本發(fā)明涉及生物醫(yī)療技術領域，更具體的說，是一種慢性乙肝治療性dc疫苗。

背景技術：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)，全球流行最廣的嗜肝病毒，感染后可引起急、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關。在我國，hbv攜帶者約9300萬人，其中慢性乙肝患者高達2500萬，是我國最為嚴重的三大傳染病之一。目前臨床上對慢性乙肝患者的主要治療藥物包括核苷(酸)類似物、干擾素和免疫調節(jié)劑，這些藥物均不能徹底清除乙肝病毒，并且復發(fā)率高。因此，研發(fā)有效的治療策略顯得極為迫切。

如何誘導強有力的特異性細胞免疫反應，打破體內hbv特異性t細胞免疫耐受已經成為目前的主要研究方向。由于dc疫苗在誘導機體特異性細胞免疫方面具有獨特優(yōu)勢，已作為針對慢性乙肝具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前慢性乙肝dc疫苗研究的焦點：(1)如何獲得有效的hbv抗原(抗原必須在慢性乙肝中不耐受)。(2)如何進一步增強dc疫苗的免疫效應。

hbv表面蛋白質或抗原(hbsag)是由pres(pres1和pres2)區(qū)域及s區(qū)域的基因通過三種起始密碼子各自進行交替翻譯編碼的三種包膜蛋白(l蛋白，m蛋白和s蛋白)。s-hbsag由226個氨基酸組成，僅包括s區(qū)域，是慢性乙型肝炎患者血清中假病毒顆粒的主要成分，也是目前臨床預防性乙肝疫苗的成分；m-hbsag是由281個氨基酸組成，包括s和pres2區(qū)域，也是假病毒顆粒的重要組成成分；l-hbsag是約400個氨基酸組成(根據乙肝不同亞型，ay型389個，ad型400個)，包括pres1域，pres2域及s域。目前研究表明：慢性hbv感染過程中，不同的病毒抗原存在不同的耐受狀態(tài)。s區(qū)域存在著很強的免疫耐受狀態(tài)，直接以此作為疫苗，無法在hbv耐受小鼠中產生治療性效果。

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補以上不足，但是以pres1區(qū)域作為疫苗就能夠在hbv耐受模型體內引起細胞免疫反應。并且聯(lián)合pres1疫苗和hbsag疫苗，可以誘導hbsag-hbsab的血清學轉化，降低肝內的乙肝病毒感染。由此可知，同時含有pres1抗原和s抗原的疫苗與只含有s抗原的疫苗相比免疫原性更強。由此本發(fā)明提供一種慢性乙肝治療性dc疫苗

本發(fā)明的方案是：

一種慢性乙肝治療性dc疫苗，包括經基因修飾的樹突狀細胞，所述經基因修飾的樹突狀細胞中含有粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽引導編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的融合基因片段。

作為優(yōu)選的技術方案，所述粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽為序列表seqidno.1所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術方案，所述m-hbsag為序列表seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種將樹突狀細胞負載融合基因片段的方法：將所述粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽引導編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的基因片段緩慢插入慢病毒表達載體plent-c-gfp中，包裝成攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒，同時，將慢性乙型肝炎患者的體外周血單個核細胞誘導成imdc，將攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒感染所述imdc，并將感染后的imdc經成熟因子誘導，得到成熟dc疫苗。

本發(fā)明還提供了一種將所述慢性乙型肝炎患者的體外周血單個核細胞誘導成imdc的方法：采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，培養(yǎng)基中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時后，倒掉懸浮t細胞，留取貼壁細胞，并加入細胞因子rhil-4，rhgm-gsf，誘導單個核細胞分化成dc，每隔48小時更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

