本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，具體地，涉及一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的藥物。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)引起的一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病。該病以引起母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)疾病為特征。prrsv為有囊膜的單股正鏈rna病毒,屬套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，根據(jù)遺傳特性和抗原性不同，分為基因i型和基因ii型，該病毒具有高度變異特性，其在田間的持續(xù)演化和變異導(dǎo)致許多重組毒株和變異毒株的產(chǎn)生，從而增加prrs防控的復(fù)雜性和艱巨性。目前防控prrs的主要方法是接種疫苗，但疫苗的安全性和有效性存在諸多問(wèn)題，不能滿足疫病防控的需求，所以開(kāi)發(fā)有效的抗病毒藥物是一種新的思路。

25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)是一種膽固醇的羥化物，由膽固醇25羥化酶催化膽固醇產(chǎn)生。25hc具有多種生物學(xué)功能，能調(diào)節(jié)脂類代謝，誘導(dǎo)b細(xì)胞遷移，抑制免疫球蛋白a(immunoglobulina，iga)的產(chǎn)生并且調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

隨著prrsv分子生物學(xué)研究的深入,目前還沒(méi)有針對(duì)prrsv復(fù)制周期中不同階段設(shè)計(jì)出有效抗病毒藥物的報(bào)道。而對(duì)該藥物在體內(nèi)的抗病毒效應(yīng)及不良反應(yīng)等還需進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物。

本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)節(jié)脂類代謝、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)功能的生物分子25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)具有抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的作用。

因此本發(fā)明提供一種治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物，含有25hc。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的藥物，該藥物中含有25-羥基膽固醇。

更進(jìn)一步地，藥物還含有藥學(xué)上可接受的輔料。

上述藥物與醫(yī)學(xué)上可接受的載體或賦形劑制成的藥物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述制劑為片劑、膠囊劑、粉針劑、噴霧劑或顆粒劑。

本發(fā)明提供一種含有25-羥基膽固醇的預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的組合物。

本發(fā)明提供了25-羥基膽固醇或含有其的組合物在制備抑制prrsv復(fù)制的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述的prrsv為jxwn06，hb-1/3.9，vr-2332(mlv)，chsx1401和gz11-g1。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，濃度5μm時(shí)，25hc能使prrsv毒株(hb-1/3.9，chsx1401和gz11-g1)的病毒滴度降低到1/100或1/1000，在濃度10μm時(shí)，25hc能使prrsv毒株(hb-1/3.9，chsx1401和gz11-g1)的病毒滴度降低到1/10000；對(duì)于vr-2332(mlv)毒株，在濃度5μm時(shí)，25hc能使病毒滴度降低到1/10，在濃度10μm時(shí)，25hc能使病毒滴度降低到1/1000；對(duì)于jxwn06毒株，在濃度1.25μm時(shí)，25hc能使病毒滴度降低到1/10，在濃度10μm時(shí)，25hc能使病毒滴度降低到1/100000，且隨25hc濃度從1.25μm到10μm的升高病毒滴度呈現(xiàn)劑量依賴的降低。

本發(fā)明提供了25-羥基膽固醇或含有其的組合物在制備抑制prrsv在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了25-羥基膽固醇或含有其的組合物在制備抑制prrsv吸附宿主細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了25-羥基膽固醇或含有其的組合物在制備抑制prrsv進(jìn)入宿主細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。

上述的制藥應(yīng)用中，所述的25-羥基膽固醇對(duì)prrs病毒粒子無(wú)滅活作用。

上述的制藥應(yīng)用中，所述25-羥基膽固醇不抑制prrs病毒基因組的合成。

上述的制藥應(yīng)用中，所述25-羥基膽固醇不抑制prrs病毒粒子的釋放。

本發(fā)明通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、病毒滴度測(cè)定、細(xì)胞活性試驗(yàn)、病毒吸附試驗(yàn)，病毒進(jìn)入試驗(yàn)、病毒釋放試驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr發(fā)現(xiàn)25-羥基膽固醇能夠通過(guò)抑制prrsv吸附和進(jìn)入細(xì)胞，而抑制該病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)25-羥基膽固醇對(duì)病毒粒子無(wú)直接滅活作用，不抑制prrsv基因組的合成和病毒粒子的釋放。本發(fā)明為豬繁殖與呼吸綜合征的預(yù)防和治療提供了新的藥物，具有較好的市場(chǎng)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1a-圖1e為預(yù)處理細(xì)胞后，25hc顯著抑制prrsv復(fù)制的效果圖。圖1a：檢測(cè)25hc的細(xì)胞毒性；圖1b：間接免疫熒光檢測(cè)，25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞后顯著減少prrsv感染的細(xì)胞數(shù)；圖1c：病毒滴度測(cè)定，25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞后顯著抑制prrsv復(fù)制；圖1d：25hc預(yù)處理pams后顯著抑制prrsv復(fù)制；圖1e：預(yù)處理細(xì)胞后，25hc顯著抑制不同基因型prrsv的復(fù)制。

