本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種凌霄花總黃酮作為唯一活性成分在制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時長期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。糖尿病致病原因很多，其中由鏈脲佐菌素所引起的糖尿病稱為鏈脲佐菌素致糖尿病，對人的身體健康危害很大。
凌霄花是紫葳科、凌霄屬攀援藤本植物，拉丁學(xué)名：(campsisgrandiflora)，具有行血去瘀、涼血祛風(fēng)的功效，用于經(jīng)閉，產(chǎn)后乳腫，風(fēng)疹發(fā)紅，皮膚瘙癢，痤瘡。但至今未見有從凌霄花中提取凌霄花總黃酮用于制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物的公開報導(dǎo)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種凌霄花總黃酮作為唯一活性成分在制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物中的應(yīng)用，可有效解決治療鏈脲佐菌素致糖尿病的用藥問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種凌霄花總黃酮作為唯一活性成分在制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物中的應(yīng)用，所述的凌霄花總黃酮是，將凌霄花粉碎成粗粉，用乙醚回流提取，脫脂，棄去乙醚；凌霄花藥渣揮干乙醚，用80％乙醇回流提取，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散成分散液，上ab-8型大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水液；繼用10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得凌霄花總黃酮。
本發(fā)明可有效解決從凌霄花中提取凌霄花總黃酮，并有效用于治療反復(fù)腦缺血，開拓了凌霄花的新用途和藥用價值，是藥物上的一大創(chuàng)新，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
具體實施方式
以下結(jié)合具體情況為本發(fā)明的具體實施方式作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實施中，一種凌霄花總黃酮作為唯一活性成分在制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物中的應(yīng)用，所述的凌霄花總黃酮是，將凌霄花粉碎成過20-30目篩的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脫脂，棄去乙醚；凌霄花藥渣揮干乙醚，加凌霄花10倍重量的、質(zhì)量濃度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加凌霄花10倍重量的、質(zhì)量濃度80％乙醇，回流提取1h，過濾，得第二次濾液，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散至相當(dāng)于含生藥0.3g/ml的分散液，分散液上ab-8型大孔吸附樹脂，先用2倍柱體積蒸餾水洗脫，棄去水液；繼用4倍柱體積的、質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用6倍柱體積的、質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得凌霄花總黃酮，凌霄花總黃酮質(zhì)量含量60％以上。
本發(fā)明所制備的凌霄花總黃酮作為唯一活性成分有效用于制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病的藥物，是治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物上的創(chuàng)新，并經(jīng)實驗取得了非常好的有益技術(shù)效果，有關(guān)實驗資料如下：
1實驗材料
1.1實驗試劑
本發(fā)明凌霄花總黃酮；鹽酸二甲雙胍片：上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號48141111；stz：sigma公司生產(chǎn)，批號20150625；葡萄糖體外診斷試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號153391；gsp體外測定試劑盒，由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20151117；胰島素體外測定試劑盒，r&d公司生產(chǎn)，批號20151101a；胰島素抗體體外測定試劑盒，r&d公司生產(chǎn)，批號20151101a；no體外測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20151112；nos體外測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20151113；膽固醇體外測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號201151116；甘油三酯體外測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20151117；sod體外測定試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號20151112。