作為優(yōu)選的技術方案，所述成熟因子為成熟因子tnf-α。

本發(fā)明還提供了一種將包裝成攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒的方法：將慢病毒包裝細胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進行轉染；慢病毒包裝質粒和目的表達質粒采用磷酸鈣轉染法共轉染293t細胞；轉染后24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落；48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達；72h后，收集上清，過濾除菌，得到重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒，所述重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

由于采用了上述技術方案，一種慢性乙肝治療性dc疫苗，包括經基因修飾的樹突狀細胞，所述經基因修飾的樹突狀細胞中含有粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽引導編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的融合基因片段。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果：

(1)首次采用pres2區(qū)域和s區(qū)域作為抗原基因制備慢性乙肝dc疫苗，傳統(tǒng)的乙肝疫苗即乙肝表面抗原小蛋白存在著很強的免疫耐受狀態(tài)，無法在慢性乙肝患者中產生治療性效果。包含pres2抗原的m-hbsag在hbv與肝細胞相應受體的粘附中起重要作用，免疫機體時就可以產生針對pres2抗原的特性抗體，這些抗體具有良好的中和hbv病毒的作用，從而保護宿主免受hbv病毒的感染。

(2)采用粒細胞-巨噬細胞簇因子受體信號肽引導m-hbsag抗原的表達，能夠提高抗原的表達效率，增強其免疫效應，產生更強的抗hbv特異性的免疫反應。

(3)采用慢病毒作為表達載體，對dc細胞感染率高，并且m-hbsag抗原基因能穩(wěn)定整合至dc細胞基因組中并長期表達，大量的m-hbsag抗原持續(xù)刺激和活化dc，從而提高dc抗原遞呈的效率。

附圖說明

圖1為對照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的野生型小鼠hbsag特異性t細胞應答對比圖；

圖2為對照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠hbsag特異性t細胞應答對比圖；

圖3為對照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠血清中hbsag抗原水平對比圖；

圖4為對照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠血清中hbsag抗體水平對比圖；

具體實施方式

具體實施如下：

1.將基因片段gm-csfrsp-m-hbsag插入慢病毒表達載體plent-c-gfp。

(1)gm-csfrsp核酸人工序列(seqidno.1)

(2)m-hbsag核酸人工序列(seqidno.2)

gm-csfrsp-m-hbsag的核酸人工序列的兩端分別加noti和asisi位點酶切位點(seqidno.4)，委托生工生物工程有限公司合成兩個完整的表達框，酶切處理后插入慢病毒plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點，轉化到e.coli(dh5α)，經核酸測序鑒定正確后，使用qiagen公司的質粒純化試劑盒提取并純化質粒，獲得重組表達載體的高品質質粒。

2.重組慢病毒包裝，滴度檢測

將慢病毒包裝細胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進行轉染。慢病毒包裝質粒和目的表達質粒采用磷酸鈣轉染法共轉染293t細胞，具體方法參考分子克隆。轉染后24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達。72h后，收集上清，過濾除菌，在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。根據lenti-x^tmgostix^tm試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司產品)測定病毒滴度，結果表明，重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒的滴度2.74×10⁶pfu/ml。

3.未成熟dc(imdc)的誘導

采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，培養(yǎng)基(購自takara公司，gt-t551)中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時后，倒掉懸浮t細胞，留取貼壁細胞，并加入細胞因子rhil-4(終濃度：50ng/ml)，rhgm-gsf(終濃度100ng/ml)，誘導單個核細胞分化成dc，每隔48小時更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

