本發(fā)明涉及動物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種建立甲減性心功能不全大鼠動物模型的方法。
背景技術(shù)：
：心臟是甲狀腺激素重要的靶器官，甲狀腺激素狀態(tài)的任何改變都直接或間接的影響心臟功能。甲減時(shí)甲狀腺激素分泌不足，心肌發(fā)生非特異性病理改變，使心肌細(xì)胞間質(zhì)中粘蛋白及粘多糖沉積，心肌發(fā)生粘液性水腫、變性甚至部分壞死，產(chǎn)生心肌纖維化，由此心肌收縮力下降，心輸出量減少，進(jìn)而出現(xiàn)心功能不全。為了更好的研究甲減導(dǎo)致心功能不全的原因、病理過程及發(fā)病機(jī)制，建立合適的動物模型至關(guān)重要，目前國內(nèi)外尚未建立方便、穩(wěn)定的甲減性心功能不全的模型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種建立甲減性心功能不全大鼠動物模型的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種建立甲減性心功能不全大鼠動物模型的方法，包括以下步驟：a、將131i用生理鹽水稀釋制成混合液；b、將混合液進(jìn)行大鼠腹腔注射；c、于實(shí)驗(yàn)4周末及8周末，進(jìn)行檢測，模型成立。優(yōu)選的，所述的步驟b中的混合液注射劑量為300μci或者500μci。優(yōu)選的，所述的步驟c中，進(jìn)行甲狀腺功能檢測時(shí)，大鼠，腹腔注射小劑量131i混合液，24h后將大鼠稱重后2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠頸部的毛發(fā)，固定后，進(jìn)行甲狀腺核素掃描。優(yōu)選的，所述的步驟c中，進(jìn)行心臟超聲檢測時(shí)，將大鼠禁食12h過夜，次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，稱重后2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠左胸前區(qū)毛發(fā)，固定后，涂抹耦合劑，取平臥位對大鼠行超聲檢查。碘是合成甲狀腺激素的物質(zhì)之一，給予131i處理后甲狀腺細(xì)胞通過鈉/碘共轉(zhuǎn)運(yùn)子克服電化學(xué)梯度從血循環(huán)中濃聚131i。131i衰變發(fā)射β射線和γ射線，β射線約占99％，β射線在組織內(nèi)的平均射程為1mm，因此在甲狀腺組織中β粒子的能量幾乎全部釋放其中，而對周圍組織和器官產(chǎn)生的影響很小。由于β射線在組織內(nèi)具有一定的射程，甲狀腺聚碘后，其中心部位接受輻射的劑量就遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于邊緣部分，因此假如給予適當(dāng)劑量的131i，就可以利用β射線的放射性來“切除”部分甲狀腺組織，同時(shí)又能保留一定量的甲狀腺組織?；谝陨咸攸c(diǎn)131i常用于治療甲亢，在其應(yīng)用的60多年中，這種操作簡便、療效確切、復(fù)發(fā)率低的方法已經(jīng)被越來越多的人所認(rèn)同。同時(shí)也由于甲狀腺組織具有聚碘的特性，131i可損傷正常甲狀腺組織而導(dǎo)致甲減。心功能不全的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，其中甲減是心功能不全的常見原因之一，無論是否存在基礎(chǔ)心臟疾病，持續(xù)性甲減均可增加心血管損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道表明，在顯著甲減和亞臨床甲減患者中，心臟結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)發(fā)生重要改變，其程度取決于甲狀腺激素缺乏的程度及持續(xù)時(shí)間。tang等發(fā)現(xiàn)，慢性甲減導(dǎo)致成年大鼠冠狀小動脈丟失及血流量受損，并誘導(dǎo)心肌形態(tài)不良改變和心功能不全發(fā)展。目前甲減導(dǎo)致心功能不全的機(jī)制尚不明確，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕⒓诇p致大鼠心功能不全的動物模型尤為重要，這樣才能為揭示甲減致心功能不全的發(fā)病機(jī)制和病理生理改變提供重要的工具。目前國內(nèi)外尚未建立方便穩(wěn)定的甲減性心功能不全大鼠的動物模型，所以我們借鑒了目前建立大鼠甲減模型的方法以建立更合適的動物模型。目前用于制作甲減動物模型的方法主要包括以下幾個(gè)方面：①手術(shù)誘導(dǎo)法：應(yīng)用手術(shù)方法將甲狀腺部分切除。②低碘誘導(dǎo)法：房輝等用重度缺碘地區(qū)的糧食配置飼料加去離子水喂養(yǎng)大鼠，3月后成模。