本發(fā)明涉及醫(yī)藥保健品領域；具體涉及中藥醇提物在抑制淀粉樣蛋白成纖維中的應用。

背景技術：

生物體中通常只有正確折疊并具有精確空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才能正常行使其生命功能，如輔助分子跨膜運輸、參與細胞的生長與分化等；然而活體細胞中只有部分蛋白質(zhì)能夠正確的自發(fā)折疊，多數(shù)蛋白質(zhì)的有效折疊和轉(zhuǎn)運過程必須有分子伴侶、輔助伴侶等復雜調(diào)控因子的參與，以避免初期天然多肽鏈或蛋白質(zhì)在環(huán)境因素影響下發(fā)生錯誤折疊而聚集沉積。

淀粉樣蛋白是指由于其構(gòu)象改變而喪失正常的功能、結(jié)構(gòu)，導致在細胞內(nèi)外形成聚集，并最終在特定組織中形成淀粉樣纖維沉積物的一類蛋白質(zhì)。與蛋白正常構(gòu)象改變而導致錯誤折疊有關的疾病被稱為淀粉樣蛋白相關疾病，因此該類疾病又被稱為“蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病”。人體對蛋白聚集體的清除能力通常會因為疾病和衰老而降低，這就導致了錯誤折疊、錯誤組裝的蛋白會隨生理條件的惡化而增加，最終誘發(fā)淀粉樣蛋白相關疾病的發(fā)生。

迄今發(fā)現(xiàn)的淀粉樣疾病多達50多種，其中包括神經(jīng)退行性疾病(如帕金森綜合征、阿爾茲海默癥、瘋牛病等)及各類全身性蛋白質(zhì)沉積疾病(如二型糖尿病等)。人類基因組序列數(shù)據(jù)顯示，與淀粉樣疾病相關的變異外顯子大約包含有60000個核苷酸序列，這導致了更多的淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。調(diào)查顯示近年來淀粉樣蛋白疾病的發(fā)病率日趨增加還與人壽命延長有關，隨著年齡的增加機體內(nèi)各種酶及分子伴侶數(shù)目降低、活性減弱，這些因素都導致本應具有正常結(jié)構(gòu)的功能蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生錯誤折疊從而在胞內(nèi)外沉積。面對這一現(xiàn)狀必須積極尋求有效治療手段，以求達到預防減緩甚至逆轉(zhuǎn)這些疾病的目的，這其中針對多種淀粉樣疾病致病機制的一個共同的防范切入點就是防止蛋白質(zhì)聚集。

然而，目前針對淀粉樣疾病的主流療法是化學藥物治療，這類方法不可避免的存在耐藥性及機體耐受度的問題。面對這一進退維谷的窘境，純天然的本草類藥物重新進入人們的視野。我國以天然動植物、礦物入藥的歷史悠久，而且具有豐富的中草藥資源，《中國藥典》中收錄中草藥共計有12807種。當今中醫(yī)藥在治療人類疾病特別是心腦血管疾病、疑難病癥和癌癥等方面，發(fā)揮著重要作用，而提倡自然療法，返樸歸真在現(xiàn)今的歐美己越來越成為一種趨勢。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是對中藥治療淀粉樣蛋白疾病的應用范疇進行探討，以期為淀粉樣蛋白疾病的預防和治療尋找到新的治療藥物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：中藥醇提物在制備治療和預防淀粉樣蛋白疾病的藥物中的應用。

優(yōu)選的，中藥醇提物在制備抑制淀粉樣蛋白成纖維的藥物中的應用。

上述的應用，所述的淀粉樣蛋白是溶菌酶。

上述的應用，所述的中藥醇提物是山茱萸醇提物或三七醇提物。

上述的應用，所述的山茱萸醇提物的制備方法是：稱取山茱萸粉末，以75％乙醇浸泡溶解后，75-85℃回流兩次，每次1-2小時；收集濾液，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無乙醇味，烘干。

上述的應用，所述的三七醇提物的制備方法是：稱取三七粉末，以75％乙醇浸泡溶解后，75-85℃回流兩次，每次1-2小時；收集濾液，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無乙醇味，烘干。

上述的應用，所述的三七醇提物的制備方法是：稱取三七粉末，以75％乙醇浸泡溶解后，于45-55℃、120轉(zhuǎn)/分，進行溫浴與震蕩，過夜浸取，抽濾，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無乙醇味，烘干。

山茱萸又被稱為藥棗、棗皮、芋肉、雞足、肉棗、石棗、蜀棗，是山茱萸科落葉小喬木或者灌木山茱萸的成熟果肉。栽培范圍分布廣泛，尤其以河南南陽更為集中。中國現(xiàn)存最早的本草專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：山茱萸“主心下邪氣寒熱，溫中逐寒濕痹，去三蟲”。性溫而味酸。歸肝、腎經(jīng)?？裳a益肝腎，有澀精固脫之功效。對于肝腎虧虛導致的崩漏帶下、腰膝酸軟、遺精遺尿、體虛大汗等癥有很好的治療作用。《醫(yī)學衷中參西錄》中記載：“山茱萸收斂元氣，固澀滑脫，振作精神，收澀之中兼具條暢之性，故又通利九竅，流通血脈，治療肝虛自汗，內(nèi)風萌動，與其他酸斂之藥不同，收斂正氣而不斂泄氣”?！断墒诶韨m(xù)斷秘方》有“加味四物湯”，以白芍、當歸等搭配山茱萸來實現(xiàn)養(yǎng)肝血，補腎固精的目的。山茱萸中的有效成分有萜類、鞣質(zhì)、有機酸、黃酮、揮發(fā)性物質(zhì)等多種，近現(xiàn)代醫(yī)學中多用于抗炎、抗氧化、神經(jīng)及心血管保護、糖尿病防治等方面；現(xiàn)有技術中主要作為一種傳統(tǒng)抗衰老的名貴中藥，其在老年病防治方面的潛力有待于進一步挖掘。

三七又名田七、金不換、參三七、血參等，是五加科人參屬的植物，在我國主要分布在西南地區(qū)。三七的藥用歷史已有600多年，且全株各部分均可入藥，歷代典籍多有記載，如《醫(yī)門秘旨》、《跌損妙方》和《本草綱目》中詳細記載，三七可消腫止痛、止血化瘀、散熱，同時還在抗疲勞，抗休克，改善微循環(huán)，治療心絞痛、冠心病、動脈硬化、中風等多方面發(fā)揮作用。近代研究表明三七總皂苷是其主要活性成分。作為我國傳統(tǒng)的名貴藥材，三七生物學特性方面的研究也已十分詳實。

溶菌酶是通過交聯(lián)β折疊片機制成纖維的典型代表。如由人溶菌酶蛋白突變而導致的遺傳性非神經(jīng)性系統(tǒng)性淀粉樣疾病是一種典型的淀粉樣疾病，由于溶菌酶在機體中存在范圍廣泛，因而更有研究意義。同時雞溶菌酶與人溶菌酶相比具有高度相似性，序列方面的相似度可達70％，高級結(jié)構(gòu)也十分相似。雞溶菌酶又同時具有出色的溶劑溶解性，方便經(jīng)濟的特點，因此是人溶菌酶的優(yōu)良替代模型。溶菌酶的成纖維過程伴隨著β折疊片的增多，最終導致結(jié)合的硫黃素t被440nm波長的激發(fā)光所激發(fā)，在480nm左右產(chǎn)生發(fā)射光，并伴有很大程度上的熒光增強。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明，探究了中藥山茱萸和三七的乙醇提物對淀粉樣蛋白(如溶菌酶)成纖維的影響。結(jié)果顯示三七、山茱萸醇提物作用組的熒光強度與正常組相比均呈現(xiàn)明顯下降，表明它們都能通過顯著延長成核期而起到抑制蛋白成纖維的作用。山茱萸醇提物的最佳抑制濃度約為1mg/ml；三七醇提物表現(xiàn)出濃度依賴性，其ic50值約為0.63mg/ml。另外不同提取方法的結(jié)果表明過夜浸取法制備的三七醇提物抑制活性高于乙醇回流提取法，即過夜浸取更有利于維持藥物活性。

