專利名稱:口蹄疫合成疫苗的制備方法
口蹄疫(FMD)是一種引起偶蹄動物衰弱、具有高度傳染性的疾病。病原體-口蹄疫病毒(FMDV)是一種屬于細(xì)小核糖核酸病毒簇的小型動物病毒。它有一條約8000核苷酸組成的正向RNA單鏈基因組。
過去，用滅活病毒或減毒活病毒已經(jīng)生產(chǎn)FMD疫苗。這些方法，雖然一般是有效的，但也不是沒有問題的。偶爾因病毒滅活不完全或減毒不夠可能引起FMD發(fā)生。合成的FMDV疫苗將免除生產(chǎn)過程中處理病毒的各種問題，因此用此疫苗作為一種最理想的代替方法是可以理解的。〔D.Rowlands，Endeavor 8(3)，123-127(1984)〕。
近幾年已經(jīng)對FMDV進(jìn)行了研究。細(xì)小核糖核酸病毒含有四種外殼蛋白，命名為VP1、VP2、VP3和VP4。這些VP蛋白的實(shí)際名稱服從于不同的衡量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明范圍內(nèi)所涉及的有關(guān)蛋白已經(jīng)被一些研究組稱之為VP3〔見，如，Kleid等，Seience 214，1125(1981)〕而被另一些研究組定為VP1〔見如，Clarke等，F(xiàn)EBS Letters 157，261(1983)〕。為了現(xiàn)時(shí)目的，這一蛋白質(zhì)稱為VP1。
VP1已經(jīng)成為相當(dāng)多的研究和結(jié)構(gòu)分析的題目，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它能產(chǎn)生豬的中和抗體反應(yīng)，〔J.Laporte，J.Groselaude，J.Wantyghem，S.Bernard，P.Rouze，C.R.Acad.Sci.276，3399(1973)〕并且使豬和牲畜都不受FMDV感染〔H.L.Bachrach，D.M.Moore，P.D.Mckercher，J.Polatnick.J Immuno
115，1636(1975)〕。已報(bào)導(dǎo)TrpLE和VP1的生物合成融合多肽經(jīng)多次接種可以保護(hù)豬和牲畜防止接觸病毒而發(fā)病〔D.G.Kleid，D.yansura，B.Small，D.Dowbenko，D.Moore，M.Grubman，P.Mckcrcher，D.O.Morgan，E.V.Robertson，H.L.Bachrach，Scieuce 214，1125-1129(1981)〕。
Strohmaier等，J.Gen.Virol.59，295-306(1982)，用化學(xué)和酶的方法消化VP1，得出結(jié)論為能產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原區(qū)位于氨基酸序列的146-154和201-213。
Bittle等，Nature 298，30-33(1982)用化學(xué)方法合成了相當(dāng)于FMDV VP1多肽的141-160和200-213區(qū)域的肽類，并且在豚鼠和家兔上證實(shí)了這些肽類能產(chǎn)生高水平中和抗體的能力。在PCT International Patent Application NO.WO 83 03，547，(1983年10月27日發(fā)表)中也有這方面的工作報(bào)告。
縱觀以前進(jìn)行的有關(guān)小肽序列的全部工作，主題是信心并發(fā)現(xiàn)這些小肽序列如果存在免疫原性只是在把它們連到一高分子量載體上而獲得的。最常用的載體是鎖眼帽貝血蘭香白(KLH)。
PCT Application NO.WO 83 03，547提出單體、非環(huán)狀的小肽不能產(chǎn)生足夠中和指數(shù)以獲得對病毒的抵抗?？锾貏e申明需要約1.5或更大的中和指數(shù)才能使動物抵抗這種病毒，并指出單體未結(jié)合的肽的中和指數(shù)接近0.5，這種肽具有實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于O1K FMDV約141-160位上氨基酸殘基序列。已報(bào)告當(dāng)同一肽與KLH結(jié)合后中和指數(shù)約3.7到3.9，這一結(jié)果可以與上一結(jié)果相比較。
一類新的未結(jié)合的單體小肽已被發(fā)現(xiàn)。不用任何載體，這些肽類能產(chǎn)生一種出乎意外的、顯著增強(qiáng)的抗FMDV的中和反應(yīng)。這些肽類能產(chǎn)生一種出乎意外的、顯著增強(qiáng)的抗FMDV的中和反應(yīng)。這些肽類在牲畜上接種一次就產(chǎn)生前所未有的保護(hù)作用，重復(fù)免疫后可以完全得到保護(hù)。在目前的發(fā)現(xiàn)以前，要獲得后一結(jié)果必須用比新發(fā)現(xiàn)肽類的體積約大五倍的抗原才能得到。
依據(jù)本發(fā)明，可提供一種含結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)序列的化合物X-A-Y-B-Z (Ⅰ)其中A和B是組成口蹄疫病毒VP1外殼蛋白血清型順序的氨基酸殘基序列，其中之一種含有從18到24個(gè)氨基酸殘基并包括O血清型的141-158位氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列，而另一個(gè)含有從14-20個(gè)氨基酸殘基并包括O血清型200-213位氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列;
X是H，H-半胱或H-半胱-半胱，它的巰基可能是封閉的或自由的;