③化學(xué)誘導(dǎo)法：應(yīng)用丙基硫氧嘧啶、甲基硫氧嘧啶、他巴唑、過氯酸鈉等藥物加入飲用水或者灌胃誘發(fā)，rbagliati等取240-280gwistar大鼠，腹腔注射131i1月后造模成功。④轉(zhuǎn)基因模型：有學(xué)者在表達(dá)δ337蘇氨酸t(yī)r-β突變體的轉(zhuǎn)基因鼠模型上，成功地誘發(fā)了甲減模型。以往雖然有人應(yīng)用131i造模，但劑量及方法仍不成熟，甲減后有無心功能改變尚不明確?；?31i的電離輻射特點(diǎn)，參照化學(xué)誘導(dǎo)建立大鼠甲減模型的方法，在本課題中建立腹腔注射131i致甲減性心力衰竭大鼠模型，但因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)的甲狀腺組織具有自我修復(fù)能力，且甲減致心功能不全所需要的時(shí)間較長，因此采用合適的131i劑量是成功建立模型的關(guān)鍵。本課題將大鼠隨機(jī)分為6個(gè)不同劑量組，目的是為了對建立甲減性心功能不全大鼠合適的131i的劑量進(jìn)行探索，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的給藥劑量均由131i劑量計(jì)算公式計(jì)算而來。由于131i作用于甲狀腺組織引起的電離輻射效應(yīng)是個(gè)長效反應(yīng)，因此將實(shí)驗(yàn)指標(biāo)復(fù)查時(shí)間限定為腹腔注射131i4周和8周后。實(shí)驗(yàn)4周末甲狀腺核素掃描顯示處理組與正常對照組相比較，甲狀腺攝碘功能未見明顯差異，實(shí)驗(yàn)8周末處理組各組大鼠甲狀腺攝碘功能幾乎完全丟失，由此證明131i已成功的對處理組大鼠甲狀腺組織進(jìn)行了破壞。對大鼠血清tt3、tt4、tsh進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)4周末及8周末，處理各組與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)對象已被成功的復(fù)制為甲狀腺功能減低，并且隨著時(shí)間的推移，甲狀腺功能并未見明顯的改善，說明了采用131i腹腔注射建立甲減模型狀態(tài)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)4周末，處理組中的低劑量組與正常對照組相比較超聲檢測的心臟功能未見明顯差異，隨著造模時(shí)間的延長，處理組各組之間與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，反應(yīng)心功能不全程度指標(biāo)血清bnp在實(shí)驗(yàn)8周末處理各組與對照組可見明顯差異，這證明了隨著造模時(shí)間的延長，甲減導(dǎo)致心功能不全的模型建立成功。通過對處理組各組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，隨著腹腔注射131i劑量的增加，各個(gè)處理組與正常對照組之間的差異就越來越明顯，但當(dāng)131i劑量增加到700μci及以上時(shí)，高劑量處理組各組之間的數(shù)據(jù)并未見明顯的差異，并且腹腔注射的劑量越高，模型組大鼠的死亡率越高。本發(fā)明的有益之處在于：1、本發(fā)明的動物模型制作簡單，費(fèi)用低，容易重復(fù)；2、本發(fā)明通過核素掃描了解甲狀腺聚碘能力，測定血清總?cè)饧谞钤彼?totaltriiodothyronine,tt3)、總甲狀腺素(totalthyroxine,tt4)、促甲狀腺激素(thyroidstimulatinghormone,tsh)水平評價(jià)甲狀腺功能，測定大鼠心臟超聲及血清腦鈉肽(brainnatriureticpeptide，bnp)評價(jià)心臟功能，綜上判斷，本發(fā)明建立的腹腔注射131i致甲減性心功能不全大鼠模型，造模成功。3、目前國內(nèi)外尚未建立方便穩(wěn)定的甲減性心功能不全大鼠的動物模型，所以本發(fā)明借鑒了目前建立大鼠甲減模型的方法以建立更合適的動物模型，但是具體的注射時(shí)間和檢測方法均與其有所不同。附圖說明圖1：實(shí)施例中的大鼠甲狀腺核素掃描圖，其中，a：4周后正常對照組甲狀腺核素掃描；b：4周后處理組甲狀腺核素掃描；c：8周后正常對照組甲狀腺核素掃描；d：8周后處理組甲狀腺核素掃描。圖2：實(shí)施例中，4周末各組大鼠血清bnp比較圖。圖3：實(shí)施例中，8周末各組大鼠血清bnp比較圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性健康wistar大鼠56只，體重在200-220克，均購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號：scxk(冀)2013-1-003；合格證編號：1403051)。大鼠于河北省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，室溫20-25℃，相對濕度40-70％，每日12小時(shí)光照維持，晝夜循環(huán)。