本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及可殺傷布氏錐蟲的化合物，包含所述化合物的藥物組合物，及其在制備治療錐蟲病的藥物方面的用途。本發(fā)明的的化合物可以作為治療非洲錐蟲病藥物的前體分子進(jìn)行開發(fā)或可直接用于錐蟲病治療。

背景技術(shù)：

布氏錐蟲是一種單細(xì)胞的真核寄生生物，包括布氏布氏錐蟲、岡比亞布氏錐蟲、羅德西亞布氏錐蟲三個(gè)亞種，可以通過(guò)蟲媒采采蠅感染人和其他動(dòng)物，引起人的嗜睡病(sleepingsickness)和動(dòng)物的拿干拿病(naganadisease)，統(tǒng)稱非洲錐蟲病。人感染布氏錐蟲后如果缺乏及時(shí)治療，在感染晚期具有很高的死亡率。目前用于治療非洲錐蟲病的藥物容易產(chǎn)生耐藥性，并且具有很強(qiáng)的副作用，因此迫切需要開發(fā)新的藥物來(lái)克服這些困難。

對(duì)布氏錐蟲等寄生生物表觀遺傳機(jī)制的研究顯示多個(gè)與染色質(zhì)有關(guān)的蛋白因子能夠影響布氏錐蟲的轉(zhuǎn)錄¹，而包括組蛋白修飾在內(nèi)的染色體標(biāo)簽可直接參與基因轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)控。先前的研究報(bào)道布氏錐蟲基因表達(dá)調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行，但近年來(lái)布氏錐蟲中各類轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)暗示了布氏錐蟲具有較為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)方式，表觀遺傳就是這樣一個(gè)調(diào)節(jié)方式。研究布氏錐蟲的表觀遺傳學(xué)調(diào)控將為本發(fā)明人了解布氏錐蟲轉(zhuǎn)錄調(diào)控，致病機(jī)理以及尋找治療錐蟲病的策略提供重要線索。

乙酰化賴氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bromodomain)是表觀遺傳調(diào)控過(guò)程中的重要蛋白結(jié)構(gòu)域元件，在真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過(guò)程以及dna損傷修復(fù)等過(guò)程中具有重要作用，鑒于這個(gè)結(jié)構(gòu)域的重要性，目前已有很多針對(duì)乙?；嚢彼峤Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性抑制劑被開發(fā)出來(lái)，已有一些已經(jīng)在美國(guó)開展癌癥方面的臨床試驗(yàn)。tbbdf5在布氏錐蟲表面糖蛋白的表達(dá)調(diào)控中占有重要作用的含有bromodomain的蛋白，能夠作為治療錐蟲病的靶標(biāo)²。

目前化合物i-bet151作為乙酰化賴氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域抑制劑已經(jīng)被用于治療非洲錐蟲病的研究中²，但存在特異性差、親和力低、機(jī)制不明確等缺點(diǎn)。因此急需尋找一種靶向特異性強(qiáng)，對(duì)哺乳動(dòng)物等宿主低毒的小分子化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法發(fā)現(xiàn)了化合物sgc-cbp30是tbbdf5-bd1(tbbdf5的第一個(gè)乙?；嚢彼峤Y(jié)合結(jié)構(gòu)域)的特異性抑制劑。化合物sgc-cbp30的分子式為：

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)化合物sgc-cbp30能在較低濃度殺傷布氏錐蟲。

化合物sgc-cbp30在治療非洲錐蟲病中的應(yīng)用機(jī)制在于：通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和核磁化學(xué)微擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sgc-cbp30能高效結(jié)合tbbdf5-bd1結(jié)合kac的位點(diǎn)，從而抑制tbbdf5與h4k10ac的結(jié)合；濃度為10～30μm的sgc-cbp30處理427細(xì)胞，24～72小時(shí)可引起427細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)化合物sgc-cbp30能夠長(zhǎng)效阻斷tbbdf5-bd1與h4k10ac的結(jié)合，并且具有較強(qiáng)的阻斷作用。

