本發(fā)明屬于材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性微/納米纖維膜的方法。

背景技術(shù)：

數(shù)十年來(lái)，骨組織工程的發(fā)展已使世界各地?cái)?shù)百萬(wàn)患有骨缺損和骨創(chuàng)傷的的患者免受病魔的摧殘。骨組織工程支架的研究也因此獲得了大量的關(guān)注。理想的骨組織工程支架應(yīng)滿(mǎn)足兩個(gè)基本要求。首先，支架應(yīng)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠抵抗外力，并保持其物理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而保證穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)和組織發(fā)育。此外，適宜的表面性質(zhì)和優(yōu)異的生物相容性對(duì)于其促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附，增殖和分化至關(guān)重要。

微/納米纖維膜作為一種具有特殊三維結(jié)構(gòu)的微/納米材料，在藥物緩釋、吸附過(guò)濾、等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，此外，由于其具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的三維立體結(jié)構(gòu)，能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)并提供細(xì)胞生長(zhǎng)與粘附的支架，因此它也是一種重要的組織工程材料。大多微/納米纖維的機(jī)械強(qiáng)度弱，表面光滑，不利于細(xì)胞的穩(wěn)定生長(zhǎng)，因此在應(yīng)用于組織工程前，需要對(duì)其進(jìn)行必要的改性。殼聚糖作為唯一帶正電荷的天然堿性多糖，具有優(yōu)異的生物相容性和抗菌活性，可在引入抗菌性能的同時(shí)保證材料的生物相容性不被破壞。層狀硅酸鹽可增強(qiáng)材料的機(jī)械強(qiáng)度，可調(diào)控微/納米纖維膜表面的粗糙度，同時(shí)可促進(jìn)殼聚糖的抑菌性能，這兩種材料是理想的可用于微/納米纖維膜改性的材料。

中國(guó)專(zhuān)利“一種排列有序的改性微/納米纖維膜及其制備和應(yīng)用”(公開(kāi)號(hào)cn106283399a)公開(kāi)了一種排列有序的改性微/納米纖維膜及其制備方法和應(yīng)用前景。具體方法為：將膠原蛋白、絲素蛋白、聚己內(nèi)酯以一定的比例共混，制成紡絲液，并進(jìn)行靜電紡絲，干燥，交聯(lián)等步驟。通過(guò)共混和改變靜電紡的收集器來(lái)制備有序微/納米纖維，并達(dá)到改性目的。該專(zhuān)利中的改性雖然是在微/納米纖維膜上進(jìn)行，但其是通過(guò)共混和改變收集器來(lái)進(jìn)行改性。在組織工程領(lǐng)域，由于涉及細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)，材料的表面特性對(duì)于其性能有著重要的影響，共混的改性手段不僅會(huì)改變材料的表面，更會(huì)改變材料的主體，使材料主體的結(jié)構(gòu)和性能帶來(lái)未知的變化。而層層自組裝的改性方法僅是在微/納米纖維的表面進(jìn)行修飾，不改變?cè)撐?納米纖維的原有組分。

層層自組裝技術(shù)作為一種多功能有潛力的改性技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單，成本低，適用性強(qiáng)，對(duì)基底的大小及形狀無(wú)要求等優(yōu)點(diǎn)，可完成對(duì)基底微/納米尺度上的可控改性，且改性材料的選擇十分廣泛。在層層自組裝的過(guò)程中，具有相反電荷的聚電解質(zhì)逐步、交替地吸附，該過(guò)程操作簡(jiǎn)便且不會(huì)產(chǎn)生其他副產(chǎn)物。此外，與在平板上的進(jìn)行的層層自組裝工藝相比，在微/納米纖維膜上進(jìn)行層層自組裝改性的研究較為少見(jiàn)，它包含兩個(gè)層面的改性：(1)在每根微/納米纖維的表面進(jìn)行改性；(2)在微/納米纖維膜的宏觀(guān)表面進(jìn)行改性。在層層自組裝過(guò)程之后，將得到微/納米纖維膜多層級(jí)結(jié)構(gòu)的多層次修飾。

基于上述考慮，選擇微/納米纖維作為底板，殼聚糖作為正電層組分和層狀硅酸鹽作為負(fù)電層組分，采用層層自組裝的方法對(duì)微/納米纖維膜進(jìn)行改性，獲得了擁有更強(qiáng)機(jī)械性能，抑菌性能和良好生物相容性的微/納米纖維膜，在組織工程領(lǐng)域有非常廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種采用殼聚糖和層狀硅酸鹽對(duì)微/納米纖維膜進(jìn)行層層自組裝改性的方法。該方法可以對(duì)微/納米纖維膜進(jìn)行改性，提高其物理和生物性能，制備出更適用于骨組織工程的微/納米纖維膜。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性微/納米纖維膜的方法，以帶電荷的微/納米纖維膜作為基板，當(dāng)基板所帶電荷為正時(shí)，依次在基板上組裝層狀硅酸鹽和殼聚糖，直至達(dá)到所需雙層數(shù)；當(dāng)基板所帶電荷為負(fù)時(shí)，依次在基板上組裝殼聚糖和層狀硅酸鹽，直至達(dá)到所需雙層數(shù)，將組裝后的微/納米纖維膜干燥，得到改性的微/納米纖維膜。

