本發(fā)明涉及nkila的用途，具體涉及kila作為靶點在篩選或制備治療腫瘤的藥物中的用途。

背景技術：

免疫治療包括過繼性免疫效應細胞治療以及免疫檢查點抑制劑等，是近十多年腫瘤免疫治療中十分活躍的研究領域，主要有以下方案:

1.腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumorinfiltratinglymphocyte，til)治療，是從腫瘤組織分離具有抗腫瘤活性的淋巴細胞，體外經(jīng)il-2培養(yǎng)增殖，再重新輸入患者體內(nèi)的細胞療法。目前僅成功用于轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療，因為從其他類型的瘤組織中采集腫瘤特異性t細胞比較困難。

2.t細胞受體(t-cellreceptor，tcr)治療，是收集患者t細胞，采用基因工程的手段導入可識別腫瘤抗原的tcr序列，使其識別特異性腫瘤抗原并殺傷腫瘤細胞。主要問題是tcr必須與患者的免疫類型匹配。有研究報道，導入mart-1及ny-eso-1分別在黑素瘤和滑膜細胞瘤患者中取得一定療效。

3.嵌合抗原受體治療(chimaericantigenreceptor，car)，采用基因工程手段，在t細胞內(nèi)導入可以與腫瘤細胞表面抗原結(jié)合的抗體樣蛋白的編碼基因，可以是常見癌癥抗原的抗體、細胞受體片段或t細胞增殖刺激因子，優(yōu)點是不需要與患者的免疫類型相匹配。目前有靶向b細胞上cd19蛋白的cart細胞治療在小規(guī)模臨床試驗中有陽性結(jié)果，因為正常細胞上也表達cd19蛋白，因此副作用的產(chǎn)生不可避免。

4.免疫檢查點抑制劑：目前研究和應用最廣泛的免疫檢查點抑制劑包括ctla-4、pd-1以及其配體pd-l1的抑制劑。利用免疫檢查點抑制劑恢復t細胞的激活狀態(tài)，借助人體免疫系統(tǒng)釋放毒性因子等達到殺滅腫瘤目的的治療策略，在黑色素瘤等惡性腫瘤中有一定的治療效果。

目前惡性腫瘤的免疫節(jié)點抑制劑治療效果仍不理想。例如在乳腺癌等多種惡性腫瘤中免疫節(jié)點抑制劑仍未顯示出明顯療效；并且，目前的免疫治理藥物針對靶點在正常組織中廣泛表達，無差別地耗竭免疫抑制細胞極易造成自身免疫反應等嚴重副作用。一項對抗pd-1(nivolumab)單抗和抗ctla-4單抗聯(lián)合治療晚期黑色素瘤的研究中，有高達23％的患者因為治療副反應停藥，1例患者出現(xiàn)治療相關性死亡(結(jié)腸炎導致的多器官衰竭)。而針對改善tcr及構建car-t的方法，有研究指出腫瘤內(nèi)血管表達fasl,誘導t細胞發(fā)生凋亡，使具有功能的淋巴細胞無法到達腫瘤局部。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述缺點，本發(fā)明的目的是為了解決具有殺腫瘤功能淋巴細胞無法到達腫瘤局部這一問題，通過改善淋巴細胞的生存，增加殺腫瘤的能力，增加免疫治療的效果。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術方案：nkila作為靶點在篩選或制備抑制t細胞凋亡的藥物中的用途。

本發(fā)明提供了nkila作為靶點在篩選或制備治療腫瘤的藥物中的用途。

本發(fā)明提供了沉默nkila表達的shrna在制備抑制t細胞凋亡的藥物中的用途。

本發(fā)明提供了沉默nkila表達的shrna在制備治療腫瘤的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述shrna的核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示。

本發(fā)明提供了nkila表達被沉默的t細胞在制備治療腫瘤的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述腫瘤為乳腺癌。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了nkila作為靶點在改善腫瘤特異淋巴細胞的生存從而抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移中的應用。所述nkila是一條與nfκb相互作用的長非編碼rna，被鑒定為可抑制nfκb通路的激活，使t淋巴細胞易于發(fā)生凋亡，是一種新的抑制乳腺癌免疫逃逸、生長、轉(zhuǎn)移的靶點。通過靶向抑制nkila，可抑制t細胞凋亡，促進乳腺癌的免疫反應，抑制乳腺癌的生長。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中沉默t細胞的nkila可抑制aicd的相關圖片；