4.重組慢病毒分別感染imdc及dc細胞的成熟

將imdc以1×10⁶個細胞/孔的量接種在12孔培養(yǎng)板中，以moi＝10的重組慢病毒感染上述imdc，感染8-12h后，用pbs洗滌細胞2-3次，加入成熟因子tnf-α繼續(xù)培養(yǎng)誘導得到成熟的dc細胞(mdc)，通過倒置顯微鏡觀察dc成熟后細胞形態(tài)，探針檢測m-hbsag基因表達情況；pcr分析慢病毒載體染色體整合情況；流式細胞儀分析dc細胞成熟標志的表達情況。重組慢病毒感染dc前體細胞后，m-hbsag陽性細胞率都為92.3％以上，流式細胞儀分析結果顯示，病毒感染組dc細胞的成熟標志cd11c+cd86+的平均值為74.04％，cd11c+cd83+的平均值為88.05％，高表達cd83、cd86。該mdc可直接注射作為預防hbv的疫苗。

m-hbsag疫苗制備：

1.將基因片段m-hbsag分別插入慢病毒表達載體plent-c-gfp。

(1)m-hbsag核酸人工序列(seqidno.2)

m-hbsag的核酸人工序列的兩端分別加noti和asisi位點酶切位點(seqidno.3)，委托生工生物工程有限公司合成兩個完整的表達框，酶切處理后插入慢病毒plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點，轉化到e.coli(dh5α)，經核酸測序鑒定正確后，使用qiagen公司的質粒純化試劑盒提取并純化質粒，獲得重組表達載體的高品質質粒。

2.重組慢病毒包裝，滴度檢測

將慢病毒包裝細胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進行轉染。慢病毒包裝質粒和目的表達質粒采用磷酸鈣轉染法共轉染293t細胞，具體方法參考分子克隆。轉染后24h后，細胞明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光蛋白表達。72h后，收集上清，過濾除菌，在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕enti-x^tmgostix^tm試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司產品)測定病毒滴度，結果表明，重組m-hbsag慢病毒的滴度2.8×10⁶pfu/ml。

3.未成熟dc(imdc)的誘導

采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，培養(yǎng)基(購自takara公司，gt-t551)中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時后，倒掉懸浮t細胞，留取貼壁細胞，并加入細胞因子rhil-4(終濃度：50ng/ml)，rhgm-gsf(終濃度100ng/ml)，誘導單個核細胞分化成dc，每隔48小時更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

4.重組慢病毒分別感染imdc及dc細胞的成熟

將imdc以1×10⁶個細胞/孔的量接種在12孔培養(yǎng)板中，以moi＝10的重組慢病毒感染上述imdc，感染8-12h后，用pbs洗滌細胞2-3次，加入成熟因子tnf-α繼續(xù)培養(yǎng)誘導得到成熟的dc細胞(mdc)，通過倒置顯微鏡觀察dc成熟后細胞形態(tài)，探針檢測m-hbsag基因表達情況；pcr分析慢病毒載體染色體整合情況；流式細胞儀分析dc細胞成熟標志的表達情況。重組慢病毒感染dc前體細胞后，m-hbsag陽性細胞率都為92.3％以上，流式細胞儀分析結果顯示，病毒感染組dc細胞的成熟標志cd11c+cd86+的平均值為75.64％，cd11c+cd83+的平均值為88.34％，高表達cd83、cd86。

對比試驗：

hbv特異性dc疫苗預防和治療慢性乙肝的效果

慢性hbv感染模型的建立，6-8周齡c57bl/6小鼠(購自廣州中醫(yī)藥大學，雌性，屬spf(iii)級動物)，尾靜脈高壓注射法注射10μgpaav/hbv1.2質粒(購自北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司)。在感染之后4周建立穩(wěn)定的hbv耐受及慢性hbv感染模型。通過該模型，我們驗證本發(fā)明的一種慢性或乙肝治療性dc疫苗，準備三組進行對比，分別是對照組、m-hbsag疫苗組和本發(fā)明的一種慢性乙肝治療dc疫苗含有gm-csfrsp-m-hbsag組，其中對照組為空白對照組。

