專利名稱:一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療心腦血管疾病的制劑的制備方法，具體為一種用光合 細(xì)菌培養(yǎng)液和中草藥提取液共同發(fā)酵制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的制劑的方法。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌(PSB)是20億年前地球上最早出現(xiàn)的利用太陽能進(jìn)行光合作用生長繁 殖的原核古老微生物，能夠進(jìn)行不放氧的光合作用，在自然界C、N、S、P等循環(huán)中起著重要 的作用。過去多被應(yīng)用于有機(jī)廢水的處理中，近年來逐步認(rèn)識到菌體的營養(yǎng)價值及一些特 殊的生理活性，其研究開發(fā)日益受到世界各國的關(guān)注。
丹參為唇形科植物。丹參Silvia miltiorrhiza Bge全國大部分地區(qū)都有分布， 南丹參Mlvia bowleyana Durm分布于浙江、江西、福建等省。藥用部分為干燥根或根莖。 丹參為一味傳統(tǒng)中藥，其味苦，微寒。歸心、肝經(jīng)。有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等作用。
現(xiàn)有技術(shù)中，已有文獻(xiàn)報道丹參的復(fù)方或單方制劑具有預(yù)防或治療心腦血管系統(tǒng) 疾病的作用，亦有以丹參復(fù)方或丹參為原料制備藥品或保健品的方法及其在治療心腦血管 疾病中的應(yīng)用的專利報道。如專利號為ZL200510075247. 0的中國發(fā)明專利，治療心腦血 管疾病的中藥制劑及其制備方法；專利號為ZL200510011731. 7的中國發(fā)明專利，一種治療 高血脂癥的中藥組合物及其制備方法；專利號為ZL200510068350. 2的中國發(fā)明專利，一種 用于降血脂的中藥膠囊及其制備方法；專利號為ZL02157381. 6的中國發(fā)明專利，一種治療 心腦血管疾病的復(fù)方丹參滴丸及其制備方法；公開號為CN 101234171A的中國發(fā)明專利， 一種具有降血脂、防治心腦血管疾病的保健品及其制備方法，等等。
已有報道光合細(xì)菌制劑的制備及其應(yīng)用的文獻(xiàn)。如專利號為94106408. 5的中國 發(fā)明專利，光合細(xì)菌的應(yīng)用及利用它制得的產(chǎn)品；申請?zhí)枮?2110316. X的中國發(fā)明專利， 光合細(xì)菌制劑的制備方法；專利號為00120974. 4中國發(fā)明專利，一種治療惡性腫瘤的中藥 制劑及制備方法；申請?zhí)枮?9107591. 9.的中國發(fā)明專利，光合細(xì)菌作為醫(yī)藥保健品的應(yīng) 用及其制作方法及其產(chǎn)品；公開號為CN1970025A的中國發(fā)明專利，六味地黃湯的中藥生物 制劑及制備方法；公開號為CN1775944A的中國發(fā)明專利，一種光合細(xì)菌的培養(yǎng)及制劑 ’專 利號為01800254. 4的中國發(fā)明專利，紅色光合細(xì)菌及其健康食品，等等。
上述已有技術(shù)中亦有用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化中草藥制備藥物的報道，但所用中草藥均為 復(fù)方，中藥復(fù)方開發(fā)成現(xiàn)代中藥最重要的必須經(jīng)過處方分析，拆方研究，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從 研究時間及經(jīng)費(fèi)上存在很大困難，何況又用光合細(xì)菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，成分會更加復(fù)雜，加大了 開發(fā)成藥物的困難，且其專利報道中無任何化學(xué)成分說明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑制備方法，該方法采用光 合細(xì)菌培養(yǎng)液和丹參提取液，通過混合發(fā)酵并對有效成分進(jìn)行濃縮處理制成各種口服制 劑，生產(chǎn)方法簡便，產(chǎn)品無毒，降血脂、降血粘度作用顯著，容易吸收，生物利用度高，可用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，包括 以下步驟
(1)在經(jīng)過滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入1/10份數(shù)光合細(xì)菌菌種，在光照、厭氧 條件下，培養(yǎng)3-5天，作為光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液；
(2)將丹參粉碎，用丹參原藥材質(zhì)量5-35倍體積的任意濃度的醇液，分1-4次回流 提取，每次0. 5-1小時，合并提取液，回收提取液中的醇至無醇味，得醇提取物，濾渣加水提 取1-3次，每次0. 5-1小時，合并濾液，和醇提取物合并，得丹參提取液；或者用丹參藥材質(zhì) 量5-35倍體積的水1-4次煎煮提取，每次0. 5-1小時，合并濾液，得丹參提取液；將丹參提 取液濃縮或者用光合細(xì)菌培養(yǎng)基或水稀釋，調(diào)整丹參提取液體積至丹參原藥材質(zhì)量的3-10 倍體積，調(diào)pH至6-10，120-125°C滅菌20-40min，制得丹參提取液滅菌溶液；
C3)在丹參提取液滅菌溶液中按10 (1- 的體積比接入光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液， 在500-3000LUX光照厭氧條件下，培養(yǎng)5-30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液；
(4)將光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液2000-7000r/min離心，上清液過大孔吸附樹脂 柱，先用水洗，然后用30% -100%的甲醇或乙醇水溶液洗脫，得上清液醇洗脫液，沉淀用 30% -100%甲醇或乙醇液超聲或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脫液， 濃縮，再制備成不同的口服制劑膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑等制劑；
以上步驟中質(zhì)量單位為g，體積單位為ml ；
所述的丹參為唇形科植物丹參Silvia miltiorrhiza Bge或南丹參 Salviabowleyana Dunn,光合細(xì)菌為紅螺菌屬RhodospiriIlium、紅假單胞菌屬 lihodopseudomonas、紅細(xì)菌屬Rodobacter中的任意一株菌或它們的任意組合。
