本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及橙皮苷、橙皮苷的衍生物或含橙皮苷的植物提取物在改善遲發(fā)型腹瀉和/或提高化療藥物生物利用度中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹽酸伊立替康(irinotecanhydrochloride,cpt-11)是dna拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅰ抑制劑，屬于細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物中喜樹堿(camptothecin,cpt)的同系物，其主要特異性的作用于細(xì)胞周期s期發(fā)揮抗腫瘤作用。cpt-11作為一個前藥，在體內(nèi)，經(jīng)羧酸酯酶(carboxylesterase,ces)代謝活化成的7-乙基-10-羥基-喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin,sn-38)，具有廣譜的抗腫瘤活性，臨床上可以用于治療多種實體瘤。cpt-11引起不良反應(yīng)主要包括嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞減少癥和腸毒性，cpt-11的腸毒性根據(jù)發(fā)生時間分為即發(fā)型腹瀉(cpt-11inducedearly-onsetdiarrhea,cied)和遲發(fā)型腹瀉(cpt-11induceddelayed-onsetdiarrhea,cidd)。其中，cied是在給藥24h內(nèi)出現(xiàn)腹瀉癥狀，癥狀較輕，持續(xù)時間較短，這種即發(fā)型腹瀉可以通過阿托品干預(yù)對癥治療。而cidd的發(fā)生，具有不可預(yù)測性和致死性，其導(dǎo)致3-4級腹瀉的發(fā)病率為30-40％，對cpt-11在臨床的使用產(chǎn)生了很大的限制。有證據(jù)認(rèn)為cpt-11腸毒性主要的、直接的原因是由于腸道內(nèi)sn-38的長時間和高濃度暴露，使sn-38對腸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用時間延長和作用程度加大，最終損傷腸細(xì)胞，誘發(fā)腸毒性。

cpt-11在體內(nèi)經(jīng)ces代謝生成活性產(chǎn)物sn-38，sn-38在ⅱ相代謝酶葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphateglucuronosyltransferase，ugts)的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合轉(zhuǎn)化成無活性的代謝物sn-38g(sn-38glucuronide)。研究顯示，cpt-11和sn-38血漿濃度的比值是10:1，但是sn-38的活性卻是cpt-11的100-1000倍，因此sn-38是cpt-11在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用或者產(chǎn)生細(xì)胞毒性的活性代謝物。sn-38g和未轉(zhuǎn)化的sn-38主要經(jīng)膽汁排泄，占靜脈給藥劑量的60％左右，腎臟排泄只占所有sn-38排泄的30％左右。cpt-11、sn-38和sn-38g隨膽汁進(jìn)入腸道后，腸腔中的sn-38g在腸道菌群β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)的作用轉(zhuǎn)化成活性形式sn-38。腸腔中的cpt-11和sn-38又被重吸收進(jìn)入血液，形成肝腸循環(huán)。但腸腔中的sn-38可對其上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性，直接損傷腸道，進(jìn)而引起嚴(yán)重的cidd。

研究表明，cpt-11、sn-38和sn-38g在體內(nèi)處置過程需經(jīng)轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)，相關(guān)轉(zhuǎn)運體功能變化可能會影響其抗腫瘤活性或其毒性。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽(theorganicaniontransportingpolypeptides,oatps)家族的oatp1b1和oatp1b3參與血液中的cpt-11、sn-38和sn-38g的肝臟細(xì)胞攝取。攝取進(jìn)入肝細(xì)胞后，cpt-11、sn-38和sn-38g由膽管側(cè)膜abc轉(zhuǎn)運體家族的abcc2(themultidrugresistance-associatedprotein-2,mrp2)、abcg2(thebreastcancerresistanceprotein,bcrp)和abcb1(themultidrugresistanceprotein-1，mdr1)介導(dǎo)膽汁外排進(jìn)入腸道。其中，mrp2介導(dǎo)的sn-38和sn-38g膽汁外排，對腸道sn-38的暴露影響最為顯著，在抗腫瘤活性和毒性方面均占主導(dǎo)地位。

