本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及mir-490-5p在制備治療肝癌的藥物組合物中的用途。
背景技術：
：肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞性肝癌是肝癌最主要的類型，在我國占原發(fā)性肝癌的90％。肝細胞性肝癌的發(fā)病率和死亡率均很高，肝癌的高轉移性是其致死率的重要原因。因而，抑制肝癌的轉移、增殖和侵襲是肝癌治療的重要途徑。mirna是一類內源性的、不參與蛋白質編碼的小rna分子，其長度大約有18-25個核苷酸。mirna前體，經酶切割為成熟mirna。后者與相關蛋白一起組成rna-誘導沉默復合體(risc)，調控其靶基因的表達。mirna調控靶基因的方式有兩種：與靶基因mrna的3’utr結合導致其降解；與靶基因mrna3’utr結合抑制其翻譯。在植物中比較普遍的沉默機制中，mirna和靶基因mrna幾乎完全配對時，誘導其降解。然而大多數(shù)哺乳動物是通過不完全的配對結合，從而在轉錄后水平抑制基因翻譯。除此之外，mirna還可通過促進靶mrnapolya尾的去除，mrna快速脫腺苷酸化促進了其被3’核酸外切酶水解。人類的mirna由2％的基因編碼，卻能調控人體約30％的基因。多種mirna已被報道在腫瘤發(fā)生中參與調節(jié)相關基因的表達。非編碼mirna在調控emt的細胞信號通路中具有重要作用。例如mir-200和mir-205抑制zeb1和zeb2，后者調控e-cadherin的表達，由此維持上皮細胞的表型。鑒于mirna在癌癥發(fā)生發(fā)展的重要作用，已有多位研究者對肝癌與mirna的關系做了深入研究，發(fā)現(xiàn)了部分與肝癌相關的mirna，這些mirna的表達在轉移性肝癌中下調明顯。然而目前的工作僅是冰山一角。技術實現(xiàn)要素：經過對肝癌發(fā)病機理的多年研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)mir-490-5p在原發(fā)性肝癌細胞中下調明顯，并且對于肝癌細胞的增殖和侵襲有抑制作用?；诖?，本申請的目的是提供一種新的治療肝癌的方式。由此，本發(fā)明的第一個目的是提供mir-490-5p在制備治療肝癌的藥物組合物中的用途。優(yōu)選地，所述mir-490-5p的序列如seqidno:1所示。優(yōu)選地，所述治療是通過抑制肝癌細胞的增殖與侵襲實現(xiàn)的。優(yōu)選地，所述肝癌為原發(fā)性肝癌。本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的mir-490-5p及其藥學上可以接受的輔料。優(yōu)選地，所述mir-490-5p的序列如seqidno:1所示。本發(fā)明的第三個目的是提供檢測mir-490-5p的特異性擴增引物，所述特異性擴增引物包括上游引物和下游引物。優(yōu)選地，所述上游引物的序列如seqidno:2所示；所述下游引物的序列如seqidno:3所示。本發(fā)明的第四個目的是提供檢測mir-490-5p的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的檢測mir-490-5p的特異性擴增引物。本發(fā)明人通過大量實驗發(fā)現(xiàn)，mir-490-5p能夠抑制肝癌細胞的增殖與侵襲，從而使肝癌細胞凋亡。特別地，可以使肝癌細胞系hepg2凋亡57.6％，使smmc7221凋亡43.9％，說明mir-490-5p或其類似物能夠用于制備治療肝癌的藥物組合物，也可以構建它的表達載體，用于基因治療。本發(fā)明的mir-490-5p對肝癌細胞的抑制效果顯著，為肝癌的治療提供了新的途徑。具體實施方式通過下面給出的具體實施例，可以進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明人對大量原發(fā)性肝癌病例的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)mir-490-5p在大部分研究的肝癌病例細胞中下調。因此，本發(fā)明人展開進一步的研究，探索mir-490-5p與肝癌之間的相關性。在本發(fā)明中，mir-490-5p的序列為：ccauggaucuccaggugggu(seqidno:1)。本發(fā)明進一步提供mir-490-5p的特異性擴增引物，其包括上游引物和下游引物。其中，所述上游引物的序列為：ctccagctgggccatggatc(seqidno:2)，所述下游引物的序列為：tggtgtcgtggagtcg(seqidno:3)。本發(fā)明中，所述藥物組合物中的治療有效量是本領域技術人員可以根據(jù)制藥領域的要求和治療效果來判斷和確定的。本發(fā)明中所述的表達載體為mirna表達載體，本領域技術人員根據(jù)mirna的莖序列可以設計出合適的表達載體。本發(fā)明中使用的細胞系hepg2、smmc7721和l-02，購自中國科學院上海細胞生物研究所，引進后在本實驗室長期培養(yǎng)。以rpmi1640+10％fbs，37℃、5％co2、95％空氣、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。以下實施例中，如沒有特殊說明，所使用的試劑和儀器都是本領域常規(guī)試劑和儀器，可以通過商購途徑獲得；所使用的方法為本領域常規(guī)方法，本領域技術人員根據(jù)實驗目的可以毫無疑問地知道如何實施該方法。實施例1：肝癌細胞中mir-490-5p表達量的驗1、收集病例收集2015年1月至2016年12月間，在第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院行原發(fā)性肝癌切除手術的78例患者切除標本及癌旁組織作為肝癌組織標本和癌旁對照。