的方法得到的。氨基酸殘基取代基最好比分子的相應(yīng)位置上的天然氨基酸殘基更親水。另外，該胰島素類似物在中性pH值時與人胰島素相比，具有相同或更大的負(fù)電性。氨基酸取代基以天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸和異亮氨酸為好，向更好的取代基是天冬氨酸和谷氨酸。該新的胰島素類似物可以用于速效胰島素溶液的制備。
文檔編號C12N15/81GK86106574SQ86106574
公開日1988年8月3日 申請日期1986年8月28日
發(fā)明者杰斯·約根·維爾加德·布朗格, 克杰德·諾里斯, 莫根斯·特里爾·翰森 申請人:諾沃工業(yè)聯(lián)合股票公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan