本發(fā)明涉及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及dspe-peg聚合物作為口服和經(jīng)肺吸收促進劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，隨著生物技術(shù)及基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，生產(chǎn)出了大量的生物大分子藥物，主要包括蛋白質(zhì)、多肽、核酸、疫苗、抗體等，多用于治療腫瘤、肝炎、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病、免疫性疾病等重大疾病。這類藥物與化學(xué)藥物相比，具有作用靶點專一，特異性強，不良反應(yīng)少，藥效強等特點，在疾病的預(yù)防和治療中應(yīng)用越來越廣泛。但是，這些藥物在具有良好活性的同時也存在著局限性。蛋白質(zhì)、多肽類藥物一般在體內(nèi)不穩(wěn)定，易被體內(nèi)的酸和蛋白酶水解而降解；脂溶性低、分子量大、透過生物膜屏障能力弱等，最終導(dǎo)致這些藥物給藥后很難被吸收。故臨床應(yīng)用多以注射途徑為主，但長期頻繁注射給藥所造成的肌體損傷及精神、經(jīng)濟壓力往往令患者難以承受。因此對該類藥物非注射給藥途徑的研究意義重大。

長期以來，口服給藥因其簡便、患者順應(yīng)性好、可接受程度高而引人關(guān)注。同時，經(jīng)肺給藥是一種非侵入性的給藥途徑，具有吸收面積巨大，毛細血管豐富，肺泡腔至毛細血管腔間轉(zhuǎn)運距離極小，患者耐受性高等眾多優(yōu)勢，也逐漸應(yīng)用于非注射給藥途徑中。

目前，提高大分子難吸收藥物生物利用度研究主要通過以下途徑：(1)通過對藥物進行適當?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾制成前體藥物，或與大分子載體蛋白或聚合物結(jié)合，以增加藥物的脂溶性，提高跨膜性能，減少酶解，從而提高生物利用度；(2)開發(fā)新劑型，采用兼具顯著的免疫反應(yīng)、優(yōu)良的組織相容性及生物降解性的新型材料制成微粒劑等亦可避免和降低胰島素、降鈣素等多肽類藥物受體內(nèi)酶的降解，同時增強黏膜滲透性等，提高藥物吸收；(3)應(yīng)用吸收促進劑，以提高藥物穩(wěn)定性，膜滲透性，從而增加水溶性大分子藥物生物利用度。但是，通過設(shè)計合成前體藥物改變藥物的物理化學(xué)特性以增加其脂溶性和代謝穩(wěn)定性，具有不同的研究與批準進入臨床試驗應(yīng)用的程序，且對此類前體藥物目前局限于僅對其結(jié)構(gòu)或少數(shù)基團的修飾，對于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大分子親水性藥物作用有限；微粒劑需要高分子物質(zhì)作為骨架材料，而生物組織相容性好又可生物降解的載體種類有限，且這些載體的體內(nèi)代謝動力學(xué)也還需要進一步系統(tǒng)研究，從而在一定程度上限制了其在實踐中的廣泛應(yīng)用。

為提高難吸收藥物生物利用度而進行的吸收促進劑研究是眾多的研究方法中較為簡便、經(jīng)濟、安全的方法之一，也是目前藥劑學(xué)研究的一個主要熱點。到目前為止，文獻報道的吸收促進劑大概可歸納為以下兩類：一類是小分子類吸收促進劑，包括中鏈脂肪酸鈉鹽、膽酸鹽、環(huán)糊精及其衍生物、表面活性劑、螯合劑及其他小分子物質(zhì)如no供與體、?；鈮A、桿菌肽等；另一類是聚合物類吸收促進劑，包括陽離子聚合物、陰離子聚合物以及巰基聚合物等。眾多研究結(jié)果表明，上述吸收促進劑均能顯著改善難吸收藥物在各給藥部位的吸收，但隨著其吸收促進作用的增強，這些吸收促進劑對吸收部位的黏膜損傷也逐漸增大，從而限制了這些吸收促進劑在藥物制劑中的應(yīng)用。因此，篩選出一種既能顯著改善難吸收藥物的吸收，又不會對吸收部位黏膜造成損傷的優(yōu)良的吸收促進劑是當前亟待解決的問題。