Z是OH，半胱-OH，或脯-半胱-甘-OH，它的巰基也可以是封閉的或自由的;
Y是約2到6個(gè)氨基酸序列，或它們在制藥上合格的鹽。
根據(jù)注釋，本發(fā)明目標(biāo)指向按結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)合成的、具有免疫原性的肽類X-A-Y-B-Z (Ⅰ)基因A和B包括相當(dāng)于O血清型、1亞型、Kaufbeuren株(O1K)FMDV的VP1外殼蛋白中存在的選擇序列和在其它任何口蹄疫病毒血清型中存在的相同的同類序列。
已知存在7個(gè)血清型的FMDV。最普遍的是歐洲并帶有A、B和C名稱。余下的3個(gè)是南非，SAT-1，SAT-2和SAT-3，還有一個(gè)是亞洲，Asia-1。另外每個(gè)血清型已知有許多亞型和與亞型有關(guān)的株。具體的例子是O血清型，1亞型，Kaufbeuren株(O1K);O血清型，1亞型、Campos株(O1C);O血清型、1亞型、British Field Strain株(O1BFS);A血清型、10亞型、61株(A10，61);A血清型、12亞型、119株(A12，119);A血清型、24亞型(A27);A血清型、79亞型(A79);和C血清型、3亞型、Indaial株(C3I)。
O血清型141-158位和200-213位氨基酸殘基序列代表本發(fā)明的肽的基因A和B定義的中心點(diǎn)。在任何具體例子中基團(tuán)A包含一個(gè)序列，而基因B包含另一個(gè)序列。另外，在任何其它血清型和血清亞型中存在的類似又不是必須的同一序列也包括在基團(tuán)A和B的定義內(nèi)。在基團(tuán)A和B的定義包括分別相當(dāng)于O血清型141-158位和200-213位氨基酸序列的大于18和14個(gè)氨基酸殘基長度的情況下，其余的殘基可以是任何氨基酸。
為了便于說明，下面給出O1K 141-158序列和其它血清型和亞型的同類序列的例子141 150 158O1K 纈脯冬酰亮精甘冬亮谷酰纈亮丙谷酰賴?yán)i丙精蘇O1BFS 纈脯冬酰亮精甘冬亮谷酰纈亮丙谷酰賴?yán)i丙精蘇O1C 纈脯冬酰纈精甘冬亮谷酰纈亮丙谷酰賴?yán)i丙精蘇A10，61 絲-精絲-甘冬亮甘絲異亮丙丙精纈丙蘇谷酰A12，119 絲甘-纈精甘冬苯丙甘絲亮丙脯精纈丙精谷酰A24C 絲甘-精精甘冬蛋甘蘇亮丙丙精纈纈賴谷酰A27 谷酰-精丙甘冬蛋甘蘇亮丙丙精纈丙賴谷酰A79 絲甘-精精甘冬蛋甘蘇亮丙丙精纈丙賴谷酰C31 -精精甘冬亮纈組亮丙丙丙組丙精組下面是O1K200-213序列和其它血清型和亞型同類序列的例子200 213O1K 精組賴谷酰賴異亮纈丙脯纈賴谷酰蘇亮O1BFS 精組賴谷酰賴異亮纈丙脯纈賴谷酰蘇亮A10，61 精蘇賴谷酰賴異亮異亮丙脯丙賴谷酰亮亮A12，119 精組賴谷酰賴異亮異亮丙脯甘賴谷酰-亮A24c 精組賴谷酰賴異亮異亮丙脯丙賴谷酰亮亮A31 精組賴谷酰脯亮異亮丙脯丙賴谷酰亮亮在本發(fā)明提供的這些肽類中，A或B基團(tuán)中的一個(gè)包含141-158順序，另一個(gè)是200-213位順序。最好是A或B中一個(gè)是141-158的序列而另一個(gè)是200-213的序列。更合意的是基團(tuán)A是200-213序列而基團(tuán)B是141-158序列。本發(fā)明肽類的A和B基團(tuán)是來自同一個(gè)FMDV血清型的肽序列最為合意。
基因x代表本發(fā)明肽類的氨基末端部分，x可代表氨基末端的氫或單半胱氨?；螂p半胱氨酰的延長。如果x是單或雙半胱氨酰，則半胱氨酸的硫氫可能是封閉的或游離的。很多為工藝熟練者所熟悉的封閉基團(tuán)都能用。例如磺酸鹽、羧甲基、羧氨基甲基、氨基乙基等等。然而最好x是氫。
基團(tuán)Z定義為本發(fā)明肽類的羧基末端。這樣Z是羥基或是含半胱氨酸的延伸，即半胱氨酸或脯-半胱-甘-OH三肽。再有，半胱氨酸可以是封閉的或游離的，如果是封閉的，可用任何前面所述的相同的封閉基團(tuán)來封閉。
基團(tuán)Y連接基團(tuán)A和B，代表一個(gè)氨基酸殘基或一個(gè)具有2至6個(gè)氨基酸殘基的序列。最好Y是一個(gè)有2至4個(gè)氨基酸殘基的序列。這序列可由多種氨基酸殘基組成。脯氨酸是一種可選擇的氨基酸殘基，含脯-脯的序列更為可取。特別可取的序列是脯-脯-絲或亮-脯-脯-蘇。
本發(fā)明所包含的化合物是藥品上合格的酸及鹽和藥品上合格的羧酸鹽?！八幤飞虾细竦柠}”是指這些鹽類可用于溫血?jiǎng)游锏幕煛?br>“藥品上合格的酸及鹽”一詞包括有機(jī)和無機(jī)兩類的酸及鹽，例如包括那些從諸如鹽酸、氫氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、延胡索酸、氫溴酸、羥基乙酸、檸檬酸、馬來酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗壞血酸、對-甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸，等等中制備的酸及鹽。最好是從鹽酸、乙酸或琥珀酸制備的酸及鹽。以上的鹽是用工藝上熟練者已知的常規(guī)方法制備的。
“羧酸鹽”一詞包括諸如氨、堿金屬鹽如鈉、鉀和鋰等等。
為方便起見，有關(guān)的氨基酸用它們已批準(zhǔn)的速記三個(gè)字母表示。
這些表示法如下3-字母丙氨酸 Ala精氨酸 Arg天門冬酰胺 Asn天門冬氨酸 Asp半胱氨酸 Cys谷氨酸 Glu谷氨酰胺 Gln甘氨酸 Gly組氨酸 His異亮氨酸 Ile亮氨酸 Leu
賴氨酸 Lys苯丙氨酸 Phe脯氨酸 Pro絲氨酸 Ser蘇氨酸 Thr色氨酸 Trp酪氨酸 Tyr纈氨酸 Val本發(fā)明的化合物的實(shí)例是VP1(O1K) H〔(200-213)脯脯絲(141-158)〕脯半胱甘-OH;