1.2實驗儀器
紫外可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司，型號uv1000；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號h1850r；酶標(biāo)儀，biotek(美國)公司，型號cyt3mfvdg。
1.3實驗動物
wistar大鼠，雄性，體重180～220g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，合格證號：37005400000044，許可證號：scxk(魯)2013—0001；實驗室許可證號syxk(豫)2015-0005，倫理編號：dwll15010021。
2試驗方法
2.1造模與給藥
取106只大鼠，正常飲食飲水一周，稱量體重后平均選擇12只為空白組，待造模大鼠以stz50mg/kg(溶于檸檬酸緩沖溶液)劑量舌下靜脈注射，用毛細(xì)管眼眶靜脈從取血，測定7天后的血糖，選取造模大鼠血糖值處于16.7mmol/l至21mmol/l之間，并具有糖尿病癥狀的60只。隨機(jī)分為模型組、大、中、小劑量凌霄花總黃酮、二甲雙胍組共5組，每組12只。模型組和空白組灌胃給藥同體積的生理鹽水(0.1ml/10g)，鹽酸二甲雙胍片組(0.23g/kg相當(dāng)于臨床用量的10倍)，大、中、小劑量凌霄花總黃酮組(0.2、0.1、0.05g/kg)，連續(xù)給藥31天，測給藥的第10、20、30天時血糖值。第31天，給藥后2h，取血，分離血清，測血清中胰島素、胰島素抗體、gsp、膽固醇、甘油三酯、sod、no含量、nos活力。取血后處死大鼠，取胰腺、腎臟、肝做病理切片，觀察其病理改變。做大鼠胰臟、腎臟、胸腺、脾臟、肝臟病理切片，觀察病理組織變化。
3統(tǒng)計學(xué)處理方法
數(shù)據(jù)分析用spss17.0醫(yī)用統(tǒng)計包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
4實驗結(jié)果
4.1對stz致糖尿病模型大鼠動態(tài)血糖、gsp、胰島素及胰島素抗體的影響，見表1。
表1凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血糖的影響(
與模型組比**p<0.01，與空白組比△△p<0.01
由上表可以看出，與空白組比，第10、20、30天，模型組血糖值升高(p<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病大鼠模型成功，且沒有自愈現(xiàn)象。相比于模型組，第20、30天，二甲雙胍組、大、中、小劑量凌霄花總黃酮組糖尿病模型大鼠血糖值降低(p<0.01)。
4.2對stz致糖尿病模型大鼠胰島素、胰島素抗體、gsp的影響，見表2
表2凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清胰島素、胰島素抗體、gsp水平的影響(
與模型組比**p<0.01，*p<0.01；與空白組比△△p<0.01
由上表可知，與空白組比，模型組血清胰島素水平降低(p<0.01)，血清高胰島素抗體水平和gsp含量升高(p<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病大鼠模型成功，且沒有自愈現(xiàn)象。相比于模型組，二甲雙胍組可升高血清胰島素水平(p<0.01)，降低血清胰島素抗體水平和gsp含量(p<0.01)；大、中、小劑量凌霄花總黃酮組可升高血清胰島素水平(p<0.01，p<0.05)，可降低血清胰島素抗體水平(p<0.01)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
4.3對stz致糖尿病模型大鼠no、nos及sod的影響，見表3
表3凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清no、nos及sod水平的影響(
與模型組比*p<0.05，與模型組比**p<0.01；與空白組比△△p<0.01
由上表可知，與空白組比，模型組no、nos升高(p<0.01)，sod的含量降低(p<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病大鼠模型成功，且沒有自愈現(xiàn)象。相比于模型組，二甲雙胍組和大、中、小劑量凌霄花總黃酮組均可降低模型大鼠血清中no和nos水平(p<0.01，p<0.05)，可顯著升高sod水平(p<0.01)。
4.4對stz致糖尿病模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯的影響，見表4
表4凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯水平的影響(
與模型組比*p<0.05，與模型組比**p<0.01；與空白組比△△p<0.01
由上表可知，與空白組比，模型組大鼠血清膽固醇及甘油三酯含量升高(p<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病大鼠模型血脂升高，且沒有自愈現(xiàn)象。相比于模型組，二甲雙胍組可降低模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯含量(p<0.01)，大、中、小劑量凌霄花總黃酮組均可降低模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯含量(p<0.01，p<0.05)，說明凌霄花總黃酮可以降血脂。