橙皮苷(hesperidin，hesd)是柑橘屬植物果實中最主要的黃酮類化合物，主要存在于橘子、檸檬及其果汁中，其中果皮橙皮苷的含量也比較高。值得注意的是，很多中藥材或者食品中都含有黃酮類成分橙皮苷，并且已經(jīng)有很多研究表明橙皮苷具有一定的生理活性，比如：抗氧化應(yīng)激，抗菌消炎，抗過敏，抗突變，抗病毒，抗血栓和治療冠心病的作用，特別是還有抗腫瘤活性。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

但關(guān)于橙皮苷在改善由各種化療藥物引起的遲發(fā)型腹瀉，和/或提高該藥物生物利用度等方面的用途尚未見有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供橙皮苷、橙皮苷的衍生物或含橙皮苷的植物提取物改善由各種化療藥物引起的遲發(fā)型腹瀉，和/或提高該藥物生物利用度等方面的新用途。

本發(fā)明提出的橙皮苷、橙皮苷的衍生物或含橙皮苷的植物提取物在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品的功能具有如下(1)至(5)中至少一種：

(1)抑制肝臟轉(zhuǎn)運體mrp2的表達(dá)；

(2)減少cpt-11及sn-38的膽汁排泄量；

(3)降低腸道sn-38的暴露量；

(4)改善由化療藥物引起的遲發(fā)型腹瀉；

(5)提高所述化療藥物的生物利用度。

優(yōu)選地，橙皮苷的衍生物為對橙皮苷進(jìn)行酯化、醚化、以及母環(huán)修飾的化合物。

優(yōu)選地，含橙皮苷的植物提取物是指由蕓香科柑橘屬植物的果實提取獲得的提取物；優(yōu)選為由橘子和/或檸檬提取獲得的提取物。

優(yōu)選地，化療藥物為在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為7-乙基-10-羥基-喜樹堿的喜樹堿類化合物。

優(yōu)選地，喜樹堿類化合物為伊立替康或拓?fù)涮婵怠?/p>

優(yōu)選地，產(chǎn)品為藥物。

優(yōu)選地，產(chǎn)品為片劑、膠囊劑、丸劑或顆粒劑。

本發(fā)明還提出的一種產(chǎn)品，其活性成分為橙皮苷、橙皮苷的衍生物或含橙皮苷的植物提取物；所述產(chǎn)品的功能具有如下(1)至(5)中至少一種：

(1)抑制肝臟轉(zhuǎn)運體mrp2的表達(dá)；

(2)減少cpt-11及sn-38的膽汁排泄量；

(3)降低腸道sn-38的暴露量；

(4)改善由化療藥物引起的遲發(fā)型腹瀉；

(5)提高所述化療藥物的生物利用度。

優(yōu)選地，橙皮苷的衍生物為對橙皮苷進(jìn)行酯化、醚化、以及母環(huán)修飾的化合物。

優(yōu)選地，含橙皮苷的植物提取物是指由蕓香科柑橘屬植物的果實提取獲得的提取物；優(yōu)選為由橘子和/或檸檬提取獲得的提取物。

優(yōu)選地，化療藥物為在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為7-乙基-10-羥基-喜樹堿的喜樹堿類化合物。

優(yōu)選地，喜樹堿類化合物為伊立替康或拓?fù)涮婵怠?/p>

優(yōu)選地，產(chǎn)品為藥物。

優(yōu)選地，產(chǎn)品為片劑、膠囊劑、丸劑或顆粒劑。

本發(fā)明涉及的橙皮苷、橙皮苷的衍生物或含橙皮苷的植物提取物具有：抑制肝臟轉(zhuǎn)運體mrp2的表達(dá)；減少cpt-11及sn-38的膽汁排泄量；降低腸道sn-38的暴露量；改善由化療藥物引起的遲發(fā)型腹瀉；提高所述化療藥物的生物利用度。