動物飼料為普通飼料，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。1.2主要試劑131i制劑(原子高科股份有限公司)，大鼠血清tt3elisa試劑盒、大鼠血清tt4elisa測試盒、大鼠血清bnpelisa測試盒(生工生物工程股份有限公司)，大鼠血清tshelisa測試盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1動物模型的建立實(shí)驗(yàn)分組：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為7組：正常對照組(control)、100μci組(100μcig)、300μci組(300μcig)、500μci組(500μcig)、700μci組(700μcig)、900μci組(900μcig)、1100μci組(1100μcig)，每組8只大鼠。均給予普通飼料喂養(yǎng)。給藥處理：將131i用生理鹽水稀釋制成混合液，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別給予含100μci131i、300μci131i、500μci131i、700μci131i、900μci131i、1100μci131i的等體積混合液，將混合液腹腔注射，正常對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射。喂養(yǎng)4周后禁食12小時(shí)過夜，2％戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉后行心臟超聲檢查、核素掃描檢查，眼眶取血留取血清。喂養(yǎng)8周后禁食12小時(shí)過夜，麻醉后行心臟超聲檢查、核素掃描檢查，腹主動脈放血處死動物，留取血清。2.2甲狀腺功能檢測2.2.1甲狀腺核素掃描于實(shí)驗(yàn)4周末及8周末，每組隨機(jī)選取2只大鼠，腹腔注射小劑量131i混合液，24h后將大鼠稱重后2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠頸部的毛發(fā)，固定后，進(jìn)行甲狀腺核素掃描，判斷各組大鼠甲狀腺的攝碘功能。2.2.2血清學(xué)指標(biāo)測定大鼠血清tt3、tt4、tsh、bnp測定：采用大鼠血清e(cuò)lisa試劑盒測定。2.3心臟超聲檢測于實(shí)驗(yàn)4周末及8周末將大鼠禁食12h過夜，次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，稱重后2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除大鼠左胸前區(qū)毛發(fā)，固定后，涂抹耦合劑，取平臥位對大鼠行超聲檢查。測量大鼠室間隔厚度(interventricularseptal,ivs)、左室舒張期末期內(nèi)徑(leftventricularend-diastolicdimension，lvedd)、左室后壁厚度(leftventriculusposteriorwalldimension，lvpwd)、左室收縮末期內(nèi)徑(leftventricularend-systolicdimension，lvesd)，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)的射血分?jǐn)?shù)(ejectionfraction，ef)和短軸縮短率(fractionalshortening，fs)，每只大鼠測量3次，取平均值。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)處理均應(yīng)用spss17.0軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，先行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1大鼠甲狀腺核素掃描(圖1)實(shí)驗(yàn)4周末，大鼠甲狀腺攝碘功能處理組各組與正常對照組相比較未見明顯差異；實(shí)驗(yàn)8周末，大鼠甲狀腺攝碘功能處理組各組與正常對照組相比較顯著下降。2大鼠甲狀腺功能(見表1、表2)實(shí)驗(yàn)4周末及實(shí)驗(yàn)8周末，大鼠tt3、tt4水平處理組各組與正常對照組相比顯著降低(p＜0.05)，tsh水平處理組各組與正常對照組相比明顯升高(p＜0.05)，隨著劑量增加差異更加顯著。表1：4周末各組大鼠甲狀腺功能比較組別周數(shù)tt3(nmol/l)tt4(nmol/l)tsh(μiu/ml)control4w1.43±0.142.68±1.974.86±19.3100μcig4w1.12±0.1133.41±1.0874.46±14.1300μcig4w0.96±0.1125.63±1.4389.64±16.09500μcig4w0.80±0.120.28±0.8990.29±11.37700μcig4w0.74±0.0415.38±1.3391.19±9.76900μcig4w0.70±0.0313.81±1.3592.12±5.071100μcig4w0.65±0.0610.94±1.6398.00±11.33f值－55.711380.606155.999p－<0.000<0.000<0.000tt3:總?cè)饧谞钤彼?