4.5對stz致糖尿病模型大鼠胰腺組織的影響
表5凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠胰腺組織形態(tài)的影響
“-”胰腺中的胰島數(shù)≥5，胰島β細(xì)胞核分布松散，胞漿均勻豐富；“+”胰腺中的胰島數(shù)＞4，少數(shù)胰島β細(xì)胞的胞漿萎縮、核密集；“++”胰腺中2＜胰島數(shù)＜3，一定數(shù)目的胰島β細(xì)胞胞漿萎縮、核密集；“+++”胰腺中胰島在＜2個，大量胰島β細(xì)胞胞漿消失，幾乎全部胰島β細(xì)胞核密集
不同給藥組大鼠胰腺病理觀察結(jié)果如下：空白組大鼠胰島細(xì)胞核松散分布，胞漿豐滿；模型組大鼠胰島細(xì)胞核分布極度密集，胞漿極度萎縮；二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞核輕度密集，胞漿輕度萎縮；大劑量凌霄花總黃酮組大鼠胰島細(xì)胞核輕度密集，胞漿較萎縮；中劑量凌霄花總黃酮組大鼠胰島細(xì)胞核中度密集，胞漿萎縮；小劑量凌霄花總黃酮組大鼠胰島細(xì)胞核中度密集，細(xì)胞胞漿萎縮。
經(jīng)radit檢驗，相比于空白組，模型組胰島細(xì)胞數(shù)目減少甚至消失，胞漿明顯萎縮，胰島細(xì)胞退化，表明模型組組胰島受到嚴(yán)重受損。相比于模型組，二甲雙胍組、凌霄花總黃酮各劑量組，恢復(fù)胰島細(xì)胞胞漿，對抗胰島素的萎縮(p<0.01)；凌霄花總黃酮大劑量組見、中劑量組胰島細(xì)胞胞漿較豐富，部分細(xì)胞核密集(p<0.01)；凌霄花總黃酮小劑量組部分胰島細(xì)胞核較密集，胰島胞漿少(p<0.01)。
4.6對stz致糖尿病模型大鼠腎臟組織的影響，見表6
表6凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠腎臟組織形態(tài)的影響
“-”腎小球、腎小囊、腎小管正常；“+”腎小球稍有增生，腎小囊腔稍有變窄，腎小管輕度水腫；“++”腎小球細(xì)胞增生，腎小囊腔變窄，腎小管上皮細(xì)胞水腫且管腔變窄；“+++”腎小球細(xì)胞出現(xiàn)明顯增生，腎小囊腔明顯變窄或消失，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫，管腔變窄或完全消失。
不同給藥組大鼠腎臟病理觀察結(jié)果如下：空白組大鼠腎小球、腎小囊、腎小管基本正常；模型組大鼠腎小球細(xì)胞增生，小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，腎小囊變窄；二甲雙胍組大鼠腎小球細(xì)胞輕度增生，腎小囊腔輕度變窄，小管上皮細(xì)胞輕度水腫；大劑量凌霄花總黃酮大鼠腎小球細(xì)胞稍有增生，腎小囊腔略微變窄，小管上皮細(xì)胞略有水腫；中劑量凌霄花總黃酮組大鼠腎小球細(xì)胞少量增生，腎小囊腔部分變窄，小管上皮細(xì)胞部分水腫；小劑量凌霄花總黃酮大鼠腎小球細(xì)胞增生，腎小囊腔變窄或消失，小管上皮細(xì)胞水腫。
經(jīng)radit檢驗，空白組腎小球，相比于空白組，模型組腎小球增生，小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫且管腔變窄(p<0.01)。相比于模型組，二甲雙胍組、大、中、小劑量凌霄花總黃酮組均具有改善模型大鼠腎的病理損傷功能(p<0.01)。
4.7對stz致糖尿病模型大鼠肝臟組織的影響，見表7
表7凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠肝組織形態(tài)的影響
“-”肝細(xì)胞、肝竇均正常；“+”肝細(xì)胞和肝竇比較正常，部分出現(xiàn)充血；“++”肝細(xì)胞水腫、肝竇變窄，部分有充血；“+++”肝細(xì)胞明顯水腫，肝竇部分消失，大部分充血
經(jīng)radit檢驗，空白組的肝細(xì)胞竇清晰，肝細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀排列。模型組的肝竇極度變窄且水腫(p<0.01)，肝細(xì)胞排列不規(guī)律雜亂。相比于模型組，二甲雙胍組肝細(xì)胞排列稍微凌亂呈放射狀，肝竇可見(p<0.01)，凌霄花總黃酮大劑量組、中劑量組肝細(xì)胞排列呈稍微凌亂放射狀，小劑量組肝細(xì)胞排列紊亂(p<0.01)。
4.8對stz致糖尿病模型大鼠脾臟組織的影響，見表8
表8凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠脾臟組織形態(tài)的影響(
與模型組比，**p<0.01；與空白組比，△△p<0.01
不同給藥組大鼠脾臟病理觀察結(jié)果如下：空白組大鼠脾臟紅髓與白髓界限清晰，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞密集，脾竇正常；模型組大鼠脾臟紅髓與白髓界限模糊，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞稀疏，脾竇充血；二甲雙胍組大鼠脾臟紅髓與白髓界限清晰，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞較密集，脾竇正常；大劑量凌霄花總黃酮組大鼠脾臟紅、白髓邊界清晰，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞密集，脾竇稍有充血；中劑量凌霄花總黃酮組大鼠脾臟紅、白髓邊界較清晰，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞較密集，脾竇稍有充血；小劑量凌霄花總黃酮組大鼠脾臟紅髓與白髓界限較清晰，脾小結(jié)和淋巴細(xì)胞較密集，脾竇部分充血。
