本發(fā)明屬于納米藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種載藥多孔納米粒子制備方法、表征和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis,uc）是炎癥性腸病中最重要的一種，主要的臨床癥狀為腹瀉、便血、體重下降、腹痛、疲勞以及發(fā)燒等。據(jù)資料顯示，潰瘍性結(jié)腸炎在歐美國家發(fā)病率較高，以美國為例，發(fā)病率高達2‰。uc通常隨著時間推移，癥狀逐漸惡化。傳統(tǒng)的治療藥物主要包括氨基水楊酸類藥物（如5-氨基水楊酸）、免疫抑制劑類藥物（如氨甲嘌呤）和糖皮質(zhì)激素類藥物（如布地奈德）等。

近幾年，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolicacid，plga）為基礎(chǔ)的微、納米粒子得到了廣泛的研究，其具有良好的生物相容性、無刺激性、無免疫原性和藥物控釋等優(yōu)點。姜黃素（curcumin,cur）是從姜科姜黃屬姜黃、郁金等植物的根莖中提取的一種活性物質(zhì)，它對于人類相對安全，但是在中性和堿性環(huán)境中易分解，穩(wěn)定性差，這些缺陷導(dǎo)致其尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

因此，為了給uc治療提供一個切實可行的治療方案，我們用plga包裹cur制備成納米粒子，同時在粒子表面修飾硫酸軟骨素，相比較傳統(tǒng)的無靶向納米粒子，硫酸軟骨素修飾的納米粒子藥物細胞吞噬更快，抗炎效果更好，成為一種有潛力的uc治療策略。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種可用于巨噬細胞靶向的納米粒子，其具有良好的生物相容性，穩(wěn)定性，可用于潰瘍型結(jié)腸炎的治療，本發(fā)明的目的之二在于提供上述靶向納米粒子的制備方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為：

載藥靶向納米粒子的制備方法包括以下步驟：

（1）稱量聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolicacid，plga）和姜黃素（cur），溶于二氯甲烷和甲醇中（二氯甲烷/甲醇=4:1）,配成溶液；

（2）將步驟（1）得到溶液逐滴加入聚乙烯醇水溶液中，配成乳濁液；

（3）將步驟（2）中所得乳濁液立即放入冰浴中，進行超聲；

（4）將超聲后的乳濁液迅速倒入聚乙烯醇水溶液中；

（5）在室溫條件下，將步驟(4)得到的乳濁液中的有機溶劑充分揮發(fā)；

（6）再進行離心，可收集到納米粒子，并用去離子水洗滌3次；

（7）將步驟（6）得到的納米粒子懸浮于ph=6的醋酸鈉緩沖液中，再加入含edc和nhs的硫酸軟骨素溶液，可以得到表面修飾硫酸軟骨素的納米粒子；

（8）再離心收集表面修飾硫酸軟骨素的納米粒子，并用去離子水洗滌3次；

（9）將步驟（8）得到的納米粒子重新分散在海藻糖的水溶液中；

（10）再將上述納米粒子凍干，存于-20攝氏度冰箱備用。

優(yōu)選的，所述步驟（1）中的溶液中plga的質(zhì)量濃度為25-100mg/ml，cur的質(zhì)量濃度為2-8mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟（2）中聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為1-5%，聚乙烯醇水溶液的體積是步驟（1）得到的溶液的2倍。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中，超聲的參數(shù)為超聲振幅20~50%，每次5~20s，間隔1~5s，超聲總時長為0.5~3min。

優(yōu)選的，所述步驟（4）中，聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為0~0.5%，體積為步驟（3）得到的乳濁液體積的3-40倍。

優(yōu)選的，所述步驟（6）和步驟（8）中，離心選取的參數(shù)為離心速率為12000rpm，離心時間為8-20min。

優(yōu)選的，所述步驟（9）中，海藻糖溶液中海藻糖濃度為5-10%，納米粒子溶于海藻糖水溶液后plga的質(zhì)量濃度為25-100mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟（10）中，冷凍干燥按照以下方法進行：在-80攝氏度冷凍過夜后置于凍干機中凍干12～36h。

相對于現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.本發(fā)明以plga為藥物載體材料，制備方法為水包油的溶劑揮發(fā)法，整個制備過程簡單快捷，制備周期短，產(chǎn)率高。