圖2a-圖2c為先感染病毒，再用25hc處理，25hc顯著抑制prrsv復(fù)制圖。圖2a：25hc對(duì)prrsv無(wú)滅活作用。圖2b和圖2c：先感染病毒，再用25hc處理，25hc顯著抑制prrsv復(fù)制。病毒分別感染marc-145細(xì)胞(圖2b)和pams(圖2c)后，用25hc處理，25hc在病毒感染早期顯著抑制prrsv復(fù)制。

圖3a-圖3d為25hc能抑制prrsv的吸附和進(jìn)入的效果圖。圖3a和圖3b：25hc抑制prrsv的吸附。在marc-145細(xì)胞(圖3a)和pams(圖3b)中，25hc均能抑制prrsv的吸附。圖3c和圖3d：25hc抑制prrsv的進(jìn)入。在marc-145細(xì)胞(圖3c)和pams(圖3d)中，25hc均能抑制prrsv的進(jìn)入。

圖4a-圖4c為25hc不抑制prrsv基因組的合成和病毒粒子的釋放效果圖。圖4a和圖4b：25hc不抑制prrsv基因組的合成。在marc-145細(xì)胞(圖4a)和pams(圖4b)中，25hc不抑制prrsv基因組的合成。圖4c顯示25hc不影響prrsv的釋放。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

本發(fā)明實(shí)施例中使用的marc-145細(xì)胞、豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcinepulmonaryalveolarmacrophages，pams)由申請(qǐng)人保存。prrsv毒株jxwn06(highlypathogenic(hp)-prrsv)，hb-1/3.9(low-pathogenicprrsv)，源于vr-2332(type2prrsv)的商品化減毒活疫苗毒株(modified-livevirus，mlv)購(gòu)自boehringeringelheimvetmedica中國(guó)分公司，chsx1401(nadc30-likeprrsv)和gz11-g1(type1prrsv)由實(shí)驗(yàn)室保存。25hc(貨號(hào)h1015-10mg)購(gòu)自sigma-aldrich公司(st.louis,mo,usa)。fluoresceinisothiocyanate(fitc)-conjugated羊抗鼠igg(h+l)(貨號(hào)115-095-003)購(gòu)自jacksonimmunoresearchlaboratories公司(westgrove，pa，usa)。rpmi-1640和dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)購(gòu)自thermofisherscientific公司(waltham，ma，usa)，胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)購(gòu)自hyclone公司(southlogan，ut，usa)。cck-8試劑盒(cellcountingkit-8)(貨號(hào)c0037)購(gòu)自碧云天公司(上海，中國(guó))。鼠抗prrsvn蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)制備。trizol(貨號(hào)206101)購(gòu)自magen公司(北京，中國(guó))。sybrselectmastermix(貨號(hào)4472897)購(gòu)自thermofisherscientific公司。fastquantrtkit(withgdnase)(貨號(hào)kr106-02)購(gòu)自天根公司(北京，中國(guó))。無(wú)水乙醇(ethanol)(貨號(hào)64-17-5)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海，中國(guó))。

本發(fā)明實(shí)施例中，無(wú)水乙醇(ethanol)是25hc的溶劑，作為溶劑對(duì)照。對(duì)照的設(shè)置(乙醇用量、處理時(shí)間等)與實(shí)驗(yàn)組25hc的設(shè)置相同。

實(shí)施例125hc對(duì)prrsv的抑制實(shí)驗(yàn)

1、方法

1.1間接免疫熒光試驗(yàn)

用預(yù)冷的無(wú)水乙醇在室溫固定感染prrsv后的marc-145細(xì)胞30分鐘(30minutes，30min)，鼠源prrsvn蛋白單克隆抗體(1:1000稀釋)作為一抗，37℃作用2小時(shí)(2hours，2h)，然后pbs洗3次，fitc-conjugated羊抗鼠igg(h+l)(1:200稀釋)作為二抗，37℃作用1h后用pbs洗3次，最后用熒光顯微鏡(nikon，japan)觀察。

1.2病毒滴度測(cè)定

將marc-145細(xì)胞鋪于96孔板中，48h后感染prrsv，感染后48h(48hourspost-infection，48hpi)收集細(xì)胞，應(yīng)用微量滴定法并結(jié)合間接免疫熒光試驗(yàn)測(cè)定病毒效價(jià)，結(jié)果以tcid50/ml(50％tissuecultureinfectivedoseperml)表示。

1.3細(xì)胞活性試驗(yàn)

應(yīng)用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。將marc-145細(xì)胞鋪于96孔板中(5×10³個(gè)細(xì)胞每孔)，培養(yǎng)12h后加入25hc，作用48h，然后加入cck-8溶液(10μl每孔)，37℃作用1h，最后測(cè)定450nm的吸光值。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的試劑盒原理是以細(xì)胞在450nm處的吸光值來(lái)判斷細(xì)胞活性，本試驗(yàn)是通過(guò)與溶劑對(duì)照ethanol比較而確定25hc是否對(duì)細(xì)胞活性有影響，故需比較25hc和ethanol吸光值的差異。

1.4病毒吸附試驗(yàn)

將marc-145細(xì)胞和pams鋪于24孔板中，37℃培養(yǎng)48h(marc-145細(xì)胞)和12h(pams)后轉(zhuǎn)入4℃環(huán)境，放置1h，然后4℃條件下用25hc(10μm)和prrsv的混合液接種細(xì)胞2h，使病毒吸附到細(xì)胞表面而不進(jìn)入，病毒感染細(xì)胞后用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，然后加入新鮮培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48h后檢測(cè)病毒滴度。

1.5病毒進(jìn)入實(shí)驗(yàn)

將marc-145細(xì)胞和pams鋪于24孔板中，37℃培養(yǎng)48h(marc-145細(xì)胞)和12h(pams)后轉(zhuǎn)入4℃環(huán)境，放置1h，然后4℃條件下將prrsv接種細(xì)胞，感作2h，使病毒吸附到細(xì)胞表面而不進(jìn)入，病毒感染后用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，然后加入含有25hc(10μm)的新鮮培養(yǎng)液，37℃孵育3h，棄上清，用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48h后檢測(cè)病毒滴度。

1.6病毒釋放試驗(yàn)

將marc-145細(xì)胞鋪于24孔板中，37℃培養(yǎng)48h后接種prrsv(moi＝0.01)，24hpi棄上清，然后加入含有25hc(10μm)的5％dmem，在換液后的15，30，45和60min分別收集上清和細(xì)胞并檢測(cè)病毒滴度。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr

應(yīng)用trizol法提取感染prrsv的細(xì)胞(marc-145細(xì)胞和pams)總rna，以提取的rna為模版，用fastquant反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cdna。以cdna為模版，參照sybrselectmastermix的使用條件，采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，以內(nèi)源性β-actin(marc-145細(xì)胞)或ppia(pams)作為內(nèi)參基因，檢測(cè)prrsv基因組的相對(duì)含量。應(yīng)用檢測(cè)prrsv非結(jié)構(gòu)蛋白9(nonstructuralprotein，nsp9)編碼區(qū)的引物檢測(cè)prrsv基因組，序列為：：5′-cctgcaattgtccgctggtttg-3′(上游引物)和5′-gacgacaggccacctctcttag-3′(下游引物)；檢測(cè)β-actin的引物序列：5′-tccctggagaagagctacga-3′(上游引物)和5′-agcactgtgttggcgtacag-3′(下游引物)；檢測(cè)ppia的引物序列：5′-aaggttcctgctttcacagaataat-3′(上游引物)和5′-aatttctctccatagatggacttgc-3′(下游引物)。應(yīng)用2^-δδct方法計(jì)算prrsv基因組的相對(duì)含量。

1.8數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±standarddeviations)表示，用graphpadprism(version5.0，graphpadsoftware，sandiego，ca，usa)軟件中的two-wayanovatest統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。p<0.05(*)，表示差異顯著；p<0.01(**)和p<0.001(***)，表示差異極顯著。

2結(jié)果

2.1預(yù)處理細(xì)胞后，25hc顯著抑制prrsv復(fù)制

為了研究25hc能否抑制prrsv復(fù)制，首先應(yīng)用cck-8試劑盒檢測(cè)了25hc是否對(duì)marc-145細(xì)胞有毒性，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組(25hc＝0μm)相比，不同濃度的25hc(2.5-20μm)對(duì)marc-145細(xì)胞在450nm處的吸光值無(wú)明顯減少，表明25hc在2.5-20μm的濃度范圍內(nèi)，對(duì)marc-145細(xì)胞無(wú)毒性(見(jiàn)圖1a)。

25hc能否抑制prrsv復(fù)制：用不同濃度(1.25-10μm)的25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞24h，然后接種prrsv(jxwn06，moi0.01)，48hpi收樣用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示，mock組無(wú)prrsv陽(yáng)性的細(xì)胞，但在溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組中prrsv能高效在細(xì)胞中復(fù)制。與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc處理組prrsv感染的細(xì)胞數(shù)顯著減少，并且隨著25hc濃度的升高(1.25-10μm)prrsv感染的細(xì)胞數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì)，這表明25hc顯著抑制prrsv的復(fù)制且呈劑量依賴性(見(jiàn)圖1b)。為了進(jìn)一步確定25hc對(duì)prrsv的抑制效果，本發(fā)明用不同濃度的25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞24h，然后接種prrsv(jxwn06，moi0.01)，48hpi收樣，檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc處理組中prrsv在marc-145細(xì)胞中的病毒滴度顯著減少。其中，在低濃度(1.25μm)時(shí)25hc能使病毒滴度降低到1/10，在高濃度(10μm)時(shí)能使病毒滴度降低到1/100000，且呈劑量依賴性，這表明25hc能顯著抑制prrsv在marc-145細(xì)胞中的復(fù)制(見(jiàn)圖1c)。用不同濃度的25hc預(yù)處理，濃度范圍是1.25到10μm，分別取了1.25μm,2.5μm,5μm,10μm4個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)了預(yù)處理pams后，25hc對(duì)prrsv(jxwn06，基因2型，高致病性毒株)復(fù)制的影響，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，在濃度(5μm)時(shí)25hc能使病毒滴度降低到1/100，這表明25hc同樣能顯著抑制prrsv在pams中的復(fù)制(見(jiàn)圖1d)。

檢測(cè)了25hc是否能抑制不同基因型prrsv的復(fù)制，本實(shí)施例又選擇了hb-1/3.9(基因2型，低致病性毒株)，vr-2332(mlv，基因2型疫苗株)，chsx1401(基因2型，低致病性毒株)和gz11-g1(基因1型)4個(gè)毒株為代表，檢測(cè)了25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞后能否抑制這些毒株的復(fù)制，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，在濃度5μm時(shí)25hc能使prrsv毒株(hb-1/3.9,chsx1401和gz11-g1)的病毒滴度降低到1/100或1/1000，在濃度10μm時(shí)25hc能使prrsv毒株(hb-1/3.9,chsx1401和gz11-g1)的病毒滴度降低到1/10000。而對(duì)于vr-2332(mlv)毒株，在濃度5μm時(shí)25hc能使病毒滴度降低到1/10，在濃度10μm時(shí)25hc能使病毒滴度降低到1/1000(見(jiàn)圖1e)。綜上，25hc預(yù)處理marc-145細(xì)胞和pams能顯著抑制prrsv復(fù)制，同時(shí)說(shuō)明25hc可能作用于細(xì)胞而發(fā)揮抑制prrsv復(fù)制的功能。

2.2prrsv感染后，25hc仍能顯著抑制prrsv復(fù)制

由于25hc預(yù)處理細(xì)胞后其能顯著抑制prrsv復(fù)制，為了研究prrsv感染后25hc對(duì)prrsv復(fù)制的影響，本實(shí)施例檢測(cè)了25hc是否對(duì)prrsv病毒粒子具有滅活效果，將25hc和prrsv(jxwn06，moi0.01)在室溫孵育2h，然后檢測(cè)25hc和prrsv混合物的病毒滴度，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，在濃度2.5μm，5μm和10μm時(shí)，25hc對(duì)prrsv的病毒滴度無(wú)下調(diào)作用(見(jiàn)圖2a)，說(shuō)明其對(duì)prrsv病毒粒子無(wú)滅活作用。