圖2為本發(fā)明實施例2中過繼性回輸沉默nkila的t細胞，可使腫瘤局部浸潤的t細胞數(shù)目增多，并抑制腫瘤生長的相關圖片；

圖3為腫瘤特異t細胞更易發(fā)生aicd的相關圖片；

圖4為t細胞誘導過程中，nfκb通路的活性決定了aicd的狀態(tài)的相關圖片；

圖5為長非編碼rnankila在t細胞誘導活化過程中上調(diào)的相關圖片。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明實施例中所述沉默nkila表達的shrna的序列為：

本發(fā)明首次提出長非編碼rnankila在t淋巴細胞表達，并在nfκb通路激活后上調(diào)，與nfκb激活呈負相關，說明nkila通過抑制iκb的磷酸化，抑制nfκb的活性，導致t細胞凋亡。通過靶向抑制nkila，可抑制t細胞凋亡，促進乳腺癌的免疫反應，抑制乳腺癌的生長。

實施例1：沉默t細胞的nkila可抑制aicd

圖1為沉默t細胞的nkila可抑制aicd的相關圖片，從圖1中a可以看出沉默nkila可抑制aicd，從圖1中b可以看出沉默nkila可增加t細胞殺傷腫瘤細胞的能力；

從圖1的體外細胞實驗證明沉默t細胞中的nkila，可解除nfκb的抑制，有效減少淋巴細胞的凋亡，增加其殺腫瘤的能力。

實施例2

圖2為過繼性回輸沉默nkila的t細胞，可使腫瘤局部浸潤的t細胞數(shù)目增多，并抑制腫瘤生長的相關圖片；從圖2中a可以看出過繼性回輸沉默nkila的t細胞使腫瘤明顯縮小，從圖2中b可以看出過繼性回輸沉默nkila的t細胞使腫瘤細胞凋亡增加；從圖2中c可以看出過繼性回輸沉默nkila的t細胞后，腫瘤局部浸潤的t細胞數(shù)目較對照組增多。

從圖2的動物實驗證明在小鼠皮下種植病人來源的移植瘤，同時收集同一個病人的外周血，分離出t淋巴細胞，并用慢病毒沉默nkila，成瘤后過繼性回輸同一個病人的t淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤明顯縮小，腫瘤局部浸潤的t細胞數(shù)目明顯增多。

為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合原理，進一步闡述本發(fā)明。

1.在誘導腫瘤特異效應t細胞的過程中，t細胞會發(fā)生活化誘導的細胞凋亡(activationinducedcelldeath,aicd)。前期t細胞的殺傷功能較弱，同時處于aicd耐受期，這一時期受到再次刺激，不會發(fā)生凋亡；后期t細胞的殺傷功能較強，同時處于aicd敏感期，在fasl的處理下迅速發(fā)生凋亡，如圖3所示，從圖3中a可以看出t細胞激活后，有殺腫瘤的能力，圖3中b可以看出t細胞激活后，腫瘤特異t細胞發(fā)生aicd。

2.在腫瘤特異淋巴細胞誘導過程中，激活了nfκb通路，轉(zhuǎn)錄了抗凋亡的基因，使t細胞進入aicd耐受期；后期，由于iκb的磷酸化被抑制，nfκb的活性降低，t細胞進入aicd敏感期，如圖4所示，從圖4中a、b可以看出nfκb在aicd耐受期被激活，在aicd敏感期被抑制，主要因為抑制了iκb的磷酸化水平，導致p65入核減少，nfκb下游基因轉(zhuǎn)錄減少。

3.在腫瘤特異淋巴細胞誘導過程中，長非編碼rnankila上調(diào)，且穩(wěn)定在aicd敏感期高表達，定位在胞漿，如圖5所示，圖5中a.qrt-pcr顯示nkila在t細胞誘導第4天明顯上調(diào)；圖5中b：fish顯示nkila定位于t細胞胞漿；圖5中c.northernblot顯示nkila在t細胞aicd敏感期明顯上調(diào)。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。

序列表

<110>中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院

<120>nkila作為靶點在篩選或制備治療腫瘤的藥物中的用途

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

gggcaguaggaaaggagaa19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

ccuugcaaguagaggagaa19