2.本發(fā)明通過plga包裹cur制備載藥納米粒子，改善cur水溶性不佳、不穩(wěn)定、易分解等，更好的把cur遞送到病患部位發(fā)揮作用，增加療效。

3.本發(fā)明引入了硫酸軟骨素作為靶向分子，硫酸軟骨素修飾的納米粒子顯著提高了細胞吞噬效率和抗炎效果，從而有效增強了結(jié)腸炎的治療效率。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中：

圖1：羧甲基纖維素修飾的納米粒子和硫酸軟骨素修飾的納米粒子的場發(fā)射掃描電鏡圖。

圖2：羧甲基纖維素修飾的納米粒子和硫酸軟骨素修飾的納米粒子的體外吞噬實驗。

圖3：羧甲基纖維素修飾的納米粒子和硫酸軟骨素修飾的納米粒子的體外抗炎實驗。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

實施例1為硫酸軟骨素修飾的載cur納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱量plga100mg和cur6mg共同溶于2ml二氯甲烷與甲醇溶液中；

（2）將上述有機溶液逐滴加入4ml5%聚乙烯醇溶液中；

（3）上述溶液立即放入冰浴中，進行超聲，振幅50%，每次10s，間隔1s，超聲總時長為1min；

（4）超聲完畢后，將上述乳濁液迅速倒入60ml0.05%的聚乙烯醇溶液中；

（5）在室溫條件下，將上述乳濁液中有機溶劑揮發(fā)；

（7）離心收集上述納米粒子，并用去離子水洗滌3次，離心速率為12000rpm，離心時間為20min；

（8）將所制粒子與硫酸軟骨素溶液室溫反應(yīng)2小時；

（9）離心收集上述納米粒子，并用去離子水洗滌3次，離心速率為12000rpm，離心時間為20min；

（10）將上述納米粒子重新分散在1ml含10%海藻糖的水溶液中；

（11）將上述納米粒子凍干，存于-20℃冰箱；

實施例2

實施例2為羧甲基纖維素修飾的載cur納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

（1）稱量plga100mg和cur6mg共同溶于2ml二氯甲烷與甲醇溶液中；

（2）將上述有機溶液逐滴加入4ml5%聚乙烯醇溶液中；

（3）上述溶液立即放入冰浴中，進行超聲，振幅50%，每次10s，間隔1s，超聲總時長為1min；

（4）超聲完畢后，將上述乳濁液迅速倒入60ml0.05%的聚乙烯醇溶液中；

（5）在室溫條件下，將上述乳濁液中有機溶劑揮發(fā)；

（7）離心收集上述納米粒子，并用去離子水洗滌3次，離心速率為12000rpm，離心時間為20min；

（8）將所制粒子與羧甲基纖維素溶液室溫反應(yīng)2小時；

（9）離心收集上述納米粒子，并用去離子水洗滌3次，離心速率為12000rpm，離心時間為20min；

（10）將上述納米粒子重新分散在1ml含10%海藻糖的水溶液中；

（11）將上述納米粒子凍干，存于-20℃冰箱；

試驗1：納米粒子的形貌通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。在分析之前，納米粒子經(jīng)過真空噴鉑處理。

圖1為納米粒子的場發(fā)射掃描電鏡圖。（a）圖為羧甲基纖維素修飾的載cur納米粒子；（b）圖為硫酸軟骨素修飾的載cur納米粒子。從得到的電鏡照片可以看出，制得的納米粒子呈球狀，表面光滑平整，且孔徑大小較為均勻。

試驗2：細胞吞噬實驗，所用細胞為raw264.7，從圖2中可以明顯的看出來用硫酸軟骨素修飾的納米粒子細胞吞噬效率更高，0.5h時，硫酸軟骨素修飾的納米粒子細胞吞噬63.99%，而羧甲基纖維素修飾的納米粒子細胞吞噬僅有21.28%。這說明硫酸軟骨素的修飾極大地提高了細胞吞噬效率。

試驗3：在眾多炎癥細胞因子中，起主要作用的是tnf-α、il-1β、il-6、il-8等。我們對其中的tnf-α、il-6和il-12進行了檢測，從圖3中我們可以看出，硫酸軟骨素修飾的納米粒子確實抑制了炎癥因子的表達水平，與羧甲基纖維素修飾的納米粒子相比，其具有更好抗炎效果。

最后說明的是，以上實施例僅用來說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。