本發(fā)明涉及桑根酮c的新用途，具體涉及桑根酮c在制備抗心肌細(xì)胞缺氧損傷藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在整個(gè)生命活動過程中，心臟不停地跳動，推動血液在心血管系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)流動。心臟實(shí)質(zhì)上沒有氧的儲存，幾乎完全依靠有氧代謝提供高能量消耗，心肌細(xì)胞攝取血液氧含量達(dá)到65％-75％，明顯高于身體其他組織的10％-25％。大氣中的氧通過呼吸進(jìn)入肺泡，彌散入血，與血紅蛋白結(jié)合，由血液循環(huán)輸送到全身，被組織、細(xì)胞攝取利用，其中任一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙都可引起缺氧。而心肌細(xì)胞攝取的氧由冠狀動脈血液循環(huán)提供。當(dāng)冠狀動脈的供氧與心肌的需氧之間出現(xiàn)不平衡時(shí)，冠狀動脈供氧量不能滿足心肌代謝的需要，就可以引起心肌細(xì)胞缺血缺氧，氧化代謝受抑，致使高能磷酸化合物儲備降低，細(xì)胞功能隨之發(fā)生變化，包括超微結(jié)構(gòu)損傷、組織學(xué)損傷、微小血管損傷、心肌功能損傷以及心電活動改變等，即為心肌細(xì)胞缺氧損傷。

桑白皮具有降血壓、利尿利瀉、殺菌消炎、止咳、抗浮腫、鎮(zhèn)靜抗驚厥的作用，中醫(yī)主治肺熱咳喘吐血、水腫、腳氣，小便不利、糖尿病、傳染性肝炎、產(chǎn)后出血不止，具有很好的藥用價(jià)值。桑根酮c是一種從桑白皮中提取的物質(zhì)，具有明顯的降血壓作用，在中草藥中亦用于抗炎。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供桑根酮c的一種新的用途。

本發(fā)明公開了桑根酮c在制備抗心肌細(xì)胞缺氧損傷藥物中的應(yīng)用，桑根酮c的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：

申請人通過大量的實(shí)驗(yàn)，研究證明了桑根酮c具有抗h9c2大鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷的作用，研究發(fā)現(xiàn)，桑根酮c的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制與細(xì)胞自噬和腺苷酸活化蛋白激酶(ampk)相關(guān)，桑根酮c增加了缺氧下的細(xì)胞自噬，使得自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平增加；同時(shí)，這一作用機(jī)制也與活性氧(ros)生成減少和抗氧化劑(no、sod)釋放增加有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桑根酮c通過激活ampka和抑制mtor、foxo3a磷酸化這一信號通路機(jī)制，減少促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減少缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有直接細(xì)胞保護(hù)作用，能夠抗心肌細(xì)胞缺氧損傷。本發(fā)明涉及的桑根酮c在制備抗心肌細(xì)胞缺氧損傷藥物中的應(yīng)用屬于首次公開。

附圖說明

圖1：桑根酮c抑制心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

rt-pcr檢測不同濃度桑根酮c對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞tnf-α，il-1和il-6的mrna水平；

*與對照組相比，p<0.05；

#與缺氧組相比，p<0.05。

圖2：桑根酮c抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激

a:熒光顯微鏡下觀察桑根酮c抑制了缺氧誘導(dǎo)的ros生成；

b:桑根酮c對no、sod水平的影響；

*與常氧pbs組對比，p<0.05；

#與缺氧pbs組對比，p<0.05。

圖3：桑根酮c激活缺氧心肌細(xì)胞中的自噬

a：rt-pcr檢測atg5和beclin-1的表達(dá)水平；

b:westernblot分析桑根酮c對lc3ⅱ/lc3i比例的影響，左側(cè)是westernblot蛋白印跡，右側(cè)是定量結(jié)果。

*與常氧pbs組對比，p<0.05；

#與缺氧pbs組對比，p<0.05。

圖4：桑根酮c對心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

a和b:tunel染色方法：100μm桑根酮c對心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡的影響，a為tunel染色圖，b為定量結(jié)果；

c和d：westernblot分析桑根酮c對激活細(xì)胞凋亡信號通路的影響，c為westernblot蛋白印跡，d為定量結(jié)果；

*與常氧pbs組對比，p<0.05；

#與缺氧pbs組對比，p<0.05。

圖5：桑根酮c對ampkα/mtor/foxo3a信號通路的影響

a和b：westernblot分析桑根酮c對激活ampkα/mtor/foxo3a信號通路的影響，a為westernblot蛋白印跡，b為定量結(jié)果；

c和d：tunel染色法評估經(jīng)桑根酮c、ampkα抑制劑cpc預(yù)處理缺氧24小時(shí)后心肌細(xì)胞的結(jié)果對比，c為tunel染色圖；d為定量結(jié)果；

e：westernblot分析桑根酮c、ampkα抑制劑cpc對lc3i/ii比例的影響，上面為westernblot蛋白印跡，下面為定量結(jié)果；

*與常氧pbs組對比，p<0.05；

#與缺氧pbs組對比，p<0.05。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡明。

實(shí)施例1：本發(fā)明所涉及化合物桑根酮c片劑的制備：

取20克化合物桑根酮c，加入制備片劑的淀粉180克，混合均勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。

