本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載索拉菲尼/sirna的介孔二氧化硅-乳糖醛酸靶向納米顆粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近幾十年以來，全球環(huán)境的惡化導(dǎo)致癌癥的發(fā)病率越來越高，每年死于癌癥的人數(shù)高達(dá)880萬人。目前，化療依舊是治療癌癥的主要方法。然而，治療癌癥所用的化療藥物大都存在缺少靶向性、多耐藥性和生物利用率低的缺陷，這些缺陷在很大程度上限制了他們的臨床使用；因而新型給藥系統(tǒng)一直是醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

索拉菲尼是一種可以靶向多種生長因子受體的多重激酶抑制劑，包括vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3、pdgfr-b、c-kit、flt-3和ret等，其結(jié)構(gòu)式為：。索拉菲尼在2005年被fda批準(zhǔn)用以治療晚期腎癌，并且是迄今為止唯一一種被fda批準(zhǔn)的全身性治療的抗肝癌藥物。盡管索拉菲尼在臨床治療上展示出較強(qiáng)的療效，但是它的副作用和耐藥性在一定程度上限制了它的更進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。因此，開發(fā)一種可以降低毒副作用和耐藥性、提高靶向性的索拉菲尼制劑尤為重要。

rna干擾（rnainterference，rnai）是指雙鏈rna（double-strandedrna，dsrna）經(jīng)由特異性核酸內(nèi)切酶dicer加工成為一種21-25個(gè)核苷酸的小分子rna（sirna），sirna通過與靶mrna編碼區(qū)或utr區(qū)完全配對，降解靶mrna，引起基因轉(zhuǎn)錄后沉默。rnai技術(shù)具有簡單、快速、特異性沉默任意基因的特點(diǎn)，使其被廣泛用來研究腫瘤、肺動(dòng)脈高壓、先天性遺傳病等疾病的靶點(diǎn)治療，并取得了一定成果。但sirna在血清的環(huán)境下很容易被降解，以致其難以在細(xì)胞中發(fā)揮其rnai作用。此外，游離的sirna無法進(jìn)入細(xì)胞中，需要進(jìn)行化學(xué)修飾或者納米顆粒負(fù)載才能有效進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。但鑒于化學(xué)修飾的sirna可能會(huì)喪失活性，因此，設(shè)計(jì)合適的載體以提高sirna的治療效果受到了極大的關(guān)注。

介孔二氧化硅納米材料是一種新型的無機(jī)高分子藥物載體。它的主要特點(diǎn)是：（1）粒子具有極大的表面積及孔道容量，總比表面積>900m²/g，孔容量>0.9cm³/g，提供了較大的存儲(chǔ)和反應(yīng)空間；（2）粒徑可調(diào)節(jié)，易被腫瘤細(xì)胞吞噬，無明顯的細(xì)胞學(xué)毒性，體外生物相容性好；（3）孔徑在2nm～10nm間，大小可調(diào)節(jié)，可通過改變孔徑進(jìn)而調(diào)節(jié)載藥量；（4）具有內(nèi)表面和外表面，可進(jìn)行功能化修飾進(jìn)而制備性能優(yōu)良的雜化載體。這些特性使介孔二氧化硅納米粒子擁有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

乳糖醛酸（la）是乳糖氧化產(chǎn)生的活性生物分子，其結(jié)構(gòu)式為：。近年來的研究表明，乳糖醛酸能夠與在癌細(xì)胞表面上過渡表達(dá)的asgpr受體特異性結(jié)合，讓乳糖醛酸有了高效靶向癌細(xì)胞的的作用。因此，乳糖醛酸在抗癌藥的給藥系統(tǒng)研究中受到了極大的關(guān)注，已成為靶向癌細(xì)胞研究的新熱點(diǎn)。

2012年，hartonno,s.b.等（acsnano，6卷，2104頁，2012年）合成大孔徑（孔徑大于10nm）的氧化硅納米顆粒，并成功在顆粒外表面和孔道內(nèi)修飾正電性的高分子材料多聚左旋賴氨酸pll(poly-l-lysine)，并通過靜電作用吸附sirna實(shí)現(xiàn)sirna干擾，但是該納米藥物載體輸送sirna的效率比較低，且顆粒在低濃度時(shí)具備較大毒性，生物相容性不高。專利cn105056239a公布了一種介孔二氧化硅負(fù)載藥物和sirna的復(fù)合材料及其制備和在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，通過以負(fù)載藥物作用的介孔二氧化硅為核，表面通過二硫鍵連接sirna進(jìn)行介孔封堵，同時(shí)起到負(fù)載藥物sirna的作用。該納米材料進(jìn)入細(xì)胞后可以通過癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的谷胱甘肽響應(yīng)引起二硫鍵斷裂同時(shí)釋放出藥物和sirna，提高了sirna的穩(wěn)定性，生物相容性較好，但是其在進(jìn)入癌細(xì)胞前沒有很好的靶向作用，不能提高癌細(xì)胞對該納米材料的攝取。此外，專利cn104027821a提供了一種輸送sirna的納米顆粒，其在介孔二氧化硅的表面修飾了聚乙二醇和多肽分子，不僅提高了生物相容性，而且極大的提高了sirna的干擾作用。但是，與專利cn105056239a相似，由于靶向分子的缺乏，包載藥物的納米材料不能實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面的高度富集，不能得到最佳的療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有靶向抗癌作用的負(fù)載有索拉菲尼/sirna的介孔二氧化硅-乳糖醛酸載藥納米顆粒，其通過將sirna吸附到介孔二氧化硅外表面，以提高sirna穩(wěn)定性，并利用乳糖醛酸對癌細(xì)胞的靶向作用，提高索拉菲尼的抗腫瘤活性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種負(fù)載索拉菲尼/sirna的介孔二氧化硅-乳糖醛酸靶向納米顆粒，其制備方法包括以下步驟：

1）制備粒徑約為100nm的介孔二氧化硅納米顆粒（msn）；

2）將所得介孔二氧化硅納米顆粒溶于無水乙醇中，加入納米顆粒重量0.4%的3-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫?cái)嚢?2h后離心，經(jīng)乙醇洗滌、冷凍干燥，得到表面氨基修飾的介孔二氧化硅納米顆粒（msn-nh2）；

3）將所得msn-nh2溶解在丙酮中，室溫下攪拌1h后加入索拉菲尼，再攪拌30min，然后于13000rpm下離心30min，棄去上清液，所得沉淀用去離子水洗滌，冷凍干燥，即得負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅納米顆粒（so@msn）；其中，氨基化修飾后的介孔二氧化硅與索拉菲尼的重量比為3:2；

4）以n,n-二甲基甲酰胺為溶劑，加入so@msn、edc和nhs（三者重量比為3:10:4），室溫下攪拌4h后，按體積比4:1加入質(zhì)量濃度為2%的乳糖醛酸溶液，繼續(xù)攪拌12h，然后離心，經(jīng)去離子水洗滌后冷凍干燥，制得負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸納米顆粒（so@msn-la）；

5）將so@msn-la加入丙酮中，超聲分散10min，然后按質(zhì)量體積比1:3g/l在溶液中加入sirna，攪拌20min，即得所述靶向納米顆粒（so/sirna@msn-la）。

步驟4）中所述乳糖醛酸溶液是將40mg乳糖醛酸、100mg二氯乙烷和0.1molmes（ph=6）于室溫下攪拌24h制得。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明將索拉菲尼負(fù)載到介孔二氧化硅的內(nèi)孔道里，并通過共價(jià)鍵將乳糖醛酸偶聯(lián)到介孔二氧化硅外表面，最后通過靜電電荷作用將sirna吸附到介孔二氧化硅外表面。這一方面提高了sirna的穩(wěn)定性和載藥系統(tǒng)的生物相容性，讓其可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)充分發(fā)揮作用；另一方面，乳糖醛酸的高效靶向抗癌作用也可以提高索拉菲尼的抗腫瘤效果。因此，本發(fā)明所得靶向納米顆?？捎糜谥瞥赡[瘤治療的靶向藥物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明以介孔二氧化硅作為sirna的載體，可顯著增強(qiáng)sirna的穩(wěn)定性，提高了其沉默基因的效率；