附圖說明

圖1是山茱萸醇提物各濃度對溶菌酶成纖維的作用效果圖。

圖2是培養(yǎng)7天時，山茱萸醇提物各濃度對溶菌酶成纖維的作用效果圖。

圖3是山茱萸醇提物與楊梅素對溶菌酶成纖維的作用效果比較圖。

圖4是單獨山茱萸醇提物的tht熒光檢測圖。

圖5是以過夜浸取法制備的三七醇提物對溶菌酶成纖維的作用效果圖。

圖6是以乙醇回流法制備的三七醇提物對溶菌酶成纖維的作用效果圖。

圖7是培養(yǎng)10天時，三七醇提物各濃度對溶菌酶成纖維的作用效果圖。

圖8是不同制備方式的三七醇提物與楊梅素對溶菌酶成纖維的作用效果比較圖。

圖9是單獨三七醇提物的tht熒光檢測圖。

具體實施方式

實施例1山茱萸醇提物抑制溶菌酶成纖維的研究

(一)山茱萸醇提物

用乙醇回流法提?。悍Q取5g山茱萸粉末，以75％乙醇150ml浸泡溶解；80℃回流兩次，每次1.5小時；抽濾，濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至無乙醇味；50℃烘干，所得山茱萸醇提物收集入ep管，封口；-20℃貯存。

(二)溶液配制

1、雞溶菌酶以50mm、ph2.0的甘氨酸-鹽酸溶成終濃度為1mg/ml(現(xiàn)用現(xiàn)溶)；

2、山茱萸醇提物以二甲基亞砜(dnso)溶成濃度為50mg/ml的母液，放入-20℃冰箱存儲待用；

3、對照品楊梅素以二甲基亞砜(dnso)溶成終濃度為16mg/ml的母液，放入-20℃冰箱存儲待用；

4、硫磺素t(thioflavinet，tht)以50mm、ph7.0的磷酸緩沖液溶成濃度為1mm，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

(三)溶菌酶成纖維培養(yǎng)

向2ml凍存管中加入500ul配制好的雞溶菌酶；實驗組加入相同體積的雞溶菌酶，然后按0.5、1、1.5mg/ml的濃度梯度加入不同體積的山茱萸醇提物溶液；陽性對照組使楊梅素的工作濃度為0.32mg/ml；以封口膜密封；65℃，140轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)。每組樣品做三個平行樣，雞溶菌酶培養(yǎng)時間梯度為0-7天，山茱萸醇提物組為1、4、5、7天。

(四)樣品tht熒光檢測

取吹打均勻后的各天培養(yǎng)樣品300ul加入30ultht儲液充分混勻，以ph7.0的磷酸緩沖液稀釋至3ml充分混勻后進行檢測。波長設置是以440nm激發(fā)，在600-450nm波長范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜，記錄480nm波長左右的峰值強度。tht檢測值用graphpadprism5進行統(tǒng)計分析，先做散點圖，后以公式y(tǒng)＝bottom+(top-bottom)/(1+10^(x-logic50))進行擬合。作圖時山茱萸簡稱為szy，楊梅素以英文myricetin做代指。

如圖1所示，在培養(yǎng)的第7天，單獨溶菌酶培養(yǎng)組熒光強度為285.40a.u.；在0.5mg/mlszy的作用下熒光強度降為72.52a.u.，在1mg/mlszy的作用下熒光強度降為31.57a.u.，在1.5mg/mlszy的作用下熒光強度降為48.06a.u.。

表明山茱萸各濃度醇提物對雞溶菌酶成纖維都表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。

如圖2所示，培養(yǎng)7天時，熒光強度最低為31.57a.u.對應山茱萸濃度為1mg/ml，即提取物抑制效果的最佳濃度為1mg/ml。

如圖3所示，通過山茱萸最佳抑制濃度與對照品楊梅素的抑制能力相比較，發(fā)現(xiàn)山茱萸組的熒光強度低于單獨溶菌酶組但一直大于楊梅素組，且第7天時山茱萸組熒光強度為31.57a.u同樣大于楊梅素對照組的7.83a.u。

表明山茱萸醇提物能較好的抑制雞溶菌酶成纖維，但效果較楊梅素稍差。

如圖4所示，單獨山茱萸醇提物的熒光強度值一直在7a.u.左右，表明不會對實驗的tht檢測造成顯著干擾。

實施例2三七醇提物抑制溶菌酶成纖維的研究

(一)三七醇提物的制備

1.用浸取法提?。悍Q取5g三七粉末，以75％乙醇150ml浸泡溶解；并按照50℃、120轉(zhuǎn)/分進行溫浴與震蕩，過夜浸取；抽濾；濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至無乙醇味；50℃烘干，所得三七醇提物收集入ep管，封口；-20℃貯存。

2.用乙醇回流提?。悍Q取5g三七粉末，以75％乙醇150ml浸泡溶解；80℃回流兩次，每次1.5小時；抽濾；濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至無乙醇味；50℃烘干，所得三七醇提物收集入ep管，封口；-20℃貯存。

(二)溶液配制

1、雞溶菌酶以50mm、ph2.0的甘氨酸-鹽酸溶成終濃度為1mg/ml(現(xiàn)用現(xiàn)溶)；

2、三七醇提物以二甲基亞砜(dnso)溶成濃度為50mg/ml的母液，放入-20℃冰箱存儲待用；

3、對照品楊梅素以二甲基亞砜(dnso)溶成終濃度為16mg/ml的母液，放入-20℃冰箱存儲待用；

4、硫磺素t(thioflavinet，tht)以50mm、ph7.0的磷酸緩沖液溶成濃度為1mm，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

(三)溶菌酶成纖維培養(yǎng)

向2ml凍存管中加入500ul配制好的雞溶菌酶；實驗組分為b組(過夜浸取法提取)和c組(乙醇回流法提取)兩組，各加入相同體積的雞溶菌酶，然后按0.1、0.25、0.5、1mg/ml的濃度梯度加入不同體積的三七醇提物；陽性對照組使楊梅素的工作濃度為0.32mg/ml；以封口膜密封；65℃，140轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)。每組樣品做三個平行樣，雞溶菌酶培養(yǎng)時間為0-10天，三七醇提物培養(yǎng)時間為2、4、6、8、10天。

(四)樣品tht熒光檢測

取吹打均勻的各天培養(yǎng)樣品300ul加入30ultht儲液充分混勻，以ph7.0的磷酸緩沖液稀釋至3ml充分混勻后進行檢測。波長設置是以440nm激發(fā)，在600-450nm波長范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜，記錄480nm波長左右的峰值強度。tht檢測值用graphpadprism5進行統(tǒng)計分析，先做散點圖，后以公式y(tǒng)＝bottom+(top-bottom)/(1+10^(x-logic50))進行擬合。作圖時三七簡稱為sq，楊梅素以英文myricetin做代指。

如圖5過夜浸取法制備的三七醇提物對溶菌酶成纖維作用效果圖所示，三七醇提物對雞溶菌酶成纖維表現(xiàn)出了抑制作用，且有明顯的濃度依賴。在培養(yǎng)7天后，單獨溶菌酶培養(yǎng)組熒光強度擬合均值約為272.08a.u.；隨藥物濃度上升加藥實驗組的熒光強度下降，且雞溶菌酶的纖維成核期也被相應延長。特別是當三七醇提物濃度達到1mg/ml時，溶菌酶的β折疊片形成速率直到第8天才開始顯著上升，說明溶菌酶纖維化過程中起重要作用的成核階段被顯著延遲，同時孵育10天的溶菌酶的tht值被降低至80.53a.u.。

如圖6所示，以乙醇回流法制備的三七醇提物低濃度時效果不穩(wěn)定，成核期的數(shù)值略高于單獨溶菌酶組，時間也略提前；高濃度則能明顯延長成核期，降低最終熒光值?？赡芤驗橐掖蓟亓鳒囟冗^高，導致部分有效成分失活。低濃度時藥物有效濃度較低，無機鹽離子等發(fā)揮主要作用；隨濃度升高藥物有效成分的影響逐漸占主導地位。但同樣與過夜浸取法結(jié)果(圖5)相似，當三七醇提物濃度達到1mg/ml時，溶菌酶的β折疊片形成速率到第6天開始顯著上升，說明同樣是成核階段被顯著延遲；同時孵育10天的溶菌酶的tht值由單獨溶菌酶的310a.u.降至100a.u.顯著降低。

如圖7所示，培養(yǎng)10天時，三七醇提物各濃度隨濃度提高抑制效果增強，有明顯的濃度依賴性。ic50約為630ug/ml。

如圖8所示，不同提取方法的比較。結(jié)果顯示b組(過夜浸取法，86a.u.)作用效果強于c組(乙醇回流提取,100.5a.u.)；同時抑制效果弱于對照組100um(0.32mg/ml)楊梅素(36.29a.u.)。

如圖9所示，單獨三七醇提物的熒光強度值一直在8a.u.左右，表明不會對實驗組的tht檢測造成顯著干擾。