用prrsv(jxwn06，moi0.01)感染marc-145細(xì)胞(圖2b)和pams(圖2c)，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)用25hc處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，在感染的早期25hc能使prrsv病毒滴度降低1/100到1/10，其中在感染后6h用25hc處理細(xì)胞，病毒滴度降低到約1/100，但在感染后期25hc的效果逐漸減弱，其中在感染后24h用25hc處理細(xì)胞，25hc不能減少prrsv病毒滴度(圖2b)。在pams中，25hc具有相似的效果(圖2c)，這說(shuō)明prrsv感染后，25hc仍能顯著抑制prrsv復(fù)制。

2.325hc抑制prrsv的吸附和進(jìn)入

為了進(jìn)一步確定25hc在prrsv復(fù)制周期的哪一個(gè)階段發(fā)揮作用，首先研究25hc是否抑制prrsv的吸附。將25hc和prrsv(jxwn06)的混合液接種4℃預(yù)冷的marc-145細(xì)胞(圖3a)和pams(圖3b)，4℃感作2h，使病毒吸附到細(xì)胞表面而不進(jìn)入，病毒感染后用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，然后加入新鮮培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48h后檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果表明，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，prrsv的moi等于10時(shí)，25hc對(duì)prrsv病毒滴度無(wú)影響，但在低moi(1到0.001moi)時(shí)，25hc能使prrsv病毒滴度降低1/100到1/10，尤其在0.0001moi時(shí)病毒滴度降低到約1/300(圖3a)。在pams中，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，prrsv的moi等于0.1時(shí)，25hc對(duì)prrsv病毒滴度無(wú)影響，但在prrsv的moi為0.01和0.001時(shí)，25hc能使prrsv病毒滴度降低到1/10和1/20(圖3b)，這說(shuō)明25hc能抑制prrsv的吸附。

研究25hc是否抑制prrsv的進(jìn)入。將prrsv(jxwn06)接種4℃預(yù)冷的marc-145細(xì)胞(圖3c)和pams(圖3d)，4℃感作2h，使病毒吸附到細(xì)胞表面而不進(jìn)入，病毒感染后用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，然后加入含有25hc的新鮮培養(yǎng)液，37℃作用3h，棄上清，用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞3次，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48h后檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果顯示，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc能使prrsv病毒滴度降低1/300到1/10，其中，prrsv的moi等于10時(shí)，25hc能使prrsv病毒滴度降低到1/10，在0.0001moi時(shí)，25hc能使prrsv病毒滴度降低到1/300(圖3c)。在pams中，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，prrsv的moi等于0.1時(shí)，25hc對(duì)prrsv病毒滴度無(wú)影響，但在prrsv的moi為0.01和0.001時(shí)，25hc能使prrsv病毒滴度降低到1/10(圖3d)，這說(shuō)明25hc能顯著抑制prrsv的進(jìn)入。

2.425hc不抑制prrsv基因組的合成和病毒粒子的釋放

為了進(jìn)一步驗(yàn)證25hc能否對(duì)prrsv基因組的合成產(chǎn)生影響。將prrsv(jxwn06，moi0.1)在37℃接種marc-145細(xì)胞和pams2h，然后用25hc(10μm)處理細(xì)胞，并在病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞提取rna檢測(cè)prrsv基因組含量，結(jié)果顯示，在marc-145細(xì)胞(圖4a)和pams(圖4b)中，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc對(duì)prrsv基因組rna的相對(duì)量無(wú)顯著影響，這說(shuō)明25hc不抑制prrsv基因組合成。

研究25hc能否對(duì)prrsv的釋放產(chǎn)生影響，將prrsv(jxwn06，moi0.1)接種marc-145細(xì)胞，接種后24h棄上清，并加入含有25hc的新鮮5％dmem，在換液后的不同時(shí)間點(diǎn)分別收集上清和細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)上清中，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc對(duì)prrsv病毒滴度無(wú)顯著影響；在細(xì)胞中，與溶劑(無(wú)水乙醇)對(duì)照組相比，25hc也對(duì)prrsv病毒滴度無(wú)顯著影響(圖4c)，說(shuō)明25hc對(duì)prrsv的釋放無(wú)顯著影響。體外試驗(yàn)證實(shí)25hc能通過(guò)抑制prrsv吸附和進(jìn)入而顯著抑制prrsv復(fù)制。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的藥物

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