由此，本發(fā)明一方面提供化合物sgc-cbp30在制備藥物中的用途，所述藥物用于殺傷錐蟲。

在優(yōu)選的是實(shí)施方案中，所述錐蟲是布氏錐蟲。

本發(fā)明另一方面提供化合物sgc-cbp30在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療錐蟲病。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述錐蟲病是非洲錐蟲病。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述錐蟲病包括嗜睡病(sleepingsickness)和拿干拿病(naganadisease)。

本發(fā)明的另一方面提供化合物sgc-cbp30在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制tbbdf5的功能，特別是tbbdf5-bd1。

tbbdf5包含兩個(gè)乙?；嚢彼峤Y(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)無(wú)序的氮端，tbbdf5-bd1表示tbbdf5的第一個(gè)乙?；嚢彼峤Y(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明中，tbbdf5蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋白，存在于非洲錐蟲中，其蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)uniprot編號(hào)為q382j7。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物sgc-cbp30以低濃度施用。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物sgc-cbp30的濃度為10～30μm。

本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含化合物sgc-cbp30和藥用載體，所述藥物組合物用于治療殺傷錐蟲、治療錐蟲病或治療錐蟲病。

根據(jù)本發(fā)明，化合物sgc-cbp30特異靶向tbbdf5，特別是tbbdf5-bd1，與tbbdf5-bd1親和力高，抑制機(jī)制清楚，并且具有高效的殺傷布氏錐蟲的能力，可作為制備治療非洲錐蟲病的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1tbbdf5-bd1結(jié)合h4k4kac和h4k10ac

核磁化學(xué)微擾實(shí)驗(yàn)顯示tbbdf5-bd1結(jié)合h4k4kac(a)和h4k10ac(b)。發(fā)生明顯化學(xué)位移的氨基被標(biāo)記到了右邊，蛋白與小肽的濃度比分別為1∶0；1∶5；1∶10，箭頭表示譜峰漂移方向。

圖2sgc-cbp30特異性結(jié)合tbbdf5-bd1

sgc-cbp30只結(jié)合tbbdf5-bd1(a)，不結(jié)合tbbdf5第二個(gè)bromodomain(b)和tbbdf2(布氏錐蟲中另外一個(gè)結(jié)合組蛋白乙酰化的蛋白)的bromodomain。b，c作為陰性對(duì)照。

圖3sgc-cbp30抑制tbbdf5-bd1結(jié)合h4k10ac

a核磁化學(xué)微擾實(shí)驗(yàn)顯示h4k10ac(上)和sgc-cbp30(下)都結(jié)合到tbbdf5-bd1的kac結(jié)合區(qū)域。

b等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)。h4k10ac小肽分別滴定tbbdf5-bd1(上)和tbbdf5-bd1-sgc-cbp30的混合物(下，混合物前后兩者濃度比為1∶5)。結(jié)果證實(shí)了sgc-cbp30對(duì)tbbdf5-bd1的阻斷作用。

圖4sgc-cbp30對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

a不同濃度的sgc-cbp30對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

b刃天青(resazurin)染色法測(cè)量sgc-cbp30對(duì)細(xì)胞的影響。用不同濃度的sgc-cbp30處理細(xì)胞72小時(shí)后加入刃天青(終濃度22.88mg/ml)孵育6小時(shí)，再用spectramaxgeminiem檢測(cè)。最后數(shù)據(jù)用originpro8.0處理。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均從生工生物工程(上海)股份有限公司購(gòu)得。

前循環(huán)型布氏錐蟲427細(xì)胞系(下文也稱為“427細(xì)胞”)來(lái)自u(píng)niversityoftexas-houston李子銀教授實(shí)驗(yàn)室。小分子抑制劑購(gòu)自apexbiotechnology，houston，usa，所有的乙酰化小肽均在吉爾生化(上海)有限公司合成。