所有患者術前未接受過放化療等抗腫瘤治療。標本取材后立即放入4％甲醛溶液中進行組織固定。所有組織標本的病理學特征均經病理檢查確認。2、總rna提取利用trizol(invitrogen)試劑說明提取組織的總rna，步驟如下：(1)組織研磨后或細胞收集后用pbs洗2次，按1×107細胞加入1ml細胞總rna抽提試劑trizol，充分勻漿；(2)加入0.2ml氯仿混勻，室溫靜置3分鐘后，4℃、12,000g離心15分鐘；吸取上層水相置于新管中，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10分鐘后，4℃、12000g離心20分鐘；(3)棄上清，沉淀以75％乙醇洗滌，4℃、7500g離心5分鐘后，空氣干燥；溶解于40μldepc處理的水溶液，進行濃度和純度測定后保存于-80℃用于反轉錄。3、microrna逆轉錄(1)取2μg組織總rna，在室溫解凍，解凍后迅速置于冰上。按照表1配制混合液。表1：microrna逆轉錄體系試劑名稱量5×反應緩沖液5μl總rna2μgrtase混合物1μl2.5u/μl聚合酶1μl無rna酶水補充到25μl37℃下，反應60min。(2)85℃，5min后放于冰上，得到的micrornacdna可用于后續(xù)實驗，或置于-20℃保存。4、檢測microrna表達以上述逆轉錄反應得到的cdna為模板，每份組織的模板設置三個復孔，在冰上操作，反應體系配制如表2。表2：pcr反應體系試劑量模板cdna1μg上游引物(2μm)2μl下游引物(2μm)2μldntp(10μm)8μldna聚合酶1μl緩沖液(10×)2μldd水補足20μl反應條件：95℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)。結果表明，在78對樣品中，有63對的肝癌組織中mir-490-5p的表達量低于癌旁對照組織的表達量，其中最大的降低量為72.5％，最小的降低量為8.7％。其它15對中，mir-490-5p的表達量沒有差異。由此可見，mir-490-5p的表達與肝癌的發(fā)生有聯(lián)系。實施例2：肝癌細胞smmc7721和hepg2中mir-490-5p的表達量分析培養(yǎng)肝癌細胞smmc7721和hepg2以及正常人肝細胞l-02至對數(shù)期，分別經脫離基質附著培養(yǎng)24h，得到脫離附著的細胞。通過實施例1的方法檢測細胞中mir-424-5p的表達。檢測結果顯示，與正常人肝細胞l-02相比，mir-490-5p在肝癌細胞smmc7721和hepg2中的表達量分別為l-02細胞中的47.7％和43.6％，進一步證實mir-490-5p在人肝癌細胞中下調表達。實施例3：肝癌細胞轉染mir-490-5p1、microrna的合成：分別合成mir-490-5p：ccauggaucuccagguggguaa(seqidno：4)uuacccaccuggagauccaugg(seqidno：5)；陰性對照：uucuccgaacgugucacgu(seqidno：6)acgugacacguucggagaa(seqidno：7)。2、細胞株的選擇：選擇smmc7221和hepg2細胞系作為實驗細胞系。3、細胞的轉染：(1)轉染前一天，胰酶消化預轉染的細胞，調整細胞濃度為2×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(2)16-20h后，細胞密度達到80％，將板內完全培養(yǎng)基換成opti-mem培養(yǎng)液。(3)取5μl的mir-490-5p或陰性對照稀釋于250μlopti-mem培養(yǎng)基中。(4)取10μllipofectamine2000脂質體稀釋于250μlopti-mem培養(yǎng)基中。(5)將稀釋好的脂質體與mir-490-5p或陰性對照混合，室溫孵育25min。(6)將(5)的混合液按每孔500μl/孔加到6孔板中，輕輕搖動混勻。(7)37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。4、轉染后分析轉染24h后消化細胞，置poly-hema培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，用移液器輕輕吹開細胞團成單個細胞，1000rpm4℃離心5min，預冷pbs沖洗3遍，進行annexinv-fitc染色，上機后檢測凋亡細胞。結果顯示，hepg2細胞中，與轉染陰性對照相比，轉染mir-490-5p的細胞凋亡了57.6％；smmc7221細胞中，與轉染陰性對照相比，轉染mir-490-5p的細胞凋亡了43.9％。序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院<120>mir-490-5p在治療肝癌中的用途<130>w171137-oi<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>rna<213>人<400>1ccauggaucuccaggugggu20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ctccagctgggccatggatc20<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<400>3tggtgtcgtggagtcg16<210>4<211>22<212>rna<213>人工序列<400>4ccauggaucuccagguggguaa22<210>5<211>22<212>rna<213>人工序列<400>5uuacccaccuggagauccaugg22<210>6<211>19<212>rna<213>人工序列<400>6uucuccgaacgugucacgu19<210>7<211>19<212>rna<213>人工序列<400>7acgugacacguucggagaa19當前第1頁12