實(shí)施例2：本發(fā)明所涉及化合物桑根酮c膠囊劑的制備：

取20克化合物桑根酮c，加入制備膠囊劑的淀粉180克，混合均勻，裝膠囊制成1000片。

下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明桑根酮c的藥物活性。

h9c2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng):將質(zhì)量百分比為89％的dmem、10％的肽牛血清、0.5％的青霉素和0.5％的鏈霉素制成培養(yǎng)基，其中青霉素的酶活力為100u/ml，鏈霉素的濃度為100g/ml。培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃，體積分?jǐn)?shù)為95％的空氣，5％的co2；1-2天更換培養(yǎng)液一次，匯合度到70-80％傳代；以0.25×10⁶/孔的密度把h9c2細(xì)胞種在6孔板上。h9c2大鼠心肌細(xì)胞來自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用spssversion19.0(spss公司，芝加哥，美國)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)例1：桑根酮c抑制心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

把上述h9c2細(xì)胞分為五組：對照組、缺氧組、ld組、md組和hd組。

對照組(control)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用10μlpbs預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的空氣和5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

缺氧組(hypoxia)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用10μlpbs預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

ld組：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用1μm桑根酮c預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

md組：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用10μm桑根酮c預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

hd組：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用100μm桑根酮c預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

上述桑根酮c均溶于pbs，用量均為10μl。

rt-pcr檢測桑根酮c對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的腫瘤壞死因子α(tnf-α)，白介素-1(il-1)和白介素-6(il-6)的表達(dá)的影響。如圖1，與對照組相比，缺氧處理使得促炎細(xì)胞因子tnf-α、il-1和il-6的表達(dá)水平顯著升高，但是經(jīng)桑根酮c處理后，三種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平有所降低。說明桑根酮c處理可逆轉(zhuǎn)這種不良影響，且隨桑根酮c的濃度增高，其作用效果越明顯。

實(shí)驗(yàn)例2：桑根酮c抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激

把h9c2細(xì)胞分為四組：常氧pbs組、常氧hd組、缺氧pbs組和缺氧hd組。

常氧pbs組(normoxia-pbs)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用10μlpbs預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的空氣和5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

常氧hd組(normoxia-hd)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用100μm桑根酮c預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的空氣和5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

缺氧pbs組(hypoxia-pbs)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用10μlpbs預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

缺氧hd組(hypoxia-hd)：細(xì)胞在6孔板上經(jīng)24小時(shí)粘附后，將培養(yǎng)基改為無血清的dmem培養(yǎng)基，并維持12小時(shí)，然后使用100μm桑根酮c預(yù)處理，放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)為95％的氮?dú)夂?％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)；

上述桑根酮c均溶于pbs，用量均為10μl。

使用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dcfh-da)熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ros)的生成水平。使用磷酸鹽緩沖液(pbs)把處理后的h9c2細(xì)胞洗滌兩次，然后在無血清的dmem中加入1×10^-5mol/l的dcfh-da，并于37℃下孵育30分鐘。之后，細(xì)胞用pbs清洗三次以祛除殘留的dcfh-da，取出爬片置于熒光顯微鏡下觀察并拍片。在心肌細(xì)胞缺氧時(shí)，需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生ros顯著增多；而經(jīng)100μm桑根酮c處理后，缺氧誘導(dǎo)的ros生成增多被明顯抑制。本發(fā)明同時(shí)檢測了桑根酮c對抗氧化劑釋放的影響，在缺氧24h后，h9c2心肌細(xì)胞中一氧化氮(no)及超氧化物歧化酶(sod)的釋放明顯降低，而桑根酮c可顯著逆轉(zhuǎn)這一改變，如圖2a和b。

實(shí)驗(yàn)例3：桑根酮c激活缺氧下心肌細(xì)胞的自噬

由于beclin-1，p62，atg5和lc3均為自噬相關(guān)蛋白，而自噬水平的上升伴隨著lc3ⅱ/lc3i比例和atg5，beclin-1的表達(dá)增加。本發(fā)明就桑根酮c對在缺氧條件下的心肌細(xì)胞自噬水平的影響進(jìn)行了探討。如圖3a和b，結(jié)果表明，與常氧pbs組和常氧hd組相比，在缺氧pbs組，心肌細(xì)胞中自噬明顯降低，但給予100μm桑根酮c預(yù)處理后心肌細(xì)胞自噬水平明顯增加。

實(shí)驗(yàn)例4：桑根酮c對心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

為了研究桑根酮c對缺氧下心肌細(xì)胞凋亡的影響，我們采用tunel染色和westernblot檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與常氧情況下相比，在缺氧24h后細(xì)胞凋亡率明顯升高，而在缺氧hd組，加入桑根酮c后，細(xì)胞凋亡率有所降低，說明桑根酮c能顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，如圖4a和b。且凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也與上述結(jié)果一致，如圖4c和d。

實(shí)驗(yàn)例5：桑根酮c對ampkα/mtor/foxo3a信號通路的影響

細(xì)胞能量水平通過三種主要的信號通路與細(xì)胞自噬機(jī)制產(chǎn)生密切聯(lián)系，這三種信號通路分別為：腺苷酸活化蛋白激酶(ampkα)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mtor)和foxo3a。研究發(fā)現(xiàn)在缺氧心肌細(xì)胞中，ampkα的活化下降，mtor和foxo3a的磷酸化水平上升。桑根酮c預(yù)處理后明顯增加ampkα的活化，同時(shí)減少mtor和foxo3a的磷酸化，如圖5a和b。實(shí)驗(yàn)使用ampkα抑制劑cpc驗(yàn)證桑根酮c是通過激活ampk信號通路發(fā)揮對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其中cpc的濃度為20μm。研究發(fā)現(xiàn)，桑根酮c抗凋亡和促自噬的作用被cpc抑制，如圖5c-e。這些數(shù)據(jù)表明，桑根酮c通過調(diào)控ampkα/mtor/foxo3a信號通路使缺氧下心肌細(xì)胞出現(xiàn)的自噬增多，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減少。