專利名稱:一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(jxa1-r株)的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獸用生物制品技術領域：
，具體地，涉及豬繁殖與呼吸綜合征疫苗技術領域：
，進一步地，涉及一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的方法及其應用。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)弓丨起的豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠母豬和I月齡以內(nèi)仔豬最易感。該病以母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異 株引起的一種急性、高致死性傳染病，臨床表現(xiàn)以體溫高、發(fā)病率高和死亡率高“三高”為主要特點。2006年夏季，該病(當時稱“豬無名高熱病”)在我國較大范圍流行，使我國養(yǎng)豬業(yè)遭受了前所未有的慘重的經(jīng)濟損失。根據(jù)基因同源性和血清學差異可將PRRSV分為美洲型和歐洲型，在我國流行的主要是美洲型毒株。由于目前尚無治療該病的特效藥物，因此使用特異性疫苗成為防控PRRS的主要措施。目前國內(nèi)外已研制出滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種類型的疫苗，一般認為滅活疫苗安全性好，而弱毒活疫苗免疫效果更佳。近幾年，隨著多種PRRS弱毒活疫苗的推廣，滅活疫苗的應用范圍正逐漸縮小。在目前尚無更好的疫苗來預防該病的現(xiàn)階段，在有PRRS病史的豬場和受到PRRSV強毒感染威脅的豬場接種PRRSV弱毒活疫苗，對控制該病和降低經(jīng)濟損失具有重要意義。
在PRRS弱毒活疫苗制備過程中，涉及制苗用病毒液的制備工藝，這是疫苗制備的關鍵點，而這一工藝傳統(tǒng)的制備方法是通過轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)方式來實現(xiàn)的，這種生產(chǎn)方式具有以下缺點1)勞動強度大；2)批間差異大；3)細胞密度低，產(chǎn)量低；4)容易污染等。實踐證明，僅僅依靠動物細胞通過轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式生產(chǎn)病毒的量是有限的。為了克服現(xiàn)有PRRS弱毒活疫苗生產(chǎn)技術所存在的缺陷，尋找簡便、高效的病毒株生長培養(yǎng)條件對提高疫苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本具有重大意義。
近年來，利用生物反應器和微載體技術培養(yǎng)細胞、繁殖病毒在生物制藥行業(yè)應用廣泛。這一技術具有以下優(yōu)點1)產(chǎn)品批間差異小；2)極大的降低細菌污染的可能性；3)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，免疫副反應低；4)易于放大。如果將這一技術應用于PRRS疫苗的生產(chǎn)，則既保持細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢又克服了其生產(chǎn)產(chǎn)量有限的缺點。我國在這方面的研究雖然起步較晚，但近年來研究非?；钴S。專利公開號CN101612395A (—種培養(yǎng)敏感細胞生產(chǎn)藍耳病疫苗的方法)公開了一種在生物反應器中用微載體培養(yǎng)敏感細胞生產(chǎn)豬藍耳病疫苗的方法，所用的生物反應器為攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、Wave生物反應器和中空纖維反應器，培養(yǎng)方式采用流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)；專利申請公布號CN102038942A(應用生物反應器工業(yè)化生產(chǎn)豬藍耳病疫苗的方法)中提出一種利用Cell Lift型生物反應器，采用生物反應器間逐級放大的倒罐式操作技術，進行細胞的高密度培養(yǎng)以制備疫苗的方法，所用的生物反應器為攪拌式生物反應器，所述載體為Cytodex系列微載體，采用批式、流加或灌注培養(yǎng)方式；專利申請公布號CN102002482A (豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒毒的生產(chǎn)方法)則提出一種應用激流-灌注式生物反應器培養(yǎng)Marc-145細胞生產(chǎn)豬藍耳病病毒的生產(chǎn)工藝，所述載體為聚酯酰胺紙片載體；而專利申請公布號CN101831412A (—種大規(guī)模生產(chǎn)豬藍耳病病毒的方法)和專利申請公布號CN101979514A (豬藍耳病病毒與疫苗及二者的生產(chǎn)方法)均提出一種米用潮汝式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器生產(chǎn)豬藍耳病病毒的方法，所述微載體為片狀、球形或網(wǎng)狀，成分為聚酯、明膠或多糖，優(yōu)選的為網(wǎng)狀聚酯纖維。而應用攪拌式生物反應器-球形微載體體系培養(yǎng)細胞生產(chǎn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)，尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明提供了一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)的方法及其應用，該方法克服PRRS弱毒活疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)工藝“細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法”的缺陷以及片狀載體難于放大的特征，使病毒滴度提高5 20倍，顯著提高疫苗的產(chǎn)量
與質(zhì)量。
本發(fā)明的技術方案如下一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)的方法及其應用，包括如下步驟