附圖說明

圖1為橙皮苷干預(yù)2h對cpt-11組織分布的影響。

圖2為橙皮苷干預(yù)2h對sn-38組織分布的影響。

圖3為橙皮苷干預(yù)4h對cpt-11組織分布的影響。

圖4為橙皮苷干預(yù)4h對sn-38組織分布的影響。

圖5為橙皮苷干預(yù)8h對cpt-11組織分布的影響。

圖6為橙皮苷干預(yù)8h對sn-38組織分布的影響。

圖7為橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38腸道內(nèi)容物的影響。

圖8為橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38累計膽汁排泄量的影響。

圖9為大鼠肝臟mrp2的免疫組化染色圖；其中a為cidd模型組，b為橙皮苷干預(yù)組。

圖10為蛋白質(zhì)印跡法中，橙皮苷干預(yù)對大鼠肝臟mrp2表達(dá)量的影響。

圖11為橙皮苷干預(yù)對cidd模型腸道內(nèi)容物中cpt-11和sn-38濃度的影響。

圖12為橙皮苷干預(yù)對大鼠體重變化的影響

圖13為橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠腹瀉發(fā)生率的影響。

圖14為橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠腹瀉評分的影響。

圖15為橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠結(jié)腸病理變化的影響；其中a為正常對照組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖，b為cidd模型組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖，c為橙皮苷干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實施例1橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38藥動學(xué)的影響

大鼠隨機(jī)分成兩組：橙皮苷組和對照組，每組6只。其中，橙皮苷組灌胃連續(xù)給予橙皮苷兩天，每天四次，每次20mg/kg，對照組以同樣的方式給予水。兩天后，大鼠腹腔給藥麻醉，進(jìn)行股動脈插管收集血樣。兩組大鼠給予橙皮苷或水1h后，靜脈給予cpt-11(20mg/kg)。

通過股動脈插管收集不同時間點的血液樣品，將收集到的血液樣品離心10min，上清血漿-80℃保存，cpt-11和sn-38的血漿濃度通過lc-ms/ms測定，并應(yīng)用藥動學(xué)統(tǒng)計軟件計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。

橙皮苷給藥干預(yù)大鼠cpt-11和sn-38的藥動學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果表明，大鼠經(jīng)多次橙皮苷干預(yù)后，再靜脈單次給予cpt-11，與對照組相比，cpt-11的auc5-t升高15％(p＜0.05)，cl降低13％(p＜0.05)；sn-38的auc5-t升高22％(p＜0.05)，cl降低22％(p＜0.05)。其結(jié)果說明：大鼠體內(nèi)cpt-11和sn-38的清除減慢，在全身循環(huán)中的量增高。

實施例2橙皮苷給藥對cpt-11和sn-38組織分布的影響

兩組大鼠靜脈給予cpt-11(20mg/kg)后，在不同時間采集肝臟、腎臟、回腸、結(jié)腸、腦、肺、心臟。所有組織樣品用生理鹽水漂洗，即刻放置于-80℃保存。測定時稱取0.4g組織，加入1.2mlpbs緩沖液，充分勻漿后12000g離心10min，取上清液100μl，應(yīng)用lc-ms/ms測定樣品中的藥物濃度。

橙皮苷干預(yù)大鼠cpt-11和sn-38的組織分布實驗結(jié)果如圖1-6所示。

2h組織分布結(jié)果顯示：與對照組相比，橙皮苷干預(yù)組肝臟、腎臟、結(jié)腸、回腸、心、肺、腦的組織濃度均無顯著性差異(p＞0.05)。

4h組織分布結(jié)果顯示：與對照組相比，橙皮苷干預(yù)組中，cpt-11的肝臟組織濃度升高26％(p＜0.05)，結(jié)腸組織濃度升高37％(p＜0.05)，其他組織均無顯著性差異(p＞0.05)；sn-38的肝臟組織濃度升高52％(p＜0.05)，結(jié)腸組織濃度升高53％(p＜0.05)，腎臟組織濃度升高45％(p＜0.05)，其他組織濃度均無顯著性差異(p＞0.05)。

8h組織分布結(jié)果顯示：與對照組相比，橙皮苷干預(yù)組中cpt-11的肝臟組織濃度升高14％(p＜0.05)，結(jié)腸組織濃度cpt-11升高39％(p＜0.05)，其他組織濃度均無顯著性差異(p＞0.05)；sn-38的肝臟組織濃度升高35％(p＜0.05)，結(jié)腸組織濃度升高19％(p＜0.05)，腎臟組織濃度升高35％(p＜0.05)，其他組織濃度均無顯著性差異(p＞0.05)。

上述結(jié)果顯示：cpt-11與sn-38在這些組織器官中濃度的升高可能與其auc升高有關(guān)。

實施例3橙皮苷干預(yù)對大鼠腸道內(nèi)容物中cpt-11和sn-38濃度的影響

在實施例2的組織分布實驗中，收集小腸段全部腸道內(nèi)容物，稱重，-80℃保存待測。測定時乙腈渦旋離心，取上清，氮氣吹干，100μl復(fù)溶、進(jìn)樣，應(yīng)用lc-ms/ms測定樣品中的藥物濃度。

通過測定腸道內(nèi)容物中cpt-11和sn-38的濃度，一方面可以反映膽汁排泄進(jìn)入腸道中的cpt-11和sn-38的量，一方面亦可以反映誘發(fā)腸毒性的sn-38在腸道的暴露情況。

橙皮苷干預(yù)大鼠腸道內(nèi)容物中cpt-11和sn-38濃度結(jié)果如圖7所示。

與對照組相比，靜脈cpt-11給予4h后，橙皮苷干預(yù)組cpt-11腸道內(nèi)容物濃度下降22％(p＜0.05)，而sn-38濃度下降37％(p＜0.05)。

以上結(jié)果表明經(jīng)橙皮苷干預(yù)后，cpt-11及sn-38的膽汁排泄受阻，從而導(dǎo)致其部分組織濃度的升高以及腸腔內(nèi)容濃度的下降。

實施例4橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38膽汁排泄的影響

兩組大鼠麻醉固定后，行膽管插管手術(shù)。給予橙皮苷或水1h后，尾靜脈注射cpt-11(20mg/kg)，然后注射cpt-11后不同時間段收集膽汁，-80℃保存，待測。測定時取膽汁樣品20μl，加入180μl乙腈稀釋，取上清液100μl，應(yīng)用lc-ms/ms測定樣品中的藥物濃度。

橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38膽汁排泄的實驗結(jié)果如圖8所示。

與對照組相比，橙皮苷干預(yù)組cpt-11大鼠8h累積膽汁排泄量減少23％(p＜0.05)，sn-38大鼠8h累計膽汁排泄量減少24％(p＜0.05)。這也直接證明橙皮苷干預(yù)后，大鼠cpt-11和sn-38的膽汁排泄途徑受到抑制，也進(jìn)一步驗證了藥動學(xué)和組織分布發(fā)生變化的原因。

實施例5橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38膽汁排泄相關(guān)轉(zhuǎn)運體表達(dá)的影響

westernblot(wb)實驗：操作按照abcam操作規(guī)程進(jìn)行。首先稱取收集所得肝臟組織40mg，加入ripa裂解液(1mmpmsf)30μl，低溫勻漿，取100μl上清液用bca試劑盒測定蛋白含量，根據(jù)蛋白含量結(jié)果ripa裂解液調(diào)整剩余上清液的蛋白濃度，然后，加入上樣緩沖液，95℃變性，5min。然后，經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、壓片和顯影定影后，進(jìn)行灰度分析。灰度分析利用imagej軟件完成，用gapdh校正。

免疫組化分析(ihc)：大鼠肝臟組織經(jīng)福爾馬林固定48h后，有機(jī)溶劑脫水，制成石蠟切片。石蠟切片在60℃烘箱中20min后脫蠟，室溫下3％過氧化氫溶液封閉10min，用ph＝6的檸檬酸緩沖液(10mm)修復(fù)45min。4℃一抗anti-abcc2(1:200)，孵化12h后加入二抗。用sabc和dab(3,3’-二氨基聯(lián)苯)可視化顯色。最后經(jīng)沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后，光學(xué)顯微鏡觀察和采集圖像。

橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38膽汁排泄相關(guān)轉(zhuǎn)運體表達(dá)量的影響結(jié)果如圖9和圖10所示。

與對照組相比橙皮苷干預(yù)組，mrp2的表達(dá)量減少37％(p＜0.05)，oatp2、mdr1和bcrp的表達(dá)量均無顯著性差異(p＞0.05)。

wb和ihc研究發(fā)現(xiàn)，mrp2的表達(dá)量顯著降低(p<0.05)，而其他轉(zhuǎn)運體的表達(dá)量沒有發(fā)生改變。

由于mrp2是介導(dǎo)cpt-11和sn-38膽汁排泄的主要轉(zhuǎn)運體，其他轉(zhuǎn)運體可能只是發(fā)揮代償作用，因此導(dǎo)致cpt-11和sn-38膽汁排泄量減少的一個可能的直接原因就是mrp2的表達(dá)經(jīng)橙皮苷干預(yù)后被抑制。

實施例6橙皮苷干預(yù)對cpt-11和sn-38小腸內(nèi)容物濃度的影響

橙皮苷干預(yù)對cidd模型腸道內(nèi)容物中cpt-11和sn-38濃度的影響結(jié)果如圖11所示。

與cidd模型組相比，橙皮苷干預(yù)組cpt-11腸道內(nèi)容物中濃度無顯著性差異(p＞0.05)，而sn-38腸道內(nèi)容物濃度下降25％(p＜0.05)。

由于mrp2是介導(dǎo)cpt-11和sn-38膽汁排泄的主要轉(zhuǎn)運體，其他轉(zhuǎn)運體可能只是發(fā)揮代償作用，因此導(dǎo)致cpt-11和sn-38腸道內(nèi)容物濃度減少的一個可能的直接原因就是mrp2的表達(dá)經(jīng)橙皮苷干預(yù)后被抑制。

實施例7橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠體重的影響

橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠體重的影響結(jié)果如圖12所示。與空白對照組相比，cidd模型組和橙皮苷干預(yù)cidd模型組大鼠體重均有顯著性下降，分別為7.4％(p＜0.05)和5.5％(p＜0.05)；而相比于cidd模型組，橙皮苷干預(yù)cidd模型組大鼠體重下降幅度明顯小于1.8％(p＜0.05)。

weightchange(％)＝(weightof7thday–weightof3rdday)/weightof3rdday×100％。

實施例8橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠腹瀉的影響

橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠腹瀉評分和腹瀉發(fā)生率的影響結(jié)果如圖13和圖14所示。

與空白對照組相比，cidd模型組和橙皮苷干預(yù)cidd模型組的腹瀉評分值均有顯著升高，分別升高120％(p＜0.05)和79％(p＜0.05)；而相對于模型組，橙皮苷干預(yù)cidd模型組的腹瀉評分值顯著下降19％(p＜0.05)。

與空白對照組相比，cidd模型組和橙皮苷干預(yù)cidd模型組的嚴(yán)重腹瀉發(fā)生率均有顯著升高，腹瀉發(fā)生率分別為45％(p＜0.05)和25％(p＜0.05)；而相對于cidd模型組，橙皮苷干預(yù)cidd模型組的腹瀉發(fā)生率明顯下降44％(p＜0.05)，腹瀉發(fā)生率明顯低于cidd模型組。

腹瀉評分每日早、晚兩次觀察全部大鼠大便形態(tài)，依照評分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行腹瀉等級評分，每天兩次觀察、記錄。依據(jù)commonterminologycriteriaforadverseevents(ctcae)v4.03對腹瀉的分級標(biāo)準(zhǔn)，cidd腹瀉評分為：0分(正常)，1分(濕狀大便)，2分(水樣大便)，3分(死亡)。2分(水樣大便)，3分(死亡)為嚴(yán)重腹瀉。

以上結(jié)果表明橙皮苷干預(yù)可一定程度上改善cidd模型大鼠腸毒性。結(jié)合藥動學(xué)研究結(jié)果，橙皮苷干預(yù)后cidd模型大鼠腸毒性的改善，可能與其抑制cpt-11和sn-38的膽汁排泄，降低腸道sn-38的暴露有關(guān)。

實施例9橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠結(jié)腸病理變化的影響

橙皮苷干預(yù)對cidd模型大鼠結(jié)腸病理變化的影響結(jié)果如圖15所示。

圖15a為正常對照組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖；圖15b為cidd模型組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖，結(jié)腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)消失，上皮腫脹、壞死，同固有層分離，固有層細(xì)胞成分增多，伴破壞、不完整，腺體結(jié)構(gòu)減少，但可見完整腺體結(jié)構(gòu)(四級)；圖15c為橙皮苷干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖，結(jié)腸黏膜絨毛頂端部分上皮細(xì)胞腫脹脫落(二級)。與模型組相比，橙皮苷組腸毒性有所改善。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。