1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇即dspe-peg，是一類磷脂類聚合物，具有很好的生物相容性和生物可降解性。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中兩親性功能基團的存在，使其易于功能化修飾，從而使該聚合物形成某些生物功能。聚合物結(jié)構(gòu)中的peg是由氧乙烯單體聚合而成的惰性長鏈兩親性分子，柔性peg分子鏈可結(jié)合水分子形成水化層，從而可以極大提高該聚合物在水中的溶解度和生物相容性。同時，peg是fda批準使用的非離子水溶性聚合物，無毒、無免疫原性，可溶于水和多種有機溶劑，已用于多種藥物制劑、食品和化妝品的載體或基質(zhì)，因而具有很高的應(yīng)用安全性能。近些年研究結(jié)果表明，dspe-peg可以延長藥物在血液循環(huán)中的滯留時間、改善藥物穩(wěn)定性能、增加藥物包封率等，因而廣泛應(yīng)用于納米遞藥系統(tǒng)中。但是，目前尚未見到關(guān)于dspe-peg作為吸收促進劑應(yīng)用于大分子難吸收藥物制劑中的報道。

dspe-peg-sh是一種親水性巰基化磷脂類聚合物，它是經(jīng)過高分子聚合物接枝共聚后經(jīng)巰基化合物修飾制得的一種黏膜黏附性材料。在聚合物結(jié)構(gòu)中的巰基可與組織黏液層糖蛋白中富含半胱氨酸的區(qū)域形成二硫鍵，以共價鍵緊密結(jié)合于黏膜，延長所載藥物滯留時間，提高局部藥物濃度，但是巰基作用的發(fā)揮同時受到了所在聚合物整體結(jié)構(gòu)的影響，是否能夠促進藥物吸收不能一概而論。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供dspe-peg聚合物作為口服和經(jīng)肺吸收促進劑的應(yīng)用，dspe-peg(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)聚合物不僅提高了水溶性大分子藥物口服和經(jīng)肺給藥的生物利用度，而且對吸收部位黏膜毒性小，安全性能高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

dspe-peg聚合物作為經(jīng)口服或經(jīng)肺吸收藥物的吸收促進劑的應(yīng)用。

所述的dspe-peg聚合物根據(jù)所使用的封端基團的不同，包括以下兩種：dspe-peg-sh和dspe-peg-oh。

所述的dspe-peg聚合物作為水溶性大分子難吸收藥物，具體包括蛋白質(zhì)、肽類藥物吸收促進劑的應(yīng)用。

所述的dspe-peg聚合物通過細胞旁路途徑打開細胞之間緊密連接促進藥物吸收。

所述的dspe-peg聚合物通過細胞途徑改變細胞膜流動性促進藥物吸收。

上述dspe-peg聚合物在制備口服或經(jīng)肺給藥制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益的效果：

本發(fā)明基于多種不同封端的dspe-peg聚合物可有效提高水溶性大分子難吸收藥物在腸道吸收和肺部吸收的作用，提出dspe-peg聚合物在藥物制劑中作為經(jīng)口服和經(jīng)肺吸收藥物的吸收促進劑的應(yīng)用。

dspe-peg聚合物作為吸收促進劑，能明顯促進大分子難吸收藥物口服和經(jīng)肺吸收；同時，毒性考察結(jié)果顯示dspe-peg聚合物對口服和肺部吸收部位黏膜無明顯損傷，因此dspe-peg聚合物是安全的吸收促進劑，可應(yīng)用于大分子藥物口服和經(jīng)肺吸收制劑中，用于改善水溶性大分子難吸收藥物，尤其是蛋白肽類藥物(如降鈣素)口服和經(jīng)肺吸收的生物利用度。

dspe-peg聚合物作為吸收促進劑，能增加細胞膜流動性，從而促進大分子難吸收藥物經(jīng)細胞途徑的吸收；這類聚合物也能下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白occludin和zo-1的表達，從而打開上皮細胞間緊密連接，促進大分子難吸收藥物經(jīng)細胞旁路途徑的吸收；且在給藥時間內(nèi)對吸收部位黏膜沒有明顯損傷。因此dspe-peg聚合物既能顯著改善大分子難吸收藥物的吸收，又不會對吸收部位黏膜造成損傷，是一種優(yōu)良的吸收促進劑。

附圖說明

圖1為吸收促進劑1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖，其中：(a)dspe-peg-oh；(b)dspe-peg-sh。