(I)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇生物反應器；選擇球形微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經(jīng)胰酶消化液消化傳代，用配方為含7% 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調(diào)整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的Marc-145細胞，經(jīng)胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后按每個微載體添加5 20個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數(shù)溫度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、攪拌速度30 55rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；
(2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48 72小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4 I工作體積的配方為含1% 4%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調(diào)整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXAl-R株種毒按照感染復數(shù)M. 0. I.為0. 0001 0. 2的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育I 5小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參數(shù)溫度37°C、pH值6. 5 7. 5、溶氧30% 60%、攪拌速度30 50rpm、C02通氣量2. 5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融I次，經(jīng)離心或過濾除去細胞碎片，_40°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定，病毒含量應不低于107_°TCID5(l/ml ；
(3)疫苗配制將檢驗合格的收獲病毒液按I : I體積比例加入5%蔗糖脫脂乳凍干保護劑，充分搖勻，定量分裝后按常規(guī)方法立即進行冷凍干燥。凍干后疫苗每頭份病毒含量應彡 IO5TCID50 ；
(4)成品檢驗按農(nóng)業(yè)部審批通過的《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)制造及檢驗試行規(guī)程》要求進行檢驗，各項指標均符合規(guī)定。
用生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的方法，步驟
(I)中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應器，容積為I. 3L 1500L。
用生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的方法，步驟
(I)中，微載體為球形微載體，添加量為2 10g/L，在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘。
本發(fā)明的有益效果為一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 (JXAl-R株)的方法及其應用，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比，具有以下優(yōu)點
(I)應用本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗，污染機率低，病毒滴度高(其毒價可提高5 20倍)，批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，副反應小，能全面提升疫苗質(zhì)量；
(2)自動化程度高，勞動強度小，節(jié)省人力，且產(chǎn)量大、占地小、生產(chǎn)周期短，能有效降低生產(chǎn)成本；
(3)本發(fā)明采用球形微載體作為細胞培養(yǎng)載體，易于快速擴大生產(chǎn)規(guī)模，能克服片狀載體難于放大的特征。
具體實施方式
實驗說明
實施例I :
一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)的方法及其應用，步驟如下
(I)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇7. 5L生物反應器，其工作體積為5L ;選擇Cytodex I球形微載體作為細胞貼附生長的載體，使用量為4g/L培養(yǎng)基，稱量Cytodex I球形微載體，并對其進行清洗、滅菌，方法為1)用適量PBS浸泡3小時；2)用適量PBS清洗微載體3遍；3)加入適量PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經(jīng)胰酶消化液消化傳代，用配方為含10%胎牛血清的90%DMEM培養(yǎng)基、PH調(diào)整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的Marc-145細胞，經(jīng)胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后按每個微載體添加10個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數(shù)溫度37°C、pH值7. O、溶氧含量50%、攪拌速度45rpm、C02通氣量5%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；
(2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4工作體積的配方為含2%胎牛血清的98%DMEM培養(yǎng)基、pH調(diào)整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXAl-R株種毒按照感染復數(shù)M.O. I.為0.002的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育3小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參數(shù)溫度37°C、pH值7. O、溶氧40%、攪拌速度40rpm、CO2通氣量5%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融I次，經(jīng)離心或過濾除去細胞碎片，-40°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定；結(jié)果收獲病毒液10L，無菌檢驗合格，病毒含量達108-8TCID50/ml;