優(yōu)選地，所述基板的zeta電位絕對(duì)值不小于10mv。

優(yōu)選地，所述的所需雙層數(shù)為1-50層。

優(yōu)選地，所述的帶電荷的微/納米纖維膜基板是由絲素蛋白、膠原蛋白、醋酸纖維素、殼聚糖及其衍生物、聚左旋乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的一種或幾種制備得到的。

優(yōu)選地，所述的微/納米纖維膜基板由靜電紡絲法、濕法紡絲法、干法紡絲法、離心紡絲法、相分離法或者復(fù)合紡絲法中的任一種制備得到。

優(yōu)選地，所述的殼聚糖按照下述方法組裝：配置殼聚糖醋酸溶液，將基板浸泡于帶正電荷的殼聚糖醋酸溶液中，一定時(shí)間后，將膜取出，用清洗液清洗去除膜表面未組裝成功的殼聚糖。

優(yōu)選地，所述的層狀硅酸鹽按照下述方法組裝：配置層狀硅酸鹽懸浮液，將基板浸泡于帶負(fù)電荷的層狀硅酸鹽懸浮液中，一定時(shí)間后，將膜取出，用清洗液清洗去除膜表面未組裝成功的層狀硅酸鹽。

優(yōu)選地，所述的殼聚糖醋酸溶液濃度為0.1-10mg/ml。

優(yōu)選地，所述的層狀硅酸鹽為蒙脫土或累托石。

優(yōu)選地，所述的層狀硅酸鹽組裝懸浮液濃度為0.1-10mg/ml。

優(yōu)選地，所述的清洗液為去離子水或0.01-1mol/l的氯化鈉溶液。

優(yōu)選地，所述的浸泡組裝時(shí)間為10-60分鐘。

優(yōu)選地，所述的干燥方法為自然干燥、真空冷凍干燥或于真空干燥箱中烘干，所述干燥為完全干燥。

一種用層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性的微/納米纖維膜，通過(guò)上述的方法制備得到。

本發(fā)明以微/納米纖維膜作為組裝基底，通過(guò)靜電力作用，交替在其多級(jí)結(jié)構(gòu)表面組裝殼聚糖和層狀硅酸鹽。殼聚糖的引入使納米纖維膜具有了抑菌特性且保持了其良好的生物相容性。而層狀硅酸鹽單獨(dú)作為帶負(fù)電荷的組裝材料被引入到復(fù)合納米纖維膜中，大大增強(qiáng)了纖維膜的機(jī)械性能和表面特性。本發(fā)明具有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，對(duì)底板材料的尺寸和形狀沒(méi)有任何限制，改性過(guò)程不引入其他雜質(zhì)和不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物等。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1制備的絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜的形貌圖。圖中左側(cè)是絲素蛋白納米纖維膜表面掃描電鏡圖，右側(cè)是雙層數(shù)為15.5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜表面掃描電鏡圖。

圖2是實(shí)施例1制備的絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜的纖維直徑分布圖。a是絲素蛋白納米纖維膜的纖維直徑分布圖，b是雙層數(shù)為15.5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜的纖維直徑分布圖。

圖3是實(shí)施例1制備的絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜的接觸角隨時(shí)間變化曲線(xiàn)。a是絲素蛋白納米纖維膜的接觸角隨時(shí)間變化曲線(xiàn)，b是雙層數(shù)為15.5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜的接觸角隨時(shí)間變化曲線(xiàn)。

圖4是實(shí)施例1制備的絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率對(duì)比圖。圖中，a表示絲素蛋白納米纖維膜，b表示雙層數(shù)為5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜，c表示雙層數(shù)為10的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜，d表示雙層數(shù)為15的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜表面掃描電鏡圖，e表示雙層數(shù)為15.5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜。

圖5是成骨細(xì)胞在實(shí)施例1中制備的絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜表面培養(yǎng)72h后生長(zhǎng)情況的掃描電鏡圖。a表示絲素蛋白納米纖維膜，b表示雙層數(shù)為15.5的層狀硅酸鹽/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，其目的在于幫助更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，但這些具體實(shí)施方案不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1，制備帶電荷的微/納米纖維膜