2、本發(fā)明采用乳糖醛酸為靶向分子，能使索拉菲尼在癌細(xì)胞周圍富集，并能顯著提高細(xì)胞對藥物的攝取率，從而在提高索拉菲尼抗腫瘤效果的同時(shí)，降低了索拉菲尼對正常組織的毒副作用；

3、本發(fā)明所構(gòu)建的納米載藥系統(tǒng)也適用于除索拉菲尼外的其他毒副作用大或者難溶性的抗癌藥；

4、本發(fā)明所設(shè)計(jì)的載藥體系制備方法簡單、材料易得，有利于進(jìn)一步擴(kuò)大制備產(chǎn)量。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1所制備的介孔二氧化硅納米顆粒（msn）的tem圖。

圖2為實(shí)施例4所制備的負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸（so@msn-la）的粒徑分布圖。

圖3為介孔二氧化硅（msn）、表面氨基化修飾的介孔二氧化硅（msn-nh2）、活化的乳糖醛酸（la）和負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸（so@msn-la）的紅外吸收光譜圖。

圖4為介孔二氧化硅（msn）、表面氨基化修飾的介孔二氧化硅（msn-nh2）和負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸（so@msn-la）的zeta電勢圖。

圖5為不同載藥體系中索拉菲尼的累積釋放率隨時(shí)間的變化曲線。

圖6為實(shí)施例7中mtt實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖7為實(shí)施例8中細(xì)胞凋亡分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖8為實(shí)施例9中細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖9為實(shí)施例10中細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中a為在熒光場下的效果圖，b為細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)施例1介孔二氧化硅納米顆粒的合成

在反應(yīng)瓶中加入2g十六烷基三乙基溴化銨、0.1g三乙醇胺和20ml去離子水，95℃下反應(yīng)1h；然后在20-30min內(nèi)逐滴加入原硅酸四乙酯1.5ml，加畢后于95℃下繼續(xù)反應(yīng)1h；反應(yīng)完后于室溫下12000rpm離心15min，得到介孔二氧化硅納米材料粗品，用去離子水和無水乙醇分別洗滌兩次，將所得固體懸浮在酸性乙醇中（濃鹽酸：無水乙醇=5:1，v:v），回流24h以除去未反應(yīng)的十六烷基三乙基溴化銨，離心，用去離子水洗滌，-50℃冷凍干燥，得到介孔二氧化硅納米顆粒純品。

圖1為所制備介孔二氧化硅納米顆粒的tem圖。從圖中可見，其粒徑約為100nm。

實(shí)施例2表面氨基化修飾的介孔二氧化硅納米顆粒（msn-nh2）的制備

取100mg實(shí)施例1中制得的介孔二氧化硅納米顆粒溶解于20ml無水乙醇，加入400μg3-氨丙基三乙氧基硅烷，室溫?cái)嚢?2h，離心，用乙醇多次洗滌以除去未反應(yīng)的3-氨丙基三乙氧基硅烷，冷凍干燥得到表面氨基修飾的介孔二氧化硅納米顆粒（msn-nh2）。

實(shí)施例3負(fù)載索拉菲尼介孔二氧化硅納米顆粒（so@msn）的制備

取30mg實(shí)施例2中制得的msn-nh2溶解在30ml丙酮中，室溫下攪拌1h后加入索拉菲尼20mg，再攪拌30min，然后于13000rpm下離心30min，棄去上清液，所得沉淀用去離子水洗滌，冷凍干燥，即得負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅納米顆粒（so@msn）。

實(shí)施例4負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸納米顆粒（so@msn-la）的制備