實(shí)施例1化合物sgc-cbp30抑制tbbdf5-bd1與h4k10ac的結(jié)合

(一)tbbdf5-bd1與h4k4ac和h4k10ac結(jié)合

根據(jù)文獻(xiàn)介紹^3，4，本發(fā)明人合成了布氏錐蟲組蛋白乙?；‰膸?kù)，通過(guò)核磁化學(xué)微擾實(shí)驗(yàn)⁵篩選發(fā)現(xiàn)，tbbdf5-bd1(把tbbdf5表達(dá)基因1-369bp的表達(dá)框克隆到pet22載體中，用bl21表達(dá)得到目的蛋白)與h4k4ac和h4k10ac小肽結(jié)合，如圖1。具體的來(lái)說(shuō)，不同濃度的小肽滴定濃度為0.3m的tbbdf5-bd1，得到不同濃度比條件下的¹h，¹⁵n-hsqc，最終把不同濃度比的¹h，¹⁵n-hsqc重疊就可以觀察到發(fā)生化學(xué)位移的氨基酸。乙?；‰男蛄腥缦滤荆浩渲幸阴；膋用下劃線表示。

h2a-k4ac：atpkqavkkas(seqidno：1)

h2b-k4ac：atpkstpaktr(seqidno：2)

h2b-k12ac：aktrkeakktr(seqidno：3)

h2b-k16ac：keakktrrqrk(seqidno：4)

h3-k23ac：skkaskgsdaas(seqidno：5)

h4-k2ac：akgkksgeak(seqidno：6)

h4-k4ac：akgkksgeak(seqidno：7)

h4-k10ac：sgeakgsqkr(seqidno：8)

h4-k14ac：akgsqkrqkk(seqidno：9)

(二)化合物sgc-cbp30特異性結(jié)合tbbdf5-bd1

本發(fā)明人解析了tbbdf5-bd的核磁溶液結(jié)構(gòu)(蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)pbd的檢索號(hào)：5wqz)，并利用軟件pyrx對(duì)常用的bromodomian抑制劑進(jìn)行模擬篩選，結(jié)合等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)⁶，最后確定sgc-cbp30特異性結(jié)合tbbdf5-bd1(kd＝13.8μm)，見圖2。pyrx軟件使用見http：//pyrx.sourceforge.net/。等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)：每隔120s滴定1.8μl0.10mm的蛋白到0.05mmsgc-cbp30中，共滴定20次。

(三)化合物sgc-cbp30抑制tbbdf5-bd1與h4k10ac的結(jié)合

h4k10ac小肽和化合物sgc-cbp30分別對(duì)tbbdf5-bd進(jìn)行核磁滴定，其中蛋白濃度為0.3mm，小肽和化合物對(duì)蛋白的濃度比分別為1∶10和1∶5。最后通過(guò)公式計(jì)算統(tǒng)計(jì)得到化學(xué)位移變化，發(fā)現(xiàn)h4k10ac和化合物sgc-cbp30都可以結(jié)合到tbbdf-bd1的kac(乙?；嚢彼?結(jié)合區(qū)域，見圖3a。

根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明人利用等溫滴定微量熱儀實(shí)施了化合物sgc-cbp30和h4k10ac小肽的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在同樣的dmso濃度的條件下，分別進(jìn)行了h4k10ac滴定tbbdf5-bd1和tbbdf5-bd1-sgc-cbp30混合物的實(shí)驗(yàn)，見圖3b。結(jié)果顯示化合物sgc-cbp30抑制tbbdf5-bd1與h4k10ac的結(jié)合。

實(shí)施例2化合物sgc-cbp30可有效殺傷布氏錐蟲

在相同的dmso濃度條件下，分別用0，10，20，30μm的sgc-cbp30處理427細(xì)胞，并每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。濃度為10～30μm的sgc-cbp30處理427細(xì)胞24～72小時(shí)后可引起427細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，并出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，見圖4a。

化合物sgc-cbp30按照濃度梯度稀釋(35，30，25.6，12.8，6.4，3.2，1.6，0.8，0.4，0.2，0.1，0微摩)并加入96孔板中，每個(gè)孔中再加入含有2×10⁵個(gè)細(xì)胞的200μl培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每個(gè)孔里加入20μl刃天青(22.88mg/ml)，孵育6小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)根據(jù)boltzmann函數(shù)用originpro8.0軟件進(jìn)行計(jì)算。最終利用刃天青染色法得到sgc-cbp30的半抑制濃度(ic50)為1.370μm，見圖4b。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)均通過(guò)參考結(jié)合于本文。

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sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)

<120>可殺傷布氏錐蟲的化合物及其在錐蟲病治療方面的應(yīng)用

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