為了取得預(yù)防和治療心腦血管疾病的更好療效，做為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的 紅螺菌屬Rhodospiri 11 ium為深紅紅螺菌(Rhodospiri 11 ium rubrum)；紅假單胞菌屬 Rhodopseudomonas為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、綠色紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、 海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)；紅細(xì)菌屬Rodobacter為球形紅細(xì)菌 (Rhodobacter sphaeroides)。
上述菌種文獻(xiàn)的出處姚竹云，張肇銘.幾株光合細(xì)菌的表型特征及其DNA-DNA 同源性分析.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1996，2(1) :84-89;張肇銘，楊素萍，趙春貴.沼澤紅假 單胞菌的分離鑒定研究.山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1992，(4) :379-385;楊素萍，張肇 銘，趙春貴.綠色紅假單胞菌和綠硫紅假單胞菌的分離與鑒定.微生物學(xué)報，1995，35 O) 91-96;張肇銘，鄧松錄，趙良啟，等.紫色非硫光合細(xì)菌的研究A.球形紅假單胞菌的分離、 鑒定和生理特性的研究.山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1984，(4) :54-59。
這些菌種可以從山西省太原市山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院光合細(xì)菌研究室得 到。
所述適合光合細(xì)菌生長的培養(yǎng)基，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的光合細(xì)菌培養(yǎng)基，本發(fā) 明優(yōu)選以下培養(yǎng)基，其組成為
乙酸鈉1000-2000mg CaCl2. 2H20 50_100mg
MgSO4. 7H20 100-300mg EDTA10_30mg[0021]酵母 500-1500mgK2HPO4500-1500mg[0022](NH4)2SO41000-2000mgKH2PO4400-1000mg[0023]FeSO4.,7H205_15mg微量元素溶液l-5ml[0024]去離子水1000-2000ml pH6-8[0025]其中微量元素溶液組成為[0026]H3BO3200-300mgNa2MoO4. 2H20 50-IOOmg[0027]CuSO42-10mgMnSO4. 4H20150-250mg[0028]ZnSO4.,7H2020-30mg去離子水100-200ml[0029]公開號為CN100431557C的中國專利公開了-一種預(yù)防和治療腫
方法，是用光合細(xì)菌培養(yǎng)液和槲寄生醇提取液混合發(fā)酵制成的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制 劑或滅菌制劑。在光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化中草藥的領(lǐng)域內(nèi)，中藥的種類不同，其物理、化學(xué)和藥理作 用是不同的，丹參含有大量的水溶性有效成分，必須經(jīng)過水提取。中藥提取方式和培養(yǎng)條件 是影響產(chǎn)品藥效和生物利用度的關(guān)鍵。實驗證明，利用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑和滅 菌制劑的方法和培養(yǎng)條件來進(jìn)行光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參不能得到理想的實驗結(jié)果。因此，對于 光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參的技術(shù)難點(diǎn)在于中藥提取和培養(yǎng)步驟的調(diào)整、培養(yǎng)條件的選擇以及培養(yǎng) 液中有效成分的濃縮。
對光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液的化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明丹參提取液經(jīng)過光合 細(xì)菌轉(zhuǎn)化以后，由于光合細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化功能使光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液中的成分發(fā)生了 很大變化。實驗過程為將光合細(xì)菌培養(yǎng)液、丹參提取液、光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，分別于 5000r/min離心。上清液過DlOl大孔吸附樹脂柱，先用水洗，然后用95%的乙醇洗脫，得上 清液醇洗脫液；沉淀用95%的乙醇水溶液超聲提取2次，每次30分鐘，得沉淀醇提取液，合 并上清液醇洗脫液。濃縮，干燥。分別進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)分析。由
圖1、2、3可知， 光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液產(chǎn)生了 m/z 175. 2，179. 3，313. 2，399. 5，429. 0,551. 5，573. 6 的 新離子，光合細(xì)菌培養(yǎng)液，丹參提取液中均沒有出現(xiàn)。另外，光合細(xì)菌培養(yǎng)液或丹參提取液 中出現(xiàn)過的離子，峰的強(qiáng)度亦發(fā)生了很大變化，例如m/z 417. 4,717. 5等的峰。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下有益效果
第一，本發(fā)明制備的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參制劑是丹參經(jīng)過光合細(xì)菌代謝的中藥生物 制劑，降低血脂、血粘度效果顯著，優(yōu)于丹參。在用于預(yù)防和治療心腦血管疾病的保健食品 和藥物的應(yīng)用方面，均有明顯的效果。
結(jié)合以下動物實驗對光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參制劑在高血脂大鼠降血脂、抗氧化作用及 對血液流變學(xué)指標(biāo)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行說明。實驗采用健康雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分組， 每組10只，即正常組、模型組、血脂康組(陽性對照組)、丹參提取物組、光合細(xì)菌培養(yǎng)液組 及光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液組?？瞻捉M給基礎(chǔ)飼料，其余5組均喂飼高脂飼料(高脂飼料 配方1 %膽固醇，10 %豬油，10 %蛋黃粉，0. 2 %膽鹽，78. 8 %基礎(chǔ)飼料)。同時空白組及模 型組給予同體積水，其余4組分別給血脂康膠囊、丹參提取物、光合細(xì)菌培養(yǎng)液、光合細(xì)菌 轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，均為灌胃給藥，每天一次，連續(xù)45天，末次給藥后禁食12h，次日眼眶取 血1ml，分離血清，分別測定血清TC (總膽固醇)、TG (甘油三脂)、LDL-C (低密度脂蛋白)， HDL-C (高密度脂蛋白)，并計算脂質(zhì)系數(shù)HDL-C/LDL-C (結(jié)果見表1)。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，下腔 靜脈取血5ml，進(jìn)行全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積血液流變學(xué)指標(biāo)測定(結(jié)果見表幻；取Iml血分離血清，進(jìn)行血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化脂質(zhì)(LPO)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA) 和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗氧化指標(biāo)的測定(結(jié)果見表3)。
表1光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液對高血脂大鼠血脂水平的影響
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)在經(jīng)過滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入1/10份數(shù)光合細(xì)菌菌種，在光照、厭氧條件 下，培養(yǎng)3-5天，作為光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液；(2)將丹參粉碎，用丹參原藥材質(zhì)量5-35倍體積的任意濃度的醇液，分1-4次回流提 取，每次0. 5-1小時，合并提取液，回收提取液中的醇至無醇味，得醇提取物，濾渣加水提取 1-3次，每次0. 5-1小時，合并濾液，和醇提取物合并，得丹參提取液；或者用丹參藥材質(zhì)量 5-35倍體積的水1-4次煎煮提取，每次0. 5-1小時，合并濾液，得丹參提取液；將丹參提取 液濃縮或者用光合細(xì)菌培養(yǎng)基或水稀釋，調(diào)整丹參提取液體積至丹參原藥材質(zhì)量的3-10 倍體積，調(diào)PH至6-10，120-125°C滅菌20-40min，制得丹參提取液滅菌溶液；(3)在丹參提取液滅菌溶液中按10 (1- 的體積比接入光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液，在 500-3000Lux光照厭氧條件下，培養(yǎng)5-30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液；(4)將光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液2000-7000r/min離心，上清液過大孔吸附樹脂柱， 先用水洗，然后用30% -100%的甲醇或乙醇水溶液洗脫，得上清液醇洗脫液，沉淀用 30% -100%甲醇或乙醇液超聲或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脫液， 濃縮，再制備成不同的口服制劑膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑；以上步驟中質(zhì)量單位為g，體積單位為ml ；所述的丹參為唇形科植物丹參Silvia miltiorrhiza Bge或南丹參&ilviabowleyana Dunn，光合細(xì)菌為紅螺菌屬Rhodospirillium、紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas、紅細(xì)菌屬 Rhodobacter中的任意一株菌或它們的任意組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，其 特征在于所述的紅螺菌屬Rhodospirillium為深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)；紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、綠色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌 (Rhodopseudomonassulfoviridis)、海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)；紅細(xì)菌 屬 Rhodobacter 為球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，其特征在于 步驟O)中所述的醇液是甲醇液或乙醇液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，其特征在 于步驟( 所述的丹參提取液濃縮時，是在丹參提取液中配入任意濃度的光合細(xì)菌培養(yǎng) 基后將體積調(diào)整至丹參原藥材質(zhì)量3-10倍體積。
專利摘要
一種預(yù)防和治療心腦血管疾病制劑的制備方法，該方法是在丹參的醇或水提取液中按10∶(1-5)的體積比接入光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液，在500-3000Lux光照厭氧條件下，培養(yǎng)5-30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，將光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液2000-7000r/min離心，上清液過大孔吸附樹脂柱，先用水洗，然后用醇洗脫，收集醇洗脫液得上清液醇洗脫液，沉淀用醇液超聲或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脫液，濃縮，再制備成不同的口服制劑。該方法生產(chǎn)簡便，降血脂、降血粘度作用顯著，容易吸收，生物利用度高，有效成分含量高，可用于制備預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物。
文檔編號A61P9/00GKCN101579400 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910074560
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月24日
發(fā)明者張肇銘, 楊官娥, 楊飛, 秦娟 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan