本發(fā)明涉及預(yù)測模型的構(gòu)建方法，特別是涉及一種抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(ctla-4)和抗程序性死亡蛋白-1(pd-1)等免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)推動了腫瘤免疫治療的發(fā)展。免疫檢查點抑制(immune?checkpointinhibition,ici)療法通過釋放t細(xì)胞的免疫抑制來激發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，徹底改變了腫瘤的治療模式。目前，靶向細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4和抗程序性死亡蛋白-1單抗及其配體(pd-l1)的免疫檢查點抑制劑越來越多地用于治療各種類型的腫瘤。然而，其治療應(yīng)答效果卻鮮有研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的構(gòu)建方法，其能夠?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌患者的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測，從而為非小細(xì)胞肺癌患者的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療效果進(jìn)行預(yù)測，從而更加適于實用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的構(gòu)建方法的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：

4、獲取非小細(xì)胞肺癌患者樣本，其中，所述患者為經(jīng)過抗程序性死亡蛋白-1單抗治療的患者樣本；

5、提取所述患者樣本在抗程序性死亡蛋白-1單抗治療前后的外周血單核細(xì)胞，其中，針對每一個患者樣本，均具有治療前子樣本、治療后子樣本一對配對樣本；

6、針對所述患者樣本在抗程序性死亡蛋白-1單抗治療前后的外周血單核細(xì)胞，依次經(jīng)過包括蛋白提取、還原烷基化、酶解的步驟，得到樣本肽段；

7、針對所述樣本肽段，進(jìn)行處理，得到處理后的樣本肽段；

8、針對所述處理后的樣本肽段，進(jìn)行基本特征分析和功能注釋，得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜；

9、以所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜為基礎(chǔ)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)，篩選得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物；

10、針對所述非小細(xì)胞肺癌患者樣本的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測，得到所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型。

11、本發(fā)明提供的情緒識別方法還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實現(xiàn)。

12、作為優(yōu)選，獲取非小細(xì)胞肺癌患者樣本，其中，所述患者為經(jīng)過抗程序性死亡蛋白-1單抗治療的患者樣本的步驟過程中，

13、所述非小細(xì)胞肺癌患者樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)的條件包括：患者年齡大于或者等于18周歲，患者在臨床上被診斷為非小細(xì)胞肺癌，患者具有完整的臨床信息，第一次使用抗程序性死亡蛋白-1單抗治療的患者；

14、所述非小細(xì)胞肺癌患者樣本的排除標(biāo)準(zhǔn)的條件包括：患者在使用抗程序性死亡蛋白-1單抗治療過程中死亡，或者，患者在使用抗程序性死亡蛋白-1單抗治療過程中。

15、針對所述患者樣本在抗程序性死亡蛋白-1單抗治療前后的外周血單核細(xì)胞，依次經(jīng)過包括蛋白提取、還原烷基化、酶解的步驟，得到樣本肽段的步驟過程中，所述蛋白提取包括以下步驟：

16、從液氮罐中取出外周血單核細(xì)胞樣品，其中，細(xì)胞個數(shù)為2×106，37℃水浴鍋解凍后，1200rpm離心3min，棄去凍存液，

17、配制1×的中效放射免疫沉淀法裂解緩沖液，其中，放射免疫沉淀法裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑的體積比為99∶1，

18、根據(jù)外周血單核細(xì)胞的量加入放射免疫沉淀法裂解緩沖液，其中，每1×106個細(xì)胞加入200μl放射免疫沉淀法裂解緩沖液，

19、加入兩粒勻漿珠子進(jìn)行裂解，勻漿一次，其中，頻率65hz，研磨總次數(shù)：2次，開45s停10s，冰上孵育10min，重復(fù)兩次，

20、4℃,12000rpm離心10min，取出上清；

21、準(zhǔn)確吸取200μg蛋白溶液，加入3倍體積的冰丙酮，-80℃冰箱中凍存1h，

22、1h后取出，4℃12000rpm離心10min，棄去上層丙酮，下層蛋白中再加入500μl容置的質(zhì)量百分含量為80％冰丙酮，渦旋混勻，同樣條件再次離心，棄去上清；

23、加入200μl?50mm碳酸氫銨溶液，超聲10min冰浴，復(fù)溶蛋白；

24、加入2μl?5mm二硫蘇糖醇，使其終濃度為0.05mm，渦旋混勻，之后1000rpm離心1min，37℃金屬浴30min；

25、加入6μl?5mm碘乙酰胺使其終濃度為0.15mm，渦旋混勻，之后1000rpm離心1min，55℃金屬浴30min，

26、胰酶水解：加入0.5μg/μl測序級胰蛋白酶10μl，使得蛋白與測序級胰蛋白酶的體積比為40∶1，

27、渦旋混勻，之后1000rpm離心1min，37℃恒溫900rpm震蕩金屬浴中酶切12h，次日加入5μl測序級胰蛋白酶，同樣條件再次酶切2h；

28、2h后取出，加入2μl體積百分含量為0.1％的甲酸，渦旋3s終止反應(yīng)，于-80℃冰箱凍存，得到樣本肽段。

29、作為優(yōu)選，針對所述樣本肽段，進(jìn)行處理，得到處理后的樣本肽段具體包括以下步驟：

30、將十八烷基固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，柱子下方放置離心管收集廢液；

31、活化：加入500μl?100％乙腈活化十八烷基固相萃取小柱，重復(fù)兩次；

32、平衡：加入500μl?0.1％甲酸洗去殘余的乙腈，重復(fù)兩次；

33、加樣品：將肽段加至十八烷基固相萃取小柱中，收集流出液，重復(fù)兩次后棄去流出液；

34、脫鹽：用500μl?0.1％甲酸洗柱，重復(fù)2-3次，盡可能除去鹽分；

35、洗脫肽段：加入200μl?70％乙腈洗脫多肽，重復(fù)兩次，收集洗脫液；

36、肽段脫鹽后使用肽段濃度測定試劑盒進(jìn)行定量；

37、打開低溫冷凍干燥機(jī)，壓力設(shè)為150kpa，冷阱溫度設(shè)為-56℃進(jìn)行預(yù)冷，待溫度降至預(yù)定值后，放置樣品，先后打開打開離心機(jī)、真空閥，關(guān)閉大氣閥，對脫鹽收集到的400μl洗脫液進(jìn)行真空濃縮干燥3h；

38、凍干完全后，加入50μl質(zhì)譜水配制的0.1％甲酸溶解凍干的肽段，充分渦旋后，4℃12000rpm離心10min，取上清45μl注入高效液相制備色譜中進(jìn)行分級，得到處理后的樣本肽段。

39、作為優(yōu)選，所述高效液相制備色譜的分級具體包括以下步驟：

40、100×儲備液溶液：將質(zhì)譜級的濃氨水稀釋成2m的濃度，取6.7ml的2m氨水加入43.3ml質(zhì)譜水，酸堿度調(diào)為10.5，配成50ml100x儲備液放4℃冰箱備用，

41、水相緩沖液a：取485ml質(zhì)譜水加入10ml色譜級乙腈，再加入5ml配好的100×儲備液，配成500ml97％質(zhì)譜水、2％色譜級乙腈和1％100×儲備液的混合溶液，

42、有機(jī)相緩沖液b：取2ml質(zhì)譜水加入196ml色譜級乙腈，再加入2ml配好的100x儲備液，配成200ml?1％質(zhì)譜水、98％色譜級乙腈和1％100x儲備液的混合溶液，

43、10％甲醇：取10ml色譜級甲醇加入90ml質(zhì)譜水配成10％的甲醇備用，

44、所需溶液配好后，擰緊瓶蓋，超聲15min，除去液體中的氣泡；

45、柱溫40℃，樣品盤溫度7℃，壓力4000psi的條件下，依次打開電源、柱溫箱、流分收集器、電腦及紫外監(jiān)測器。更換新配好的流動相，依次進(jìn)行濕灌注、沖洗進(jìn)樣器、清洗進(jìn)樣針、清洗泵頭以及紫外監(jiān)測，采集214nm和280nm波長處的吸收峰，

46、取45μl樣品通過自動進(jìn)樣器注入色譜柱后開始梯度洗脫同時收集流分，流分收集器的程序設(shè)置為每分鐘收集一管，總共56min，共收集56管，棄去第一管，剩余55管，標(biāo)好序號，最后按一定順序依次將洗脫液合并成最終的20個流分，離心濃縮凍干，得到處理后的樣本肽段。

47、作為優(yōu)選，針對所述處理后的樣本肽段，進(jìn)行基本特征分析和功能注釋，得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜具體包括以下步驟：

48、采用蛋白組發(fā)現(xiàn)軟件(本專利使用proteome?discoverer?2.4)對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫，將每個樣品的20個流分合在一起，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中下載的人蛋白庫進(jìn)行匹配，得到蛋白質(zhì)的鑒定與定量。數(shù)據(jù)庫的搜索采用sequest算法，參數(shù)設(shè)為：組成肽段的氨基酸個數(shù)大于等于6，最多允許2個漏切位點，母離子的質(zhì)量容差設(shè)定在-10ppm-10ppm，母離子碎片離子的質(zhì)量容差為-20ppm-20ppm；

49、protein?discover?2.4鑒定到的結(jié)果導(dǎo)出后進(jìn)行數(shù)據(jù)合并生成矩陣。蛋白定量值采用公式：蛋白豐度/(樣本平均蛋白/所有樣本的平均蛋白豐度)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以消除加樣量、儀器操作等引起的樣品間蛋白定量值誤差；

50、基于protein?discover?2.4鑒定到的結(jié)果，剔除污染蛋白后進(jìn)行肽段、蛋白和母離子質(zhì)量容差分布分析來評定質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量。并對鑒定到的蛋白進(jìn)行基本特征分析、功能數(shù)據(jù)庫包括基因本體論和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫的注釋以及定量分析，包括鑒定蛋白質(zhì)的總體差異分析和差異蛋白的篩選及表達(dá)模式聚類分析；

51、使用開放式搜索引擎(本專利使用opendelta)對每個樣品進(jìn)質(zhì)譜得到的20個原始文件，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中下載的人蛋白庫進(jìn)行搜索匹配，并利用現(xiàn)有的修飾數(shù)據(jù)庫(https://www.unimod.org/)進(jìn)行已知修飾的系統(tǒng)注釋，利用msfragger軟件進(jìn)行未知修飾的搜索和注釋。其中設(shè)置蛋白n端的乙?；图琢虬彼嵘系难趸癁榭勺冃揎?，進(jìn)行已知修飾和未知修飾的開放式搜索，前體離子分子量偏差設(shè)定在-10ppm-10ppm，fragment碎片離子分子量偏差范圍設(shè)定在mass?tolerance設(shè)為-20ppm-20ppm；

52、開放式搜索引擎(本專利使用opendelta)的分析結(jié)果采用(某一修飾在某一蛋白位點的肽匹配圖譜數(shù))/(該蛋白位點的未修飾、某一修飾和其他任意修飾的肽匹配圖譜總數(shù))，目的是為了去除蛋白豐度的影響；

53、基于opendelta的鑒定結(jié)果，將體外修飾，包括前處理引入的烷基化修飾，甲硫氨酸的氧化修飾等剔除后從中篩選潛在的生物標(biāo)志物。

54、作為優(yōu)選，以所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜為基礎(chǔ)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)，篩選得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物的步驟過程中，篩選條件包括：

55、將每個蛋白在兩個相互比較的樣品組中的定量值進(jìn)行了t-test檢驗，并計算相應(yīng)的p值，以此作為顯著性指標(biāo)，并以差異倍數(shù)>2和p值<0.05作為篩選差異蛋白的條件；

56、將每個修飾在兩個相互比較的樣品組中的定量值進(jìn)行了秩和檢驗，并計算相應(yīng)的p值，以此作為顯著性指標(biāo)，并采用錯誤發(fā)現(xiàn)率法對p值進(jìn)行校正，以差異倍數(shù)>2和p值<0.05作為篩選差異蛋白的條件；

57、采用隨機(jī)森林法進(jìn)行模擬篩選進(jìn)一步探索可用于預(yù)測抗程序性死亡蛋白-1單抗治療獲益的候選生物標(biāo)志物，其中，在隨機(jī)森林分析中，使用r包隨機(jī)森林構(gòu)建了50000棵樹，森林中終端節(jié)點樹的最大數(shù)量設(shè)置為5棵。為了評估模型的有效性，繪制了受試者生存特征曲線，計算其95％置信區(qū)間的曲線下面積(auc)。

58、作為優(yōu)選，以所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜為基礎(chǔ)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)，篩選得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物的步驟過程中，分析方法包括：

59、蛋白表達(dá)模式聚類分析：使用熱圖和基于模糊均值聚類的擬時間的序列分析(mfuzz)兩種方法對差異蛋白進(jìn)行聚類分析；

60、基因本體論和京都基因與基因組百科全書功能富集分析：采用cytoscape3.8.1軟件內(nèi)部插件cluego對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能和通路富集分析；

61、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：將目標(biāo)蛋白導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作關(guān)系并將結(jié)果導(dǎo)入cytoscape?3.8.1軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，使用cytoscape內(nèi)部插件mcode和cytohubba分別得到相應(yīng)的核心模塊和核心節(jié)點。

62、作為優(yōu)選，以所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白譜和修飾譜為基礎(chǔ)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)，篩選得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物的步驟過程中，驗證方法包括：

63、驗證隊列的蛋白前處理包括蛋白提取、還原、烷基化、酶解、脫鹽；

64、蛋白組：通過以下標(biāo)準(zhǔn)選擇目標(biāo)蛋白的肽段建立平行反應(yīng)監(jiān)測方法：1)只選擇蛋白獨有肽段；2)肽段中無錯切位點；3)肽段中無可變修飾位點，如氧化修飾和烷基化修飾；4)滿足以上要求的肽段選擇響應(yīng)值高的；5)每個蛋白至少選擇一條，最多選擇3條蛋白獨有肽段；

65、修飾組：目標(biāo)修飾肽段建立平行反應(yīng)監(jiān)測方法：1)肽段中無錯切位點；2)肽段中無可變修飾位點，如氧化修飾和烷基化修飾；3)滿足以上要求的肽段選擇響應(yīng)值高的；

66、樣品用反相十八烷基自填充毛細(xì)管色譜柱(75μm×100mm)進(jìn)行分析，使用easy-nlc?1200超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離，其中，流動相a為含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流動相b為含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；梯度設(shè)置為：0-46min，6％～28％?b相；46-53min，28％-45％?b相；53-60min，100％?b相，流速維持在350nl/min，柱溫50℃)。肽段經(jīng)超高效液相系統(tǒng)分離后注入到鈉噴離子源(電壓2.1kv)，用thermoscientifictm?q?exactivehf-x(賽默飛世爾)質(zhì)譜儀檢測，其中，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用以下參數(shù)的高靈敏度平行反應(yīng)監(jiān)測模式獲取，碎裂方式為高能碰撞解離，碰撞能量為32％，一級分辨率60000，二級分辨率15000，掃描范圍為100～1800m/z，掃描時間為100ms，篩選包括前驅(qū)體在內(nèi)+2-+4的電荷狀態(tài)，動態(tài)排除時間為30s，隔離窗為4da，時間窗為7min；

67、平行反應(yīng)監(jiān)測數(shù)據(jù)處理采用skyline?3.6軟件，所有的結(jié)果都被導(dǎo)入skyline，選擇正確的峰，在所有樣品中獲得所有肽段的結(jié)果，其中，平行反應(yīng)監(jiān)測結(jié)果包括蛋白質(zhì)名稱和峰面積，被進(jìn)一步輸出分析，對不同組別的差異蛋白進(jìn)行篩選比較；

68、基于skyline峰面積得到的相對定量結(jié)果，使用r語言進(jìn)行差異的相關(guān)分析及可視化，并使用r包進(jìn)行受試者工作特征曲線(roc)的繪制，并計算曲線下面積值。

69、作為優(yōu)選，針對所述非小細(xì)胞肺癌患者樣本的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測，得到所述抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的步驟過程中，非小細(xì)胞肺癌患者樣本根據(jù)模塊蛋白和修飾的表達(dá)趨勢歸類為預(yù)測組、耐藥組、獲益組三個亞型。

70、本發(fā)明提供的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型的構(gòu)建方法以治療前子樣本、治療后子樣本作為一對配對樣本，然后，針對患者樣本在抗程序性死亡蛋白-1單抗治療前后的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取、還原烷基化、酶解的步驟，得到樣本肽段，進(jìn)一步處理后，得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答效果的生物標(biāo)志物，然后針對該生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測，能夠得到抗程序性死亡蛋白-1單抗治療應(yīng)答預(yù)測模型，其能夠為非小細(xì)胞肺癌患者的抗程序性死亡蛋白-1單抗治療效果進(jìn)行預(yù)測。