VP1(O1K) H-半胱〔(200-213)脯脯絲(141-158)〕半胱-OH;
VP1(O1K) H-半胱半胱〔(200-213)脯脯絲(141-158)脯半胱甘-OH;
VP1(O1K) H〔(200-213)脯脯絲(141-158)〕OH;
VP1(O1BFS) H〔(141-158)脯脯(200-213)〕OH;
VP1(Al0，61) H〔(141-158)亮脯脯絲(200-213)〕OH;
VP1(A12，119) H-半胱〔(200-213)亮脯脯絲(141-158)〕OH;
VP1(A24C) H〔(200-213)纈脯脯蘇精(141-158)〕OH;
VP1(O1C) H-半胱半胱(141-158)脯脯(200-213)〕半胱-OH;
VP1(C3I) H〔(200-213)脯脯絲(141-158)〕OH;
VP1(O1K) H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯蘇〔谷酰丙(200-213)〕OH;等等。
本發(fā)明的化合物可以由各種已知的肽合成技術(shù)來制備，包括傳統(tǒng)(溶解)方法、固相方法及最近使用的重組DNA方法。
制備本發(fā)明復(fù)合物的主要方法之一是固相技術(shù)，這一技術(shù)中氨基酸序列是從一不溶解的樹脂支持的C-末端的起始氨基酸開始依次構(gòu)建的。固相方法技術(shù)是J.Stewart等描述過的，多相肽的合成，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，1984。
固相肽合成工藝情況的實(shí)例由R.D.Dimarchi，J.P.Tam，R.B.Merrifield報(bào)告中提供，Int.J.Pep.Prot.Res.19，270-279(1982);還有R.B.Merrifield，L.D.Vizioli，H.G.Boman，Biochem.21，5021-5031(1982);S.Mojsov，R.B.Merrifield，Eur.J.Biochem.145，601-605(1984)，這些方法在制備這些FMDV合成免疫原時(shí)可能被采用。最重要的特點(diǎn)如下1.利用聚合(苯乙烯-1%二乙烯苯)樹脂，200-400篩孔珠，取自Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室。
2.用Mitchell等方法(1978，見后)使樹脂支持物轉(zhuǎn)變?yōu)榘奔谆鶚渲?br>3.羧基末端的氨基酸通過(季一)t-丁酰-羰基-氨?；?〔4-(羥甲基)苯基〕乙酸衍生物酰胺化到氨甲基樹脂上。
4.保護(hù)氨基的t-丁酰-羰基(Boc)基團(tuán)以50%TFA/CH2Cl2斷開，并在5% DIEA/CH2Cl2中中和胺。
5.利用每個(gè)殘基上的雙偶聯(lián)、除了天門冬酰胺、谷酰胺和精氨酸外，第一偶聯(lián)是用予先形成的對稱酐。第二偶聯(lián)都是用予先形成的HOBt-酯。前面提到的例外是第一偶聯(lián)與第二偶聯(lián)相同。
6.通過在碳陽離子消除劑存在的情況下，把肽暴露于一種酸的方法從樹脂支持物上切下肽。
7.最好利用下列側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)精氨酸(對甲苯磺酰)，天門冬氨酸(O-環(huán)戊基)，半胱氨酸(4-芐甲氧基)，谷氨酸(O-環(huán)戊基)，組氨酸(芐氧甲基)賴氨酸(2-氯-芐氧羰基)，絲氨酸(芐基)，蘇氨酸(芐基)，色氨酸(甲酰基)和酪氨酸(2-溴芐氧羰基)。
更可取的肽與樹脂的裂解條件包括在從-10℃到+15℃溫度下，使肽-樹脂暴露于無水氫氟酸。最好的碳陽離子消除劑是對-甲酚。
本發(fā)明的復(fù)合物也能通過重組DNA方法制備。制備時(shí)，編碼所要的肽的核苷酸序列是用目前這類常規(guī)的合成方法制備的。這些方法一般包括制備所需的序列的片段和其互補(bǔ)序列兩者的寡核苷酸編碼。設(shè)計(jì)寡核苷酸提供一個(gè)片段的編碼序列與二個(gè)互補(bǔ)序列的片段一致，反之亦然。寡核苷酸配對、連結(jié)，最后產(chǎn)生所需的基因序列。
這序列插入到一個(gè)克隆載體的一個(gè)部位，該部位可使已編碼的肽類產(chǎn)物得以表達(dá)。一個(gè)合適的克隆載體至少含有基因表達(dá)控制序列部分。
典型的表達(dá)控制序列可以用五種成分表示。這些成分在基因上出現(xiàn)的次序如下(a)起動子區(qū);(b)5′非翻譯區(qū);(c)蛋白質(zhì)編碼序列;(d)3′非翻譯區(qū)和(e)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。
基因系上每一成分的功能已明瞭。起動子區(qū)起動產(chǎn)生mRNA(轉(zhuǎn)錄)。起動子可以是(1)不受外界控制(基本的)，(2)在阻遏物控制下，所謂阻遏物，即當(dāng)存在該物質(zhì)時(shí)抑制基因功能，或(3)在誘導(dǎo)物控制下，所謂誘導(dǎo)物，即需要該物質(zhì)誘導(dǎo)基因功能。例如，脂蛋白(Ipp)基因不受外界控制，這就稱之為“基本的”。
位于起動子旁或附近的是“轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)”，RNA聚合酶在此結(jié)合引起mRNA的轉(zhuǎn)錄起始。一旦轉(zhuǎn)錄起始，就產(chǎn)生mRNA。產(chǎn)生的mRNA的結(jié)構(gòu)由上述(b)到(d)基因成分的DNA順序所決定。