空白對照組不進行任何處理；

m-hbsag疫苗組；以1×10⁶個細胞/次尾部注射m-hbsag疫苗進行免疫治療，總共免疫兩次，第一次和第二次免疫間隔7天。

本發(fā)明的一種慢性乙肝治療dc疫苗組：以1×10⁶個細胞/次尾部注射本發(fā)明基于dc的hbv病毒疫苗進行免疫治療，總共免疫兩次，第一次和第二次免疫間隔7天。通過elispot(購自ebioscience公司)和elisa(購自thermofisherscientific公司)檢測對比發(fā)現(xiàn)，不論在野生小鼠還是耐受小鼠中，其都能夠誘導強勁的針對hbsag特異性t細胞免疫應答。并且hbv耐受小鼠中產生的免疫反應能夠完全清除血清中hbsag，同時誘導了部分的血清學hbsab的轉化，這在臨床上被認為是hbv治愈的關鍵指標，因此本發(fā)明所制備的疫苗具有更好的治療效果。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種慢性乙肝治療性dc疫苗

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>75

<212>dna

<213>gm-csfrsp人工序列

<400>1

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctg60

atccccgacatccag75

<210>2

<211>843

<212>dna

<213>m-hbsag人工序列

<400>2

atgcagtggaactccacagcattccaccaaactctgcaagatcccagagtaggcggcctg60

tatcttcctgtaggtggctccagttcaggaacagtgaaccctgctccgaatattgcctct120

cacatctcgtcagtctccgcggcgactagggaccctgtaccgaacatgtcaaacatccca180

tcatcactcctaggactcctggccgccttacaggtggtgtatttcttgtggacaaaagtc240

ctcacaatgccacagagtctagactcgttgtggacttctctctcttttccacggcgagca300

cccgcgcgtcctggcctaaattcgcagcctccaacccctaatcactcaccaacctcttgt360

ccttcaatttgtcctggtcatcactggatgcgtctgtggcgttttatcatctacctctta420

gtcctgttgctatgcctcatcttcctcttggttcttctggactatcgaggtgtgttgccc480

gtttgtcctccacttccaggatcatcgaccaccggcacgggaccatgcaaaacctgcacg540

attcctcctcaaggaacctctttgattccctcatgttgctgtacaaaaccttcggacgga600

tcgtgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggctttcgcaaagttcctatgggactgg660

gcctcagtccgtttctcctggctctcattactagcgccatttgttcagaggttcgcaggg720

ctttcccccgctgcttggcttttagctacatggatcatctggttctgggggccaaatctg780

ttcaacatcatgaatccctttataccgctgttaccacttttcttttggctctgggtatac840

att843

<210>3

<211>871

<212>dna

<213>兩端加酶切位點m-hbsag人工序列

<400>3

ggatccgcgatcgcatgcagtggaactccacagcattccaccaaactctgcaagatccca60

gagtaggcggcctgtatcttcctgtaggtggctccagttcaggaacagtgaaccctgctc120

cgaatattgcctctcacatctcgtcagtctccgcggcgactagggaccctgtaccgaaca180

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gggggccaaatctgttcaacatcatgaatccctttataccgctgttaccacttttctttt840

ggctctgggtatacattgcggccgcctcgag871

<210>4

<211>946

<212>dna

<213>兩端加酶切位點gm-csfrsp-m-hbsag人工序列

<400>4

cagtgaaccctgctccgaatattgcctctcacatctcgtcagtctccgcggcgactaggg240

accctgtaccgaacatgtcaaacatcccatcatcactcctaggactcctggccgccttac300

aggtggtgtatttcttgtggacaaaagtcctcacaatgccacagagtctagactcgttgt360

ggacttctctctcttttccacggcgagcacccgcgcgtcctggcctaaattcgcagcctc420

caacccctaatcactcaccaacctcttgtccttcaatttgtcctggtcatcactggatgc480

gtctgtggcgttttatcatctacctcttagtcctgttgctatgcctcatcttcctcttgg540

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ggatcatctggttctgggggccaaatctgttcaacatcatgaatccctttataccgctgt900

taccacttttcttttggctctgggtatacattgcggccgcctcgag946