圖2為不同濃度的dspe-peg-sh對fd4在大鼠小腸(a)和大腸(b)吸收促進作用結(jié)果。

圖3為dspe-peg-sh對小腸吸收部位黏膜毒性評價結(jié)果；其中，(a)protein；(b)ldh。

圖4為不同濃度的dspe-peg-sh分別對fd4(a)、fd10(b)和fd70(c)在大鼠肺部吸收促進作用結(jié)果。

圖5為不同濃度的dspe-peg-oh分別對fd4(a)、fd10(b)和fd70(c)在大鼠肺部吸收促進作用結(jié)果。

圖6為dspe-peg聚合物對降鈣素在大鼠肺部吸收促進作用結(jié)果。

圖7為dspe-peg-sh對肺部吸收部位黏膜毒性評價結(jié)果；其中，(a)protein；(b)ldh。

圖8為dspe-peg-oh對肺部吸收部位黏膜毒性評價結(jié)果；其中，(a)protein；(b)ldh。

圖9為dspe-peg聚合物通過打開細胞之間緊密連接促進吸收機制考察結(jié)果；其中，(a)westernblot蛋白條帶圖；(b)westernblot蛋白定量結(jié)果統(tǒng)計圖。

具體實施方式

下面結(jié)合不同封端的dspe-peg聚合物(dspe-peg-sh及dspe-peg-oh，結(jié)構(gòu)如圖1所示，peg具體為peg2000)促腸道吸收、促肺吸收的實施例來說明dspe-peg聚合物作為經(jīng)口服、經(jīng)肺吸收藥物的吸收促進劑的作用。

1、dspe-peg-sh促大鼠在體腸道吸收

選取8-10周齡雄性sd大鼠(體重230-250克)構(gòu)建在體腸道吸收實驗?zāi)Ｐ?。實驗?6小時禁食，可自由飲水，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40mg/kg)，將大鼠仰臥置于固定板上，沿腹中線剪開，首先結(jié)扎膽總管，從待研究的腸段上端插管，以pbs(ph7.4)溶液沖洗腸道，另一端從目標腸段末端插管后密封，從腸段上端用注射器將藥液緩緩注入，以止血鉗密封，縫合腹部開口。剝離大鼠頸靜脈，分別于不同的時間間隔取血0.25ml，置于肝素化的離心管中，12000rpm離心5分鐘，分離血漿于離心管內(nèi)，置于冰盒內(nèi)待測。采用上述在體腸道吸收實驗?zāi)Ｐ?，以異硫氰酸熒光?右旋糖酐即fd4(平均分子量為4400)為模型藥物(8mg/kg)，以h2o為溶劑，考察不同濃度dspe-peg-sh(1％，2％，w/v，即dspe-peg-sh質(zhì)量(單位：g)/h2o體積(單位：ml))對fd4在大鼠小腸和大腸吸收的影響，結(jié)果如圖2所示。

如圖2(a)所示，與單獨使用fd4的對照相比，兩個濃度的dspe-peg-sh均能提高fd4在小腸的吸收，其中，1％(w/v)的dspe-peg-sh吸收促進作用最佳；然后，選取吸收促進作用最佳的濃度，考察其對fd4在大腸的吸收促進能力；如圖2(b)所示，與單獨使用fd4的對照相比，濃度為1％的dspe-peg-sh能提高fd4在大鼠大腸的吸收。

2、dspe-peg-sh對腸道黏膜毒性評價

選取8-10周齡雄性sd大鼠(體重230-250克)，采用上述在體腸道吸收實驗?zāi)Ｐ?，配制不同濃?1％，2％，w/v)dspe-peg-sh溶液給予大鼠小腸部位，給予dspe-peg-sh溶液4小時后，以pbs(ph7.4)分別沖洗給予dspe-peg-sh溶液部位腸段，以灌流液中總蛋白(protein)和乳酸脫氫酶(ldh)為檢測指標，評價dspe-peg-sh對吸收部位黏膜毒性，結(jié)果見圖3。

如圖3(a)、圖3(b)所示，與陰性對照組(pbs溶液，ph7.4)相比，給予dspe-peg-sh(1％，2％)組乳酸脫氫酶活性和總蛋白量均無顯著差異(n.s.,nosignificance)；同時，如圖3(a)所示，與陽性對照組(tritonx-100,3％)相比，給予dspe-peg-sh(1％，2％)組具顯著差異(^**p﹤0.01)，表明dspe-peg-sh(1％，2％)對各吸收部位黏膜沒有明顯損傷，在1％-2％濃度范圍內(nèi)可以安全應(yīng)用。

3、dspe-peg聚合物大鼠體內(nèi)經(jīng)肺吸收實驗

取健康雄性sd大鼠(體重220-250g)構(gòu)建體內(nèi)經(jīng)肺吸收實驗?zāi)Ｐ?。實驗前禁?2小時，自由飲水。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40mg/kg，i.p.)，仰臥位固定于鼠板上，剝離氣管后進行氣管插管，絲線固定，微量注射器通過插管注入藥液100μl。實驗過程中用白熾燈照明，保持大鼠體溫在37℃左右。剝離頸靜脈，于不同時間點(0,15,30,60,90,120,180,240min)從頸靜脈采血。血樣取出后立即離心(12000rpm，5min，4℃)，分離出血漿，置于冰箱待測。采用上述體內(nèi)經(jīng)肺吸收實驗?zāi)Ｐ?，分別以不同分子量范圍的fds(fd4、fd10和fd70，8mg/kg)和降鈣素(4μg/kg)為模型藥物，考察不同濃度(0.1％，0.5％，1％，2％，w/v)及不同封端的dspe-peg聚合物(dspe-peg-sh,dspe-peg-oh)對上述模型藥物在大鼠肺部吸收的影響，結(jié)果見圖4、圖5、圖6。

從圖4中可以看到，較高濃度(0.5％，1％，w/v)dspe-peg-sh均能提高fd4、fd10及fd70的肺部吸收(與未使用dspe-peg-sh相比，即圖中fd4、fd10及fd70組)，并延緩fd4和fd10達峰時間。此外，dspe-peg-sh吸收促進效果與模型藥物的分子量相關(guān)，當模型藥物分子量在4400-10000范圍內(nèi)，分子量越大，其吸收促進率越大；隨著模型藥物分子量繼續(xù)增加，吸收促進效果逐漸減小。應(yīng)用的高、中、低三個濃度(1％，0.5％，0.1％，w/v)中，濃度為1％的dspe-peg-sh對分子量為10000的fd10在肺部吸收顯示了最強的吸收促進效果，表明該類吸收促進劑對分子量為10000左右的大分子藥物具有很好的吸收促進作用。

從圖5可以看到，dspe-peg-oh吸收促進作用與dspe-peg-sh的作用規(guī)律相似，各濃度dspe-peg-oh對fds在大鼠肺部的吸收促進作用強弱依次為：2％≦1％>0.5％>0.1％(w/v)，表明2％時促吸收作用達到飽和。

為進一步考察dspe-peg-sh和dspe-peg-oh是否能改善蛋白質(zhì)、肽類大分子難吸收藥物在大鼠肺部的吸收，本發(fā)明采用降鈣素為模型藥物，選擇吸收促進效果最佳的濃度，評價1％(w/v)dspe-peg-sh和dspe-peg-oh分別對降鈣素在大鼠肺部吸收的影響。如圖6所示，兩種聚合物均能顯著降低血鈣水平，從而說明1％(w/v)dspe-peg-sh和dspe-peg-oh均能有效提高降鈣素在大鼠肺部的吸收(與未使用吸收促進劑的給藥組相比，即圖中control組，圖中blank為僅建立實驗?zāi)Ｐ徒M)。

通過與腸吸收實驗結(jié)果的比較，dspe-peg-sh和dspe-peg-oh對難吸收藥物經(jīng)肺吸收的促進效果更為顯著。

4、dspe-peg聚合物對肺部黏膜毒性評價實驗

選取8-10周齡雄性sd大鼠(體重230-250g)，采用上述經(jīng)肺吸收實驗?zāi)Ｐ停渲撇煌瑵舛?0.1％，0.5％，1％)dspe-peg聚合物溶液，分別經(jīng)肺給予，給予聚合物溶液4小時后，收集肺灌流液并剝離肺組織，以灌流液中總蛋白釋放量和乳酸脫氫酶活力為檢測指標，評價dspe-peg聚合物對肺部吸收部位黏膜的毒性。本實驗設(shè)置陰性對照組(pbs溶液)、實驗組(不同濃度dspe-peg聚合物溶液)、陽性對照組(10mm去氧膽酸鈉溶液)，結(jié)果見圖7、圖8。