(3)疫苗配制將檢驗合格的收獲病毒液按I : I體積比例加入5%蔗糖脫脂乳凍干保護劑，充分搖勻，定量分裝后按常規(guī)方法立即進行冷凍干燥。凍干后疫苗每頭份病毒含量應彡 105TCID50 ；
(4)成品檢驗按農(nóng)業(yè)部審批通過的《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)制造及檢驗試行規(guī)程》要求進行檢驗，各項指標均符合規(guī)定，詳見表I。
表I用生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 ( JXAl-R株)檢驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)的方法及其應用，包括如下步驟 (I)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞選擇生物反應器；選擇球形微載體作為細胞貼附生長的載體；選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；將Marc-145細胞經(jīng)胰酶消化液消化傳代，用配方為含7% 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調(diào)整為7. 2的細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，形成良好單層時，取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的Marc-145細胞，經(jīng)胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后按每個微載體添加5 20個細胞的比例接種到含有細胞生長液與微載體的生物反應器中；生物反應器設定如下參數(shù)溫度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、攪拌速度30 55rpm、C02通氣量5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；
(2)制苗用毒液的繁殖與收獲培養(yǎng)后48 72小時待觀察到微載體上細胞基本長滿形成致密單層時，去掉細胞生長液，加入1/4 I工作體積的配方為含1% 4%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、pH調(diào)整為7. 2的細胞維持液；將豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXAl-R株種毒按照感染復數(shù)M.O. I.為0.0001 0.2的比例接種生長良好的上述細胞單層，37°C孵育I 5小時，然后向生物反應器中補足生物反應器正常工作所需要的培養(yǎng)基，并設定如下參 數(shù)溫度37°C、pH值6. 5 7. 5、溶氧30% 60%、攪拌速度30 50rpm、C02通氣量2. 5 10%，進行反應器自動控制培養(yǎng)；接毒后每隔2小時取反應器中微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，待觀察微載體上細胞基本全部脫落、細胞病變達到80%以上時，停止反應器的攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體；反復凍融I次，經(jīng)離心或過濾除去細胞碎片，_40°C以下保存作為半成品；按《中國獸藥典》附錄對半成品進行無菌檢驗及病毒含量測定，病毒含量應不低于107_°TCID5(l/ml ； (3)疫苗配制將檢驗合格的收獲病毒液按I: I體積比例加入5%蔗糖脫脂乳凍干保護劑，充分搖勻，定量分裝后按常規(guī)方法立即進行冷凍干燥，凍干后疫苗每頭份病毒含量應彡 105TCID50 ； (4)成品檢驗按農(nóng)業(yè)部審批通過的《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)制造及檢驗試行規(guī)程》要求進行檢驗，各項指標均符合規(guī)定。
2.如權(quán)利要求
I所述的一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)的方法及其應用，步驟(I)中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧和攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應器，容積為1.3L 1500L。
3.如權(quán)利要求
I所述的一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的方法及其應用，其特征在于，步驟(I)中，微載體為球形微載體，添加量為2 10g/L，在使用前需清洗、滅菌，方法如下1)用PBS浸泡微載體三小時以上；2)用PBS清洗微載體3遍；3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌30分鐘。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種生物反應器制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的方法及其應用，包括如下步驟(1)用微載體培養(yǎng)制苗用細胞；選擇生物反應器；(2)制苗用毒液的繁殖與收獲；(3)疫苗配制；(4)成品檢驗。該方法生產(chǎn)的疫苗，污染機率低，病毒滴度高(其毒價可提高5～20倍)，批間差異小，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，副反應小，能全面提升疫苗質(zhì)量。
文檔編號C12N7/00GKCN102727877SQ201210231128
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日
發(fā)明者周智, 徐家華, 曲萍, 林綺萍, 田克恭, 練炳洲, 翟新驗, 遇秀玲, 鄧小熊, 陳瑞愛 申請人:中國動物疫病預防控制中心, 廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan