本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和功能材料，具體涉及多途徑的可注射抗腫瘤凝膠系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是全世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因之一。2022年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，新增癌癥病例數(shù)高達(dá)2000萬(wàn)，約有970萬(wàn)人因癌癥而去世。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)的估計(jì)，約有20%的人會(huì)在一生中患上癌癥，約有11.1%的男性和8.3%的女性會(huì)死于癌癥。過(guò)去，臨床嘗試通過(guò)手術(shù)、放療、化療和免疫療法來(lái)治療腫瘤，但使用傳統(tǒng)方法存在復(fù)發(fā)率高、副作用大和對(duì)正常組織的不可逆損傷等問(wèn)題。因此，整合新的腫瘤治療策略來(lái)治療腫瘤已迫在眉睫。

2、多柔比星（dox）是典型的化療藥物，具有阻斷腫瘤細(xì)胞合成核酸的作用。它可以引起線粒體腫脹，改變線粒體功能，進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，過(guò)度產(chǎn)生活性氧（ros），導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但dox的臨床應(yīng)用受到心臟毒性和骨髓抑制等嚴(yán)重副作用的限制。通過(guò)設(shè)計(jì)刺激響應(yīng)的靶向給藥系統(tǒng)可以作為dox的一種替補(bǔ)給藥選擇，能被應(yīng)用于在腫瘤微環(huán)境（tme）中選擇性地對(duì)特異性刺激靶向定位和釋放藥物，提高dox的療效并降低全身毒性。

3、光動(dòng)力療法（pdt）是一種通過(guò)ros對(duì)核酸、酶和細(xì)胞膜的強(qiáng)大氧化能力來(lái)使腫瘤細(xì)胞凋亡的非侵入性方法，具有微創(chuàng)、精確消除局部腫瘤、避免損傷健康組織的特點(diǎn)。近年來(lái)，納米金屬卟啉有機(jī)骨架（nmofs）因其具有1o2易擴(kuò)散、可避免自淬滅和藥物高負(fù)載等優(yōu)點(diǎn)被用于pdt。多孔配位網(wǎng)絡(luò)-224（pcn-224）是基于卟啉的zr-mof，具有生物可降解、大表面積和在廣泛的ph范圍內(nèi)穩(wěn)定等特點(diǎn)，可在660nm激光照射下將o2轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧（1o2）。但惡性腫瘤大多處于缺氧狀態(tài)，以及pdt容易受光穿透深度和范圍的限制，影響了pdt的治療效果。如果將其和其他的抗腫瘤療法聯(lián)合使用，可以有效提高抗腫瘤的療效。

4、葡萄糖氧化酶（gox）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性氧化還原酶，它是由兩個(gè)相同的多肽鏈亞基和兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）輔酶組成的二聚糖蛋白。利用gox可以催化腫瘤細(xì)胞內(nèi)的d-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸和過(guò)氧化氫（h2o2），消耗腫瘤內(nèi)的葡萄糖和氧氣。在此催化反應(yīng)中，gox能夠利用分子氧作為電子受體，有效催化β-d-葡萄糖氧化成d-葡萄糖-δ-內(nèi)酯，然后再水解成葡萄糖醛酸。同時(shí)，gox中的fad被還原為fadh2，然后被氧氣氧化生成fad和h2o2。但由于無(wú)法阻斷毛細(xì)血管內(nèi)持續(xù)的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，僅僅靠gox很難完全清除腫瘤。因此可以聯(lián)合其他的治療方式來(lái)對(duì)抗腫瘤，以求達(dá)到最佳的治療效果。

5、水凝膠是一種3d親水性聚合物網(wǎng)絡(luò)，因其具有高吸水性、良好的溶脹性、載藥能力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。目前，水凝膠常用的交聯(lián)方法主要有化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)兩類。而傳統(tǒng)水凝膠缺乏強(qiáng)度，借助共價(jià)鍵的化學(xué)交聯(lián)在變形過(guò)程中容易發(fā)生永久性斷裂，以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏特殊的功能，這在很大程度上限制了它們的應(yīng)用?？勺⑸渌z可以通過(guò)氫鍵、離子相互作用和靜電相互作用等物理相互作用進(jìn)行構(gòu)建，其交聯(lián)結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)可逆的，具有溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的特征。

6、ha是一種天然的陰離子線性粘多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)?（ecm）?的組成部分。它的二糖單元具有羧基、羥基和n-乙?；?，可以與不同的官能團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)。銅是人體中許多酶反應(yīng)的關(guān)鍵性氧化還原輔助因子，具有良好的生物安全性和獨(dú)特的多種生物活性。基于ha的可注射水凝膠可以將藥物快速定位并傳遞到腫瘤組織，然后直接釋放到腫瘤細(xì)胞中，具有改善藥物的內(nèi)吞作用和組織滲透能力、提高藥物在局部組織的治療濃度和延長(zhǎng)藥物在腫瘤的滯留時(shí)間的特點(diǎn)，具有出色的生物相容性、微創(chuàng)遞送能力和調(diào)節(jié)功能的高度適應(yīng)性結(jié)構(gòu)，可用作腫瘤治療的局部藥物遞送系統(tǒng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種多途徑的可注射抗腫瘤凝膠系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中水凝膠強(qiáng)度低、生物相容性差和制備工藝復(fù)雜等問(wèn)題。本發(fā)明以ha-cu水凝膠為基底，通過(guò)肼-cu2+金屬配位交聯(lián)，同時(shí)以物理吸附的方式將抗腫瘤藥物包封進(jìn)水凝膠，操作簡(jiǎn)單，原位注射到腫瘤部位具有高效的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用和低毒副作用。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：

3、（1）pcn-224的合成：將中-四（4-羧基苯基）卟吩（tcpp）、八水氧氯化鋯(zrocl2·8h2o)、苯甲酸(ba)和n,n'-二甲基甲酰胺（dmf）通過(guò)超聲分散均勻后，在90℃油浴鍋中攪拌反應(yīng)5h，將所得溶液離心收集并純化得到納米級(jí)pcn-224；

4、（2）dox@pcn的合成：將多柔比星（dox）和所得pcn-224在去離子水中混合均勻，室溫避光攪拌反應(yīng)24h，將所得溶液離心收集并純化得到dox@pcn；

5、（3）tph-ha的合成：將3,3'-二硫烷二基二(丙酰肼)（tph）和透明質(zhì)酸（ha）混合均勻得到澄清溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至5.5，然后加入n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽（edc?hcl）用以活化羧基。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h后，用透析袋透析72h，將所得溶液凍干得到白色絮狀物tph-ha；

6、（4）gdp@ha-cu水凝膠的制備：將dox@pcn水溶液和葡萄糖氧化酶（gox）水溶液逐滴加入到tph-ha水溶液中，混合均勻后加入硝酸銅水溶液，在室溫條件下高速攪拌，10s內(nèi)形成可注射抗腫瘤水凝膠。

7、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中tcpp、zrocl2·8h2o、ba的質(zhì)量比為1-3:2-5:27-28。

8、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中超聲分散時(shí)間為2min，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm。

9、進(jìn)一步地，所述步驟（1）中離心收集并純化處理為：在轉(zhuǎn)速15000rpm的條件下離心15min，收集沉淀后用dmf和乙醇各洗滌三次。

10、進(jìn)一步地，所述步驟（2）中pcn-224和dox的質(zhì)量比為2-8:0.1-6.4。

11、進(jìn)一步地，所述步驟（2）中離心收集并純化處理為：在轉(zhuǎn)速15000rpm的條件下離心15min，收集沉淀后用去離子水洗滌三次。

12、進(jìn)一步地，所述步驟（3）中調(diào)節(jié)ph值所使用的溶劑是1m鹽酸或者1m氫氧化鈉溶液。

13、進(jìn)一步地，所述步驟（3）中tph、ha、nhs、edc?hcl的質(zhì)量比為1.1-1.2:1-1.1:0.069:0.096。

14、進(jìn)一步地，所述步驟（4）中dox@pcn、gox、tph-ha和硝酸銅的質(zhì)量比為2-3：0.27-0.6:13-40:7.7-31.4。

15、本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極的效果如下：

16、（1）本發(fā)明提供的多途徑的可注射抗腫瘤凝膠系統(tǒng)采用了一種超分子絡(luò)合制備水凝膠的方法，通過(guò)cu2+與tph-ha上的肼基之間的金屬配位作用形成物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，加入的dox@pcn納米粒子通過(guò)靜電吸引作用成為水凝膠內(nèi)部的交聯(lián)點(diǎn)從而增強(qiáng)了水凝膠的強(qiáng)度。動(dòng)態(tài)的肼-cu2+配位反應(yīng)也賦予了水凝膠良好的拉伸性能、自愈性能和可注射性等多種物理化學(xué)功能。

17、（2）本發(fā)明的多途徑的可注射抗腫瘤凝膠系統(tǒng)負(fù)載的dox@pcn能釋放出dox使細(xì)胞凋亡，納米金屬有機(jī)骨架pcn-224在660nm的近紅外激光照射下能產(chǎn)生1o2并伴有熱療作用。同時(shí)gox催化腫瘤細(xì)胞內(nèi)的d-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸及h2o2，與內(nèi)源性h2o2被谷胱甘肽（gsh）還原的cu+通過(guò)類fenton反應(yīng)氧化成?oh，而大量的cu2+積累則誘導(dǎo)了銅死亡。與單一療法相比，整合了多種途徑并通過(guò)原位注射的給藥方式來(lái)抗腫瘤的聯(lián)合治法能達(dá)到良好的治療效果。

18、（3）本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，可在中性ph和室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間超快速，可在10s內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)單，生物相容性良好，抗腫瘤效果優(yōu)異，具有良好的應(yīng)用前景。