如圖7、圖8所示，與陰性對照組(pbs溶液，ph7.4)相比，給予dspe-peg聚合物(0.1％，0.5％，1％，w/v)組總蛋白量和乳酸脫氫酶活性均無顯著差異，且與陽性對照組(nadc,10mm)具顯著差異(p＜0.01)，表明dspe-peg聚合物(0.1％，0.5％，1％，w/v)對肺部吸收部位黏膜沒有顯著損傷，在0.1％～1％范圍內(nèi)可以安全應(yīng)用。

5、dspe-peg聚合物吸收促進機制考察

吸收促進劑促進藥物跨膜轉(zhuǎn)運一般主要以兩種方式進行，一種是經(jīng)細胞途徑，另一種是細胞旁路途徑，本發(fā)明中，通過研究dspe-peg聚合物對緊密連接相關(guān)蛋白表達量的影響，以及其對細胞膜流動性的影響，從而確認dspe-peg聚合物促進藥物轉(zhuǎn)運的途徑。具體實驗方案如下：

選取8-10周齡雄性sd大鼠(體重230-250克)，實驗前16小時禁食，可自由飲水，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40mg/kg)，將大鼠仰臥置于固定板上，打開腹腔，腹主動脈脫血處死，分離出大鼠肺臟。將剔除結(jié)締組織及氣管的肺葉用生理鹽水洗凈，濾紙吸干表面水分，稱重后剪碎成小塊，置于組織勻漿器中，按重量體積比1:4加入tris-hcl緩沖溶液進行勻漿，取勻漿3400rpm離心10min(4℃)，再取上清15000rpm離心15min(4℃)，棄上清，再分別向各離心管中加入1mltris-hcl緩沖溶液洗滌一次，15000rpm離心10min(4℃)，棄上清，用0.01mpbs分散該沉淀，制成終濃度為10mg/ml的溶液，即膜制劑。取上述膜制劑1ml，加入50μl促進劑(dspe-peg-sh、dspe-peg-oh)溶液，37℃孵育20min。再直接向各管中加入950μl熒光標記物dph或tma-dph，在37℃水浴中標記30min。采用多功能酶標儀測定其熒光偏振度(p)，并計算微黏度(η)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，dspe-peg-sh和dspe-peg-oh均能顯著降低細胞膜熒光偏振度，說明這兩種促進劑能提高生物膜脂質(zhì)的流動性，從而使藥物經(jīng)細胞途徑的轉(zhuǎn)運量增加。

表1.dspe-peg聚合物改變細胞膜流動性促進吸收機制考察結(jié)果

注：與對照組比較，^*p﹤0.05，^**p﹤0.01

為了考察dspe-peg聚合物對緊密連接相關(guān)蛋白表達量的影響，本發(fā)明選擇occludin與zo-1作為研究對象，采用westernblot技術(shù)研究dspe-peg-oh和dspe-peg-sh對其在大鼠肺組織表達的影響。采用β-actin(內(nèi)參)、occludin及zo-1的抗體可分別識別出大鼠肺組織中相應(yīng)蛋白的表達，結(jié)果見圖9a，分別于43kda、59kda、220kda處出現(xiàn)條帶，計算機灰度掃描軟件分析灰度值，occludin與zo-1在肺組織的表達量見圖9b。由圖9b可以看出，occludin、zo-1在對照組(control,即上述經(jīng)肺吸收實驗中fd4組)大鼠肺組織中均有較高的表達，上述經(jīng)肺吸收實驗中dspe-peg-oh和dspe-peg-sh作用組occludin、zo-1蛋白表達量均下降，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組相比具有顯著性差異。以上研究結(jié)果表明dspe-peg-oh和dspe-peg-sh均能下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白occludin和zo-1的表達，從而打開上皮細胞間緊密連接，促進水溶性大分子藥物經(jīng)細胞旁路途徑的吸收。

經(jīng)上述實驗表明：dspe-peg聚合物作為吸收促進劑，能明顯促進水溶性大分子難吸收藥物口服和經(jīng)肺吸收；同時，毒性考察結(jié)果顯示dspe-peg聚合物對口服和肺部吸收部位黏膜無明顯損傷，由此可以推斷，dspe-peg聚合物是安全的吸收促進劑，可應(yīng)用于大分子藥物口服和經(jīng)肺吸收制劑中，用于改善水溶性大分子難吸收藥物，尤其是蛋白肽類藥物(如降鈣素)口服和經(jīng)肺吸收的生物利用度。

總之，上述dspe-peg聚合物不僅可以明顯提高大分子難吸收藥物生物利用度，而且對吸收部位黏膜毒性小，安全性高，是一種安全、高效的吸收促進劑。