以絲素蛋白為例：

將絲素蛋白溶解于六氟異丙醇溶劑中，磁力攪拌24h，得到7wt％的絲素蛋白紡絲液。然后通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備絲素蛋白納米纖維膜，靜電紡絲相關(guān)參數(shù)為：電壓為16kv，紡絲液推進(jìn)速度為1ml/h，紡絲針與接收器之間距離為12cm，相對(duì)溫度和相對(duì)濕度分別為25℃和40％。隨后將所得的電紡絲素蛋白納米纖維膜在55℃下真空干燥，使得殘留溶劑充分揮發(fā)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際情況還可以選用膠原蛋白、醋酸纖維素、殼聚糖及其衍生物、殼寡糖、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、甲基丙烯酸酯化聚乙烯亞胺、聚丙烯腈、聚氨酯、聚異丁烯中的一種或幾種作為微/納米纖維膜的原材料，并根據(jù)選用的原材料選用適當(dāng)?shù)娜軇┖椭苽浞椒ㄟM(jìn)行制備。

可選用的溶劑包括六氟異丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙酸、四氫呋喃、苯、甲苯、苯乙醚、氯苯、n,n二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、甲酸乙酯、乙酸乙酯、醋酸、磷酸、甲醇、甲酸、戊醇、水中的一種或多種作為溶劑，配置濃度為3-30wt％的紡絲液。

可選用的制備方法包括靜電紡絲法、濕法紡絲法、干法紡絲法、離心紡絲法、相分離法以及復(fù)合紡絲法。

需要指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本領(lǐng)域公知常識(shí)對(duì)于這些原料、溶劑、制備方法的選擇，并不影響本發(fā)明對(duì)微/納米纖維膜的改性方法和最終得到的產(chǎn)品，采用本發(fā)明所述的方法對(duì)這些原料、溶劑和制備方法得到的微/納米纖維膜進(jìn)行改性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

此外，當(dāng)選用的微/納米纖維膜本身不帶電荷或所帶電荷較少(zeta電位絕對(duì)值小于10mv)，可通過(guò)溶膠-凝膠技術(shù)、液相沉積、氣相沉積、濕化學(xué)法、等離子體處理、接枝共聚、原位聚合使其表面電荷增強(qiáng)。

以聚己內(nèi)酯為例：

將聚己內(nèi)酯溶解于六氟異丙醇中，磁力攪拌24h，得到10wt％的聚己內(nèi)酯紡絲液。然后通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備得到聚己內(nèi)酯納米纖維膜，靜電紡絲相關(guān)參數(shù)為：電壓為15kv，紡絲液推進(jìn)速度為2ml/h，紡絲針與接收器之間距離為10cm，相對(duì)溫度和相對(duì)濕度分別為25℃和40％。隨后將所得的電紡聚已內(nèi)酯納米纖維膜在55℃下真空干燥，使得殘留溶劑充分揮發(fā)。隨后采用濕化學(xué)法，將聚己內(nèi)酯于50％的乙醇溶液中浸泡2小時(shí)，再將其置于1.0mg/ml的聚乙烯胺的0.15mol/l的氯化鈉溶液中，10分鐘后取出，用去離子水沖洗三次，即得到帶正電荷的聚己內(nèi)酯納米纖維膜。

以醋酸纖維素為例：

將丙酮和n，n-二甲基乙酰胺以2:1(w/w)的比例混合，并將醋酸纖維素溶于該混合溶液中，得到16wt％的醋酸纖維素紡絲液。然后通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備得到醋酸纖維素納米纖維膜，靜電紡絲相關(guān)參數(shù)為：電壓為16kv，紡絲液推進(jìn)速度為1ml/h，紡絲針與接收器之間距離為15cm，相對(duì)溫度和相對(duì)濕度分別為25℃和45％。隨后將所得的電紡聚已內(nèi)酯納米纖維膜在55℃下真空干燥，使得殘留溶劑充分揮發(fā)。隨后將所得醋酸纖維素納米纖維膜浸泡于0.05mol/l氫氧化鈉溶液中7天，取出后用去離子水漂洗，得到帶負(fù)電荷的纖維素納米纖維膜。

以絲素蛋白為例：

將磷酸與甲酸以不同的比例進(jìn)行混合，將絲素蛋白溶解在該混合溶液中，對(duì)該混合溶液進(jìn)行過(guò)濾和消泡處理，得到濃度為15％的絲素蛋白紡絲液；以甲酸為凝固液，采用濕法紡絲技術(shù)制備微/納米纖維膜。濕法紡絲相關(guān)參數(shù)為：紡絲液推進(jìn)速度為30ml/h，相對(duì)溫度和相對(duì)濕度分別為25℃和40％。隨后將所得的濕法紡絲素蛋白微/納米纖維膜在甲醇中浸泡24h，使其完全固化和結(jié)晶，并除去殘留甲酸。然后再將絲素蛋白微/納米纖維浸入60℃蒸餾水中15分鐘，隨后進(jìn)行5倍牽伸。最后進(jìn)行張力干燥，防止干燥過(guò)程中收縮。