首先將la活化，即在反應(yīng)瓶中加入40mg乳糖醛酸、100mg二氯乙烷和0.1mol一水嗎啉乙磺酸（mes，ph=6），室溫下攪拌24h，即得活化的la。

取30mg實(shí)施例3中制得的so@msn、20mln,n-二甲基甲酰胺、100mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）和40mgn-羥基琥珀酰亞胺（nhs）于圓底燒瓶中，室溫下攪拌4h，然后在混合液中加入2%的la溶液5ml，再攪拌12h，離心，用去離子水洗滌后冷凍干燥，即得負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸納米顆粒（so@msn-la）。

圖2為所得so@msn-la的粒徑分布圖。由圖2可見，其平均粒徑約為150nm。

圖3為介孔二氧化硅（msn）、表面氨基化修飾的介孔二氧化硅（msn-nh2）、活化的乳糖醛酸（la）和負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸（so@msn-la）的紅外吸收光譜圖。

圖4為介孔二氧化硅（msn）、表面氨基化修飾的介孔二氧化硅（msn-nh2）和負(fù)載索拉菲尼的介孔二氧化硅-乳糖醛酸（so@msn-la）的zeta電勢圖。從圖4可見，msn的平均zeta電勢約為-19mv，msn-nh2的平均zeta電勢約為+27mv，即msn氨基化后電勢由負(fù)值變?yōu)檎?，表明已成功制備了msn-nh2；而so@msn-la的zeta電勢為+17mv。

實(shí)施例5負(fù)載索拉菲尼/sirna的介孔二氧化硅-乳糖醛酸納米顆粒（so/sirna@msn-la）的制備

稱取20mg實(shí)施例4中制得的so@msn-la溶于20ml丙酮中，超聲分散10min，然后從中取6μl與2μg的sirna攪拌20min，即得負(fù)載索拉菲尼與sirna的介孔二氧化硅-乳糖醛酸納米顆粒（so/sirna@msn-la）。

實(shí)施例6索拉菲尼體外釋放度的測定

取索拉菲尼、實(shí)施例3制備的so@msn和實(shí)施例4制備的so@msn-la各2mg，分別懸浮在2mlph=7.4的pbs緩沖液中，37℃下恒溫震蕩進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。在不同時(shí)間取500μl樣液，13000rpm下離心10min后，采用紫外分光光度計(jì)在210nm下檢測上清液中的索拉菲尼濃度，繪制累積釋放百分比與時(shí)間的關(guān)系圖，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，so@msn與so@msn-la的索拉菲尼釋放率沒有顯著的差異，說明采用乳糖醛酸為靶向分子不會(huì)阻礙索拉菲尼的釋放。

實(shí)施例7mtt實(shí)驗(yàn)

首先，分別培養(yǎng)huh7細(xì)胞和hepg2細(xì)胞，待其處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好時(shí)，用胰蛋白酶消化后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵個(gè)/ml，配成細(xì)胞懸液；按每孔100μl接種到96孔板，周圍用pbs封板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞活性達(dá)到80%時(shí)加入用培養(yǎng)液孵育的不同濃度梯度的msn-la、so@msn、so@msn-la、so/sirna@msn-la及so，培養(yǎng)24h；去除培養(yǎng)液，加入100μl用無血清無酚紅培養(yǎng)基稀釋后的mtt溶液，37℃培養(yǎng)4h；取出96孔板，吸出mtt溶液后加入100μldmso，并在搖床上緩慢搖晃10min，搖勻后多功能酶標(biāo)儀于570nm處檢測od值，使用graphpadprism5計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可見，msn-la對huh7細(xì)胞和hepg2細(xì)胞幾乎沒有抑制作用，而so、so@msn、so@msn-la及so/sirna@msn-la對huh7細(xì)胞和hepg2細(xì)胞的抑制率依次提高，且隨劑量的增加抑制效果更為明顯。其中，so@msn-la對huh7細(xì)胞和hepg2細(xì)胞的細(xì)胞抑制效果（處理后細(xì)胞活性分別為12%和18%）明顯優(yōu)于so@msn（處理后細(xì)胞活性分別為28%和30%），這說明通過在其上偶聯(lián)乳糖醛酸分子可提高索拉菲尼的抗腫瘤效果；此外，so/sirna@msn-la的抑制效果（處理后細(xì)胞活性為4%和7%）較so@msn-la的顯著，這說明，與so單獨(dú)用藥相比，so與sirna共負(fù)載到納米粒上可以起到協(xié)同增效的治療效果。

實(shí)施例8細(xì)胞凋亡分析

細(xì)胞凋亡分析由流式細(xì)胞法測定。將hepg2細(xì)胞接種分別施加到加入有實(shí)施例2中制備的msn-nh2（對照）、索拉菲尼、實(shí)施例3制備的so@msn、實(shí)施例4制備的so@msn-la、實(shí)施例5制備的so/sirna@msn-la的6孔板培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵個(gè)/孔板，在37℃下培養(yǎng)24h，然后1500rpm下離心5分鐘得到細(xì)胞，用pbs洗滌三次，將細(xì)胞懸浮在500μl1×結(jié)合緩沖液中，用annexin-vfitc與pi體積比為1:1的10μl混合液在黑暗中著色10min，最后得到的樣品用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果如圖7所示。

由圖7結(jié)果表明，無論是早期凋亡還是晚期凋亡，so/sirna@msn-la的促進(jìn)作用都要比so@msn-la、so@msn以及單獨(dú)施加索拉菲尼強(qiáng)的多，說明so/sirna@msn-la可以顯著提高索拉菲尼和sirna的抗癌效果，即起到協(xié)同抗腫瘤的療效。

實(shí)施例9細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將2mgfitc和20μlaptms加到2ml乙醇中，并在室溫下避光攪拌12h，使fitc先與aptes共價(jià)偶聯(lián)；將200mgmsn及msn-la分別溶解在50ml乙醇中并超聲30min，再與3mlfitc/aptes乙醇溶液混合，避光攪拌24h，將混合物離心并用純乙醇洗滌純化，即得到fitc@msn和fitc@msn-la納米顆粒。hepg2細(xì)胞接種在含dmem培養(yǎng)液400μl的24孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/孔板，37℃下培養(yǎng)24h。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長后，棄去培養(yǎng)液，培養(yǎng)盤用pbs洗滌三次，然后，在細(xì)胞中分別加入100μg/mlfitc@msn、fitc@msn-la和fitc@msn-la+la，37℃下培養(yǎng)2h?？装逯械募?xì)胞用pbs洗滌三次后用hoechst33342將細(xì)胞核染色，最后樣品用共聚焦顯微鏡觀測，結(jié)果如圖8所示。

從圖8可以看到，fitc@msn-la的熒光強(qiáng)度最大，說明細(xì)胞對它的攝取率最高。而fitc@msn-la+la的熒光強(qiáng)度要稍低于fitc@msn-la，說明la能夠與fitc@msn-la競爭癌細(xì)胞上的受體，進(jìn)一步證明了la的靶向抗癌作用。

實(shí)施例10體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將2μgsirna分別加入6μlmsn和6μlmsn-la中，室溫下緩慢攪拌20min，即可得到sirna@msn和sirna@msn-la。將hepg2細(xì)胞接種到24孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/孔板，培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中分別加入sirna及事先制好的sirna@msn和sirna@msn-la，轉(zhuǎn)染48h。轉(zhuǎn)染完畢后，細(xì)胞用olympusix71熒光顯微鏡觀測結(jié)果并計(jì)算轉(zhuǎn)染率，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可見，游離sirna的轉(zhuǎn)染率僅為4.5%，低于sirna@msn（23%），說明以納米顆粒為載體能夠提高sirna的穩(wěn)定性，增強(qiáng)轉(zhuǎn)染率；而sirna@msn-la的轉(zhuǎn)染率高達(dá)45%，表明了偶聯(lián)la可起到靶向抗癌作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。