由此產(chǎn)生的mRNA攜帶能翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列。能翻譯的序列位于5′非翻譯區(qū)向下和3′非翻譯區(qū)向上的區(qū)域。翻譯由核糖體結(jié)合到mRNA5′非翻譯區(qū)的一個(gè)序列上，以核糖體結(jié)合位點(diǎn)表示之，并且在翻譯起始密碼(AVG)處開始，該密碼以產(chǎn)物基因序列的第一個(gè)密碼子出現(xiàn)，也為蛋氨酸(Met)編碼。翻譯終止于編譯區(qū)末端出現(xiàn)的一個(gè)或幾個(gè)終止密碼上。
利用重組DNA技術(shù)，使制備一種克隆載體成為可能，通過把一個(gè)表達(dá)控制序列插入到此載體上，該克隆載體用來生產(chǎn)選擇的外部(外源)蛋白。表達(dá)控制序列是-核苷酸序列當(dāng)它有效地連結(jié)到基因上時(shí)，就能控制和調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。
在上述內(nèi)容中，“表達(dá)控制序列”一詞包含前述(a)、(b)、(d)和(e)的成分。
重組DNA方法學(xué)可用于表達(dá)本發(fā)明的化合物，其方式是作為較大的“雜交”分子的一部分，或者直接表達(dá)。在直接表達(dá)的方式中，克隆載體可以這樣設(shè)計(jì)，即該表達(dá)產(chǎn)物由基本起始密碼子的蛋氨酸(Met)殘基為先導(dǎo)的全部所需產(chǎn)物所組成。多余的Met殘基可以通過用溴化氰處理或用苯基異硫氰酸鹽再加一強(qiáng)脫水酸如三氟醋酸處理產(chǎn)物而移除。
在雜交分子表達(dá)方式中，把編碼所需產(chǎn)物的DNA序列插入到克隆載體的表達(dá)控制序列的一個(gè)位點(diǎn)上，使表達(dá)的產(chǎn)物組成雜交蛋白。“雜交蛋白”意思是組成外源蛋白的重組DNA產(chǎn)物，一般是指全部或部分由表達(dá)控制序列所產(chǎn)生的固有(內(nèi)源性)蛋白，(例如，脂蛋白基因上的脂蛋白)，所需蛋白是連結(jié)在這些固有蛋白上的。
由重組DNA方法所生產(chǎn)的設(shè)計(jì)合理的雜交分子將含有一個(gè)裂解位點(diǎn)，它位于內(nèi)源蛋白部分與所需產(chǎn)物的連結(jié)處。通過化學(xué)或酶法處理雜交蛋白產(chǎn)物，裂解位點(diǎn)允許終產(chǎn)物產(chǎn)生。非常有用的選擇性裂解位點(diǎn)包含一個(gè)DNA序列，該序列編碼可被化學(xué)式酶法在C-末端裂解的一個(gè)氨基酸或氨基酸序列。
用來裂解蛋白的化學(xué)試劑如溴化氰，BNPS-甲基吲哚，羥胺等等。溴化氰在C末端的蛋氨酸殘基上裂解蛋白。因此，選擇裂解位點(diǎn)就是蛋氨酸基本身。
羥胺在C末端的某一天冬酰胺-Z上裂解，這里Z是甘氨酸、亮氨酸或丙氨酸。
BNPS-甲基吲哚在C末端色氨酸殘基上裂解。
用于裂解的酶制劑如胰蛋白酶、木瓜酶、纖維蛋白酶、凝血酶等等。每一種酶引起裂解都發(fā)生在它所識別的特殊氨基酸序列上。例如腸激酶識別的選擇性切點(diǎn)是-(天門冬氨酸)n-賴氨酸-這-氨基酸序列，其中n為2到4的整數(shù)。
特別是對于本發(fā)明缺乏蛋氨酸的復(fù)合物，最適合的選擇性切點(diǎn)是蛋氨酸殘基。這殘基連在所需產(chǎn)物的N-末端上，很容易被使用溴化氰的已知方法所裂解從而產(chǎn)生所期望的終產(chǎn)物。
構(gòu)造有用的克隆載體時(shí)，需要幾個(gè)因素。其中兩個(gè)因素對所有的有用的克隆載體是共同的。第一，載體必須具有一段含有復(fù)制功能點(diǎn)(復(fù)制子)的DNA片段。質(zhì)粒和噬菌體DNA本來就含有復(fù)制子它促進(jìn)在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程。第二，載體必須具有這樣一個(gè)DNA片段，它能從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中把對選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞有用的性質(zhì)轉(zhuǎn)送給能轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。各種其他性質(zhì)也可用于選擇的目的。最常用的一種性質(zhì)是抗菌素耐藥性，如四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
上述兩種因素一般存在于容易使用和識別的克隆載體上。合適的克隆載體的例子是細(xì)菌質(zhì)粒，例如包括pBR322、pMB9、ColE1、pCR1質(zhì)粒的大腸桿菌質(zhì)粒;廣宿主質(zhì)粒，包括RP4，噬菌體DNA，如入噬菌體等等。上述已知載體如果不是全部，也是絕大部分帶有前面所述的兩種因素。
第三個(gè)因素是表達(dá)控制序列。其它任何這類控制表達(dá)序列都能使用，例如包括來自脂蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因，色氨酸基因，β-內(nèi)酰氨酸基因，入噬菌體等等。
用插入一個(gè)選擇表達(dá)控制序列得到一個(gè)合適的克隆載體時(shí)，使用的是常規(guī)的方法?？寺≥d體上存在各種位點(diǎn)，在該位點(diǎn)上用對它特異的限制性內(nèi)切酶可以進(jìn)行切割。任何這樣的位點(diǎn)都可選擇來插入表達(dá)控制序列。舉一例子，在已知道得很清楚和已被證明的質(zhì)粒pBR322上，存在幾個(gè)合適的限制性位點(diǎn)，其中任何一個(gè)都可作為插入位點(diǎn)。PstI位點(diǎn)位于β-內(nèi)酰胺酶基因。其余在特異編碼區(qū)以外的位點(diǎn)是EcoRI和PvuⅡ。這些和別的位點(diǎn)都能被工藝熟練者很好辨認(rèn)。