；tt4:總甲狀腺素；tsh:促甲狀腺激素。表2：8周末各組大鼠甲狀腺功能比較組別周數(shù)tt3(nmol/l)tt4(nmol/l)tsh(μiu/ml)control8w1.54±0.2035.2±1.29166.45±14.64100μcig8w1.29±0.225.45±2.83228.32±18.84300μcig8w1.01±0.1815.03±1.98264.36±18.74500μcig8w0.99±0.2412.12±0.71278.91±13.7700μcig8w0.95±0.1811.49±2.16287.47±14.28900μcig8w0.83±0.079.94±1.71300.2±181100μcig8w0.67±0.089.3±1.59302.29±14.08f值－15.92538.52825.470p－<0.000<0.000<0.000tt3:總?cè)饧谞钤彼?；tt4:總甲狀腺素；tsh:促甲狀腺激素。3大鼠心臟功能(見表3、表4)表3：4周末大鼠心臟功能比較組別周數(shù)ivs(mm)lvedd(mm)lvpwd(mm)lvesd(mm)ef(％)fs(％)control4w1.39±0.046.03±0.331.4±0.043.67±0.4866.94±2.4138.75±3.21100μcig4w1.46±0.036.24±0.241.45±0.033.98±0.3264.17±2.735.42±1.85300μcig4w1.57±0.056.04±0.111.66±0.094.05±0.2860.47±1.4133.19±1.88500μcig4w1.59±0.056.39±0.381.67±0.094.57±0.4658.67±4.1730.59±1.42700μcig4w1.67±0.036.79±0.221.72±0.064.75±0.6557.33±5.7529.46±1.57900μcig4w1.69±0.017.1±0.191.74±0.054.98±0.1855.33±2.8828.35±1.811100μcig4w1.69±0.036.98±0.281.8±0.065.11±0.2755.59±5.4727.24±1.29f值－98.8804.5871.2976.3759.5915.246p－<0.0000.0020.2940.000<0.0000.001ivs:測量大鼠室間隔厚度；lvedd:左室舒張期末期內(nèi)徑；lvpwd:左室后壁厚度；lvesd:左室收縮末期內(nèi)徑；ef：射血分?jǐn)?shù)；fs:短軸縮短率。表4：8周末大鼠心臟功能比較ivs:測量大鼠室間隔厚度；lvedd:左室舒張期末期內(nèi)徑；lvpwd:左室后壁厚度；lvesd:左室收縮末期內(nèi)徑；ef：射血分?jǐn)?shù)；fs:短軸縮短率。實(shí)驗(yàn)4周末，大鼠ivs、lvedd在處理組各組與正常對照組相比明顯升高(p＜0.05)，隨著給藥劑量的增加，這種趨勢變的更加明顯，然而lvpwp在實(shí)驗(yàn)組與正常對照組相比也有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；ef、fs處理組各組與正常對照組相比明顯降低(p＜0.05)，同樣隨著給藥劑量的增加，這種趨勢更加明顯(詳見表3)。在實(shí)驗(yàn)8周末，大鼠ivs、lvedd、lvpwp在處理組各組與正常對照組相比明顯升高(p＜0.05)，隨著給藥劑量的增加，這種趨勢變的更加明顯；ef、fs處理組各組與正常對照組相比明顯降低(p＜0.05)，同樣隨著給藥劑量的增加，這種趨勢更加明顯(詳見表4)。4大鼠bnp表達(dá)水平(見圖2、圖3)實(shí)驗(yàn)4周末，大鼠bnp水平處理組各組與正常對照組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)(詳見圖2)。實(shí)驗(yàn)8周末，大鼠bnp水平處理組各組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，且隨著給藥劑量的增加，血清bnp有增加的趨勢(詳見圖3)。綜上，131i是方便的建立甲減模型的方法，本研究認(rèn)為300μci組和500μci組成模大鼠具備穩(wěn)定的甲狀腺功能減退及心功能不全的特征，且達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)后能維持足夠長的時(shí)間，4周即有心功能改變，8周時(shí)出現(xiàn)顯著的心功能不全，就造模劑量及成模大鼠的存活率而言，此兩組優(yōu)于其他劑量組。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12