由表8可知，可見空白組脾小結(jié)的體積較大、淋巴細(xì)胞較為密集，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，與空白組比模型組脾小結(jié)的數(shù)目減少且體積減小，皮質(zhì)顯著變薄(p<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組、凌霄花總黃酮大、中、小劑量組劑量組能顯著增大脾小結(jié)的體積(p<0.01)，和淋巴細(xì)胞個數(shù)。
4.9對stz致糖尿病模型大鼠胸腺組織的影響，見表9
表9凌霄花總黃酮對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠胸腺組織形態(tài)的影響(
模型組比較**p﹤0.05；與空白組比較△△p﹤0.01
不同給藥組大鼠胸腺病理觀察結(jié)果如下：空白組大鼠胸腺皮質(zhì)厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，淋巴細(xì)胞密集；模型組大鼠胸腺皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)和髓質(zhì)界限模糊，淋巴細(xì)胞稀疏；二甲雙胍組大鼠胸腺皮質(zhì)厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較清晰，淋巴細(xì)胞密集；大劑量凌霄花總黃酮組大鼠胸腺皮質(zhì)厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較清晰，淋巴細(xì)胞密集；中劑量凌霄花總黃酮組大鼠胸腺皮質(zhì)較厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較清晰，淋巴細(xì)胞較密集；小劑量凌霄花總黃酮組大鼠胸腺皮質(zhì)較厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界部分模糊，淋巴細(xì)胞較密集。
由表9可以看出：空白組胸腺正常(p<0.01)，模型組胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)界限混亂。相比于模型組，二甲雙胍組、大、中、小劑量凌霄花總黃酮組的模型大鼠胸腺的皮質(zhì)厚度和淋巴細(xì)胞數(shù)增加(p<0.01，p<0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
5結(jié)論
凌霄花總黃酮對因造模導(dǎo)致的大鼠血糖值、gsp、甘油三酯、膽固醇含量、胰島素水平、no水平和nos活力均升高，胰島素抗體水平和sod活力降低現(xiàn)象有很好的改善作用。不僅能減少模型血脂，還能模型的清除自由基的能力，促使糖尿病模型動物的胰腺、腎臟、肝臟恢復(fù)，提高機(jī)體免疫力。
6臨床實驗資料
在動物試驗確保安全的基礎(chǔ)上，在臨床上進(jìn)行了對比試驗，對比組采用飲食干預(yù)，試驗組采用飲食干預(yù)加凌霄花總黃酮，有關(guān)試驗情況如下：
選擇未經(jīng)藥物治療的輕型糖尿病患者60例，隨機(jī)分為2組，每組30人：一組采取飲食干預(yù)，計算每日所需總熱量按照成人糖尿病熱量供給標(biāo)準(zhǔn)表，計算每日應(yīng)攝入熱能標(biāo)準(zhǔn)為理想體重(公斤)×千卡/公斤體重。按不同體型、勞動強(qiáng)度計算每日所需的熱能。體型按消瘦、正常和肥胖劃分，勞動強(qiáng)度分為臥床休息、輕度、中度和重度。其中，體型為消瘦時，不同勞動強(qiáng)度所需的熱量依次為25～30、35、40、45～50千卡/公斤/天；體型為正常時，不同勞動強(qiáng)度所需的熱量依次為20～25、30、35、40千卡/公斤/天；體型為肥胖時，不同勞動強(qiáng)度所需的熱量依次為15～20、20～25、30、35千卡/公斤/天。另一組為在飲食干預(yù)基礎(chǔ)上加用凌霄花總黃酮(制成膠囊，每粒0.3g，每次2粒，每天2次)。
4周后檢測結(jié)果：控制飲食組開始時空腹靜脈血糖為7.88±1.22mmoi/l，一個月后平均降低0.87mmoi/l；控制飲食加用凌霄花總黃酮組開始時空腹靜脈血糖為7.86±1.14mmoi/l，一個月后平均降低1.65mmoi/l。控制飲食加用凌霄花總黃酮組療效明顯優(yōu)于控制飲食組。
從上述實驗中可以清楚的看出，本發(fā)明從凌霄花中提取的凌霄花總黃酮作為唯一活性成分有效用于制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病的藥物，實現(xiàn)凌霄花總黃酮在制備治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物中的應(yīng)用，其制備方法簡單，易操作，開拓了凌霄花新的藥用價值和商業(yè)價值，是治療鏈脲佐菌素致糖尿病藥物上的創(chuàng)新，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著。