利用任何這樣的或其它的位點(diǎn)，插入一個(gè)表達(dá)控制序列或其基本部分來生產(chǎn)本發(fā)明所限定的載體是容易做到的。
第四個(gè)因素當(dāng)然是編碼所需產(chǎn)品的DNA序列。正如前面注明的，這種DNA序列可以通過合成來構(gòu)建，即用已知的磷酸三酯的方法或其它已知方法來合成。
合適的克隆載體可用于多種宿主體，例如革蘭氏陰性原核生物如大腸桿菌，沙雷氏菌屬，假單胞菌屬等等;革蘭氏陽性原核生物如芽胞桿菌屬，鏈霉菌屬等等;及其核生物如酵母屬等等。合適的宿主體是革蘭氏陰性原核生物，尤其是大腸桿菌更為合適，例如大腸桿菌K-12系，象PV308。
用已知的方法學(xué)，把適當(dāng)?shù)刂苽涑鰜淼目寺≥d體用于轉(zhuǎn)化適合的宿主體，在這樣的生物體內(nèi)擴(kuò)增，并用標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵條件表達(dá)外源性蛋白產(chǎn)物。這外源性蛋白產(chǎn)物是用常規(guī)方法從所得的發(fā)酵肉湯中分離出來的。
于是，根據(jù)本發(fā)明，就提供了一個(gè)制備含結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)序列的合成口蹄疫疫苗的程序x-A-y-B-Z (Ⅰ)其中x、A、y、B和Z如前所定義的，它包含(a)從結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)相應(yīng)的被保護(hù)復(fù)合物中裂解出一保護(hù)性基團(tuán);或(b)培養(yǎng)一種微生物，它被含有編碼結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)復(fù)合物的DNA序列的表達(dá)轉(zhuǎn)移載體所轉(zhuǎn)化，在適于表達(dá)編碼結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)復(fù)合物的DNA序列的情況下，由上述微生物的溶菌液或培養(yǎng)基中純化結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)復(fù)合物。
(c)如果需要，使游離復(fù)合物鹽化，形成相應(yīng)的藥品上合格的鹽。
有效治療口蹄疫的本發(fā)明的復(fù)合物能用于各種藥品組成和配方之中，并可經(jīng)各種方便途徑給藥，如鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)。
本發(fā)明復(fù)合物給藥時(shí)，適于注射的藥品形式包括無菌水溶液或彌散劑，及可重新制成無菌注射液或彌散劑的無菌粉末。載體可以是溶劑或彌散介質(zhì)，例如含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等等)，及合適的上述混合物和植物油。保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如通過使用卵磷脂涂層，通過保持在彌散情況下所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑。通過各種抗菌劑和抗真菌劑確保予防微生物的作用，例如paraten，氯代丁醇、苯酚，m-甲酚，山梨酸等等。在很多情況下，期望含有等張?jiān)噭?，例如蔗糖，氯化鈉等等。利用延緩吸收的物質(zhì)可以延長注射藥物形式的吸收，例如，單硬脂酸鋁和白明酸。
無菌注射液可以通過把本發(fā)明的復(fù)合物摻入適量合適的溶劑，如果需要，可帶有各種別的配料。
如需要，為更有效的分布，復(fù)合物可摻入慢釋放或有目標(biāo)的傳送系統(tǒng)，如基質(zhì)聚合物、脂質(zhì)體和微球體。
在期望對口蹄疫有予防或治療作用期間，都要給受者一定劑量的本發(fā)明復(fù)合物。接受者的量和給藥方式將對誘發(fā)特殊反應(yīng)的必需劑量的大小有影響。
為了給藥方便和劑量一致，本發(fā)明復(fù)合物接單位劑量配方有特殊的優(yōu)點(diǎn)。“單位劑量形式”涉及到物理學(xué)上分主單位，適于給治療對象提供單個(gè)劑量。每一單位含有予先定量的復(fù)合物來計(jì)算復(fù)合物與藥品上合格的載體聯(lián)在一起產(chǎn)生預(yù)期的治療和予防作用。這個(gè)特殊單位劑量形式直接依賴并受(a)特殊組成的單一特性和(b)所獲得的特殊效果所支配。
以下非限定實(shí)例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)例1.FMD合成疫苗的制備所有的肽類都在Beckman 990 B固相肽合成儀上用半自動程程進(jìn)行合成。起始作用過程從加上第一個(gè)氨基酸，經(jīng)過后面的所有步驟直到加上最后一個(gè)氨基酸都是人工獲得的。所有試劑除非另有說明，都是商業(yè)用的最高擋品。二甲基甲酰胺(DMF)使用之前要過4
分子篩后貯存一周。二氯甲烷(CH2Cl2)是高壓液相層析純的。二異丙基乙胺(DIEA)用前用茚三酮稀釋。共聚樹脂(苯乙烯-1%二乙烯苯)，200-400網(wǎng)孔珠，從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室購買。保護(hù)氨基酸的質(zhì)量是購自Peninsula實(shí)驗(yàn)室和Bachem，用前經(jīng)過薄層層析、旋光、氨基酸分析和質(zhì)譜分析檢測過的。