2，對(duì)得到的微/納米纖維膜進(jìn)行層層自組裝改性

實(shí)施例1

(1)得到zeta電位小于-10mv的絲素蛋白微/納米纖維膜；

(2)將殼聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力攪拌3-5h至溶液澄清透明，使殼聚糖充分溶解，配制得到濃度為1mg/ml的殼聚糖溶液。將絲素蛋白微/納米纖維膜浸泡于所得的殼聚糖溶液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的殼聚糖；

(3)累托石加入到去離子水中，采用超聲儀進(jìn)行分散，制備得到濃度為1mg/ml的累托石懸浮液，將組裝了殼聚糖的絲素蛋白納米纖維膜浸入到所得的累托石懸浮液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的累托石，至此組裝成功了一個(gè)雙層；

(4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)若干次，將所得微/納米纖維膜干燥，分別得到雙層數(shù)為5、10、15、15.5的復(fù)合微/納米纖維膜。

所得絲素蛋白納米纖維膜和改性納米纖維膜的形貌見(jiàn)圖1，圖1左側(cè)是絲素蛋白納米纖維膜表面掃描電鏡圖，圖1右側(cè)是雙層數(shù)為15.5的累托石/殼聚糖層層自組裝改性納米纖維膜表面掃描電鏡圖。可以看出，改性過(guò)后的納米纖維的微觀(guān)形貌發(fā)生了明顯的改變，表面變粗糙。而且，改性后纖維平均直徑為594±112nm增加為886±143nm(圖2)。同時(shí)，改性后的納米纖維膜機(jī)械性能增強(qiáng)至5.64mpa(圖4)，水接觸角降低至60.3°(圖3)，且水接觸角在與膜接觸后6.4s內(nèi)將為0，親水性增加。與改性前絲素蛋白納米纖維膜相比，改性后的納米纖維膜生物相容性增加，更適宜成骨細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)和遷移(圖5)。

實(shí)施例2

(1)得到zeta電位大于+10mv的聚己內(nèi)酯微/納米纖維膜；

(2)蒙脫土加入到去離子水中，采用超聲儀進(jìn)行分散，制備得到濃度為1mg/ml的蒙脫土懸浮液，將帶正電荷的聚己內(nèi)酯納米纖維膜浸入到所得的蒙脫土懸浮液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的蒙脫土；

(3)將殼聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力攪拌3-5h至溶液澄清透明，使殼聚糖充分溶解，配制得到濃度為1mg/ml的殼聚糖溶液。將組裝了累托石的聚己內(nèi)酯納米纖維膜浸泡于所得的殼聚糖溶液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的殼聚糖，至此組裝成功了一個(gè)雙層；

(4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)若干次，將所得微/納米纖維膜干燥，即可獲得雙層數(shù)為所需層數(shù)的復(fù)合納米纖維膜。

實(shí)施例3

(1)得到zeta電位小于-10mv的醋酸纖維素微/納米纖維膜；

(2)將殼聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力攪拌3-5h至溶液澄清透明，使殼聚糖充分溶解，配制得到濃度為10mg/ml的殼聚糖溶液。將纖維素納米纖維膜浸泡于所得的殼聚糖溶液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的殼聚糖；

(3)累托石加入到去離子水中，采用超聲儀進(jìn)行分散，制備得到濃度為10mg/ml的累托石懸浮液，將組裝了殼聚糖的纖維素納米纖維膜浸入到所得的累托石懸浮液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的累托石，至此組裝成功了一個(gè)雙層；

(4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)若干次，將所得微/納米纖維膜干燥，即可獲得雙層數(shù)為所需層數(shù)的復(fù)合納米纖維膜。

實(shí)施例4

(1)得到zeta電位小于-10mv的絲素蛋白微/納米纖維膜；

(2)將殼聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力攪拌3-5h至溶液澄清透明，使殼聚糖充分溶解，配制得到濃度為1mg/ml的殼聚糖溶液。將絲素蛋白微/納米纖維膜浸泡于所得的殼聚糖溶液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的殼聚糖；

(3)蒙脫土加入到去離子水中，采用超聲儀進(jìn)行分散，制備得到濃度為1mg/ml的蒙脫土懸浮液，將組裝了殼聚糖的絲素蛋白納米纖維膜浸入到所得的蒙脫土懸浮液中，使膜與溶液充分接觸，20分鐘后將膜取出，采用去離子水清洗三次去除膜表面未組裝成功的蒙脫土，至此組裝成功了一個(gè)雙層；

(4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)若干次，將所得微/納米纖維膜干燥，即可獲得雙層數(shù)為所需層數(shù)的復(fù)合納米纖維膜。