A、氨甲酰樹脂的制備氨甲酰樹脂的制備如A.R.Mitchell，S.B.H.Kent，M.Engelharol R.B.Merrifield，J.Org.Chen.43，2845-2852(1978)所述，但所期望的作用是他們報(bào)告的四倍。徹底洗過的100克樹脂放在三頸的圓底燒瓶內(nèi)，加入16克(81毫摩爾)的正-(羥甲基)酞亞胺和三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)2升。在快速攪拌下，慢慢加入三氟甲烷磺酸(40ml，0.44摩爾)。22℃反應(yīng)6小時(shí)后，過濾溶液，每次用4升三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)，二氯甲烷、乙醇，最后是二氯甲烷廣泛洗滌。樹脂一旦經(jīng)真空干燥后，在2升含5%肼的乙醇中回流16小時(shí)。樹脂趁熱過濾，并用煮沸乙醇(4×2升)，甲醇(4×2升)和二氯甲烷(4×2升)洗滌。產(chǎn)物經(jīng)真空干燥，通過茚三酮分析，產(chǎn)生胺化作用為0.836毫摩爾/克〔V.Sarin，S.B.H.Kent，J.P.Tam，R.B.Merrifield，Anal、Biochem.117，147-151(1981)〕。
B、Boc-甘氨酸-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸的制備。
合成Boc-甘氨酸-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸，嚴(yán)格按J.P.Tam，S.B.H.Kent，T.W.Wang，R.B.Merrifield，合成法，955-957(1979)〕所述，得率為45%。
C、衍生的甘氨酸與氨甲基樹脂的連結(jié)。
Boc-甘-〔4-(氧甲基苯)〕醋酸(1.4毫摩爾)于0℃，在1.4毫摩爾1-羥基苯三唑(HOBt)存在的條件下，溶于20毫升DMF/二氯甲烷(1∶3，V/V)中。加入等量的(1.4毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，于0℃攪拌反應(yīng)混合物10分鐘，然后過濾除去二環(huán)己基脲，上清液加到4克懸于20毫升二氯甲烷的氨甲基樹脂上。過二小時(shí)后，過濾樹脂，用40毫升二氯甲烷洗滌3次，然后懸于40毫升0.5M醋酸酐/0.1MDIEA/二氯甲烷。再過2小時(shí)后樹脂對茚三酮呈陰性。樹脂用40毫升二氯甲烷洗三次，然后在40毫升三氟醋酸/二氯甲烷(1∶1，V/V)中去除甘氨酸的-丁基氧羰基的保護(hù)基團(tuán)。
D、重復(fù)分步合成方案在每種情況下，每種氨基酸用多于胺的三倍量進(jìn)行雙偶聯(lián)。而天門冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸以它們先形成的HOBt-酯的形式偶聯(lián)兩次，其余氨基酸第一次偶聯(lián)以其先形成的對稱酐進(jìn)行，再以其先形成的HOBt-酯的形式重復(fù)偶聯(lián)。中和作用、去保護(hù)和全部洗滌，在15毫升溶劑/克起始樹脂開始，按以下方案全部自動化。
1. 5%DIEA/CH2Cl2(2×2分鐘)
2. CH2Cl2(6×1分鐘)3. 第一次偶聯(lián)(1×120分鐘)4. CH2Cl2(6×1分鐘)5. 5%DIEA/CH2Cl2(2×2分鐘)6. CH2Cl2(6×1分鐘)7. 第二次偶聯(lián)(1×120分鐘)8. CH2Cl2(6×1分鐘)9. 5%TFA/CH2Cl2(1×2分鐘;1×20分鐘)10. CH2Cl2(6×1分鐘)在合成過程中，將樹脂等分移出用以制備縮短的免疫原。
E、制備O1K，VP1(141-158)脯半胱甘-〔21殘基肽〕約3克肽樹脂代表1.34克被保護(hù)的O1K，VP1(141-158)-脯半胱甘，用30毫升HF/對-甲酚(9∶1)于0℃處理60分鐘，裂解完成后，于0℃在真空下把樹脂蒸發(fā)干，隨后用5×50毫升二乙基醚洗滌。去保護(hù)的肽依次用醋酸處理來溶解10%醋酸(3×30毫升)，50%醋酸(1×30毫升)，最后10醋酸(3×30毫升)。該肽冷凍干燥至產(chǎn)量的76%。Ellmantritration顯示出最少70%游離的巰基成分。該肽經(jīng)葡聚糖(Sephadex)G-25凝膠滲透層析用10%醋酸純化，隨后二硫蘇糖醇(DTT)還原，得到經(jīng)分析高壓液相層析(HPLC)確定的高度均一的單體部分。
F、制備O1K，VP1〔亮脯脯絲(141-158)〕脯半胱甘-〔25殘基肽〕
約1.1克肽樹脂代表0.532克已保護(hù)的O1K，VP1〔亮脯脯絲-(141-158)〕脯半胱甘如E項(xiàng)一樣處理，得到所要肽的產(chǎn)量為84%。
G、制備O1K，VP1〔(200-213)脯脯絲(141-158)〕脯半胱甘-〔38殘基肽〕約2.4克肽樹脂代表1.29克已保護(hù)的O1K，VP1〔(200-213)脯脯絲(141-158)脯半胱甘按E項(xiàng)處理得到97%產(chǎn)量的所要肽。
H.制備O1K，VP1〔半胱半胱(200-213)脯脯絲(141-158)脯半胱甘-〔40殘基肽〕約2.5克肽樹脂代表1.39克已保護(hù)的O1K，VP1〔半胱半胱(200-213)脯脯絲(141-158)〕脯半胱甘按E項(xiàng)處理得到97%產(chǎn)量的所要肽。
I、制備O1K，VP1H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯蘇〔谷丙(200-213)〕OH-〔45殘基肽〕已保護(hù)的O1K，VP1H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)〕亮脯脯蘇〔谷丙(200-213)〕-肽樹脂按E項(xiàng)處理得到標(biāo)題所列的肽。
這五種多肽的氨基酸分析如表1所示
Ⅰ.肽類通過SPDP化學(xué)性附著到KLH上下面敘述最小肽的研究過程基本上對所有的化學(xué)性結(jié)合到KLH上的肽是相同的。SPDP〔N-琥珀酰亞胺-3(2-二硫吡啶)丙酸鹽〕對KLH最大適合的負(fù)載水平是按照反應(yīng)超過60分鐘的復(fù)合物的沉淀程度來確定的。據(jù)觀察SPDP對KLH超過250摩爾是合適的。1.5克KLH(～1×10-4毫摩爾)溶于25毫升0.1摩爾Na2HPO4，pH7.2用輕度超聲處理。少量不溶物用離心除去，上清液加入7.81毫克溶于625微升DMF的SPDP(2.5×10-2毫摩爾)。堿性吸收停止后，樣品離心，上清液用Sephadex G-25層析(0.1M NaHPO4，pH7.2，速度為20厘米/小時(shí))胱鹽。在衍生化過程中得到的負(fù)載水平用DTT還原測得約為40%。
在100g被處理過的KLH(2×10-6摩爾配體)的25毫升0.1M Na2HPO4，pH7.2中加入溶于600微升0.1摩爾pH7.4的Tris緩沖液中超過十倍量的(141-158)脯半胱甘還原肽(44毫克，2×10-5摩爾)。反應(yīng)通過釋出的配體來監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在22℃，60分鐘時(shí)接近定量。樣品在Sephacryl S-200上用0.1摩爾NH4HCO3，pH7.5胱鹽并凍干?；谟邢薜姆磻?yīng)物，偶聯(lián)21-，25-和38-殘基肽的產(chǎn)量分別為84%、85%和68%。
J.肽類的配方所有肽和肽-KLH連結(jié)物在需要的濃度下溶于10mM Tris，pH8.0，然后用Freund氏完全估劑按1∶1稀釋。給與每個(gè)動物的總量及抗原濃度在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中敘述。
Ⅱ、生物學(xué)方案A、豚鼠接種全部實(shí)驗(yàn)用隨機(jī)近親繁殖的雌性Duncan Hartly豚鼠，體重為450-500克。每組5只豚鼠，按所述劑量皮下注射每只為0.15毫升體積的每種疫苗制劑。除0.15毫升總劑量外，只有一次是0.45毫升劑量用于抗原量滴定得到規(guī)定的最高濃度。從O1Kaufbeuren品系制備對照疫苗，已發(fā)表的序列數(shù)據(jù)就是來自這一品系。疫苗用氫氧化鋁凝膠制備，每一劑量含1.66毫克皂苷，五只豚鼠皮下各注射一毫升疫苗。攻擊病毒的是上述的O1Kaufbeuren品系。它通過連續(xù)的小泡啉巴管適應(yīng)于豚鼠，以第五豚鼠啉巴管水平用作攻擊目的。病毒滴定后，進(jìn)行1/20稀釋，得到豚鼠ID50為103.5的攻擊劑量，即每只動物3000感染劑量。所有的實(shí)驗(yàn)動物都在左右足墊作病毒攻擊的皮內(nèi)接種，體積為0.2毫升。連續(xù)7天觀察每只受攻擊的豚鼠是否在其它的后足、手或口發(fā)生繼發(fā)性或延及性損傷。予防標(biāo)準(zhǔn)為沒有任何繼發(fā)損傷。
B、牲畜接種全部實(shí)驗(yàn)用6到8個(gè)月對口蹄疫敏感的小母牛。混合喂養(yǎng)，體重約150-180公斤。按所述劑量每種疫苗制品皮下注射每只給3毫升，每組為三只牲畜。每次實(shí)驗(yàn)，一組三只是不接種的作為陽性實(shí)驗(yàn)對照。在舌上十個(gè)部位用舌內(nèi)注射一次劑量為0.1毫升的104ID50新滴定的O1BFS 1860病毒來攻擊全部動物。每天檢查攻擊過的動物看體溫是否升高，舌、足上損傷是否出現(xiàn)。感染后七天無繼發(fā)損傷出現(xiàn)，則認(rèn)為動物是被保護(hù)了。全部動物試驗(yàn)和血清估測在聯(lián)合國動物病毒研究所進(jìn)行。
C、血清中和滴度(SNT)的測定用于測定血清中和滴度的定量方法如Golding，S.M，Hedger，R.S.，Talbot，T.，Watson，J.，所述，Rese ch in Veterinary Science 40，142-147(1976)。所有ELISA抗體滴度都是規(guī)定為直接抗肽140-160。在所有采用上述肽類接種的動物中已經(jīng)得出ELISA測定和血清中和滴度之間極為密切的相關(guān)關(guān)系。
Ⅲ、生物學(xué)結(jié)果建立一系列可能合成的肽類疫苗的相對效力的最方便方法是測定其最小預(yù)防摩爾劑量。表2代表用四種不同免疫原在豚鼠上得到的劑量滴度結(jié)果。資料在幾個(gè)方面做了說明，最主要的方面是明顯增高血清中和滴度(SNT)及與21-殘基肽比較通過38-和40-殘基肽得到的預(yù)防作用。這些結(jié)果清楚表明本發(fā)明復(fù)合物的意想不到的有利性質(zhì)，它提供對病毒攻擊最滿意的預(yù)防作用。38-和40-殘基肽在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)似乎是相等的，從而使后者氨基末端半胱-半胱殘基的重要性減到最小。這二個(gè)肽提供的完全保護(hù)作用只用了21-殘基抗原肽劑量的1/10到1/100。然而，不用任何提及的載體，使豚鼠抵抗FMDV的神奇能力顯著簡化了方法并消除變異性的主要來源。最理想的能提供完全抗性的合成劑是這樣的，它包含處于高度限定和純凈狀態(tài)下最少的病毒結(jié)構(gòu)信息。去除KLH或類似載體而仍然提供抗性標(biāo)志著在合成疫苗的方法方面有了顯著進(jìn)步。
抗原最優(yōu)化的必要性是極為重要的，因?yàn)樯唐坊瘜⒑芸赡苁褂帽菷reund氏完全佐劑低效的佐劑。表3顯示了40殘基肽在商品合格的Al(OH)3佐劑中有完全保護(hù)作用的摩爾劑量，該劑量相當(dāng)于21殘基肽在完全Freund氏佐劑中產(chǎn)生保護(hù)作用的劑量。
表3.用40-殘基肽接種豚鼠佐劑估價(jià)肽濃度 佐劑 被保護(hù)的動物數(shù)/受攻擊的動物數(shù)150毫微摩爾 Freund氏完全佐劑 5/517毫微摩爾 ″ 5/52毫微摩爾 ″ 4/50.2毫微摩爾 ″ 0/5150毫微摩爾 Al(OH)35/517毫微摩爾 ″ 1/52毫微摩爾 ″ 0/50.2毫微摩爾 ″ 0/4對于估價(jià)FMD疫苗，雖然已經(jīng)證明豚鼠是個(gè)有用的模型，但最終成功的試驗(yàn)必須在牲畜上進(jìn)行，在主要的商業(yè)指標(biāo)動物上進(jìn)行。表4表示了用40-殘基肽接種牲畜，再用常規(guī)的攻擊即在每個(gè)接種過的動物上做舌的直接病毒感染的結(jié)果。血清中和滴度迅速增加，在第14天接近最大值，至少在整個(gè)攻擊時(shí)間內(nèi)(32天)一直保持著。第32天，受攻擊的9只動物中的2只完全有抗性，沒有表現(xiàn)出繼發(fā)損傷。這些動物代表用合成肽成功地單次牲畜接種FMD的第一個(gè)例子。這證明了本發(fā)明的免疫原效力。再有，通過攻擊前中和抗體濃度
的血清學(xué)測定，證明不可能予先存在抗性。與傳統(tǒng)的FMD疫苗所期望的中和抗體濃度的已知最低水平比較，所有動物都已明顯具有抗性。所以此時(shí)不能接受把肽疫苗的功效建立在用傳統(tǒng)疫苗作為比較基礎(chǔ)的SNT值上。重復(fù)免疫動物1，2和3號動物在攻擊后14天得到完全抗性。加強(qiáng)免疫后，觀察到用ELISA測定的這些動物的抗體滴度增加了將近一半的對數(shù)單位(log unit)。這種40-殘基肽僅為其它已經(jīng)證明能使牲畜免疫的合成抗原的不到五分之一體積。在無任何潛在的低水平的細(xì)菌增強(qiáng)作用的情況下，它的合成性質(zhì)將允許對它與各種佐劑組合中的固有活性加以評價(jià)。
勘誤表
勘誤表
權(quán)利要求
1.制備含式(1)序列的復(fù)合物的方法x-A-y-B-z(1)其中A和B是組成口蹄疫病毒VP1外殼蛋白血清型序列的氨基酸殘基序列，其中一個(gè)含18到24個(gè)氨基酸殘基，并包括在O血清型的141到158位的氨基酸序列或其它血清型的相同序列，另一個(gè)含14到20個(gè)氨基酸殘基并包括O血清型200-213位的氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列；x是H，H-半胱，或H-半胱-半胱，它的巰基可能封閉或游離；z是OH，半胱-OH，或脯-半胱-甘-OH，它的巰基可能封閉或游離；y是約2到6個(gè)氨基酸殘基序列，或是其藥品上合格的鹽，它包括(a)從含式(1)序列的相應(yīng)的被保護(hù)的復(fù)合物上裂解出的一個(gè)保護(hù)性基團(tuán)；或(b)在適于表達(dá)編碼式(1)復(fù)合物的DNA序列的條件下，培養(yǎng)由含有編碼式(1)復(fù)合物的表達(dá)轉(zhuǎn)移載體所轉(zhuǎn)化的微生物，并從所說的微生物的溶菌液或培養(yǎng)基中純化式(1)復(fù)合物。(C)如果需要，可使游離的復(fù)合物鹽化形成相應(yīng)的藥品合格的鹽。
2.制備如權(quán)利要求
1項(xiàng)中所要求的復(fù)合物的方法，其中x是H-或H-半胱半胱-。
3.制備如權(quán)利要求
1或2中所要求的復(fù)合物的方法，其中y是2到4個(gè)氨基酸殘基的序列。
4.制備如權(quán)利要求
3所要求的復(fù)合物的方法，其中y含有-脯-脯-序列。
5.制備如權(quán)利要求
4所要求的復(fù)合物的方法，其中y是-脯-脯-絲-或亮-脯-脯-蘇。
6.制備如權(quán)利要求
1-5中任何一個(gè)復(fù)合物的方法，其中z是-OH或-脯-半胱-甘-OH。
7.如權(quán)利要求
1中所要求的為制備VP1(O1K)〔半胱-半胱(200-213)-脯-脯-絲(141-158)〕-脯半胱甘;VP1(O1K)〔(200-213)-脯-脯-絲-(141-158)〕-脯半胱甘;或其在藥品上合格的鹽的方法。
8.按權(quán)利要求
1要求的為制備VP1(O1K)H-半胱-〔精酪冬酰精冬酰丙(141-158)-亮脯脯蘇(谷丙(200-213)〕-OH，或其藥品合格的鹽的方法。
專利摘要
公開了有治療或預(yù)防口蹄疫活性的化合物。這化合物含有結(jié)構(gòu)式X-A-Y-B-Z序列，其中A和B是組成口蹄疫病毒VP外殼蛋白血清型序列的氨基酸殘基序列，其中一個(gè)含有18到24氨基酸殘基，并包括O血清型141-158位上氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列，而另一個(gè)含有14到20氨基酸殘基，并包括O血清型200到213位上的氨基酸殘基序列或其它血清型的相同序列；X，Z和Y的定義如說明書中所述。
文檔編號C12N15/09GK86103718SQ86103718
公開日1987年2月4日 申請日期1986年6月2日
發(fā)明者理查德·丹尼斯·迪馬奇, 杰拉爾德·斯蒂芬·布魯克 申請人:伊萊利利公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan